CN115820748B - 一种提高体细胞核移植发育效率的药物及应用 - Google Patents

一种提高体细胞核移植发育效率的药物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了提供了一种提高体细胞核移植发育效率的药物,该药物为HDACs/mTORInhibitor1,其化学式为C28H38N8O5。可以通过添加该双靶点药物在体细胞培养液中,通过诱导体细胞自噬激活,来清除体细胞内受损线粒体,抑制体细胞衰老和凋亡;也可以提高体细胞同期性和表观修饰水平,使体细胞基因组易和转录因子结合,提高重编程效率,同时进一步提高体细胞自噬水平,并通过协同作用,提高供体细胞质量和表观修饰状态,从而提高体细胞核移植胚胎的发育效率。

Description

一种提高体细胞核移植发育效率的药物及应用
技术领域
本发明涉及体细胞核移植领域,特别涉及一种提高体细胞核移植发育效率的药物及应用。
背景技术
体细胞核移植(SCNT)技术在优良种畜快速扩繁、地方品种保护、基因编辑动物生产等方面具有巨大潜力,但目前低下的克隆效率影响其应用。研究表明,体细胞活力、周期、表观修饰等均影响着克隆胚胎发育和质量。且核移植胚胎中,来源于供体细胞的线粒体会导致克隆胚胎的线粒体异质性,影响克隆胚胎的重编程和发育效率。
自噬或自噬作用是清除不必要或受损的细胞蛋白和成分的过程,细胞在外界压力刺激下会诱导自噬发生以降解自身物质用于维持稳态,从而适应环境维持生存。研究表明,自噬可能通过抑制细胞衰老和细胞凋亡来促进细胞多能性的诱导。组蛋白乙酰化转移酶和去乙酰化酶在细胞内控制乙酰化修饰,调控相关基因的转录,组蛋白一些位点的乙酰化水平也调节细胞的自噬活性,如Pacer蛋白乙酰化水平的降低则导致自噬活性的降低。因此细胞自噬水平和表观修饰状态均影响着体细胞的质量,且两种方式互相作用,可能具有协同效应。
目前,急需要研发一种新的靶点药物,该药物能够诱导体细胞自噬激活、提高体细胞同期性和表观修饰水平,进而提高作为核移植供体细胞的体细胞的质量,提高克隆效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高体细胞核移植发育效率的药物来诱导体细胞自噬激活、提高体细胞同期性和表观修饰水平,进而提高作为核移植供体细胞的体细胞的质量,提高克隆效率。
根据本发明的第一个方面,提供了一种提高体细胞核移植发育效率的药物,该药物为HDACs/mTOR Inhibitor 1,其化学式为C28H38N8O5,其结构式为:
根据本发明的第二个方面,提供了一种药物HDACs/mTOR Inhibitor 1在提高体细胞核移植发育效率上应用。由此,可以通过添加该双靶点药物在体细胞培养液中,并通过诱导体细胞自噬激活,来清除体细胞内受损线粒体,抑制体细胞衰老和细胞凋亡;同时提高体细胞同期性和表观修饰水平,使体细胞基因组易和转录因子结合,提高重编程效率,同时进一步提高体细胞自噬水平,并通过协同作用,提高供体细胞质量和表观修饰状态,从而提高体细胞核移植胚胎的发育效率。
在某些实施方式中,该药物HDACs/mTOR Inhibitor 1浓度为100nM-1μM。
在某些实施方式中,该药物HDACs/mTOR Inhibitor 1浓度为100nM。
根据本发明的第三个方面,提供了一种提高体细胞核移植发育效率的方法,该方法通过将体细胞置于含有HDACs/mTOR Inhibitor 1药物的培养液中,培养48h后,作为核移植的供体细胞。由此,可以通过添加该双靶点药物HDACs/mTOR Inhibitor 1在作为供体细胞的体细胞培养液中,并通过诱导体细胞自噬激活,来清除体细胞内受损线粒体,抑制体细胞衰老和细胞凋亡;也可以提高体细胞同期性和表观修饰水平,使体细胞基因组易和转录因子结合,提高重编程效率,同时进一步提高体细胞自噬水平,并通过协同作用,提高供体细胞质量和表观修饰状态,从而提高体细胞核移植胚胎的发育效率。
在某些实施方式中,该提高体细胞核移植发育效率的方法还包括如下步骤:
S1:将体细胞置于含有药物HDACs/mTOR Inhibitor 1的培养液中,培养48h后,作为核移植的供体细胞;
S2:将供体细胞与卵母细胞进行融合激活;
S3:融合激活后继续体外培养至144小时,即可获得核移植囊胚;
S4:将获得的囊胚移入代孕子宫,待克隆动物出生后,即可提高体细胞核移植效率。
根据本发明的第四个方面,提供了一种药物HDACs/mTOR Inhibitor 1在提高体细胞自噬水平上的应用。由此,可以通过提高体细胞自噬水平,进而提高该体细胞作为核移植供体细胞的质量,来提高核移植发育效率。
根据本发明的第五个方面,提供了一种药物HDACs/mTOR Inhibitor 1在提高体细胞同期性水平上的应用。由此,可以通过提高体细胞同期性水平,进而提高该体细胞作为核移植供体细胞的质量,来提高核移植发育效率。
根据本发明的第六个方面,提供了一种药物HDACs/mTOR Inhibitor 1在提高体细胞表观修饰水平上的应用。由此,可以通过提高体细胞表观修饰水平,进而提高该体细胞作为核移植供体细胞的质量,来提高核移植发育效率。
根据本发明的第七个方面,提供了一种药物HDACs/mTOR Inhibitor 1在降低体细胞HDAC和/或mTOR基因表达上的应用。由此,可以通过降低体细胞HDAC和/或mTOR基因表达,进而提高该体细胞作为核移植供体细胞的质量,来提高核移植发育效率。
本发明的有益效果:
1、公开了一种提高体细胞核移植发育效率的药物,该药物为HDACs/mTORInhibitor 1,其化学式为C28H38N8O5。
2、公开了一种药物HDACs/mTOR Inhibitor 1在提高体细胞核移植发育效率上应用。可以通过添加该双靶点药物在体细胞培养液中,并通过诱导体细胞自噬激活,来清除体细胞内受损线粒体,抑制体细胞衰老和细胞凋亡;也可以提高体细胞同期性和表观修饰水平,使体细胞基因组易和转录因子结合,提高重编程效率,同时进一步提高体细胞自噬水平,并通过协同作用,提高供体细胞质量和表观修饰状态,从而提高体细胞核移植胚胎的发育效率。
3、公开了一种提高体细胞核移植发育效率的方法,该方法通过将体细胞置于含有HDACs/mTOR Inhibitor 1药物的培养液中,培养48h后,作为核移植的供体细胞。由此,可以通过添加该双靶点药物HDACs/mTOR Inhibitor 1在作为供体细胞的体细胞培养液中,并通过诱导体细胞自噬激活,来清除体细胞内受损线粒体,抑制体细胞衰老和细胞凋亡;也可以提高体细胞同期性和表观修饰水平,使体细胞基因组易和转录因子结合,提高重编程效率,同时进一步提高体细胞自噬水平,并通过协同作用,提高供体细胞质量和表观修饰状态,从而提高体细胞核移植胚胎的发育效率。用药物HDACs/mTOR Inhibitor 1处理供体细胞后,细胞增殖受到抑制但其活力不受影响,将处理后的细胞为供体构建克隆胚胎,可提高胚胎发育效率,囊胚率显著高于对照组(P<0.05)。
4、公开了一种药物HDACs/mTOR Inhibitor 1在提高体细胞自噬水平上的应用,可以通过提高体细胞自噬水平,进而提高该体细胞作为核移植供体细胞的质量,来提高核移植发育效率。
5、公开了一种药物HDACs/mTOR Inhibitor 1在提高体细胞同期性水平上的应用,可以通过提高体细胞同期性水平,进而提高该体细胞作为核移植供体细胞的质量,来提高核移植发育效率。
6、公开了一种药物HDACs/mTOR Inhibitor 1在提高体细胞表观修饰水平上的应用,可以通过提高体细胞表观修饰水平,进而提高该体细胞作为核移植供体细胞的质量,来提高核移植发育效率。
7、公开了一种药物HDACs/mTOR Inhibitor 1在降低体细胞HDAC和/或mTOR基因表达上的应用,可以通过降低体细胞HDAC和/或mTOR基因表达,进而提高该体细胞作为核移植供体细胞的质量,来提高核移植发育效率。
附图说明
图1为CCK-8试剂盒检测不同浓度HDACs/mTOR Inhibitor 1处理细胞48h后的细胞活力结果图;
图2为不同浓度HDACs/mTOR Inhibitor 1处理体细胞48h后的细胞形态结果图;
图3为100nM HDACs/mTOR Inhibitor 1处理细胞48h后相关基因的表达水平结果图;
图4为不同浓度HDACs/mTOR Inhibitor 1处理细胞48h进行核移植后囊胚发育的显微照片结果图。
具体实施方式
以猪体细胞核移植为例,结合附图对本发明作进一步详细的说明。
实施例1成体耳成纤维细胞的获取和药物处理
选用优秀种猪耳皮成纤维细胞作为供体细胞,用酒精消毒猪耳部后,剪取小块耳组织,4℃冻存运回实验室,消毒清洗后将猪耳皮组织块剪碎,加入DMEM,离心去除上清液,将沉淀用适量血清重悬后转移到10cm培养皿中,并置于37℃、5%CO2饱和湿度环境中培养。第二天去除血清换成含10%胎牛血清的DMEM,待细胞长至80%~90%汇合度时进行冻存或传代培养,选用第3~6代的成体耳成纤维细胞作为供体细胞。
对照组:普通细胞培养液(含10%胎牛血清的DMEM)培养成体耳成纤维细胞传代后,再培养至完全贴壁(一般7h即可),然后换液(不含HM1)培养48h,胰酶消化后用作核移植的供体细胞。
实验组:普通细胞培养液(含10%胎牛血清的DMEM)培养成体耳成纤维细胞传代后,再培养至完全贴壁(一般7h即可),换含有100nM、300nM、500nM、700nM、1μM HDACs/mTORInhibitor 1(HM1)的培养液(该培养液是将100nM、300nM、500nM、700nM、1μM HDACs/mTORInhibitor 1添加至含有10%胎牛血清的DMEM的普通细胞培养液中)分别处理细胞48h,胰酶消化后用作核移植的供体细胞。
实施例2卵母细胞的获取和体外成熟培养
从屠宰场采集猪卵巢,放至装有生理盐水的保温瓶中运至实验室,用带有18号针头的无菌注射器抽吸卵泡液,待沉降后,用DPBS-PVA缓冲液重悬3次,之后在体视镜下挑选出卵丘细胞严密包裹三层以上,胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体放入成熟培养液中,在CO2培养箱中培养42~44h后,用透明质酸酶消化反复轻轻吹打去除卵母细胞周围的颗粒细胞。在显微镜下将极体明显且大小适中的成熟卵母细胞挑选出来用做核移植受体。
实施例3克隆胚胎的构建及融合激活
用Hoechst33342染色确定细胞核的位置,固定针将卵母细胞固定,使用显微操作针移除细胞核,并在卵周隙注入一个体细胞完成胚胎重构过程。按批次将重构胚胎放入胚胎培养液PZM-3中静置培养。之后转移到融合液中平衡,平衡后将重构胚胎放入已铺满融合液的融合槽内,使供体细胞和卵母细胞的细胞膜接触面与电极平行,用100v/mm、80μs、2次脉冲直流电诱导融合同时激活,接着洗涤3遍后立即转入预平衡的含有5μg/ml CB的胚胎培养液PZM-3培养4h,然后将获得的核移植胚胎分组培养。置于38.5℃、5%O2、5%CO2和饱和湿度条件下培养,发育至48h和144h时可记录卵裂和囊胚发育情况。
实施例4药物处理后细胞的活力
采用CCK-8试剂盒检测不同时间和浓度的药物处理下的成体成纤维细胞的活力,筛选出药物处理的最适时间和浓度。将成体成纤维细胞接种于96孔板培养,每孔细胞个数约为104个细胞,铺板24h后,用不同时间和浓度的药物处理,每孔加入10μl CCK-8,孵育3~4h后,在波长450nm下检测吸光度。由图1和2结果可知,药物在100nM~1μM处理细胞48h后对细胞增殖有明显的抑制作用(图1),但不损伤细胞形态(图2)。以100nM,HDACs/mTORInhibitor 1(HM1)处理48h效果最佳。
实施例5药物处理后细胞相关基因的表达水平
选择HDACs/mTOR Inhibitor 1(HM1)药物处理细胞的最适浓度和时间为100nM、48h。待细胞长至90%汇合度后,传代至六孔板中,每孔细胞个数约为104~105个细胞,铺板24h后,用100nM HDACs/mTOR Inhibitor 1处理细胞48h后消化冻存,复温后用trizol提取细胞的RNA,检测浓度后反转录,反转录后QPCR,95℃10s,60℃30s,72℃30s,再延伸72℃5min。采用GraphPad Prism软件分析100nM HM1处理细胞48h后细胞的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)、自噬(LC3B)、哺乳动物雷帕霉素蛋白(mTOR)以及发育和凋亡(Nanog、Zscan4、Bax、Bcl-xl)基因的相对表达水平,根据结果可知,100nM HM1处理细胞48h后HDAC和mTOR水平显著降低,达到了有效抑制去乙酰化酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的作用,与全能性有关的基因表达水平显著上升,与凋亡有关的基因表达水平显著降低(图3)。
实施例6克隆胚胎的发育情况
胚胎培养至48h时观察卵裂,培养至144h时观察囊胚(图4),采用SPSS 26软件对数据进行方差分析,比较不同浓度药物处理供体细胞后克隆胚胎的发育情况(表1),根据结果可知,100nM、48h药物处理供体细胞后克隆胚胎的囊胚率显著提高(P<0.05)。
表1不同浓度HM 1处理细胞后克隆胚胎的发育情况
备注:统计分析3次重复试验的数据,计算其平均值±标准误,同一列的不同小写字母表示差异显著(P<0.05),下同。
实施例7HDACs/mTOR Inhibitor 1(HM1)提高体细胞核移植发育效率
将核移植的供体体细胞置于含有100nM HDACs/mTOR Inhibitor 1(HM1)培养液中,培养48h后,作为核移植的供体细胞;将供体细胞与卵母细胞进行融合激活;融合激活后继续体外培养至144小时,即可获得核移植囊胚;将获得的克隆胚胎移入代孕子宫,待克隆动物出生后,即可提高体细胞核移植发育效率。
本申请仅以猪体细胞作为实施例,但是该HDACs/mTOR Inhibitor 1包括不限于在猪体细胞上发挥作用,还可以在牛、羊、小鼠等动物上发挥作用。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明创造构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种HDACs/mTOR Inhibitor 1药物在提高猪的体细胞核移植发育效率上的应用,其中,所述HDACs/mTOR Inhibitor 1药物的化学式为C28H38N8O5,其结构式为:,所述药物的浓度为100nM-1μM。
2.一种提高猪的体细胞核移植发育效率的方法,其中,所述方法通过将猪的体细胞置于含有如权利要求1中所述的药物的培养液中,培养48h后,作为核移植的供体细胞。
3.根据权利要求2所述的方法,其中,所述方法包括如下步骤:
S1:将猪的体细胞置于含有如权利要求1中所述的药物的培养液中,培养48h后,作为核移植的供体细胞;
S2: 将供体细胞与卵母细胞进行融合激活;
S3:融合激活后继续体外培养至144小时,即可获得核移植囊胚;
S4:将获得的克隆胚胎移入代孕母猪的子宫,待克隆的仔猪出生后,即可提高猪的体细胞核移植效率。
4.根据权利要求1中所述的应用,其中,所述的药物可提高猪的体细胞自噬水平。
5.根据权利要求1中所述的应用,其中,所述的药物可提高猪的体细胞同期性水平。
6.根据权利要求1中所述的应用,其中,所述的药物可提高猪的体细胞表观修饰水平。
7.根据权利要求1中所述的应用,其中,所述的药物可降低猪的体细胞HDAC和/或mTOR基因表达。
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