CN108913653B - 一种提高猪核移植效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高猪核移植效率的方法，所述方法主要包括在体细胞核移植前，使用BET蛋白抑制剂(+)‑JQ1预处理供体细胞，然后使用处理后的供体细胞进行猪核移植胚胎构建。本发明方法简便，效果明显，一次处理多孔体细胞，可以生产大规模的克隆胚胎，且显著提高体细胞克隆胚胎体外发育效率。

Description

一种提高猪核移植效率的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高猪核移植效率的方法。
背景技术
早在体细胞作为克隆胚胎供体之前，已有胚胎干细胞作为供体细胞的克隆动物出生，但胚胎干细胞难以获得且不易培养，如猪胚胎干细胞尚未建系成功，因此并不能广泛应用。自1997年多莉羊因使用体细胞而使克隆技术得以广泛运用。与干细胞相比，高度分化的体细胞具有独特的转录组，这种独特的基因表达定义了体细胞不具备多能性，因此在克隆过程中易造成重编程不完整的现象，从而导致克隆效率低下。
自从1997年首例体细胞克隆哺乳动物“多莉”羊出生以来，陆续有克隆动物出生的报道，然而，克隆动物的整体效率仍然较低。
克隆动物核移植操作，就是通过卵母细胞胞质中的物质处理，激活供体细胞核表观遗传重编程，使体细胞高度分化状态转变成全能性胚胎状态。研究发现克隆胚胎发育过程中与胚胎发育相关的关键基因没有被激活或表达水平过低，胚胎呈现过度甲基化和低乙酰化水平，说明基因组重编程不完全，是克隆胚胎发育效率低下的主要原因。
发明内容
鉴于此，有必要针对上述问题提供一种提高猪核移植效率的方法，主要通过抑制供体细胞定向转录表达的方法，诱导体细胞多功能基因表达，使用该体细胞进行核移植胚胎构建，以此来提高体细胞核移植胚胎的质量，从而提高克隆效率。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种提高核移植效率的方法，包括核移植前，使用BET蛋白抑制剂预处理供体细胞。
进一步的，所述供体细胞为非病变体细胞，优选成体耳皮成纤维细胞。
进一步的，所述BET蛋白抑制剂处理浓度为100-150nM，优选100nM。
进一步的，所述BET蛋白抑制剂为(+)-JQ1；所述(+)-JQ1分子式：C23H25ClN4O2S；所述(+)-JQ1结构式为：
Figure BDA0001683442240000021
进一步的，所述培养时间为48-72h,最佳处理时间为72h；培养条件为：DMEM培养液加入10％胎牛血清，37℃、5％CO2饱和湿度培养环境。
进一步的，所述供体细胞预处理前，将核移植供体细胞消化后传代于6孔细胞培养板中，每孔105个细胞，细胞贴壁后吸去培养液。
进一步的，所述供体细胞可以包括所有哺乳动物。
本发明有益效果：
体细胞转录记忆是通过一个转录标记有丝分裂染色质的过程来实现的，而BET蛋白是负责转录记忆的有丝分裂蛋白的一个家族。如果能够抑制BET蛋白的表达，通过扰乱体细胞转录记忆来促进体细胞多能性的重编程，则有可能提高克隆效率。BET家族包含BRD2、BRD3、BRD4及BRDT蛋白，其中BRD4通过与组蛋白末端乙酰化赖氨酸结合，可以促使染色质重塑因子和转录因子等相关蛋白富集于特定的基因转录位点，在调控基因的表达中起着重要作用。本发明采用的BET蛋白抑制剂((+)-JQ1)是一种小分子抑制剂，可以竞争性地与BRD4溴结构域相结合，使BRD4蛋白从染色质的乙酰化赖氨酸上置换下来，从而抑制了BRD4在转录记忆中的作用。
本发明方法采取核移植前处理供体细胞更方便，处理一批供体细胞可以做很多克隆胚胎。原理上抑制剂处理供体细胞，抑制了体细胞定向表达，可能使细胞朝向多功能干细胞发展，这些经处理的体细胞，除了用于进行克隆，提高克隆效率，还可以用于其他途径，比如制备多功能干细胞等。
本发明方法简便，效果明显，一次处理多孔体细胞，可以生产大规模的克隆胚胎，显著提高体细胞克隆胚胎体外发育效率。
具体实施方式
为了更好的说明本发明技术方案所要解决的问题、采用的技术方案和达到的有益效果，现结合具体实施方式进一步阐述。值得说明的是，本发明技术方案包含但不限于以下实施方式。
本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。
本申请中单位“M”表示“mol/L”；“nM”表示“nmol/L”。
实施例一(+)-JQ1不同浓度对提高核移植效率的影响
以猪核移植胚胎构建为例。
1、供体细胞分离和培养
供体细胞来源于广东温氏集团特级公猪耳组织，剪取猪耳皮后放入DMEM培养液4℃保存运回实验室，将猪耳皮组织块剪碎后，用DMEM清洗组织碎片后用适量胎牛血清重悬并转移到培养皿中，37℃、5％CO2、饱和湿度环境中培养。5-7h后添加含10％胎牛血清的DMEM培养液，待细胞长至90％汇合时进行传代。传代第二天，换为含有不同浓度的(+)-JQ1的细胞培养液(DMEM培养液+10％胎牛血清)，处理72h，每24h更换一次培养液，直到细胞长满培养板，胰酶消化作为供体细胞；未处理组使用相同的体细胞、相同的培养方法，区别仅在于培养液中未添加(+)-JQ1。
2、卵母细胞收集和成熟培养
从屠宰场母猪获取的卵巢，放入37℃生理盐水内运回实验室，使用添加抗生素(添加抗生素预防细菌感染，常规添加即可，也可不添加)的生理盐水冲洗3遍后，用配有18G针头的10mL注射器抽取2-6mm的卵泡，在体视显微镜下用自制捡卵针(使用市售的巴氏吸管拉制而成，内径为200-300μm)捡取卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，用洗卵液洗3遍后，再用成熟培养液(常规技术的成熟细胞培养液即可，如TCM-199成熟培养液等)洗2遍，然后放入已在CO2培养箱内平衡4h以上的成熟培养液中，在39℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中成熟培养44h。将成熟培养后的COCs与0.1％透明质酸酶混合，用移液枪反复吹打除去卵丘细胞，去除卵丘细胞的卵母细胞挑选出卵周隙明显且无杂质、胞质均匀、明显排出第一极体的卵母细胞进行克隆胚胎的构建。
3、克隆胚胎构建和激活
成熟的卵母细胞使用荧光照射的方法确定核的位置，使用显微操作针精确移除卵母细胞核，并在卵周隙注入一个使用(+)-JQ1处理过的体细胞完成胚胎重构过程，未处理体细胞作为对照组。将重构卵分批放入已经铺满激活液的融合槽内，使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行，用100v/mm、80μs、2次脉冲直流电诱导融合同时激活。将融合的重构胚用胚胎培养液洗涤后，转入预平衡的含有5μg/mlCB的胚胎培养液培养4h，然后转入胚胎培养液中培养。
4、克隆胚胎体外培养与囊胚细胞计数
克隆胚胎培养条件为39℃、5％O2、5％CO2、90％N2和饱和湿度.在培养第2天和第7天分别观察记录卵裂和囊胚发育情况.将第7天的囊胚用4％多聚甲醛固定10min，再用10mg/L Hoechst33342中染色10min，压片后在荧光显微镜下观察记录囊胚细胞数。使用SPSS软件对实验数据进行方差分析，比较不同(+)-JQ1终浓度处理对克隆胚胎早期发育的影响，包括胚胎卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数的差异(表1)。
表1不同浓度JQ1处理供体细胞对克隆胚胎体外发育效率的影响
Figure BDA0001683442240000061
备注：统计分析3次重复试验的数据，计算其平均值±标准差，同一列的不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，下同。
结果表明，使用(+)-JQ1处理72h的体细胞作为猪核移植胚胎供体，可以提高猪克隆胚胎的体外发育效率，尤其是100nM(+)-JQ1处理的供体细胞，克隆胚胎体外培养囊胚率显著高于未处理组。
实施例二用含(+)-JQ1的培养液对供体细胞培养不同的时间对核移植效率的影响
本实施例仍以猪核移植胚胎构建为例。
1、供体细胞分离和培养
供体细胞来源于广东温氏集团特级公猪耳组织，剪取猪耳皮后放入DMEM培养液4℃保存运回实验室，将猪耳皮组织块剪碎后，用DMEM清洗组织碎片后用适量胎牛血清重悬并转移到培养皿中，37℃、5％CO2、饱和湿度环境中培养。5-7h后添加含10％胎牛血清的DMEM培养液，待细胞长至90％汇合时进行传代。传代第二天，换为含有终浓度为100nM的(+)-JQ1的细胞培养液(DMEM培养液+10％胎牛血清)分别培养不同时间(24h、48h、72h、96h)，每24h更换一次培养液，直到细胞长满培养板，胰酶消化作为供体细胞。
2、卵母细胞收集和成熟培养，同实施例一。
3、克隆胚胎构建和激活，同实施例一。
4、克隆胚胎体外培养与囊胚细胞计数，实验操作同实施例一，
实验结果见表2，通过表2的数据比较适用含(+)-JQ1的培养液培养不同时间对克隆胚胎早期发育的影响，包括胚胎卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数的差异。
表2 JQ1供体细胞不同处理时间对克隆胚胎体外发育效率的影响
Figure BDA0001683442240000071
从实验结果可知，随着供体细胞处理时间增加，构建的克隆胚胎体外发育效率随着增加，且囊胚总细胞数也随着增加，尤其是处理72h，囊胚率显著高于处理24h的，但随着处理时间增加，细胞死亡随之增加，处理96h，体细胞克隆胚胎的囊胚率也下降，因此选择使用100nM的(+)-JQ1处理供体细胞72h为最佳。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (1)

1.一种提高猪核移植效率的方法，其特征在于，包括在猪体细胞核移植前，将猪耳皮组织碎片于适量胎牛血清中培养5-7h，之后添加含10%胎牛血清的DMEM培养液，待细胞长至90%汇合时进行传代，传代第二天使用含有BET蛋白抑制剂(+)-JQ1的含10%胎牛血清的DMEM培养液预处理供体细胞48-72h，所述BET蛋白抑制剂的终浓度为100-150nM；所述供体细胞为猪耳皮成纤维细胞。
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