CN108913663B

CN108913663B - 一种提高核移植胚胎体外发育效率的方法

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Publication number: CN108913663B
Application number: CN201810561797.0A
Authority: CN
Inventors: 吴珍芳; 石俊松; 许卫华; 周荣; 罗绿花; 麦然标; 蔡更元
Original assignee: Wens Foodstuff Group Co Ltd
Current assignee: Wens Foodstuff Group Co Ltd
Priority date: 2018-06-04
Filing date: 2018-06-04
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2038-06-04
Also published as: CN108913663A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高核移植胚胎体外发育效率的方法。本发明提供的提高核移植胚胎体外发育效率的方法，包括：将激活后的核移植重构胚，转入含BET蛋白抑制剂(+)‑JQ1的胚胎培养液中培养。本发明方法可以抑制细胞定向转录记忆，促进了核移植胚胎重编程，从而提高体细胞核移植胚胎的体外发育效率。

Description

一种提高核移植胚胎体外发育效率的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高核移植胚胎体外发育效率的方法。

背景技术

自从1997年首例体细胞克隆哺乳动物“多莉”羊出生以来，陆续有克隆动物出生的报道，然而，克隆动物的整体效率仍然较低。

在所有通过体细胞核转移(SCNT)生产的哺乳动物中，有缺陷的表观遗传重编程可能是低成功率的主要原因。组蛋白修饰和DNA甲基化是阻碍体细胞重新编程成为多能状态的主要因素。研究表明，与体内受精胚胎相比，体细胞核移植胚胎中出现了大量异常DNA和组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化模式。表观遗传异常可导致早期胚胎发育异常的基因表达，导致克隆动物出生率较低，也易出现较多的畸形如大舌头、八字脚等，导致克隆动物存活率较低。

发明内容

鉴于此，有必要针对上述问题提供一种体细胞核移植胚胎的处理方法，以此来提高体细胞核移植胚胎的质量，从而提高体细胞核移植效率。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供的提高核移植胚胎体外发育效率的方法，包括：将激活后的核移植重构胚，转入BET蛋白抑制剂的胚胎培养液中培养。

进一步的，所述BET蛋白溴抑制剂在培养液中浓度为10-20nM，最佳浓度为10nM。

进一步的，所述BET蛋白抑制剂为(+)-JQ1；所述(+)-JQ1分子式：C₂₃H₂₅ClN₄O₂S，结构式为：

进一步的，所述激活后的核移植重构胚，在含BET蛋白抑制剂的PZM-3胚胎培养液中培养时间为48-72h，优选72h。

进一步的，所述重构胚在含BET蛋白抑制剂的PZM-3胚胎培养液中培养后，再换为PZM-3胚胎培养液继续培养至144-168h，优选168h。

进一步的，所述培养条件为38.5-39℃、5％O₂、5％CO₂、90％N₂和饱和湿度。

进一步的，所述核移植胚胎可以包括所有哺乳动物，包括但不局限于猪、牛、羊、鼠、人的核移植胚胎。

本发明有益效果：

BET蛋白家族具有调控体细胞定向表达的功能，克隆胚胎构建后供体细胞受卵母细胞的重编程，它的定向表达记忆“抵抗”了卵母细胞的重编程，造成克隆效率低下，重编程中一个关键事件就要擦除供体细胞的转录记忆，使其由定向表达转为多功能表达。(+)-JQ1是一种高度特异的BET蛋白抑制剂，尤其对BRD4具有高度的选择性。因此使用BET蛋白抑制剂(+)-JQ1处理克隆胚胎，抑制了BET蛋白的作用，降低了这种“抵抗”性，从而抑制了供体细胞的转录记忆，促进了核移植胚胎重编程，提高体细胞核移植胚胎的体外发育效率。

具体实施方式

为了更好的说明本发明技术方案所要解决的问题、采用的技术方案和达到的有益效果，现结合具体实施方式进一步阐述。值得说明的是，本发明技术方案包含但不限于以下实施方式。

本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的或常规的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。

本申请中单位“M”表示“mol/L”；“nM”表示“nmol/L”。

实施例1核移植和重构胚融合激活

本实施例以猪核移植胚胎构建为例：

1、供体细胞分离和培养

供体细胞来源于广东温氏集团特级公猪耳组织，剪取猪耳皮后放入DMEM培养液4℃保存运回实验室，将猪耳皮组织块剪碎后，用DMEM清洗组织碎片后用适量胎牛血清重悬并转移到培养皿中，37℃、5％CO₂、饱和湿度环境中培养。5-7h后添加含10％胎牛血清的DMEM培养液，待细胞长至90％汇合时进行传代，用传至第2代的体细胞作为核移植的供体细胞。

2、卵母细胞收集和成熟培养

从屠宰场母猪获取的卵巢，放入37℃生理盐水内运回实验室，使用添加抗生素的生理盐水冲洗3遍后，用配有18G针头的10mL注射器抽取2-6mm的卵泡，在体视显微镜下用自制捡卵针捡取卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，用洗卵液洗3遍后，再用成熟培养液洗2遍，然后放入已在CO2培养箱内平衡4h以上的成熟培养液中，在39℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中成熟培养44h。将成熟培养后的COCs与0.1％透明质酸酶混合，用移液枪反复吹打除去卵丘细胞，去除卵丘细胞的卵母细胞挑选出卵周隙明显且无杂质、胞质均匀、明显排出第一极体的卵母细胞进行克隆胚胎的构建。

3、体细胞核移植和重构胚融合激活

成熟的卵母细胞使用荧光照射的方法确定核的位置，使用显微操作针精确移除卵母细胞核，并在卵周隙注入一个体细胞完成胚胎重构过程。将重构卵分批放入已经铺满激活液的融合槽内，使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行，用100v/mm、80μs、2次脉冲直流电诱导融合同时激活。将融合的重构胚用胚胎培养液洗涤后，转入预平衡的含有5μg/mlCB的胚胎培养液培养4h，然后将获得的核移植胚胎按本发明的方法进行进一步培养。

实施例2(+)-JQ1不同浓度处理对核移植胚胎体外发育的影响

2.1实验设计

对照组：将施例1操作后得到的核移植胚胎放入PZM-3培养液中培养至168h。

实验组：将施例1操作后得到的核移植胚胎分别放入含有1nM、10nM、15nM、20nM和50nM(+)-JQ1的5组PZM-3培养液中分别培养72h，之后分别转移至不含(+)-JQ1的PZM-3培养液中继续培养到168h。

2.2克隆胚胎体外培养与囊胚细胞计数

克隆胚胎培养条件为39℃、5％O₂、5％CO₂、90％N₂和饱和湿度。在培养第2天和第7天分别观察记录卵裂和囊胚发育情况。将第7天的囊胚用4％多聚甲醛固定10min，再用10mg/L Hoechst33342中染色10min，压片后在荧光显微镜下观察记录囊胚细胞数。使用SPSS软件对实验数据进行方差分析，比较不同浓度处理组和未处理组的胚胎早期发育情况，包括胚胎卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数的差异(结果详见表1)。

表1(+)-JQ1不同浓度处理对核移植胚胎体外发育的影响

组别	克隆胚胎数(重复次数)	卵裂率(％)	囊胚率(％)	囊胚总细胞数
					对照组	241(4)	74.27±3.54	9.13±2.80<sup>a</sup>	37.95±3.35
(+)-JQ1(1nM)	154(4)	77.27±5.84	9.09±3.68<sup>a</sup>	31.28±3.61
					(+)-JQ1(10nM)	240(4)	76.25±2.21	15.42±3.38<sup>b</sup>	38.47±2.86
(+)-JQ1(15nM)	239(4)	76.22±3.11	14.67±3.08<sup>b</sup>	38.86±3.90
					(+)-JQ1(20nM)	240(4)	79.13±2.47	15.03±3.86<sup>b</sup>	37.89±2.74
(+)-JQ1(50nM)	240(4)	77.92±2.93	7.92±3.27<sup>a</sup>	36.50±5.86

备注：统计分析4次重复试验的数据，计算其平均值±标准差，同一列的不同小写字母表示差异显著(P＜0.05),下同。

结果表明，使用10nM(+)-JQ1处理猪核移植胚胎，可以显著提高猪克隆胚胎的体外发育效率，其168h的囊胚率显著高于对照组。

实施例3(+)-JQ1不同处理时间对核移植胚胎体外发育的影响

3.1实验设计

对照组(同实施例2)：将实施例1操作后得到的核移植胚胎放入PZM-3培养液中培养至168h。

实验组：将实施例1操作得到的核移植胚胎放入含有10nM(+)-JQ1的PZM-3培养液中分别培养24h、48h、72h和120h，之后转移至不含(+)-JQ1的PZM-3培养液中继续培养至168h。

7.2克隆胚胎体外培养与囊胚细胞计数

克隆胚胎培养条件为39℃、5％O₂、5％CO₂、90％N₂和饱和湿度。在培养第2天和第7天分别观察记录卵裂和囊胚发育情况。将第7天的囊胚用4％多聚甲醛固定10min，再用10mg/L Hoechst33342中染色10min，压片后在荧光显微镜下观察记录囊胚细胞数。使用SPSS软件对实验数据进行方差分析，比较不同浓度处理组和未处理组的胚胎早期发育情况，包括胚胎卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数的差异(结果详见表2)。

表2(+)-JQ1不同处理时间对核移植胚胎体外发育的影响

组别	克隆胚胎数(重复次数)	卵裂率(％)	囊胚率(％)	囊胚总细胞数
					对照组	241(4)	74.27±3.54	9.13±2.80<sup>a</sup>	37.95±3.35
处理24h组	108(3)	62.04±5.57<sup>a</sup>	10.19±2.79<sup>a</sup>	34.30±5.11
					处理48h组	110(3)	69.43±2.05<sup>b</sup>	15.11±4.76<sup>b</sup>	33.55±3.12
处理72h组	124(3)	74.19±0.96<sup>b</sup>	16.13±7.66<sup>b</sup>	32.82±2.97
					处理120h组	112(3)	72.32±10.86<sup>b</sup>	11.61±5.86<sup>a</sup>	36.67±4.01

结果表明，使用10nM(+)-JQ1处理猪核移植胚胎72h，可以显著提高猪克隆胚胎的体外发育效率，其囊胚率显著高于处理其他各组。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种提高猪核移植胚胎体外发育效率的方法，其特征在于，包括：将激活后的猪核移植重构胚，转入含BET蛋白抑制剂(+)-JQ1的胚胎培养液中培养72h，所述BET蛋白抑制剂在培养液中浓度为10-20 nmol/L；再换为不含BET抑制剂的胚胎培养液继续培养至168h，所述猪核移植重构胚的制备过程包括：（1）将猪耳皮组织碎块用DMEM清洗后用适量胎牛血清重悬，于37℃、5%CO₂、饱和湿度环境中培养5-7h后添加含10%胎牛血清的DMEM培养液，待细胞长至90%汇合时进行传代，用传至第2代的体细胞作为核移植的供体细胞；（2）采集卵丘-卵母细胞复合体COCs，用洗卵液洗3遍后，再用成熟培养液洗2遍，然后放入成熟培养液中，于39℃、5%CO₂、饱和湿度环境中成熟培养44h；（3）将成熟培养后的COCs与0.1%透明质酸酶混合，去除卵丘细胞，并挑选出卵周隙明显且无杂质、胞质均匀、明显排出第一极体的卵母细胞；（4）将卵母细胞使用荧光照射的方法确定核的位置，并移除卵母细胞核，在卵周隙注入一个供体细胞完成胚胎重构过程；（5）将重构卵分批放入已经铺满激活液的融合槽内，使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行，用100 v/mm、80μs、2次脉冲直流电诱导融合同时激活，然后将融合的重构胚用胚胎培养液洗涤后，转入预平衡的含有5μg/ml细胞松弛素B（CB）的胚胎培养液培养4h，获得激活后的核移植重构胚。