JP2004500066A - 異種間核移植により生成する胚あるいは幹様細胞 - Google Patents
異種間核移植により生成する胚あるいは幹様細胞 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004500066A JP2004500066A JP2001546899A JP2001546899A JP2004500066A JP 2004500066 A JP2004500066 A JP 2004500066A JP 2001546899 A JP2001546899 A JP 2001546899A JP 2001546899 A JP2001546899 A JP 2001546899A JP 2004500066 A JP2004500066 A JP 2004500066A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell
- human
- stem
- oocyte
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
分化したドナー細胞の核を、適合する細胞質かつ／またはミトコンドリア（ドナーと同一種の）と共に、ドナー細胞とは異なる動物種の脱核した卵母細胞中に移植するための核移植法を提供する。得られた核移植ユニットは、イソジェニックな胚性幹細胞、特にヒトのイソジェニックな胚細胞あるいは幹細胞を作成する上で有用である。これらの胚細胞あるいは幹様細胞は、目的とする分化細胞を作成する上で、および例えば同種組換えによりこれらの細胞のゲノムの特定の部位において目的とする遺伝子を導入、除去あるいは修飾する上で、有用である。これらの細胞は、異種遺伝子を含有する可能性があり、細胞移植療法やｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞分化の研究のために特に有用である。適合する細胞質あるいはミトコンドリアＤＮＡ（ドナー細胞または核と同一種もしくは類似種）を導入することによって、核移植効率を上昇させることが可能である。また、特定の細胞周期を選択することにより、かつ／または胚の生育および発達を促進する条件下で培養することにより、アポトーシスを阻害するようドナー細胞を遺伝的に操作することで、核移植効率をさらに上昇させることが可能である。
Description
【０００１】
（発明の分野）
本発明は全般的に、動物あるいはヒト細胞に由来する細胞核を、ドナー核と異種の動物の除核した卵母細胞に移植することによる、胚あるいは幹様細胞の生成に関する。より具体的には、本発明は、霊長類あるいはヒトの細胞核を、例えば霊長類あるいは有蹄類の卵母細胞、および好ましい実施態様においてはウシ除核卵母細胞などの除核した動物卵母細胞に移植することによる、霊長類あるいはヒトの胚あるいは幹様細胞の生成に関する。
【０００２】
さらに本発明は、好ましくは霊長類あるいはヒト胚細胞あるいは幹様細胞である生成した胚あるいは幹様細胞の、治療、診断への応用、同じく治療あるいは診断に用いる分化細胞の生成、およびトランスジェニック胚細胞あるいはトランスジェニック分化細胞、細胞株、組織および臓器の生成を目的とした使用に関する。また、本発明に従って生成した胚あるいは幹様細胞自体を、好ましくはトランスジェニック、クローンあるいはキメラ動物であるキメラあるいはクローンの生成を目的とした核移植において、細胞核ドナーとして用いても良い。
【０００３】
（発明の背景）
Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてマウスの初期着床前胚より胚幹（ＥＳ）細胞株を生成する方法は周知である。（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９：１５４−１５６（１９８１）；Ｍａｒｔｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７８：７６３４−７６３８（１９８１）を参照のこと）。ＥＳ細胞は、線維芽細胞（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｄ．）あるいは分化抑制源（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２１：１−９（１９８７））からなるフィーダー層が存在すれば、未分化段階で継代することが可能である。
【０００４】
ＥＳ細胞は、これまでに様々な用途を有することが報告されている。例えば、ＥＳ細胞を分化のｉｎ ｖｉｔｒｏモデル、特に発生初期の調節に関与する遺伝子の研究に使用できることが報告されている。マウスＥＳ細胞を着床前マウス胚に導入すると、生殖細胞系キメラが成長し、その多能性が証明される（Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０９：２５５−２５６（１９８４））。
【０００５】
ＥＳ細胞は、自らのゲノムを次世代に伝達する能力の点から見ると、所望の遺伝子修飾の有無に関わらず、ＥＳ細胞を用いることにより家畜の生殖細胞系操作にとって有用である可能性がある。さらに、例えば有蹄類などの家畜の場合は、同じく着床前の家畜胚に由来する核が、除核した卵母細胞の発生の完了を助ける（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，４０：１０２７−１０３５（１９８９）；ａｎｄ Ｋｅｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５０：９３５−９３９（１９９４））。このことは、移植後８細胞期を過ぎたマウス胚に由来する細胞核が、除核卵母細胞の発生を助けないと報告されていることと対照的である（Ｃｈｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，４８：９５８（１９９３））。よって家畜由来のＥＳ細胞は、遺伝子操作を加えるか、そうでなければ核移植操作に用いる全能ドナー細胞核の供給源となる可能性があるために、非常に望ましい。
【０００６】
一部の研究グループは、多能性であるといわれている胚細胞株の分離を報告している。例えばＮｏｔａｒｉａｎｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｓｕｐｐｌ．，４３：２５５−２６０（１９９１）は、ヒツジ胚盤胞より免疫手術により摘出した内部細胞塊の一次培養における細胞と、形態および成長の特性が幾分類似しているブタおよびヒツジの胚盤胞より、安定で多能性といわれている細胞株を樹立したと報告している。（Ｉｄ．）また、Ｎａｔａｒｉａｎｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｓｕｐｐｌ．，４１：５１−５６（１９９０）は、ブタ胚盤胞に由来する、多能性と考えられる胚細胞株の培養の保守管理および分化を開示している。さらに、Ｇｅｒｆｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｉｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，６（１）：１−１４（１９９５）では、ブタ胚盤胞由来の胚細胞株の分離を開示している。これらの細胞は、調節培地を用いることなく、マウス胚線維芽細胞フィーダー層で安定に維持される。これらの細胞は、培養中に異なる数種類の細胞型に分化すると報告されている（Ｇｅｒｆｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｄ．）。
【０００７】
さらに、Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｏｕｘ’ｓ Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２０１：１３４−１４１（１９９２）では、ウシ胚幹細胞様細胞株を培養すると３世代継代時は生存したが、第４世代目で消失したと報告している。またさらに、Ｈａｎｄｙｓｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｒｏｕｘ’ｓ Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１９６：１８５−１９０（１９８７）では、マウスＩＣＭ由来のマウスＥＳ細胞が分離する条件下で、免疫手術により摘出した、ヒツジ胚の内部細胞塊の培養法を開示している。Ｈａｎｄｙｓｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）（Ｉｄ．）は、こうした条件下では該ヒツジＩＣＭが接着し、拡散し、かつＥＳ細胞様および内胚葉様細胞の領域を生じせしめるが、長期間培養後は内胚葉様細胞のみが認められると報告している。（Ｉｄ．）
【０００８】
最近、Ｃｈｅｒｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，４１：１７５（１９９４）では、多能性といわれているウシ始原生殖細胞由来の細胞株が、長期間培養で維持されると報告した。これらの細胞は、約７日間培養した後、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）染色に陽性であるＥＳ様コロニーを生成し、胚様体形成能を示し、少なくとも２種類の異なる細胞型に自然分化した。これらの細胞は、報告によると、ＥＳ細胞のみに発現すると考えられているホメオボックス遺伝子パターンである転写因子ＯＣＴ４，ＯＣＴ６およびＨＥＳ１のｍＲＮＡを発現した。
【０００９】
また最近、Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ，３８０：６４−６８（１９９６）は、マウスのＥＳ細胞株の分離を促進する条件下で培養した、９日目のヒツジ胚より摘出して培養した杯盤（ＥＤ）細胞の核移植後に、子ヒツジの産子を生成したと報告した。著者らは、その結果に基づき、９日目ヒツジ胚に由来するＥＤ細胞は、核移植により全能性となり、培養中は全能性が維持されると結論付けた。
【００１０】
Ｖａｎ Ｓｔｅｋｅｌｅｎｂｕｒｇ−Ｈａｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，４０：４４４−４５４（１９９５）は、ウシ胎盤胞の内部細胞塊細胞に由来する、永久的といわれる細胞株の分離および同定を報告した。著者らは、８あるいは９日目のウシ胚盤胞より、最も効果的にウシＩＣＭ細胞の接着および外殖を助けるフィーダー細胞および培地の判定を目的として、様々な条件下でＩＣＭを分離して培養した。著者らは、その結果に基づき、培養ＩＣＭ細胞の接着および外殖は、ＳＴＯ（マウス線維芽細胞）フィーダー細胞（ウシ子宮上皮細胞の代用）の使用、および培地に添加するためのチャコール処理血清（通常血清より優れている）の使用により促進されると結論付けた。しかしＶａｎ Ｓｔｅｋｅｌｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌは、その細胞株が多能性ＩＣＭ細胞よりも上皮細胞に類似していると報告した。（Ｉｄ．）
【００１１】
またさらに、１９９４年１０月２７日に公表されたＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ９４／２４２７４、１９９０年４月５日に公表されたＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ９０／０３４３２、１９９４年１１月２４日に公表されたＷｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ９４／２６８８９では、トランスジェニック動物の生成に使用できるといわれている動物幹細胞の分離、選択および増殖を報告している。また１９９０年４月５日に公表されたＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ９０／０３４３２では、トランスジェニック動物の生成に有用であることが確実であるブタおよびウシに由来する多能性であるといわれている胚幹細胞の生成を報告した。さらに、１９９４年１１月２４日に公表されたＷｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ９４／２６８８４では、キメラおよびトランスジェニック有蹄類の製造に有用であることが確実である胚幹細胞を開示した。このため、前述の事項に基づいて、数多くのグループが、例えばクローン化あるいはトランスジェニック胚の生成および核移植への応用の可能性などにより、ＥＳ細胞株の生成を試みていることは明らかである。
【００１２】
有蹄類ＩＣＭ細胞の核移植への使用についても報告されている。例えば、Ｃｏｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３８：２６４−２６７（１９９４）では、溶解したドナー細胞を除核した成熟卵細胞にマイクロインジェクションすることによる、ウシＩＣＭの核移植を開示している。該参照文献では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚を７日間培養して１５個の胚盤胞を生成し、これをウシレシピエントに移植して妊娠４例と産子２例を得たことを開示した。またＫｅｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５０：９３５−９３９（１９９４）では、胚盤胞の生成を目的とした核移植操作におけるウシＩＣＭ細胞のドナー核としての使用によって生成した胚幹細胞を、ウシレシピエントに移植したところ、数匹の産子が得られたことを開示している。さらに、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：６１４３−６１４７（１９９３）では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで短期間培養したウシＩＣＭ細胞から除核した成熟卵細胞への核移植による仔ウシの生産を開示した。
【００１３】
また、培養した杯盤細胞の核移植後の子ヒツジの生産が報告されている（Ｃｈａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８０：６４−６８（１９９６））。またさらに、核移植におけるウシ多能性胚細胞の使用およびキメラ胎児の生成も報告されている（Ｓｔｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５４：１００−１１０（１９９６））；Ｃｏｌｌａｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３８：２６４−２６７（１９９４）。
【００１４】
さらに、異種間ＮＴ単位の生成が過去に試みられている（Ｗｏｌｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，３３：３５０（１９９０）。具体的には、ウシ胚細胞をヤギュウの卵母細胞と融合し、内部細胞塊を有していると思われる異種間ＮＴユニットをいくつか生成した。しかし、核移植操作におけるドナー核としては、成体細胞ではなく胚細胞を用いた。原則は、胚細胞は生体細胞よりも容易にリプログラミングされることであった。これは、カエルを用いた初期のＮＴ研究にさかのぼる（ＤｉＢｅｒａｒｄｉｎｏによる総説，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，１７：１７−３０（１９８０））。また、この研究は系統発生論的に極めて類似した動物（ウシ細胞核とヤギュウ卵母細胞）が関与するものであった。対比してみると、これまではＮＴにより融合する種の差が大きくなると（ウシ細胞核をハムスター卵母細胞に移植）、内部細胞塊構造は得られらなかった。さらに、ＮＴユニット由来の内部細胞塊細胞を用いて、増殖可能なＥＳ細胞様コロニーを形成するできることは、これまで報告されていない。
【００１５】
また、Ｃｏｌｌａｓ ｅｔ ａｌ（Ｉｄ．）は、ウシ核移植胚の生成を目的とした顆粒膜細胞（成体体性細胞）の使用を報告した。しかし、本発明とは異なり、これらの実験は異種間の細胞核移植に関するものではなかった。また本発明とは異なり、ＥＳ−様細胞コロニーは得られなかった。
【００１６】
最近、１９９８年１２月１日にＪａｍｅｓ Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎに対して発行し、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎに譲渡された米国特許第５，８４３，７８０号では、（ｉ）１年以上にわたってｉｎ ｖｉｔｒｏ培養における増殖が可能で、（ｉｉ）霊長類種の特徴を有する染色体が全て存在し、長期間の培養でも顕著に変化せずに核型を維持し、（ｉｉｉ）培養を通じて内胚葉、中胚葉、外胚葉組織の派生物に分化する可能性を維持し、（ｉｖ）線維芽細胞フィーダー層上で培養したとき分化しない霊長類精製胚幹細胞の調製の開示を意図している。これらの細胞は、報告によるとＳＳＥＡ−１マーカー陰性、ＳＥＡ−３マーカー陽性、ＳＳＥＡ−４マーカー陽性であり、アルカリフォスファターゼ活性を示し、多能性であり、霊長類種の特徴を有する全染色体の存在を含み、染色体のいずれもが変化しない核型を有している。さらに、これらの細胞はＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１マーカーにそれぞれ陽性である。細胞をＳＣＩＤマウスに注入すると、内胚葉、中胚葉、および外胚葉細胞に分化するといわれている。また、ヒトあるいは霊長類胚の胚盤胞に由来するといわれる胚幹細胞株については、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ９２：７８４４−７８４８（１９９５）に論じられている。
【００１７】
このように、Ｔｈｏｍｓｏｎはヒト以外の霊長類およびヒト胚あるいは幹様細胞といわれるものおよびその生成法を開示している。しかし、その顕著な治療および診断における可能性を考えた場合、意図する移植レシピエントにとって自己由来であるヒト胚あるいは幹様細胞を生成する方法の大きな必要性はまだ存在する。
【００１８】
この点に関して、細胞移植によって治療できると思われるヒトの疾患が数多く同定されている。例えば、パーキンソン病は黒質内のドパミン作動性ニューロンの変性に起因する。パーキンソン病の標準的治療法には、ドパミンの消失を一時的に改善するＬ−ＤＯＰＡの投与が含まれるが、重度の副作用を引き起こし、最終的には疾患の進行を回復させることはできない。パーキンソン病の異なる治療法は、数多くの脳疾患および中枢神経損傷の治療への幅広い応用性が期待され、動物の胎児あるいは新生児の細胞あるいは組織の成人脳への移植を含んでいる。脳の様々な領域より採取した胎児ニューロンは、成人脳に組み込まれることが可能である。このような移植片は、実験動物に対して実験的に誘発した、複合認知機能を含む行動欠損を軽減することが証明されている。ヒト臨床試験の最初の試験結果も有望であった。しかし、流産により得られるヒト胎児細胞あるいは組織の供給は極めて限られている。さらに、流産した胎児から細胞あるいは組織を採取することには激しい異論がある。
【００１９】
現在該患者から「胎児様」細胞を生成できる方法はない。さらに、同種移植組織片の確保は容易ではなく、また同種移植片および異種移植片組織は移植片拒絶反応を被る。さらに、移植前の細胞あるいは組織に遺伝子的修飾を施すことが有益と思われる場合もある。しかし、このような修飾が望ましい細胞あるいは組織の多くは、培養時に良好に分割せず、大部分の遺伝子変異の型は急速に分裂する細胞を必要とする。
【００２０】
このため、移植および細胞および遺伝子治療における使用を目的とした、ヒト胚あるいは幹様未分化細胞の供給には、明らかな技術上の必要性がある。
【００２１】
（発明の目的）
本発明の目的は、胚あるいは幹様細胞を生成する新規かつ改善された方法の提供である。
【００２２】
本発明のより具体的な目的は、哺乳動物あるいはヒトの細胞核の、種の異なる除核卵母細胞への移植を包含する、胚あるいは幹様細胞を生成する新規かつ改善された方法の提供である。
【００２３】
本発明のもう１つの具体的な目的は、ヒト以外の霊長類あるいはヒトの細胞核の、例えば有蹄類、ヒトあるいは霊長類の除核卵母細胞などの動物あるいはヒトの除核卵母細胞への移植を包含する、ヒト以外の霊長類あるいはヒト胚あるいは幹様細胞を生成する新規の方法を提供することである。
【００２４】
本発明のもう１つの目的は、ドナー細胞あるいは細胞核と互換性のある（同種の）卵母細胞、割球あるいはその他の胚細胞から細胞質を誘導することにより、異種間核移植の効率を高めることである。
【００２５】
本発明のより具体的な目的は、細胞質がドナー細胞あるいは細胞核と互換性のある（同種あるいは近縁種の）１個あるいはそれ以上の未成熟卵母細胞より細胞質を誘導することにより、異種間核移植の効率を高めることである。このような未成熟卵母細胞は、細胞質の採取およびレシピエント除核卵母細胞への細胞質の導入の前に、任意にｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟、および／あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性化を行っても良い。
【００２６】
本発明のもう１つの目的は、ドナー細胞と同種あるいは近縁種（同種が好ましい）に由来するミトコンドリアＤＮＡを、除核前あるいは除核後に、核移植に使用する異種の卵母細胞に添加、あるいは核移植ユニットに添加（ドナー細胞の誘導後）して異種間核移植の効率を高めることである。
【００２７】
さらに本発明のもう１つの目的は、除核した体性細胞（例えば除核したヒト体性細胞）（核体）を、活性化した、あるいは活性化していない、除核あるいは除核しない、例えばウシなどの異種卵母細胞に融合させるか、あるいは活性化したあるいは活性化していない開裂してもしなくともよい異種間ＮＴユニットと融合することにより、異種間核移植の効率を高めることである。
【００２８】
本発明のもう１つの目的は、例えば成人細胞などの、ヒト以外の霊長類あるいはヒトの細胞核の、ヒト以外の霊長類あるいはヒトの除核卵母細胞への移植を包含する、ヒト以外の霊長類あるいはヒトの系統欠損胚あるいは幹様細胞の新規の製造法を提供することであり、この場合、このような細胞は、例えばアンチセンスあるいはリボジームテロメラーゼ遺伝子の発現の操作など、遺伝子的に加工を受けて、個別の細胞系統への分化が不可能となっているか、あるいは修飾を受けて細胞が「致死的」となっているために、産子が生じなくなっている。
【００２９】
さらに本発明のもう１つの目的は、核移植の効率を高めること、具体的には例えばＭＨＣ Ｉファミリー、また特にＱ７および／あるいはＱ９などのＰｅｄ遺伝子などの、胚の発生を促進する遺伝子の発現をもたらすことを目的とした核移植に用いた遺伝子操作ドナー体性細胞による核移植により生成した着床前の胚の発生の促進である。
【００３０】
本発明のもう１つの目的は、ＢＡＸ，Ａｐａｆ−１などの細胞死遺伝子あるいはカプサーゼあるいはその一部、あるいはデメチラーゼをコードするアンチセンスＤＮＡの発現をもたらす核移植前あるいは核移植後の導入遺伝子の導入により、例えば異種間核移植胚などの核移植胚の生成を促進することである。
【００３１】
さらに本発明のもう１つの目的は、ＩＶＰによる核移植胚の生成、より具体的には、例えばＢｃｌ−２あるいはＢｃｌ−２ファミリー遺伝子などのアポトーシスを阻害する遺伝子の発現をもたらすＤＮＡ構成の導入、および／あるいは胚発生の初期段階でアポトーシスを誘導する遺伝子に特異的なアンチセンスリボジームの発現などにより、核移植に用いるドナー細胞の遺伝子を変化させてアポトーシスに耐性とすることによる核移植胚の生成の促進である。
【００３２】
さらに本発明のもう１つの目的は、例えばＧ１期などの特定の細胞周期にあるドナー細胞の改善された選別法によって、ＤＮＡ構成が、例えば視覚化（例えば蛍光タグなど）マーカー蛋白などの検出可能なマーカーと結合した特定のサイクリンをコードするようなドナー細胞の遺伝子操作による核移植の効率を改善することである。
【００３３】
また本発明の目的は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成した胚を、好ましくは１種類あるいはそれ以上のカプサーゼ阻害物質である、１種類あるいはそれ以上のプロテアーゼ阻害物質の存在下で培養してアポトーシスを阻害することにより、こうした胚の発生を促進することである。
【００３４】
本発明のもう１つの目的は、動物あるいはヒト細胞核の異種の除核卵母細胞への移植により生成した胚あるいは幹様細胞を提供することである。
【００３５】
本発明のより具体的な目的は、霊長類あるいはヒト細胞核の、例えばヒト、霊長類あるいは有蹄類除核卵細胞などの除核動物卵母細胞への移植により生成した霊長類あるいはヒト胚あるいは幹様細胞を提供することである。
【００３６】
本発明のもう１つの目的は、このような胚あるいは幹様細胞を治療あるいは診断目的で使用することである。
【００３７】
本発明の具体的な目的は、このような霊長類あるいはヒト胚あるいは幹様細胞を、細胞、組織あるいは臓器の移植が治療上あるいは診断上有益である何らかの疾患の治療あるいは診断を目的として使用することである。
【００３８】
本発明のもう１つの具体的な目的は、本発明に従って生成した胚あるいは幹様細胞を、分化細胞、組織あるいは臓器の生成を目的として使用することである。
【００３９】
本発明のより具体的な目的は、本発明に従って生成した霊長類あるいはヒト胚あるいは幹様細胞を、ヒト分化細胞、組織あるいは臓器の生成を目的として使用することである。
【００４０】
本発明のもう１つの具体的な目的は、本発明に従って生成した胚あるいは幹様細胞を、例えば遺伝子治療の用途を有する、遺伝子操作したあるいは形質転換した分化ヒト細胞、組織あるいは器官の生成に用いることができる細胞より構成される、遺伝子操作した胚あるいは幹様細胞の生成を目的として使用することである。
【００４１】
本発明のもう１つの具体的な目的は、本発明に従ってｉｎ ｖｉｔｒｏで生成した胚あるいは幹様細胞を、例えば細胞の分化および薬物の試験などのための分析を目的として使用することである。
【００４２】
本発明のもう１つの目的は、本発明に従って生成した胚あるいは幹様細胞より生成した同系の細胞、組織あるいは臓器の利用を具備する、改善された移植療法を提供することである。このような治療法は、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄損傷、多発性硬化症、筋ジストロフィー症、糖尿病、肝疾患、心疾患、軟骨の置換、熱傷、血管疾患、尿路疾患の他とりわけ免疫欠損、骨髄移植、癌などを含む疾患および損傷の治療を例として含んでいる。
【００４３】
本発明のもう１つの目的は、本発明に従って生成した、形質転換あるいは遺伝子操作胚あるいは幹様細胞を、遺伝子治療、特に上で特定した疾患および損傷の治療および／あるいは予防を目的として使用することである。
【００４４】
本発明のもう１つの目的は、本発明に従って生成した胚あるいは幹様細胞、あるいは本発明に従って生成したトランスジェニックあるいは遺伝子操作胚あるいは幹様細胞を、核移植用の核ドナーとして使用することである。
【００４５】
さらに本発明のもう１つの目的は、本発明に従って生成した遺伝子操作ＥＳ細胞を、例えばヒト以外の霊長類、げっ歯類、有蹄類などのトランスジェニック動物の生成を目的として使用することである。このようなトランスジェニック動物は、ヒト疾患の動物モデルなどの生成を目的として、あるいは治療用あるいは栄養薬学用などの所望のポリペプチドの生成を目的として使用することができる。
【００４６】
本発明の前述およびその他の目的、長所および特徴を以下で明らかにすれば、後述の発明の好ましい態様の詳細な説明、および添付した請求項を参照することにより、本発明の性質をさらに明らかに理解することができる。
【００４７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、胚あるいは幹様細胞、より具体的には、核移植によるヒト以外の霊長類あるいはヒトの胚あるいは幹様細胞の新規生成法を提供する。標題の出願においては、核移植あるいはＮＴは互換的に使用される。
【００４８】
上述のように、核移植による胚あるいは幹様細胞の分離の実現については報告されていない。むしろ、これまでに報告されたＥＳ様細胞の分離は、受精胚由来のものであった。また、遺伝的に類似していない種の細胞あるいはＤＮＡ、あるいはより具体的には、ある種（例えばヒトなど）の成体細胞あるいはＤＮＡおよび他の非近縁種の卵母細胞による核移植の成功は報告されていない。むしろ、例えばウシ−ヤギおよびウシ−ヤギュウなどの近縁種の細胞の融合により生成した胚について報告されているが、これらはＥＳ細胞を生成しなかった。（Ｗｏｌｆｅ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，３３（１）：３５０（１９９０））。また、非胎児組織源に由来する霊長類あるいはヒトＥＳ細胞の生成法も報告されていない。むしろ、現在入手できる限られたヒト胎児細胞および組織は、自然流産組織および流産胎児より入手あるいは由来しなければならない。
【００４９】
また、本発明以前には、異種間核移植によって胚あるいは幹様細胞を得た者はいなかった。
【００５０】
非常に予測し難いことであったが、本発明者は、ヒト胚あるいは幹様細胞および細胞コロニーがヒト細胞核の移植によって得られること、例えば分化した成人細胞を核移植（ＮＴ）ユニットの生成に使用する除核した動物卵母細胞に移植し、これらの細胞を培養するとヒト胚および幹様細胞あるいは細胞コロニーが生成することなどを発見した。この結果は、分化したドナー細胞あるいは核を、遺伝的に類似していない種の除核した卵母細胞に導入する、例えば分化した動物あるいはヒト細胞の核、例えば成体細胞を他種の動物の除核した卵に移植するなどして、適切な条件下で培養すれば胚あるいは幹様細胞及び細胞コロニーを生成する細胞を含む核移植ユニットを生成することを含む、有効な異種間核移植の最初の証明であるため、非常に驚異的なものである。
【００５１】
レシピエント卵母細胞は、好ましくは（ｉ）ドナー細胞あるいは細胞核および（ｉｉ）互換性のあるミトコンドリアＤＮＡあるいは互換性のある細胞質のうち少なくとも１つを組み合わせて移植する。本明細書中の「互換性がある」という用語は、ミトコンドリアＤＮＡあるいは細胞質がドナー細胞あるいは細胞核と同種、あるいはドナー細胞あるいは細胞核と極めて近い種の細胞に由来することを意味する。例えば、ドナー細胞あるいは細胞核がヒト細胞あるいは細胞核である場合、ミトコンドリアＤＮＡあるいは細胞質はヒト由来、あるいは例えばチンパンジー、ゴリラ、あるいはヒヒなどの高等霊長類のものとなるであろう。同様に、ドナー細胞あるいは細胞核がウシ細胞あるいは細胞核であれば、互換性のある細胞質は近縁種である有蹄類、例えば水牛などの細胞質となるであろう。最も好ましくは、互換性のあるミトコンドリアＤＮＡおよび／あるいは細胞質がドナーと同種の細胞に由来し、また最も好ましくは、ドナー細胞あるいは細胞核と同一の個体に由来する。
【００５２】
好ましい実施態様では、細胞質は未熟卵母細胞あるいは割球に由来し、このような未熟卵母細胞より細胞質を採取する前に、これを適宜ｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟および／あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化させてもよい。ヒト卵母細胞を含む卵母細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化する方法については後述する。同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで卵母細胞を成熟させる方法は文献に報告されている。
【００５３】
好ましくは、ＥＳ様細胞の生成に用いられているＮＴユニットは、細胞の個数が少なくとも２〜４００個となる大きさ、好ましくは４〜１２８個、最も好ましくは少なくとも約５０個となる大きさまで培養する。
【００５４】
本発明では、胚あるいは幹様細胞は本発明に従って生成した細胞を意味する。本明細書では、このような細胞が代表的に生成される方法、すなわち異種間核移植による生成から、これを幹細胞ではなく幹様細胞と呼ぶ。これらの細胞は通常の幹細胞と類似した分化能を有することが予測されるが、その生成方法によりわずかな差を有することがある。例えば、これらの幹様細胞は核移植に用いた卵母細胞のミトコンドリアを有すると思われるので、従来の胚幹細胞と同一の挙動を示さないか、あるいは形態学的に同一でない場合がある。
【００５５】
この発見は、成人細胞核の核移植、具体的にはヒトドナーの口腔より採取したヒト上皮細胞を、除核したウシ卵母細胞に移植すると、核移植ユニットを形成し、その細胞を培養するとヒト幹様あるいは胚細胞およびヒト胚あるいは幹様細胞コロニーを形成するという所見に基づいてなされた。最近この結果は、成人から採取した角化細胞を除核ウシ卵母細胞に移植して、胚盤胞およびＥＳ細胞株の生成に成功したことにより、再現された。これに基づき本発明者らは、ウシ卵母細胞とヒト卵母細胞、またおそらく一般的哺乳類卵母細胞は、胚発生中に成熟過程を経なければならず、ウシ卵母細胞がヒト卵母細胞の有効な置換物あるいは代替物として機能できるように、この過程が十分に類似しているかあるいは維持されているという仮説を立てている。明らかに、一般的な卵母細胞は自然の状態でおそらくはタンパク質あるいは核酸である因子を具備し、これが適当な条件下で胚の発生を誘発し、これらの機能は異種間で同じであるか、あるいは極めて類似している。これらの因子はＲＮＡ物質および／あるいはテロメラーゼを具備していると思われる。
【００５６】
ヒト細胞核をウシ卵母細胞に有効に移植することができるという事実に基づけば、ヒト細胞を、例えば有蹄類その他の動物などの、他の非近縁種卵母細胞に移植できると予測することは妥当である。特に、例えばブタ、ヒツジ、馬、ヤギなどの他の有蹄類の卵母細胞がふさわしいはずである。また例えばチンパンジー、マカク類、ヒヒ、ゴリラ、アカゲザルなどの他の霊長類に由来する卵母細胞、両生類、げっ歯類、ウサギ、モルモットなどの他の動物に由来する卵母細胞もふさわしいはずである。さらに、同様の方法を用いて、ヒト細胞あるいはヒト細胞核をヒト卵母細胞に移植し、生成した胚盤胞を用いてヒトＥＳ細胞を生成することも可能なはずである。
【００５７】
このため、その最も広範な実施態様においては、本発明は動物あるいはヒト細胞核、または動物あるいはヒト細胞の、ドナー細胞核と異なる種の（好ましくは除核した）卵母細胞への、注入あるいは融合による移植、さらに胚あるいは幹様細胞および／あるいは細胞培養を得るのに用いることのできる細胞を含んだＮＴユニットを生成することを目的とした前記レシピエント卵母細胞への、好ましくはドナー細胞あるいは細胞核と同種である互換性のあるミトコンドリアＤＮＡおよび／あるいは細胞質の注入を適宜含む。除核（卵母細胞内の細胞核の除去）は核移植の前あるいは核移植後に実施することができる。例えば本発明は、有蹄類細胞核あるいは有蹄類細胞の、注入あるいは融合による、例えば他の有蹄類あるいは非有蹄類などの異種の除核卵母細胞への移植を含むことがあり、この注入あるいは融合により細胞および／あるいは細胞核を結合してＮＴユニットを生成し、次に、好ましくは少なくとも約２〜２００個、より好ましくは４〜１２８個、最も好ましくは少なくとも約５０個の細胞を含む多細胞ＮＴユニットを得るのに適した条件下で培養する。このようなＮＴユニットの細胞は、培養時に胚あるいは幹様細胞あるいは細胞コロニーを生成するのに用いることができる。
【００５８】
本発明の好ましい該実施態様は、ドナーヒト細胞核あるいはヒト細胞を、例えば有蹄類卵母細胞などの除核したヒト、霊長類、あるいは霊長類以外の動物の卵母細胞に、また好ましい実施態様においては、ウシ除核卵母細胞に移植することによる、ヒト以外の霊長類あるいはヒト胚あるいは幹様細胞の生成を具備している。好ましくは、除核卵母細胞に、ヒト細胞質（例えば少なくとも１個以上の未成熟あるいは成熟卵母細胞あるいは割球）を注入、あるいは核体？？？？？（除核ヒト卵母細胞あるいは割球、あるいは高等霊長類の卵母細胞あるいは割球）および／あるいはヒトミトコンドリアＤＮＡと融合せしめる。
【００５９】
一般的に、胚あるいは幹様細胞は、以下の手順からなる核移植操作により生成される：
（ｉ）ドナー細胞核源として用いる所望のヒトあるいは動物細胞を採取する（遺伝的に改変が加えられていても良い）；
（ｉｉ）例えば哺乳類、より好ましくは霊長類あるいはウシなどの有蹄類の卵母細胞源などの適当な採取源より卵母細胞を採取する；
（ｉｉｉ）前期卵母細胞から細胞内の核を除去して除核する；
（ｉｖ）ヒトあるいは動物の細胞、あるいは細胞核を、ドナー細胞あるいは細胞核と異種の除核卵母細胞に、例えば融合あるいは注入などにより移植、ただし手順（ｉｉｉ）および（ｉｖ）はどちらを先に実施しても良い；
（ｖ）生成したＮＴ生成物あるいはＮＴユニットを培養して、複数の細胞からなる構造物（識別可能な内部細胞塊を有する胚様体構造物）を生成；
（ｖｉ）前記胚から得られた細胞を培養して胚あるいは幹様細胞および幹様細胞コロニーを得る。
【００６０】
前述のように、核移植操作には、好ましくは互換性のある、すなわちドナー細胞あるいは細胞核と同種あるいは近縁種に由来するミトコンドリアＤＮＡおよび／あるいは細胞質の導入も含める。この実施はドナー細胞あるいは細胞核のレシピエント卵母細胞への導入の前でも、同時でも、あるいは後でも良い。好ましくは、互換性のある細胞質および／あるいはミトコンドリアＤＮＡは、ドナー細胞あるいは細胞核のレシピエント卵母細胞への導入後早い時点、すなわちこのような導入より約２４時間以内に、より好ましくはこのような導入より約６時間以内に、最も好ましくはこのような導入より約２〜４時間以内に導入する。
【００６１】
互換性のある細胞質の採取源には、卵母細胞から多数得ることができる未成熟卵母細胞を特に含める。例えばヒトの場合は、例えば子宮摘出術を受けた女性など同意を得たドナーの卵巣から卵母細胞を採取することができる。
【００６２】
このような未熟な卵母細胞から細胞質を採取する前に、これをｉｎ ｖｉｔｒｏで適宜成熟させる。卵母細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させる方法は、その全文を本明細書に参照文献として引用している米国特許第５，９４５，５７７号に記載されている。
【００６３】
さらに、このような未成熟の卵母細胞から細胞質を採取する前に、これをさらにｉｎ ｖｉｔｒｏで適宜活性化することができる。ヒト卵母細胞を含む卵母細胞を単為発生的に活性化させる方法は周知である。Ｉｎ ｖｉｖｏでの卵母細胞活性化法の例は、その全文を本明細書に参照文献として引用している米国出願番号Ｎｏ．０８／８８８，０５７に記載されている。Ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化させる好ましい方法には、ＤＭＡＰとイオノマイシンの使用、およびシクロヘキサミドとイオノマイシンの使用が含まれる。
【００６４】
レシピエント卵母細胞に導入する細胞質の量は、好ましくは細胞の容積を最大で５倍にし、好ましくは約２倍を上回らず、最も好ましくは約１ １／２倍を上回らない量とする。これは、互換性のある卵母細胞に由来する細胞質をレシピエント卵母細胞に注入するか、あるいはその代わりに互換性のある卵体（レシピエント卵母細胞と同種であるか、極めて近縁である種の除核卵母細胞）のレシピエント卵母細胞と融合することにより実施することができる。適宜、レシピエント卵母細胞の細胞質の全体あるいは一部を除去し、互換性のある卵体を導入する容積を増加せしめることができる。文献では、そのことに関して、適切な細胞核／細胞質の比率および細胞の容積の維持が、胚盤胞の形成および発生において重要であることが示唆されている（Ｋａｒｙｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ，Ｒｅｐｒｏｄ，Ｎｕｔｒ．Ｄｅｖｅｌ．３８（６）：６６５−６７０）。
【００６５】
本発明者らはその考えに従うことを望まないが、卵母細胞の細胞質内には胚形成を助ける、例えば核酸配列および／あるいはタンパク質などの成分が存在するという仮説があり、このような因子は系統発生的に異なる種間である程度保たれていると考えられ、種の相違は異種間核移植の有効性を妨げるほどに重要であるという理論がある。よって、本発明者らは、このような有効性の問題を、胚形成を促進する同種あるいは極めて近い種の成分を含んでいると思われる互換性のある細胞質を導入することで軽減することを意図している。
【００６６】
上記のように、互換性のある、すなわちドナー細胞あるいは細胞核と同種あるいは極めて近い種のミトコンドリアＤＮＡを導入することにより、クローン化の有効性も改善することができる。この導入の実施は、ドナー細胞あるいは細胞核の導入前でも、導入と同時でも、あるいは導入後でも可能である。本質的に、本発明のもうひとつの目的は、ドナー細胞あるいは細胞核と同種あるいは極めて近い種のミトコンドリアＤＮＡを、移植の前後、活性化の前後、および融合と開裂の前後にレシピエント卵母細胞に導入することによる、例えば異種間核移植などの核移植の有効性の改善である。好ましくは、ドナー細胞がヒト細胞であれば、ヒトミトコンドリアＤＮＡを、同じドナーに由来する例えば肝細胞および組織などから採取する。
【００６７】
ミトコンドリアの分離法は技術上周知である。ミトコンドリアは組織培養中の細胞、あるいは組織より分離することができる。個々の細胞あるいは組織は個々のドナー細胞に依存する。ミトコンドリア採取源として使用できる細胞あるいは組織の例には、線維芽細胞、上皮、肝臓、肺、角化細胞、胃、心臓、膀胱、膵臓、食道、リンパ球、単球、単核球、卵丘細胞、子宮細胞、胎盤細胞、腸細胞、造血細胞、卵母細胞、およびこのような細胞を含む組織が含まれる。
【００６８】
例えば、ミトコンドリアは組織培養細胞およびラット肝臓から分離することができる。同一のあるいは類似した操作を用いて、他の細胞および組織、すなわちヒト細胞および組織からミトコンドリアを分離することができると予測される。上記のように、好ましいミトコンドリア採取源には、ヒト肝臓組織が含まれるが、これは、こうした細胞が多数のミトコンドリアを含んでいるからである。当業者は、個別の細胞株あるいは組織に応じて、該操作に必要な改変を行うことができる。分離したＤＮＡは、所望すれば例えば密度勾配遠心法などの既知の方法でさらに精製することもできる。
【００６９】
生成した分離ミトコンドリアＤＮＡは、レシピエント卵母細胞に注入するのが好ましい。好ましくは、１個あるいは数個の細胞から分離したミトコンドリアＤＮＡを全て導入して、レシピエント卵母細胞に互換性のあるミトコンドリアＤＮＡの完全な成分を確保せしめる。好ましくは、ミトコンドリアＤＮＡは自己採取源、すなわちドナー細胞あるいは細胞核の採取源であるヒト被験者、あるいは近縁者などこの被験者と遺伝的に互換性のあるヒトから採取した細胞あるいは組織から得る。また、互換性のあるミトコンドリアを未成熟卵母細胞より採取し、互換性のある細胞質とともに導入することができる。
【００７０】
本発明で利用することのできる個別の核移植は、文献に報告されており、発明の背景の項で引用されている様々な参照文献に記載されている。特に、その全文を本明細書に参照文献として引用しているＣｈａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，４３：１８１（１９９５）：Ｃｏｌｌａｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔ Ｄｅｖ．，３８：２６４−２６７（１９９４）；Ｋｅｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５０：９３５−９３９（１９９４）；Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：６１４３−６１４７（１９９３）；ＷＯ ９４／２６８８４；ＷＯ ９４／２４２７４およびＷＯ ９０／０３４３２を参照のこと。また米国特許第４，９４４，３８４号および５，０５７，４２０号は、ウシ核移植の操作について記載している。また、いずれもその全文を本明細書に参照文献として引用しているＣｉｂｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８０：１２５６−１２５８（１９９８），米国特許第５，９４５，５７７号；ＷＯ ９７／０７６６９；ＷＯ ９７／０７６６８およびＷＯ ９６／０７７３２も参照のこと。
【００７１】
ヒト、あるいは好ましくは哺乳類細胞である動物細胞は、周知の方法により採取し、培養することができる。本発明において有用であるヒトおよび動物細胞には、例として、上皮、神経細胞、表皮細胞、角化細胞、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴリンパ球）、その他の免疫細胞、赤血球、マクロファージ、メラニン細胞、単球、単核球、幹細胞、線維芽細胞、心筋細胞、およびその他の筋肉細胞などが含まれる。さらに、核移植に用いられるヒト細胞は、皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器官、膀胱、腎臓、尿道、および他の泌尿器などの様々な臓器より得ることができる。これらは適したドナー細胞の実例である。
【００７２】
適したドナー細胞、すなわち標題の発明に有用な細胞は、身体のあらゆる細胞あるいは臓器から得ることができる。これには全ての体性細胞および胚細胞が含まれる。好ましくは、ドナー細胞あるいは細胞核は活発に分裂、すなわち非休止期にある（Ｇ１，ＳあるいはＭ細胞周期）細胞を含み、このような細胞はクローン化効率を高めると報告されている。さらにより好ましくは、このようなドナー細胞はＧ１細胞周期にある。しかし、休止期のドナー細胞（Ｇ０）も本発明の範囲内にある。例えば適切な培養条件で、血清の欠乏により、休止期細胞を採取することができる。
【００７３】
生成した胚盤胞は、その全文を本明細書に参照文献として引用しているＴｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：１１４５−１１４７（１９９８）およびＴｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９２：７５４４−７８７８（１９９５）で報告されている培養法に従い、胚幹細胞株を得るのに用いることができる。
【００７４】
一方、識別可能な内部細胞塊を有する生成した胚盤胞は、その全文を本明細書に参照文献として引用している米国特許第５，９０５，０４２号に開示された方法に従い培養することができる。この方法は、フィーダー層上での内部細胞塊の全体あるいはその一部の培養を本質的に具備し、このとき該フィーダー層との接触は培養期間を通して維持されている。この培養法は、培養を続けると培養した内部細胞塊の一部、すなわちＥＳ様の外観を有する細胞を含む培養された内部細胞塊の最外部の選択的除去をさらに具備する。次にこの細胞コロニーの最外部を、代表的には胎児線維芽細胞であるもう１つのフィーダー層上に導入する。この方法は、組織培養において未分化（胚幹）細胞、すなわちＥＳ様の形態を示し、フィーダー層より除去すると他の細胞型に分化する細胞の維持をもたらすことが判明している。
【００７５】
後述の例では、核移植ドナーとして使用される細胞はヒトドナーの口腔から採取した上皮細胞、および成人角化細胞であった。しかし、論じたように、開示された方法は他のヒト細胞あるいは細胞核に適用可能である。さらに、細胞核はヒト体性細胞からも、胚細胞からも採取することができる。
【００７６】
また、技術上既知の適当な方法を用いて、核移植前にドナー細胞を有糸分裂期で停止させることも可能である。様々な段階で細胞周期を止める方法は、その全文を参照文献として本明細書中に引用している米国特許第５，２６２，４０９号で幅広く検討されている。特に、シクロヘキサミドは有糸分裂阻害作用を有すると報告されているが（Ｂｏｗｅｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ（１９５５） Ｊ．Ｈｅｒｅｄｉｔｙ，４５：３−９）、電気パルス処理と組み合わせた場合は、成熟ウシ濾胞卵母細胞の活性化の改善に用いることもある（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，４２（Ｓｕｐｐｌ．１）：１１７）。
【００７７】
接合体遺伝子活性化はヒストンＨ４の過アセチル化を伴う。トリコスタチンＡは、ヒストンデアセチラーゼを、他の化合物と同様に可逆的に阻害することが証明されている（Ａｄｅｎｏｔ ｅｔ ａｌ，“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｈ４ ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｅｒｎａｌ ａｎｄ ｍａｔｅｒｎａｌ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｐｒｅｃｅｄｅｓ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｐｒｏｎｕｃｌｅｉ ｏｆ １−ｃｅｌｌ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ．”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ （Ｎｏｖ．１９９７）１２４（２２）：４６１５−４６２５；Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．“Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ Ａ ａｎｄ ｔｒａｐｏｘｉｎ：ｎｏｖｅｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ”Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ （Ｍａｙ，１９９５） １７（５）：４２３−４３０）。
【００７８】
例えば、酪酸もヒストンデアセチラーゼを阻害することによりヒストン過アセチル化を惹起すると考えられている。酪酸は、全般的に遺伝子の発現を変化せしめ、ほとんど全ての場合これを細胞培養に添加することにより細胞の成長を止めると見られる。細胞の成長停止を目的とした酪産の使用は、その全文を本明細書に参照文献として引用している米国特許第５，６８１，７１８号に記載されている。よってドナー細胞は、融合前にトリコスタチンＡあるいはその他の適切なデアセチラーゼ阻害物質に曝露するか、あるいはゲノムを活性化する前にこの様な化合物を培地に添加しても良い。
【００７９】
さらに、ＤＮＡの脱メチル化は、転写因子がＤＮＡ調節配列に適切に接触するための要件と考えられている。着床前の胚の８細胞期〜胚盤胞期におけるＤＮＡ全体の脱メチル化については、すでに報告されている（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．＆ Ｄｅｖ．，４７（４）：４２１−４２９）。また、Ｊａｅｎｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９７）は、５−アザシチジンを用いて細胞内のＤＮＡのメチル化レベルを低下させることにより、転写因子のＤＮＡ調節配列への接触が増大する可能性があると報告している。よって、融合前のドナー細胞を５−アザシチジン（５−Ａｚａ）に曝露するか、あるいは８細胞期〜胚盤胞期の培地に５−Ａｚａを添加しても良い。これに替えて、ＤＮＡを脱メチル化する他の既知の方法を用いても良い。
【００８０】
核移植のレシピエントとして、あるいは互換性のある細胞質の回収に用いられる卵母細胞は、哺乳類および両生類を含む動物から採取することができる。卵母細胞の採取に適した哺乳動物には、ヒツジ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヤギ、モルモット、マウス、ハムスター、ラット、霊長類、ヒトなどが含まれる。好ましい該実施態様では、霊長類、あるいは例えばウシなどの有蹄類より卵母細胞を採取する。ヒト卵母細胞の場合、適当な採取源には、子宮摘出術を受ける患者など同意を得た女性から採取した卵巣が含まれる。
【００８１】
卵母細胞の分離法は技術上周知である。これは、本質的に例えばウシなどの哺乳類あるいは両生類の卵巣あるいは生殖管からの卵母細胞の分離を具備する。ウシ卵母細胞が容易に入手できる採取源は、屠畜場から得られる材料である。
【００８２】
遺伝子操作、核移植およびクローン化などの技術を成功裏に使用するために、核移植のレシピエントとして使用できるようになるまで卵母細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させるのが好ましい。この操作は、全般的に、例えば屠畜場より入手したウシ卵巣などの動物の卵巣より未成熟（第Ｉ相）の卵母細胞を採取し、受精あるいは除核前に卵母細胞を成熟培地内で成熟させて、卵母細胞を、ウシ卵母細胞の場合は一般的に吸引後１８〜２４時間で起こる減数第二分裂中期とする必要がある。本発明の用途では、この期間は「成熟期間」として知られる。本明細書で期間の計算に用いられているように、「吸引」は、卵胞からの未成熟卵母細胞の吸引を意味する。
【００８３】
さらに、ｉｎ ｖｉｖｏで成熟させた減数第二分裂中期卵母細胞は、核移植術で成功裏に使用されている。例えば、成熟減数第二分裂中期卵母細胞は、非過剰排卵あるいは過剰排卵雌ウシあるは若雌ウシから、発情開始、あるいはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）あるいは類似のホルモンの注射より３５〜４８時間後に外科的に採取することができる。また、例えばヒツジ、ヤギ、ブタなどの他の種からもｉｎ ｖｉｖｏ成熟卵母細胞を採取することができる。
【００８４】
除核時および核移植時の卵母細胞の成熟段階は、ＮＴ法の成功にとって重要であると報告されている。（例えばＰｒａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，４８，１−８，１９９１などを参照のこと）。全般的に、過去の哺乳類胚クローン化の成功例では、減数第二分裂中期においては卵母細胞は導入した核を受精精子と同様に扱えるまでに「活性化」が可能で、あるいは十分に「活性化」されると考えられるので、この段階の卵母細胞がレシピエント卵母細胞として使用された。家畜、特にウシでは、卵母細胞の活性化期は一般的に吸引より約１６〜５２時間後、好ましくは吸引より約２８〜４２時間後である。
【００８５】
例えば、未成熟卵母細胞は、Ｓｅｓｈａｇｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，４０．５４４−６０６，１９８９に報告されているように、ＨＥＰＥＳ緩衝化ハムスター胚培養培地（ＨＥＣＭ）内で洗浄し、３９℃でウシ胎児血清を１０％含んだ５０μｌの組織培養培地（ＴＣＭ）１９９に黄体形成ホルモン（ＬＨ）および卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）などの適切なゴナドトロピンを含ませた成熟培地数滴の中に移し、軽量パラフィンあるいはシリコン層の下にエストラジオールを入れる。
【００８６】
代表的には約１０〜４０時間、また好ましくは約１６〜１８時間であり、ｉｎ ｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれで行っても良い一定の成熟期間の後で、卵母細胞を除核するのが好ましいであろう。除核の前に、好ましくは卵母細胞を取り出して１ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼを含んだＨＥＣＭに入れたのち卵丘細胞を摘出する。これは、内径の極めて小さいピペットによる反復ピペッティングか、あるいは短時間の振盪により行う。次に皮膜を取った卵母細胞を極体によってスクリーニングし、極体があれば減数第二分裂中期卵母細胞であると判定してこれを選択し、引き続き核移植に使用する。代表的にはこの時期に除核を実施する。しかし、ドナー細胞核は内生細胞核と容易に識別できるので、除核の実施はドナー細胞あるいは細胞核の導入前でも導入後でも良い。
【００８７】
除核は、その全文を本明細書に参照文献として引用している米国特許第４，９９４，３８４号に記載されているような既知の方法で実施することができる。例えば、減数第二分裂中期卵母細胞は、迅速除核用に適宜７．５μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢを含んだＨＥＣＭに入れるか、あるいは、例えばＣＲ １ａａに１０％発情期雌ウシ血清を加えたものなどの適当な培地に入れても良く、その後好ましくは２４時間未満経過後、より好ましくは１６〜１８時間後に除核してもよい。
【００８８】
除核は、マイクロピペットを用いた顕微手術により、極体および付属する細胞質を除去して行うことができる。次に卵母細胞をスクリーニングし、除核に成功した卵母細胞を同定することができる。このスクリーニングは、１μｇ／ｍｌの３３３４２ Ｈｏｅｃｈｓｔ染色剤のＨＥＣＭ溶液で卵母細胞を染色し、卵母細胞に紫外線を１０秒未満照射して観察することで実施できる。除核に成功した卵母細胞は、次に適切な培地に移すことができる。
【００８９】
本発明では、レシピエント卵母細胞は、代表的にはｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟開始より約１０〜約４０時間後の間、より好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟開始より約１６〜約２４時間後、最も好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟開始より約１６〜１８時間後に除核する。除核の実施は核移植前でも、核移植と同時でも、あるいは核移植後でもよい。また、除核の実施は活性化の前でも、活性化の後でも、あるいは活性化と同時でも良い。
【００９０】
代表的には除核した卵母細胞と異種である１個の動物あるいはヒト細胞あるいはその細胞核は、その後代表的には除核されているＮＴユニットの生成を目的として用いられる卵母細胞の囲卵腔に移植する。しかし、その代わりに、核移植後に内生核の除去を実施しても良い。動物あるいはヒト細胞あるいは細胞核および除核した卵母細胞は、技術上既知の方法に従いＮＴユニットを生成することを目的として用いられる。例えば、細胞を電気融合法で融合してもよい。電気融合は、原形質膜を一過的に破壊するのに十分な電気パルスを与えて行う。原形質膜は速やかに修復されるため、この原形質膜の破壊はきわめて短時間である。本質的に、隣接する２枚の膜の破壊が誘導されれば、修復時に脂質２層膜が混合し、２個の細胞の間に小さなチャネルが開くであろう。このような小さな開口部は熱力学的に不安定であるため、２個の細胞が１つになるまで拡大する。この過程についての更なる議論についての参照文献は、Ｐｒａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．による米国特許第４，９９７，３８４号（その全文を参照文献として本明細書に引用）である。例えばショ糖、マンニトール、ソルビトール、およびリン酸緩衝化溶液を含む様々な電気融合培地を用いることができる。センダイウイルスを細胞融合誘導物質として用いて融合を行うこともできる（Ｇｒａｈａｍ，Ｗｉｓｔｅｒ Ｉｎｏｔ．Ｓｙｍｐ．Ｍｏｎｏｇｒ．９，１９，１９６９）。
【００９１】
また一部の例（例えばドナー細胞核が小さい場合など）では、細胞核を電気穿孔融合法を用いることなく、直接卵母細胞に注入するのが好ましいであろう。このような方法は、Ｃｏｌｌａｓ ａｎｄ Ｂａｒｎｅｓ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３８：２６４−２６７（１９９４）に開示されており、その全文が本明細書中に参照文献として引用されている。
【００９２】
好ましくは、ヒトあるいは動物細胞および卵母細胞を、卵母細胞の成熟開始より約２４時間後に９０〜１２０Ｖの電気パルスを１５μ秒間適用して５００μｍチャンバー内で電気融合する。融合後、生成した融合ＮＴユニットは、好ましくは活性化するまで、例えば上記で指定した培地などの適切な培地内に入れておく。代表的には、この後すぐに活性化を、代表的には２４時間未満経過後、好ましくは４〜９時間後に実施するであろう。しかし、核移植の前あるいは直前（同時）に、除核されている、あるいはされていないレシピエント卵母細胞を活性化することも可能である。例えば、核移植より約１２時間前〜核移植より約２４時間後に活性化を実施してもよい。より代表的には、核移植と同時あるいは直後、例えば約４〜９時間後などに活性化を実施する。
【００９３】
ＮＴユニットは既知の方法で活性化してよい。このような方法には、例えば低温とするか、あるいは実際に低温のショックをＮＴユニットに実質的に適用することによる、亜生理的温度でのＮＴユニットの培養が含まれる。これは、胚が通常曝露されている生理的温度条件よりも低温である室温でＮＴユニットを培養することにより最も簡便に実施できる。
【００９４】
一方、既知の活性化物質により活性化を実施することができる。例えば、受精時の精子の卵母細胞への進入によって融合前の卵母細胞が活性化されることにより、核移植後のウシの生存子妊娠が増加し、かつ遺伝的に同一の子ウシが複数得られることが証明されている。また、電気的および化学的ショック、あるいはシクロヘキサミド処理などの処理も、融合後のＮＴ胚の活性化を目的として用いることができる。適切に卵母細胞を活性化する方法は、その全文が本明細書中に参照文献として引用されている、Ｓｕｓｋｏ−Ｐａｒｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，に対する米国特許第５，４９６，７２０号の標題である。
【００９５】
例えば、卵母細胞の活性化は同時に行っても、順に行ってもよく：
（ｉ）卵母細胞内の２価陽イオンの濃度を高め、
（ｉｉ）卵母細胞内の細胞蛋白のリン酸化を低下させる。
【００９６】
これは、全般的に、卵母細胞の細胞質内に、例えばマグネシウム、ストロンチウム、バリウムあるいはカルシウムなどの２価の陽イオンを、例えばイオノフォアの形などで導入して実施されるであろう。２価陽イオンレベルを上昇せしめる方法には、電気ショックの使用、エタノール処理、およびケージドキレーター処理が含まれる。
【００９７】
リン酸化は、例えば６−ジメチルアミノプリン、スタウロスポリン、２−アミノプリン、およびスフィンゴシンなどのセリン−トレオニンキナーゼ阻害物質などのキナーゼ阻害物質の添加などによる既知の方法で低下せしめてもよい。
【００９８】
一方、細胞蛋白のリン酸化は、例えばフォスファターゼ２Ａおよびフォスファターゼ２Ｂなどのフォスファターゼを卵母細胞内に導入して阻害してもよい。
【００９９】
以下に具体的な活性化法を列挙する。
１． イオノマイシンおよびＤＭＡＰによる活性化
１− イオノマイシン（５μＭ）および２ｍＭ ＤＭＡＰの溶液に卵母細胞を４分間入れる；
２− ＤＭＡＰを２ｍＭ含む培地に該卵母細胞を移し、４時間置く；
３− ４回すすいだ後培養する。
２． イオノマイシンＤＭＡＰおよびロスコビチンによる活性化
１− イオノマイシン（５μＭ）および２ｍＭ ＤＭＡＰ溶液に卵母細胞を４分間入れる；
２− 該卵母細胞をＤＭＡＰ ２ｍＭおよびロスコビチン２００μＭを含んだ培地に移し、３時間置く；
３− ４回すすいだ後培養する。
３． イオノマイシン曝露後のサイトカラシンおよびシクロフォスファミドによる活性化
１− 卵母細胞をイオノマイシン（５μＭ）中に４分間入れる；
２− 卵母細胞を、サイトカラシンＢ ５μｇ／ｍｌおよびシクロヘキサミド５μｇ／ｍｌを含んだ培地に移し、５時間置く；
３− ４回すすいだ後培養する。
４． 電気パルスによる活性化
１− １００μＭ ＣａＣｌ２を含んだマンニトール培地に卵を入れる；
２− １．０ ｋＶｃｍ−１のパルスを２０μ秒間、各パルス間の間隔を２２分として３回通電する；
３− 卵母細胞を、サイトカラシンＢ ５μｇ／ｍｌを含んだ培地に移し、３時間置く。
５． エタノール曝露後のサイトカラシンおよびシクロヘキサミドによる活性化
１− 卵母細胞を７％エタノール中に１分間入れる；
２− 卵母細胞を、サイトカラシンＢ ５μｇ／ｍｌおよびシクロヘキサミド５μｇ／ｍｌを含んだ培地に移し、５時間置く；
３− ４回すすいだ後培養する。
６． アデノフォスチンのマイクロインジェクションによる活性化
１− 卵母細胞に、アデノフォスチン１０μＭを含んだ溶液を１０〜１２ｐｌ注入する；
２− 卵母細胞を培養する。
７． 精子因子のマイクロインジェクションによる活性化
１− 卵母細胞に、例えば霊長類、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、マウス、ラット、ウサギ、あるいはハムスターなどから分離した精子因子を１０〜１２ｐｌ注入する。
２− 卵母細胞を培養する
８． 組換え精子因子のマイクロインジェクションによる活性化
９． ＤＭＡＰ曝露後のシクロヘキサミドおよびサイトカラシンＢによる活性化
代表的には成熟の２２〜２８時間後に、卵母細胞あるいはＮＴユニットを約２ｍＭのＤＭＡＰ中に約１時間入れ、その後サイトカラシンＢ ５μｇ／ｍｌおよびシクロヘキサミド２０μｇ／ｍｌ中で２〜１２時間、好ましくは約８時間インキュベーションする。
【０１００】
上記の活性化プロトコルは、例えば霊長類あるいはヒトドナー細胞あるいは卵母細胞の使用を含む操作などの核移植操作に用いられているプロトコルの例である。しかし、上記の活性化プロトコルは、ドナー細胞および核が、例えばヒツジ、ヤギュウ、ウマ、ヤギ、ウシ、ブタなどの有蹄類由来で、かつ／あるいは卵母細胞が例えばヒツジ、ブタ、ヤギュウ、ウマ、ヤギ、ウシのほか他の種類の有蹄類由来のいずれかあるいは両者である場合に使用できる。
【０１０１】
前述のように、活性化の実施は、核移植前でも、核移植と同時でも、あるいは核移植後でもよい。活性化は、一般的には核移植および融合の約４０時間前〜核移植および融合の約４０時間後に、より好ましくは核移植および融合の約２４時間前〜約２４時間後に、最も好ましくは核移植および融合の約４〜９時間前〜核移植および融合の約４〜９時間後に実施する。活性化は、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ ｖｉｖｏで卵母細胞成熟後あるいは直前直後、例えばほぼ同時あるいは成熟より約４０時間以内などに、より好ましくは成熟より約２４時間以内に実施する。
【０１０２】
活性化されたＮＴユニットは適切なｉｎ ｖｉｔｒｏ培地において、胚あるいは幹様細胞および細胞コロニーが生成するまで培養することができる。胚の培養および成熟に適した培地は技術上周知である。ウシ胚の培養および維持に用いられる既知の培地の例には、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１０＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ），Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ−１９９（ＴＣＭ−１９９）＋１０％ウシ胎児血清、Ｔｙｒｏｄｅｓ−Ａｌｂｕｍｉｎ−Ｌａｃｔａｔｅ−Ｐｙｒｕｖａｔｅ（ＴＡＬＰ），Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）、Ｅａｇｌｅ’ｓ ａｎｄ Ｗｈｉｔｔｅｎｓ’ｓ ｍｅｄｉａが含まれる。卵母細胞の採取と維持に最も多く用いられる培地の１つはＴＣＭ−１９９、およびウシ胎児血清、新生児血清、発情牝ウシ血清、子ヒツジ血清あるいは去勢ウシ血清などの血清の１〜２０％添加物である。好ましい維持培地にはＥａｒｌ ｓａｌｔ、１０％ウシ胎児血清、０．２Ｍａピルビン酸、および５０μｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシンを含むＴＣＭ−１９９が含まれる。上記の培地は、いずれも、顆粒層細胞、卵管細胞、ＢＲＬ細胞および子宮細胞およびＳＴＯ細胞などの様々な種類の細胞による共培養にも使用できる。
【０１０３】
特に、着床前期および着床期中のヒト子宮内膜上皮細胞は白血病阻害因子（ＬＩＦ）を分泌する。このため、培地へのＬＩＦの添加は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける再構築された胚の発生の促進において重要となるであろう。ＬＩＦの胚あるいは幹様細胞培養への使用については、その全文が本明細書中に参照文献として引用されている米国特許第５，７１２，１５６号に記載されている。
【０１０４】
もう１つの維持培地については、その全文が本明細書中に参照文献として引用されている、Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｓ Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，に対する米国特許第５，０９６，８２２号に記載されている。この胚培地の名称はＣＲ１であり、胚を維持するのに必要な栄養素を含んでいる。ＣＲ１はＬ−酪酸ヘミカルシウムを１．０ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは１．０ｍＭ〜５．０ｍＭ含んでいる。Ｌ−酪酸ヘミカルシウムは、Ｌ−酪酸にヘミカルシウム塩が結合したものである。
【０１０５】
また、培養ヒト胚細胞の維持に適した培地については、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：１１４５−１１４７（１９９８）およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９２：７８４４−７８４８（１９９５）に記載されている。さらに、該ＮＴユニットは腹水、羊水、硝子体／房水およびリンパ液などの生物学的液体で培養することもできる。
【０１０６】
その後に、培養した１つあるいは複数のＮＴユニットは、好ましくは洗浄し、その後例えばＣＲＩａａ培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１０，Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ−１９９（ＴＣＭ−１９９）、Ｔｙｒｏｄｅｓ−Ａｌｂｕｍｉｎ−Ｌａｃｔａｔｅ−Ｐｙｒｕｖａｔｅ（ＴＡＬＰ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）、Ｅａｇｌｅ’ｓ、あるいは好ましくは１０％ＦＣＳを含むＷｈｉｔｔｅｎｓ’ｓ培地などの、上記で指定した培地などの適切な培地に移す。このような培養は、好ましくは適切な集密化フィーダー層を含んだウェルプレート内で実施する。適切なフィーダー層には、例えば有蹄類由来の線維芽細胞および子宮上皮細胞、ニワトリ線維芽細胞、ネズミ科（例えばマウスあるいはラット）線維芽細胞、ＳＴＯおよびＳＩ−ｍ２２０フィーダー細胞株、およびＢＲＬ細胞などの、線維芽細胞および上皮細胞が例として含まれる。
【０１０７】
好ましい該実施態様では、フィーダー細胞はマウス胚線維芽細胞を具備している。適切な線維芽細胞のフィーダー層を調製する方法は、後述の例に記載されており、十分に通常の技術者の熟練の範囲内である。
【０１０８】
該ＮＴユニットは、該ＮＴユニットが胚幹様細胞あるいは細胞コロニーの生成を目的として使用できる細胞を採取するのに適した大きさに達するまで、該フィーダー層上で培養する。これらのＮＴユニットは、好ましくは細胞数が少なくとも約２〜４００個、より好ましくは約４〜１２８個、最も好ましくは少なくとも約５０個となる大きさに達するまで培養する。当該培養は、適切な条件下、すなわち約３８．５℃でＣＯ２濃度５％とし、成長を適正化するために、代表的には２〜５日ごとに、好ましくは約３日ごとに培地を交換しながら実施する。
【０１０９】
ヒト細胞／除核ウシ卵母細胞由来のＮＴユニットの場合は、代表的には約５０個であるＥＳ細胞コロニーを生成するのに十分な細胞が、卵母細胞活性化より約１２日後に採取される。しかし、これは核ドナーとして用いる個々の細胞、個々の卵母細胞の種、および培養条件によって異なることがある。当業者は、望ましい十分な個数の細胞が得られた場合、培養されたＮＴユニットの形態によって、肉眼で容易に確認できる。
【０１１０】
ヒト／ヒト核移植胚、あるいはヒト以外の霊長類ドナーあるいは卵母細胞を用いて生成したその他の胚の場合、組織培養中でヒトあるいは他の霊長類細胞を維持するのに有用であることが知られている培地を用いるのが有益であると思われる。ヒト胚培養に適した培地の例には、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄ．，１３（１）：１６９−１７７（１９９８）に報告された培地、いずれも、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａより入手可能なＰ１−カタログ＃９９２４２培地、およびＰ−１カタログ＃９９２９２培地、およびその全文が本明細書中に参照文献として引用されているＴｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）および（１９９５）によって使用されている培地が含まれる。
【０１１１】
もう１つの好ましい培地は、ＡＣＭ＋ウリジン＋ブドウ糖＋ＬＩＦ １０００ＩＵを具備する。
【０１１２】
さらに適当な培地の他の例には、腹水、硝子体／房水、羊水およびリンパ液などの自然に発生する生物学的液体が含まれる。
【０１１３】
上述のように、本発明で使用する細胞は、好ましくは哺乳類体性細胞を、最も好ましくは細胞が活発に増殖する（非静止期）哺乳類細胞培養に由来する細胞を具備している。特に好ましい実施態様では、所望のＤＮＡ配列の追加、欠失あるいは置換によってドナー細胞が遺伝的に修飾されている。例えば、ヒト、霊長類あるいはウシなどに由来する角化細胞あるいは線維芽細胞などのドナー細胞は、例えば治療用ポリペプチドなどの所望の遺伝子産物の発現をもたらすＤＮＡ構成に形質転換あるいは変換することができる。その例には、例えばＩＧＦ−Ｉ，ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン、コロニー刺激因子などのリンフォカイン、コラーゲンなどの結合組織ポリペプチド、遺伝因子、凝固因子、酵素、酵素阻害物質などが含まれる。また、所望の遺伝子は、相同的組換えにより「ノック・イン」あるいは「ノック・アウト」することができる。
【０１１４】
また、上述のように、核移植の前に、例えば細胞の系統発生の障害、胚発生の促進および／あるいはアポトーシスの阻害などを目的としてドナー細胞を修飾することができる。望ましい修飾については後述する。
【０１１５】
本発明の態様の１つでは、例えばヒト細胞などのドナー細胞を遺伝的に修飾し、系統欠損とし、核移植に用いる場合には生産児を生じせしめない。これは、特にヒト核移植胚の場合に、倫理的な理由により生存胚の生成が望まれない場合に望ましい。これは、ヒト細胞を遺伝的に操作して、核移植に用いる際に特定の系統細胞への分化を不能とすることにより実施できる。特に、細胞を遺伝的に修飾し、核移植ドナーとして用いる場合には、生成した「胚」が中胚葉、内胚葉あるいは外胚葉組織のうち少なくとも１つを含まないか、相当量を欠損せしめることができる。
【０１１６】
これは、例えばノック・アウト、あるいは中胚葉、内胚葉あるいは外胚葉のうち１つあるいはそれ以上に特異的な遺伝子の発現を障害することなどにより実施できる。その例には、
中胚葉： ＳＲＦ，ＭＥＳＰ−１，ＨＮＦ−４，β−Ｉインテグリン、ＭＳＤ；
内胚葉： ＧＡＴＡ−６，ＧＡＴＡ−４；
外胚葉： ＲＮＡヘリカーゼＡ，Ｈβ５８
が含まれる。
【０１１７】
上記のリストは、例示することを意図したもので、中胚葉、内胚葉および外胚葉の発生に関与する既知の遺伝子を網羅するものではない。中胚葉欠損、内胚葉欠損、および外胚葉欠損細胞および胚の生成は、すでに文献に報告されている。例えばＡｒｓｅｎｉａｎ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．，Ｖｏｌ．１７（２）：６２８９−６２９９（１９９８）；Ｓａｇａ Ｙ．Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．７５（１−２）：５３−６６（１９９８）；Ｈｏｌｄｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２０（５）：１３５５−１３４６（１９９４）；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．Ｖｏｌ．８（２０）：２４６６−２４７７（１９９４）；Ｒｏｈｗｅｄｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２０１（２）：１６７−１８９（１９９８）（中胚葉）；Ｍｏｒｒｉｓｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｓ，Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１２（２２）：３５７９−３５９０（１９９８）；Ｓｏｕｄａｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２１（１１）：３８７７−３８８８（１９９５）（内胚葉）；およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９５：（２３）：１３７０９−１３７１３（１９９８）；およびＲａｄｉｃｅ ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１１１（３）：８０１−８１１（１９９１）（外胚葉）などを参照のこと。
【０１１８】
全般的に、例えばヒト角化細胞、上皮細胞あるいは線維芽細胞などの所望の体性細胞を遺伝子操作すると、特定の細胞系統に特異的な１つあるいはそれ以上の遺伝子が「ノック・アウト」され、かつ／あるいはこうした遺伝子の発現が顕著に障害される。これは、例えば相同組換えなどの既知の方法によって実施することができる。所望の遺伝子を「ノック・アウト」するための好ましい遺伝子系は、Ｃａｐｅｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ，によって、米国特許第５，６３１，１５３号および第５，４６４，７６４号によって開示され、所望の哺乳類ゲノム中の標的とするＤＮＡ配列の修飾を可能にする陽性−陰性選択（ＰＮＳ）ベクターが報告されている。こうした遺伝子修飾により、核移植ドナーとして用いた場合に特定の細胞系統への分化が不可能な細胞が生成するであろう。
【０１１９】
この遺伝子修飾された細胞は、系統欠損核移植胚、すなわち機能的中胚葉、内胚葉、あるいは外胚葉のうち少なくとも１つが発生しない胚を生成するのに用いられる。このため、生成した胚は、例えばヒト子宮などに移植しても、生産児を生じせしめないであろう。しかし、こうした核移植により発生したＥＳ細胞は、１つまたは２つの残った未障害系統の細胞を生成する上でまだ有用である。例えば、外胚葉欠損ヒト核移植胚は、まだ中胚葉および内胚葉由来の分化細胞を生成する。外胚葉欠損細胞は、ＲＮＡヘリカーゼＡあるいはＨβ５８遺伝子の一方あるいは両者の欠失あるいは障害により生成することができる。
【０１２０】
これらの系統欠損ドナー細胞を遺伝子修飾して、もう１つの所望のＤＮＡ配列を発現せしめることも出来る。このため、遺伝子修飾されたドナー細胞は、系統欠損胚盤胞を生成し、これを平板培養すると、多くとも２つの胚葉に分化する。
【０１２１】
一方、ドナー細胞を修飾し、「不死性」とすることができる。これはアンチセンスあるいはリボジームテロメラーゼ遺伝子を発現せしめることにより達成できる。これは、アンチセンスＤＮＡあるいはリボジームの発現をもたらす既知の遺伝的方法、あるいは遺伝子ノック・アウトにより実施できる。これらの「不死性」細胞は、核移植に用いた場合、分化して産子となることができないであろう。
【０１２２】
本発明のもう１つの好ましい実施態様は、組織培養中でより効率的に成長する核移植胚の生成である。これは、ＥＳ細胞および／あるいは産子（胚盤胞が代理雌に移植される場合）を生成するのに必要な時間および必要な融合を減少せしめる上で有利である。このことが望ましい理由は、核移植により生じた胚盤胞とＥＳ細胞が発生能力を障害されていることがあることが認められているためである。これらの問題は、多くの場合組織培養条件を変えることで軽減されるが、もう１つの解決法は、胚発生に関与する遺伝子の発現を促進することで胚発生を促進することである。
【０１２３】
例えば、ＭＨＣ Ｉグループの一員であるＰｅｄ型遺伝子産物は、胚の発育にとって重要であることが報告されている。より具体的には、マウスの着床前胚の例において、Ｑ７およびＱ９遺伝子が「急速成長」表現型を発現させることが報告されている。したがって、これらおよび関連する遺伝子を発現させるＤＮＡ、もしくはヒトあるいは他の哺乳類の同種ＤＮＡをドナー細胞に導入することによって、より速く成長する核移植胚が得られることが期待される。これは特に、異種間での核移植胚が同一動物種の細胞もしくは核の融合によって産生される核移植胚よりも組織培養液中での発育効率が悪い場合に、望ましい手法である。
【０１２４】
核移植の前に、Ｑ７かつ／またはＱ９遺伝子を含有するＤＮＡ構築物をドナー体細胞中に導入するのが望ましい。例えば、哺乳類の強力な構成プロモーターをＱ７かつ／またはＱ９遺伝子、ＩＲＥＳ、ネオマイシンのような１つ以上の適切な選択用マーカー、ＡＤＡ、ＤＨＦＲ、およびｂＧＨポリＡ配列のようなポリＡ配列に機能的に結合させた発現用構築物を作成することが可能である。また、孤立遺伝子を加えることは、Ｑ７およびＱ９遺伝子の発現をさらに促進するために有益であると考えられる。これらの遺伝子は異なる動物種、例えばウシ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコおよびヒトにおける保存度がきわめて高いため、未分化胚芽細胞の発育の初期の段階で発現されると予想される。また、胚の発育を促進する他の遺伝子にも影響を与えるよう、ドナー細胞を設計することも可能であると考えられる。このように、遺伝子操作を施したこれらのドナー細胞は、未分化胚芽細胞および着床前段階の胚をより効率良く産生することができるはずである。
【０１２５】
本発明のさらに別の局面として、アポトーシス、すなわちプログラムされた細胞死に対して耐性をもつドナー細胞の構築が含まれる。着床前段階の胚の中に細胞死に関連する遺伝子が存在することが文献中で報告されている（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１（５３８１）：１３２２−１３２６（１９９８））。アポトーシスを誘発することが報告されている遺伝子として、Ｂａｄ、Ｂｏｋ、ＢＨ３、Ｂｉｋ、Ｈｒｋ、ＢＮＩＰ３、ＢｉｍＬ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、およびＥＧＬ−１などが挙げられる。一方、プログラムされた細胞死から細胞を保護することが報告されている遺伝子には、例えばＢｃＬ−ＸＬ、Ｂｃ１−ｗ、Ｍｃ１−１、Ａ１、Ｎｒ−１３、ＢＨＲＦ−１、ＬＭＷ５−ＨＬ、ＯＲＦ１６、Ｋｓ−Ｂｅｌ−２、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ、およびＣＥＤ−９などがある。
【０１２６】
したがって、胚の発育中にアポトーシスを誘発する遺伝子が「ノックアウト」されるように、あるいは細胞をアポトーシスから保護する遺伝子の発現を促進する、もしくは発現を引き起こすように、ドナー細胞を構築することが可能である。
【０１２７】
例えば、胚の発育の間にこのような保護遺伝子（例としてＢｃｌ−２）もしくは関連遺伝子を調節して発現させるＤＮＡ構築物を導入することによってこれを実現することができる。これにより、特定の発育条件下で胚を培養することによって遺伝子の「スイッチを入れる」ことが可能である。別の方法として、構成プロモーターに結合させてもよい。
【０１２８】
より具体的には、Ｂｃｌ−２遺伝子を含有するＤＮＡ構築物をＰＧＫ、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ユビキチンのような調節可能プロモーターもしくは構成プロモーター、あるいはβ−アクチン、ＩＲＥＳ、適切な選択マーカー、およびポリＡ配列に機能的に結合させた構築物を作成し、目的とするドナー哺乳類細胞、例えばヒトケラチノサイトや線維芽細胞の中に導入することが可能である。
【０１２９】
これらのドナー細胞を利用して核移植胚を作成すれば、アポトーシスに耐性を有するはずであるから、組織培養中でより効率良く分化すると考えられる。それによって、核移植により産生される適切な着床前胚の速さかつ／または数が増加するであろう。
【０１３０】
これと同様の成果を得るための別の方法として、アポトーシスを誘発する１種類以上の遺伝子の発現を阻害する、というものがある。これは、胚の中で発現し発育の初期の段階でアポトーシスを誘発する遺伝子をノックアウトするか、あるいはアンチセンスもしくは遺伝子に対するリボザイムを用いるかによって実現可能である。これらの例は上述のとおりである。アンチセンスの方向で発現すると思われる細胞死遺伝子には、ＢＡＸ、Ａｐａｆ−１、およびカプサーゼがある。また、センスあるいはアンチセンスの方向にメチラーゼもしくはデメチラーゼをコードするトランスジーンを導入することも可能である。メチラーゼおよびデメチラーゼの酵素をコードするＤＮＡに関しては、本分野においてよく知られている。さらに別の方法として、両方の調節、すなわちアポトーシス誘発遺伝子の阻害と、アポトーシスを阻害するあるいは予防する遺伝子の発現の促進とを含有するようにドナー細胞を構築することもできる。アポトーシスに影響を及ぼす遺伝子の構築および選択、そしてこのような遺伝子を発現する細胞株については、米国特許Ｎｏ．５，６４６，００８中に開示されており、この特許は引用文により本特許に含まれる。アポトーシスを促進する、あるいは阻害する多くのＤＮＡが報告されており、それに関する特許も数多く申請されている。
【０１３１】
クローニング効率を上げるための別の方法として、ドナー細胞と同一の特定の細胞周期にある細胞を選択するというものがある。これによって核移植効率が健著に上昇することが報告されている。（Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖｅｌ．、３６（１）：３３−４１（１９９３））。特定の細胞周期にある細胞を選択するための方法として種々のものが報告されており、血清枯渇（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：６４−６６（１９９６）；Ｗｉｌｍｕｔ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３８５：８１０−８１３（１９９７））、および化学物質による同調（Ｕｒｂａｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、２１９（１）：１５９−１６８（１９９５）などがある。例えば、特定のサイクリンＤＮＡを検出用マーカー（例として緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ））と共に調節配列に機能的に結合させ、その後ろにサイクリン破壊ボックス、そして任意で孤立配列を連結し、サイクリンおよびマーカー蛋白質の発現を促進させることができる。これによって、目的とする細胞周期にある細胞を肉眼で容易に検出することができ、核移植ドナーとして選択することが可能である。その例として、Ｇ１期にある細胞を選択するためのサイクリンＤ１遺伝子が挙げられる。しかし、本発明においてはどのようなサイクリン遺伝子でも使用可能なはずである。（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、第７巻（９）：１３４３−１３５７（１９９６）などを参照のこと）。
【０１３２】
しかし、目的とする細胞周期にある細胞を産生するために、できるだけ侵襲性が少なくより効率の高い方法が必要である。これは、検出可能な条件下で特定のサイクリンを発現するようにドナー細胞の遺伝子を修飾することによって実現可能であると期待される。それによって特定の細胞周期にある細胞を他の細胞周期にある細胞から用意に識別することができる。
【０１３３】
サイクリンは、細胞周期のうちの特定の段階においてのみ発現される蛋白質である。例としてＧ１期のサイクリンＤ１、Ｄ２およびＤ３、Ｇ２／Ｍ期のサイクリンＢ１およびＢ２、そしてＳ期のサイクリンＥ、ＡおよびＨがある。これらの蛋白質はサイトゾル中で容易に翻訳され破壊される。これらの蛋白質がこのように「一時的に」発現する理由の１つは、「破壊ボックス」の存在である。これは、ユビキチン経路を通じてこれらの蛋白質の速やかな破壊を指令するタグとして機能する蛋白質の一部である短いアミノ酸配列である。（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１（５３２１）：１３２２−１３２６（１９９８））。
【０１３４】
本発明では、容易に検出できる条件下、望ましくは例えば蛍光標識を用いることによって肉眼で検出可能な条件下で、このようなサイクリン遺伝子を１つあるいはそれ以上発現するようにドナー細胞を構築する。例として、特定のサイクリンＤＮＡを検出用マーカー（例として緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ））と共に調節配列に機能的に結合させ、その後ろにサイクリン破壊ボックス、そして任意で孤立配列を連結し、サイクリンおよびマーカー蛋白質の発現を促進させることができる。これによって、目的とする細胞周期にある細胞を肉眼で容易に検出することができ、核移植ドナーとして選択することが可能である。その例として、Ｇ１期にある細胞を選択するためのサイクリンＤ１遺伝子が挙げられる。しかし、本発明においてはどのようなサイクリン遺伝子でも使用可能なはずである。（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、第７巻（９）：１３４３−１３５７（１９９６）などを参照のこと）。
【０１３５】
上述のように、本発明は、特に異種間核移植過程における核移植効率を上げるための種々の方法を提供するものである。本発明の発明者らは、ある動物種の核あるいは細胞を別の動物種の脱核卵母細胞に挿入もしくは融合させた場合に、未分化胚芽細胞を産生する核移植胚が得られ、その核移植胚がＥＳ細胞株にまで生育することを実証しているが、このような手法の効率はきわめて低い。このため、培養することによってＥＳ細胞およびＥＳ細胞株を産生し得る細胞である未分化胚芽細胞を産生するために、多くの融合を行う必要があるのが普通である。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて核移植胚の生育を促進するための別の方法として、培養条件を最適化することが挙げられる。このための１つの手段は、アポトーシスを阻害する条件下でＮＴ胚を培養することである。本発明のこの態様に関して、カプサーゼのようなプロテアーゼは、他の細胞種と同様のアポトーシスによって卵母細胞の死を誘発する可能性があることが報告されている。（Ｊｕｒｉｓｉｃｏｓｖａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖｅｌ．、５１（３）：２４３−２５３（１９９８）を参照。）
【０１３６】
未分化胚芽細胞の発育は、核移植および未分化胚芽細胞の維持、あるいは着床前段階の胚の培養のために使用する培地中に１種類以上のカプサーゼ阻害剤を添加することによって促進されると考えられる。このような阻害剤の例として、カプサーゼ−４阻害剤Ｉ、カプサーゼ−３阻害剤Ｉ、カプサーゼ−６阻害剤ＩＩ、カプサーゼ−９阻害剤ＩＩ、およびカプサーゼ−１阻害剤Ｉがある。アポトーシスを阻害するために必要なこれら阻害剤の量は、例えば培地の重量の０．００００１から５．０％であり、より望ましくは培地の重量の０．０１％から１．０％である。このように、前述の方法を用いて組織培養中における未分化胚芽細胞および胚のその後の発育を促進することにより、核移植の効率を上昇させることができる。
【０１３７】
目的とする大きさのＮＴユニットが得られた後、細胞を物理的にゾーンから除去し、胚細胞あるいは幹様細胞および細胞株を産生するために使用する。これは、ＮＴユニットを含有する細胞を通常５０個以上含む細胞塊を洗い、例えば放射線照射した線維芽細胞のような支持細胞層上にこれらの細胞をプレーティングすることによって行うのが望ましい。一般に、幹様細胞もしくは細胞コロニーを産生するために使用する細胞は、最低５０個の細胞から構成されるのが望ましい培養ＮＴユニットの最も内部から採取する。しかし、細胞数がそれ以下もしくはそれ以上のＮＴユニットでも、またＮＴユニットの他の部分から採取した細胞でも、ＥＳ様細胞および細胞コロニーを産生するために使用できると思われる。
【０１３８】
さらに、ドナー細胞のＤＮＡを卵母細胞のサイトゾルにより長時間接触させることによって、分化の過程が起こり易くなると推測される。これは、再クローニング、すなわち再構築した胚から割球を摘出し、新しい脱核卵母細胞と融合させることによって実現可能である。これとは別に、ドナー細胞を脱核卵母細胞と融合させ、４〜６時間後に活性化することなく染色体を摘出し、より若い卵母細胞と融合させるという方法もある。活性化はその後に起こると考えられる。
【０１３９】
細胞は、適切な生育用培地中の支持細胞層の中で維持する。培地の例として、１０％ＦＣＳおよび０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）とＬ−グルタミンを添加したαＭＥＭ培地が挙げられる。生育用培地は、最大限に生育させるために必要な頻度、例えば約２〜３日毎に交換する。
【０１４０】
この培養過程によって、胚細胞あるいは幹様細胞もしくは細胞株が産生される。ヒト細胞／ウシ卵母細胞由来のＮＴ胚の場合には、α−ＭＥＭ培地中で培養を開始してから約２日後にコロニーが観察される。しかし、この時期は、個々の核ドナー細胞、卵母細胞および培養条件によって変動すると思われる。本分野の専門家であれば、特定の胚細胞あるいは幹様細胞を最大限に生育させるために、必要に応じて培養条件を変更することができるであろう。他の適切な培地もここに開示する。
【０１４１】
得られた胚細胞あるいは幹様細胞および細胞コロニーは、ドナー卵母細胞の動物種ではなく核細胞ドナーとして用いた動物種の胚あるいは幹様細胞と同様の外観を呈するのが普通である。例えば、ヒトの核ドナー細胞を脱核したウシ卵母細胞中に移植して得られた胚細胞あるいは幹様細胞の場合には、細胞はウシのＥＳ様細胞ではなくマウスの胚性幹細胞に似た形態を示す。
【０１４２】
より具体的には、ヒトＥＳ細胞株の細胞コロニーの個々の細胞は明瞭に識別することができず、コロニーの周囲は屈折性で滑らかな外観をもつ。さらに、細胞コロニーの細胞倍化時間は長く、マウスのＥＳ細胞の倍化時間の約２倍である。また、ウシおよびブタ由来のＥＳ細胞とは異なり、コロニーは上皮様外観をとらない。
【０１４３】
前述のように、米国特許５，８４３，７８０号の中でＴｈｏｍｓｏｎにより、霊長類の幹細胞はＳＳＥＡ−１（−）、ＳＳＥＡ−４（＋）、ＴＲＡ−１−６０（＋）、ＴＲＡ−１−８１（＋）およびアルカリ性ホスファターゼ（＋）であることが報告されている。本発明の方法に従って作成したヒトおよび霊長類のＥＳ細胞も、同様あるいは同一のマーカー発現を示すものと予想される。
【０１４４】
これとは別に、これらの細胞が中胚葉、外胚葉および内胚葉のどれにでもなり得る能力を有することに基づき、このような細胞が実際のヒトあるいは霊長類の胚性幹細胞であることが確認される。これは、本発明に従い、適切な条件下（例として米国特許５，８４３，７８０号の中でＴｈｏｍｓｅｎが開示した条件、引用文によりそのすべてが本特許に含まれる）で作成したＥＳ細胞を培養することによって実証されるであろう。これとは別に、本発明に従って作成した細胞が多能性であるという事実は、このような細胞を動物、例えばＳＣＩＤマウス、あるいは大型の家畜などに注射し、その後当該着床細胞から生じる組織を採取することによって確認できると考えられる。これらの着床ＥＳ細胞は、あらゆる種類の分化細胞、すなわち中胚葉、外胚葉、および内胚葉組織に生育するはずである。
【０１４５】
このようにして得られた胚細胞あるいは幹様細胞および細胞株、望ましくはヒトの胚細胞あるいは幹様細胞および細胞株は、治療上および診断上非常に応用範囲が広い。特に、このような胚細胞あるいは幹様細胞は細胞移植療法のために利用可能である。ヒトの胚細胞あるいは幹様細胞は、各種疾患の治療において応用性をもつ。
【０１４６】
この点に関して、マウスの胚性幹（ＥＳ）細胞はほとんどあらゆる種類の細胞、例えば造血幹細胞などに分化し得ることが知られている。したがって、本発明に従って作成したヒト胚細胞あるいは幹様細胞も、同様の分化能を有するはずである。本発明に従って作成した胚細胞あるいは幹様細胞は、既知の方法を用いて誘導することにより目的とする細胞種に分化するものと考えられる。例えば、主題のヒト胚細胞あるいは幹様細胞を分化用培地中で細胞分化を起こす条件下において培養することによって、造血幹細胞、筋細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞、尿路細胞などに分化させることが可能である。胚性幹細胞の分化を引き起こすための培地および方法、そして適切な培養条件については、本分野においてよく知られている。
【０１４７】
例えば、Ｐａｌａｃｉｏｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９２：７５３０−７５３７（１９９５）は、幹細胞の凝集塊を最初にレチン酸を含まない懸濁培養液中で培養した後、レチン酸を含有する同培養液中で培養し、さらに細胞を付着させる基質に細胞凝集塊を移すという誘導手順を用いることにより、胚細胞株から造血幹細胞を作成することができると報告している。
【０１４８】
さらに、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．、６：５４３−５５２（１９９４）は、胚性幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させ、造血幹細胞、筋、心筋、神経細胞などの各種分化細胞型を作成するための方法を開示した数多くの文献を引用する総説論文である。
【０１４９】
また、Ｂａｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、１６８：３４２−３５７（１９９５）は、ニューロンの特性を有する神経細胞を作成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける胚性幹細胞の分化について述べている。これらの参考文献は、胚細胞あるいは幹様細胞から分化した細胞を作成するための方法として報告されたものの代表例である。これらの参考文献、およびその中でも特に胚性幹細胞を分化させるための方法に関連する開示内容は、引用文によりすべて本特許に含まれる。
【０１５０】
このように、本分野の専門家であれば、既知の方法および培地を用いることにより、主題の胚細胞あるいは幹様細胞を培養して目的とする分化した細胞種、例えば神経細胞、筋細胞、造血幹細胞などを作成することができる。また、特定の細胞系列のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける生育を促進するために、誘導可能なＢｃｌ−２あるいはＢｃｌ−ｘｌを用いるのも有用であると考えられる。ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＢｃｌ−２は、リンパ系および神経系の発達の間に起こるアポトーシスによる細胞死のすべてではないが多くの型を防止する。Ｂｃｌ−２の発現をどのように利用してドナー細胞のトランスフェクションの後の目的とする細胞系のアポトーシスを阻害し得るか、についの詳細な議論は、米国特許Ｎｏ．５，６４６，００８の中で開示されており、引用文により本発明に含まれる。
【０１５１】
主題の胚細胞あるいは幹様細胞を利用して、希望するあらゆる種類の分化細胞を作成することができると考えられる。このような分化したヒト細胞の治療上の使途は計り知れないものがある。例えば、ヒトの造血幹細胞は、骨髄移植を必要とする治療のために使用可能である。このような手法は、卵巣ガンおよび白血病などの末期ガン、ＡＩＤＳのような免疫不全疾患など、多くの疾患の治療に利用されている。造血幹細胞は、例えばガンあるいはＡＩＤＳ患者の成熟した体細胞（例として上皮細胞もしくはリンパ球）を脱核した卵母細胞（例としてウシ卵母細胞）と融合させて上述のようにして胚細胞あるいは幹様細胞を作成し、造血幹細胞が得られるまで分化に適した条件下でそれらの細胞を培養することによって得ることができる。こうして得られた造血細胞は、ガンおよびＡＩＤＳを含めた疾患の治療のために利用可能である。
【０１５２】
これとは別に、神経疾患のある患者からの成熟した体細胞を脱核した動物卵母細胞（例として霊長類またはウシの卵母細胞）と融合させ、これらの細胞を分化する条件下で培養し神経細胞系を作成することも可能である。このようなヒト神経細胞の移植によって治療可能な疾患の具体的な例として、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＡＬＳおよび脳性小児麻痺など多くの疾患がある。パーキンソン病の場合には、移植した胎児脳の神経細胞が周囲の細胞と正しく連結し、ドパミンを産生することが確認されている。これによって、パーキンソン病の症状を長期的に改善することができる。
【０１５３】
分化した細胞を特異的に選択するために、誘導可能なプロモーターを通じて発現する選択的マーカーを用いてドナー細胞をトランスフェクトすることにより、分化が起きた時点で特定の細胞系統を選択、もしくは濃縮することが可能である。例えば、ＣＤ３４−ｎｅｏは造血細胞の選択に使用することができ、Ｐｗ１−ｎｅｏは筋細胞、Ｍａｓｈ−１−ｎｅｏは交感神経ニューロン、Ｍａｌ−ｎｅｏはヒト大脳皮質の灰白質ＣＮＳニューロンの選択に使用することができる、などである。また、組織の発達を助ける基質を用いることも有益であろう。
【０１５４】
本発明の大きな長所は、移植に適した同系（イソジェニック即ちシンジェニック）のヒト細胞をほぼ無限に供給できる、という点である。したがって、現時点での移植法における重大な問題、すなわち宿主対移植片あるいは移植片対宿主拒絶反応が原因で起こる可能性のある移植組織の拒絶を回避することができる。従来、拒絶反応はシクロスポリンなどの拒絶反応防止薬を投与することによって予防、あるいは軽減している。しかし、このような薬剤には免疫抑制、発ガン性などの重大な副作用があり、また非常に高価である。本発明によって、シクロスポリン、イムラン、ＦＫ−５０６、グルココルチコイド、ラパマイシン、およびその誘導体などの拒絶反応防止薬を投与する必要性がなくなる、あるいは少なくとも低くなるはずである。
【０１５５】
イソジェニック細胞療法によって治療が可能であるその他の疾患や病態の例として、脊髄損傷、多発性硬化症、筋ジストロフィー、糖尿病、肝臓疾患、すなわち高コレステロール血症、心臓疾患、軟骨置換、火傷、脚部潰瘍、胃腸疾患、血管疾患、腎臓疾患、尿路疾患、および老化に起因する疾患や病態などが挙げられる。
【０１５６】
また、本発明に従って作成したヒトの胚細胞あるいは幹様細胞は、遺伝子操作した、もしくはトランスジェニックなヒト分化細胞を作成するためにも利用可能である。実際には、目的とする１個もしくは複数の遺伝子（異種でもかわまない）を導入するか、本発明に従って作成したヒト胚細胞あるいは幹様細胞の内在性遺伝子の全部または一部を除去し、これらの細胞を目的とする細胞型に分化させることによってこれが可能となるであろう。このような修飾を行うための望ましい方法とは、同種間での組換えである。何故なら、この手法を幹様細胞のゲノム中の特異的な部位（１個でも複数でも）にある１個もしくは複数の遺伝子を挿入、欠損、または修飾するために用いることができるからである。
【０１５７】
この方法を利用して、欠損した遺伝子、例えば欠損した免疫系遺伝子、嚢胞性線維症遺伝子などを補充したり、成長因子、リンホカイン類、サイトカイン類、酵素などの治療上有用な蛋白質の発現を引き起こす遺伝子を導入したりすることができる。例えば、脳由来の成長因子をコードする遺伝子をヒトの胚細胞あるいは幹様細胞中に導入し、それらの細胞を神経細胞に分化させてパーキンソン病の患者に移植すれば、この疾患の間に起こる神経細胞の消失を遅らせることが可能である。
【０１５８】
以前は、ＢＤＮＦによってトランスフェクトする細胞の種類は、初代の細胞から無限に増殖する細胞株まで、また神経細胞に由来する細胞や非神経系の細胞（筋原細胞および線維芽細胞）など、さまざまであった。例えば、星状神経膠細胞はレトロウイルスベクターを用いてＢＤＮＦ遺伝子によりトランスフェクトされ、これらの細胞はパーキンソン病モデルのラットに移植された（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６９１：２５−３６、（１９９５））。
【０１５９】
このｅｘ ｖｉｖｏ治療法により、移植後３２日目にはラットにおけるパーキンソン病様の症状が４５％まで軽減した。また、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子を星状神経膠細胞中に導入した場合にも、同様の結果が得られた（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１３９：３９−５３（１９９６）参考文献はここに引用する）。
【０１６０】
しかし、このようなｅｘ ｖｉｖｏ系には問題点がある。特に、現在使用されているレトロウイルスベクターはｉｎ ｖｉｖｏでダウンレギュレートされるため、トランスジーンは一時的にしか発現しない（Ｍｕｌｌｉｇａｎによる総説、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０：９２６−９３２（１９９３））。また、これらの研究では初代の細胞、星状神経膠細胞を使用したが、これらの寿命は有限で、複製速度も遅い。この特性はトランスフェクション率に悪影響を及ぼし、安定してトランスフェクトされた細胞の選択を妨害する。さらに、遺伝子の標的となる初代の細胞を大量に増殖させ同種組換え手法において使用することはほぼ不可能である。
【０１６１】
これに対して、レトロウイルス系に起因する問題点は、ヒトの胚細胞あるいは幹様細胞を使用することによって解消するはずである。主題の讓受人によって以前に、ウシおよびブタの胚細胞株をトランスフェクトし異種ＤＮＡが安定して組み込まれた細胞を選択し得ることが実証された。この方法については、米国特許Ｎｏ．５，９０５，０４２に記載されており、引用文によりそのすべてが本特許に含まれる。したがって、これらの方法あるいはその他の既知の方法を用いることにより、目的とする遺伝子を主題のヒト胚細胞あるいは幹様細胞中に導入し、それらの細胞を目的とする細胞型、例えば造血細胞、神経細胞、膵臓細胞、軟骨細胞などに分化させることが可能となる。
【０１６２】
主題の胚細胞あるいは幹様細胞中に導入することのできる遺伝子の例として、上皮増殖因子、基礎型線維芽細胞増殖因子、神経膠由来神経栄養増殖因子、インシュリン様増殖因子（ＩおよびＩＩ）、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン４／５、毛様体神経栄養因子、ＡＦＴ−１、サイトカイン遺伝子（インターロイキン、インターフェロン、コロニー形成促進因子、腫瘍壊死因子（αおよびβ）など）、治療用の酵素をコードする遺伝子、コラーゲン、ヒト血清アルブミンなどが挙げられる。
【０１６３】
また、必要に応じて患者から治療用の細胞を除去するために、本分野において知られた負の選択系のうちのいずれかを利用することも可能である。例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子によってトランスフェクトしたドナー細胞は、ＴＫ遺伝子を含有する胚細胞を産生するようになる。これらの細胞が分化すれば、やはりＴＫ遺伝子を発現する当該治療用細胞を分離することができる。これらの細胞は、患者に対してガンシクロビルを投与することによりどの時点においても患者から選択的に除去することが可能である。このような負の選択系については、米国特許Ｎｏ．５，６９８，４４６に記載されており、引用文により本特許に含まれる。
【０１６４】
主題の胚細胞あるいは幹様細胞、望ましくはヒトの細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分化モデルとして、特に初期発育の調節に関与する遺伝子の研究のために利用することができる。
【０１６５】
また、主題の胚細胞あるいは幹様細胞を用いて分化させた細胞組織および臓器は、薬物試験においても使用可能である。
【０１６６】
さらに、主題の細胞は組換えＤＮＡを発現させるために使用することもできる。
【０１６７】
さらにまた、主題の胚細胞あるいは幹様細胞は、他の胚細胞あるいは幹様細胞および細胞コロニーを作成するための核ドナーとして用いることができる。
【０１６８】
また、本発明に従って作成した培養内細胞塊、あるいは幹細胞を腎臓カプセルもしくは筋肉内投与により例えばＳＣＩＤマウス、ウシ、ブタなどの動物に導入し、そこで奇形腫を誘発させるために使用することができる。この奇形腫は、種々の組織型を派生させるために用いることができる。また、Ｘ−種核移植によって作成した内細胞塊を、生体内で分解される生体適合性のポリマー基質と共に導入し、３次元の組織を形成させることが可能である。組織が形成された後、ポリマーは分解し、ドナーの組織、例えば心臓、膵臓、神経、肺、肝臓などをそのまま残すのが理想である。場合によっては、成長因子および血管新生を促進する蛋白質を含めるのが有用であるかもしれない。これとは別に、適切な培養用培地および条件、成長因子および生体内で分解するポリマー基質を使用することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて完全に組織を形成させることが可能である。
【０１６９】
本発明をより明確に説明するために、以下の例を挙げる。
【０１７０】
例１
材料および方法
核移植のためのドナー細胞
同意を得た成人の口腔内壁から、標準スライドグラスを用いて上皮細胞を軽く掻き取る。細胞をスライドから洗出し、ＣａあるいはＭｇを含まないリン酸緩衝溶液の入ったペトリ皿に入れる。細胞を径の細いピペットで吸って細胞塊を壊し、１個ずつの細胞の懸濁液とする。次に、脱核したウシ卵母細胞中に核移植するためのオイルの下で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＴＬ−ＨＥＰＥＳ培地のマイクロドロップ中に細胞を移す。
【０１７１】
核移植の手順
核移植の基本的な手順については以前に報告したとおりである。簡単に述べると、屠殺場で採取した卵母細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させた後、成熟後約１８時間目に（ｈｐｍ）卵母細胞から堆積細胞を除去し、斜面マイクロピペットを用いて脱核した。ビスベンツイミド（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、３μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を添加したＴＬ−ＨＥＰＥＳ培地中で脱核を確認した。その後、個々のドナー細胞を受容側の卵母細胞の卵黄周囲腔内に注入した。電気細胞融合法を用いて、ウシ卵母細胞の細胞質とドナーの核（ＮＴユニット）を一緒に融合させる。ＮＴユニットに対して、１回に９０Ｖの融合パルスを１５μ秒間与えた。成熟開始後２４時間目（ｈｐｍ）の卵母細胞を用いてこれを行った。ＮＴユニットを２８ｈｐｍまでＣＲ１ａａ培地中で維持した。
【０１７２】
卵母細胞を人工的に活性化するための方法は、別の所に報告されている。ＮＴユニットの活性化は２８ｈｐｍにおいて行った。活性化の手順に関する簡単な説明は次のとおりである：１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを添加したＴＬ−ＨＥＰＥＳ中でＮＴユニットをイオノマイシン（５μＭ；ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に４分間曝露させた後、３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを添加したＴＬ−ＨＥＰＥＳ中で５分間洗浄した。次に、０．２ｍＭのＤＭＡＰ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＣＲ１ａａ培地のマイクロドロップ中にＮＴユニットを移し、５％ＣＯ２存在下で３８．５℃において４〜５時間培養した。ＮＴユニットを洗浄した後、マウス胚線維芽細胞の集密支持細胞層を形成させた４穴プレート中のＣＲ１ａａ培地＋１０％ＦＣＳおよび６ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡに移した（以下に説明）。５％ＣＯ２存在下で３８．５℃においてＮＴユニットをさらに３日間培養した。活性化の時点から１２日後まで、培地を３日毎に交換した。この時点で、ＮＴユニットは目的とする細胞数、すなわち約５０個に到達しており、物理的にゾーンから除去し、胚細胞株を作成するために使用した。上述のようにして作成したＮＴユニットの写真を図１に示す。
【０１７３】
線維芽細胞による支持細胞層
第１４〜１６日のマウス胎児から、胚線維芽細胞の初代培養を作成した。頭、肝臓、心臓および消化管を無菌的に除去した後、胚を細かく刻んで、予め加温したトリプシンＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ；ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で３７℃において３０分間インキュベートした。線維芽細胞を組織培養用フラスコに入れ、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇｅｎ、ＵＴ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５０μｌ／ｍｌ）を添加したα−ＭＥＭ培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中で培養した。３〜４日継代した後、胚線維芽細胞を３５×１０Ｎｕｎｃ培養用ディッシュ（Ｂａｘｔｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭｃＧａｗ Ｐａｒｋ、ＩＬ）中で照射した。照射した線維芽細胞は、５％ＣＯ２存在下の加湿空気中で３７℃において生育させ維持した。均一な細胞単層が形成された培養プレートを用いて胚細胞株の培養を行った。
【０１７４】
胚細胞株の作成
上述のようにして作成したＮＴユニット細胞を洗浄し、照射した線維芽細胞の支持層の上に直接プレーティングした。これらの細胞は、ＮＴユニットの内部のものを用いた。１０％ＦＣＳおよび０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を添加した生育用培地中で細胞を維持した。生育用培地は２〜３日毎に交換した。培養第２日に１個目のコロニーが観察された。コロニーは増殖し、以前に開示したマウス胚性幹（ＥＳ）細胞と同様の形態を示すようになる。コロニー内の個々の細胞は明瞭に識別することができず、コロニーの周囲は屈折性で滑らかな外観をもつ。細胞コロニーの細胞倍化時間はマウスのＥＳ細胞よりも長いようである。また、ウシおよびブタ由来のＥＳ細胞とは異なり、コロニーはこれまでのところ上皮様外観を呈していない。上述のようにして得られたＥＳ様細胞コロニーの写真を図２から５に示す。
【０１７５】
分化したヒト細胞の作成
作成したヒト胚細胞を分化用培地に移し、分化したヒト細胞型が得られるまで培養する。
【０１７６】
結果
【０１７７】
１６個以上の細胞をもつ構造まで発育したＮＴユニット１個を、線維芽細胞支持層の上にプレーティングした。この構造体を支持細胞層に付着させ、ＥＳ細胞様の形態をもつコロニーを形成するまで増殖させた（例として図２を参照）。さらに、４〜１６細胞期の構造体を用いてＥＳ細胞コロニーの作成を試すことはしなかったが、この期でもＥＳ細胞あるいはＥＳ様細胞株を作成し得ることが以前に示されている（マウス、Ｅｉｓｔｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｄｅｖｅｌ．Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒ．、３１：２７５−２８２（１９８９）；ウシ、Ｓｔｉｃｅ ｅｔ ａｌ．、１９９６））。したがって、４〜１６細胞期のＮＴユニットからも胚細胞あるいは幹様細胞および細胞コロニーを作成し得るはずであると期待される。
【０１７８】
また、ヒト成人のケラチノサイト細胞株を脱核したウシ卵母細胞と融合させ、ＡＣＭ、ウリジン、グルコース、および１０００ＩＵのＬＩＦを含有する培地中で培養した場合にも、同様の結果が得られた。再構築した胚５０個のうち、２２個が細胞分裂し、１個が約１２日目に未分化胚芽細胞にまで発育した。この未分化胚芽細胞をプレーティングし、現在ＥＳ細胞株を作成中である。
【０１７９】
例２
Ａ．細胞からミトコンドリアを分離する手順
この例は、ミトコンドリアの分離と、異種間核移植の効率を上昇させるためのその利用に関するものである。細胞１個当たりのミトコンドリアの数は、細胞株によって異なる。例えば、マウスのＬ細胞の１細胞当たりのミトコンドリア含有数は〜１００個であるのに対して、ＨｅＬａ細胞では少なくともその２倍はある。低張緩衝液中で細胞を膨張させ、造作のきつい乳棒を用いてＤｏｕｎｃｅホモジナイザーの中で数回ストロークすることによって細胞を破壊し、分画遠心によりミトコンドリアを分離する。
【０１８０】
溶液、試験管、およびホモジナイザーは、氷上で予冷しておかなければならない。遠心手順はすべて４０℃において行う。本手順は、洗浄した１〜２ｍｌの細胞ペレットから開始するものである。細胞ペレットを１１ｍｌの氷冷ＲＳＢ中に再懸濁し、１６ｍｌ Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーに移す。
【０１８１】
ＲＳＢ緩衝液
ＲＳＢ（組織培養細胞を膨張させるための低張緩衝液）
１０ｍＭ ＮａＣｌ
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５
ＭｇＣｌ２
【０１８２】
細胞を５〜１０分間膨張させる。位相差顕微鏡を用いて膨張の進行を確認する。膨張した細胞を、望ましくは乳棒の数回のストロークにより、破壊する。直後に、８ｍｌの２．５×ＭＳ緩衝液を添加し、最終濃度が１×ＭＳとなるようにする。次にホモジナイザーの上部をＰａｒａｆｉｌｍで覆い、数回反転させることによって混合する。
【０１８３】
２．５×ＭＳ緩衝液
５２５ｍＭマンニトール
１７５ｍＭショ糖
１２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５
２１５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ ７．５
【０１８４】
１×ＭＳ緩衝液
２１０ｍＭマンニトール
７０ｍＭショ糖
５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５
１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５
【０１８５】
ＭＳ緩衝液は、細胞小器官の張度を維持し、凝集を防ぐための等浸透圧性緩衝液である。
【０１８６】
その後、ホモジネートを遠心チューブに移し、分画遠心を行う。ホモジナイザーを少量のＭＳ緩衝液ですすぎ、ホモジネートに添加する。ＭＳ緩衝液を用いて容積を３０ｍｌにする。次に、ホモジネートを１３００ｇにおいて５分間遠心し、核、破壊した細胞、および大きい膜断片を除去する。その後、上清を清潔な遠心チューブに移す。核スピンダウンを２回繰り返す。さらに、上清を清潔な遠心チューブに移し、ミトコンドリアを含む沈渣を１７，０００ｇで１５分間遠心する。上清を捨て、チューブの内側をＫｉｍｗｉｐｅで拭う。沈渣を１×ＭＳに再懸濁し、１７，０００ｇでの遠心を繰り返すことによってミトコンドリアを洗浄する。上清を捨て、沈渣を緩衝液中に再懸濁する。ミトコンドリアは、−８０℃において長期間、例えば１年間程度保管することができるが、ＮＴのためにはすぐに使用するのが望ましい。
【０１８７】
この基本手順は、変更可能である。特に、ミトコンドリアのＤＮＡをさらに分離し、ＮＴのために同様に使用するのが望ましい。この場合には、細胞小器官ではなく核の混入が問題となる可能性があるため、次のような変更を加えるのがよい。例えば、ほとんどの細胞が活発に分裂していない定常期に細胞を回収し、ＭｇＣｌ２の代わりにＣａＣｌ２を添加したＲＳＢ中で核膜を安定化させる。密度勾配精製法の場合と同様に、ミトコンドリア沈渣の洗浄は省略する。その代わりに、ミトコンドリア沈渣を単純に再懸濁させて溶解し、残っている核ＤＮＡからミトコンドリアのＤＮＡを精製する。前述のとおり、ミトコンドリアおよびミトコンドリアＤＮＡを精製するために適した方法は、本分野においてよく知られている。
【０１８８】
最も効率良くホモジナイズすることができるのは、細胞沈渣の容積の少なくとも５〜１０倍の溶液に再懸濁した場合であり、また細胞懸濁液がホモジナイザーの少なくとも半分を満たしている場合である。ホモジナイザーの乳棒をチューブに向って真っ直ぐに押し、安定した強い圧力を維持する。Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーは、膨張した組織培養細胞を圧力の変化によって破壊するものである。乳房を押し下げた時には、細胞周辺の圧力が上昇する；細胞が乳棒の端をすべって通過する再に圧力が突然低下し、細胞が崩壊する。乳棒の造作が非常にきつければ、同時に物理的な破壊も起こるであろう。
【０１８９】
Ｂ．組織からのミトコンドリア分離
ミトコンドリア分離手順は、個々の組織に応じて選択する。例えば、組織に応じて最適なホモジナイズ用緩衝液、最適なホモジナイズ法を使用する必要がある。最適な方法については、この分野でよく知られている。
【０１９０】
ラット肝臓は、入手が容易であり、ホモジナイズし易く、細胞中に多数のミトコンドリア（一細胞当たり１０００〜２０００個）が含まれるため、ミトコンドリア調製のために最もよく用いられる組織である。例えば、ラット肝臓をホモジナイズするためには、モーター駆動式テフロン（登録商標）ガラスＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーを使用することができる。一方、組織が柔らかい場合には、ゆるい乳棒のついたＤｏｕｎｃｅホモジナイザーを使用する。ミトコンドリア調製の回収率および純度は、調製方法、調製の速さ、動物の年齢および生理学的状態によって変動する。前述のように、ミトコンドリアを精製するための方法は良く知られている。
【０１９１】
緩衝液、チューブ、およびホモジナイザーを予冷しておくのが望ましい。ガラステフロン（登録商標）型のホモジナイザーを予冷することによって、チューブと乳棒の間に適正な空隙ができる。遠心過程は、４０℃で行うのが望ましい。
【０１９２】
基本的な手順として、胆嚢を破裂させないように注意しながら肝臓を摘出することが重要である。摘出した肝臓を氷上のビーカーに入れ、結合組織を除去する。組織を確認し、ビーカーに戻す。例えば非常に鋭利な鋏、小刀、あるいは剃刀の刃を用いて１〜２片に切断する。次に断片をホモジナイズ用緩衝液（１×ＭＳ）で望ましくは２回すすいで血液の大半を除去し、組織をホモジナイザーのチューブに移す。ホモジナイズ用緩衝液を１：１０（ｗ／ｖ）ホモジネートの比率になるよう添加する。
【０１９３】
ＮＴ効率を上昇させるための分離ミトコンドリアまたはミトコンドリアＤＮＡの使用
発明者らは、ドナー細胞もしくは核と同一動物種のミトコンドリアあるいはミトコンドリアＤＮＡを導入することによって異種間核移植の効率が上昇する可能性がある、との理論づけをしている。その結果、得られたＮＴユニットの核ＤＮＡが種適合性をもつようになると考えられる。
【０１９４】
上述の方法、もしくは他に知られた方法によって分離したミトコンドリアは、次のうちのいずれか（ヒトドナー細胞／ウシ卵母細胞核移植の場合）に導入する（一般に、注射による）：
（ｉ）活性化していない、脱核していないウシ卵母細胞；
（ｉｉ）活性化していない、脱核したウシ卵母細胞；
（ｉｉｉ）活性化し、脱核したウシ卵母細胞；
（ｉｖ）活性化していない、融合した（ヒトドナー細胞または核と）ウシラン母細胞；
（ｖ）活性化し、融合して切断して再構築した（ウシ卵母細胞／ヒト細胞）胚；もしくは
（ｖｉ）活性化し、融合した１細胞再構築（ウシ卵母細胞／ヒト細胞）胚。
これと同一の手順によって、他の異種間ＮＴも促進することができる。基本的には、ミトコンドリアを同様にドナー細胞あるいは核と同じ動物種の（ｉ）から（ｖｉ）のいずれかに導入し、異なる動物種に由来する卵母細胞を使用する。一般に、約１〜２００ピコリットルのミトコンドリア懸濁液を、上記のいずれかに注射する。このようにミトコンドリアを導入することによって、ミトコンドリアＤＮＡとドナーＤＮＡが適合するＮＴユニットが得られる。
【０１９５】
例３
異種間核移植の効率を上昇させるための別の方法として、１個または複数個の脱核した体細胞（一般にはヒト、ドナー細胞または核と同一の動物種の細胞）を次のうちのいずれかと融合させる、というものがある：
（ｉ）活性化していない、脱核していない（例えばウシの）卵母細胞；
（ｉｉ）活性化していない、脱核した（例えばウシの）卵母細胞；
（ｉｉｉ）活性化し、脱核した（例えばウシの）卵母細胞；
（ｉｖ）活性化していない、融合した（ヒト細胞と）卵母細胞（一般にウシ）；
（ｖ）活性化し、融合して切断して再構築した（例えばウシ卵母細胞／ヒト細胞）胚；
（ｖｉ）活性化し、融合した１細胞再構築（ウシ卵母細胞／ヒト細胞）胚。 （ｖｉｉ）活性化していない、融合した（例えばヒト細胞と）卵母細胞（一般にウシ卵母細胞）。
【０１９６】
融合は、電気パルスを用いて、あるいはＳｅｎｄａｉウイルスを用いて行うのが望ましい。脱核した細胞（例えばヒト細胞）を作成するための方法は、本分野においてよく知られている。望ましい手順を以下に記載する。
【０１９７】
脱核の手順
サイトカラシンＢを用いて細胞の大規模な脱核を行うための方法は、本分野においてよく知られている。脱核は、単層法を用いて行うのが望ましい。この方法は培養ディスクの生育表面に付着した少数の細胞を利用するもので、ドナー細胞が限られた数しか入手できない場合に理想的である。もう１つの適切な手段である勾配法では、Ｆｉｃｏｌｌ勾配によって細胞を遠心する必要があるため、大量（＞１０７）の細胞の脱核に最も適している。
【０１９８】
単層法。単層法は、生育表面に付着して増殖する細胞であれば、ほぼすべての細胞に適している。
【０１９９】
ポリカーボネート製あるいはポリプロピレン製のねじ蓋付き広口遠心チューブ（容積２５０ｍｌ）をオートクレーブにより滅菌する。キャップは、遠心ボトルへの損傷を防ぐために、ボトルとは別にオートクレーブすることが望ましい。各ボトルに３０ｍｌ ＤＭＥＭ、２ｍｌウシ血清、および０．３２ｍｌサイトカラシンＢ（１ｍｇ／ｍｌ）を無菌的に添加し、脱核手順のための準備をする。ボトルにキャップをはめ、使用時までボトルを３７℃に保温する。
【０２００】
脱核を行う細胞（数百個〜１０５個の細胞）を培養ディッシュ（３５×１５ｍｍ；Ｎｕｎｃ Ｉｎｃ．、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）上に接種する。一般に、細胞を生育表面に最大限に付着させるために、細胞を少なくとも２４時間、ディッシュ上で生育させる。細胞が集密状態にならないようにするのが望ましい。滅菌の目的のため、培養ディッシュ（細胞を含む）の外側の下半分を７０％（ｖ／ｖ）エタノールで拭って遠心の準備をする。これ以外に、細胞培養の間にディッシュをさらに大きい無菌の培養ディッシュ内にいれておくことにより、ディッシュを無菌状態に保つことも可能である。ディッシュから培地を捨て、ディッシュ（蓋なし）を遠心ボトル内で上下逆になるよう置く。
【０２０１】
ローター（ＧＳＡ、ＤｕＰｏｎｔ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）および遠心機は、８０００ｒｐｍで３０〜４５分間遠心することにより、３７℃まで予熱しておくのが望ましい。これ以外に、ＨＳ−４スイングバケットローター（ＤｕＰｏｎｔ）を使用してもよい。最適な遠心時間および速度は、細胞の種類によって異なる。筋原細胞および線維芽細胞の場合には、培養ディッシュの入った遠心ボトルを予熱したローターに入れ、約２０分間遠心する（ローターが目的とする速度に到達してから遠心機のスイッチを切るまでの時間）。６５００から７２００ｒｐｍの速度を用いるのが望ましい。
【０２０２】
遠心が終了した後、遠心ボトルをローターから取り出し、鉗子を用いてボトルから培養プレートを取り出す。細胞の生存能を維持するため、細胞の水分を保つようプレート中に少量の培地を残す。ディッシュの外側を蓋の端も含めて滅菌ワイパーで拭き取った後、９５％（ｖ／ｖ）エタノールを添加し、残りの培地を除去して乾燥させる。滅菌した蓋をディッシュにかぶせる。脱核した細胞の準備がすぐにできない場合には、完全培地（適切な濃度の血清を添加した培地）をディッシュに添加し、細胞をＣＯ２インキュベーター内で維持しなければならない。得られた脱核細胞（核質）を上記の（ｉ）から（ｖｉｉｉ）のいずれかと融合させる。
【０２０３】
本発明に関して、各種の具体的な材料、手順、および例を引用してここに説明し例示しているが、本発明は特定の材料、材料の組み合わせ、および当該目的のために選択した手順に限定されるものではない。このような具体例には数多くの変法があり、本分野における専門家であればその真価が理解できるはずである。
【図面の簡単な説明】
【図１】成人細胞核を、除核ウシ卵母細胞に移植して生成した核移植（ＮＴ）ユニットの写真である。
【図２】図１に示すようなＮＴユニットに由来する胚幹様細胞の写真である。
【図３】図１に示すようなＮＴユニットに由来する胚幹様細胞の写真である。
【図４】図１に示すようなＮＴユニットに由来する胚幹様細胞の写真である。
【図５】図１に示すようなＮＴユニットに由来する胚幹様細胞の写真である。
（発明の分野）
本発明は全般的に、動物あるいはヒト細胞に由来する細胞核を、ドナー核と異種の動物の除核した卵母細胞に移植することによる、胚あるいは幹様細胞の生成に関する。より具体的には、本発明は、霊長類あるいはヒトの細胞核を、例えば霊長類あるいは有蹄類の卵母細胞、および好ましい実施態様においてはウシ除核卵母細胞などの除核した動物卵母細胞に移植することによる、霊長類あるいはヒトの胚あるいは幹様細胞の生成に関する。
【０００２】
さらに本発明は、好ましくは霊長類あるいはヒト胚細胞あるいは幹様細胞である生成した胚あるいは幹様細胞の、治療、診断への応用、同じく治療あるいは診断に用いる分化細胞の生成、およびトランスジェニック胚細胞あるいはトランスジェニック分化細胞、細胞株、組織および臓器の生成を目的とした使用に関する。また、本発明に従って生成した胚あるいは幹様細胞自体を、好ましくはトランスジェニック、クローンあるいはキメラ動物であるキメラあるいはクローンの生成を目的とした核移植において、細胞核ドナーとして用いても良い。
【０００３】
（発明の背景）
Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてマウスの初期着床前胚より胚幹（ＥＳ）細胞株を生成する方法は周知である。（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９：１５４−１５６（１９８１）；Ｍａｒｔｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７８：７６３４−７６３８（１９８１）を参照のこと）。ＥＳ細胞は、線維芽細胞（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｄ．）あるいは分化抑制源（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２１：１−９（１９８７））からなるフィーダー層が存在すれば、未分化段階で継代することが可能である。
【０００４】
ＥＳ細胞は、これまでに様々な用途を有することが報告されている。例えば、ＥＳ細胞を分化のｉｎ ｖｉｔｒｏモデル、特に発生初期の調節に関与する遺伝子の研究に使用できることが報告されている。マウスＥＳ細胞を着床前マウス胚に導入すると、生殖細胞系キメラが成長し、その多能性が証明される（Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０９：２５５−２５６（１９８４））。
【０００５】
ＥＳ細胞は、自らのゲノムを次世代に伝達する能力の点から見ると、所望の遺伝子修飾の有無に関わらず、ＥＳ細胞を用いることにより家畜の生殖細胞系操作にとって有用である可能性がある。さらに、例えば有蹄類などの家畜の場合は、同じく着床前の家畜胚に由来する核が、除核した卵母細胞の発生の完了を助ける（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，４０：１０２７−１０３５（１９８９）；ａｎｄ Ｋｅｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５０：９３５−９３９（１９９４））。このことは、移植後８細胞期を過ぎたマウス胚に由来する細胞核が、除核卵母細胞の発生を助けないと報告されていることと対照的である（Ｃｈｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，４８：９５８（１９９３））。よって家畜由来のＥＳ細胞は、遺伝子操作を加えるか、そうでなければ核移植操作に用いる全能ドナー細胞核の供給源となる可能性があるために、非常に望ましい。
【０００６】
一部の研究グループは、多能性であるといわれている胚細胞株の分離を報告している。例えばＮｏｔａｒｉａｎｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｓｕｐｐｌ．，４３：２５５−２６０（１９９１）は、ヒツジ胚盤胞より免疫手術により摘出した内部細胞塊の一次培養における細胞と、形態および成長の特性が幾分類似しているブタおよびヒツジの胚盤胞より、安定で多能性といわれている細胞株を樹立したと報告している。（Ｉｄ．）また、Ｎａｔａｒｉａｎｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｓｕｐｐｌ．，４１：５１−５６（１９９０）は、ブタ胚盤胞に由来する、多能性と考えられる胚細胞株の培養の保守管理および分化を開示している。さらに、Ｇｅｒｆｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｉｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，６（１）：１−１４（１９９５）では、ブタ胚盤胞由来の胚細胞株の分離を開示している。これらの細胞は、調節培地を用いることなく、マウス胚線維芽細胞フィーダー層で安定に維持される。これらの細胞は、培養中に異なる数種類の細胞型に分化すると報告されている（Ｇｅｒｆｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｄ．）。
【０００７】
さらに、Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｏｕｘ’ｓ Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２０１：１３４−１４１（１９９２）では、ウシ胚幹細胞様細胞株を培養すると３世代継代時は生存したが、第４世代目で消失したと報告している。またさらに、Ｈａｎｄｙｓｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｒｏｕｘ’ｓ Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１９６：１８５−１９０（１９８７）では、マウスＩＣＭ由来のマウスＥＳ細胞が分離する条件下で、免疫手術により摘出した、ヒツジ胚の内部細胞塊の培養法を開示している。Ｈａｎｄｙｓｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）（Ｉｄ．）は、こうした条件下では該ヒツジＩＣＭが接着し、拡散し、かつＥＳ細胞様および内胚葉様細胞の領域を生じせしめるが、長期間培養後は内胚葉様細胞のみが認められると報告している。（Ｉｄ．）
【０００８】
最近、Ｃｈｅｒｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，４１：１７５（１９９４）では、多能性といわれているウシ始原生殖細胞由来の細胞株が、長期間培養で維持されると報告した。これらの細胞は、約７日間培養した後、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）染色に陽性であるＥＳ様コロニーを生成し、胚様体形成能を示し、少なくとも２種類の異なる細胞型に自然分化した。これらの細胞は、報告によると、ＥＳ細胞のみに発現すると考えられているホメオボックス遺伝子パターンである転写因子ＯＣＴ４，ＯＣＴ６およびＨＥＳ１のｍＲＮＡを発現した。
【０００９】
また最近、Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ，３８０：６４−６８（１９９６）は、マウスのＥＳ細胞株の分離を促進する条件下で培養した、９日目のヒツジ胚より摘出して培養した杯盤（ＥＤ）細胞の核移植後に、子ヒツジの産子を生成したと報告した。著者らは、その結果に基づき、９日目ヒツジ胚に由来するＥＤ細胞は、核移植により全能性となり、培養中は全能性が維持されると結論付けた。
【００１０】
Ｖａｎ Ｓｔｅｋｅｌｅｎｂｕｒｇ−Ｈａｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，４０：４４４−４５４（１９９５）は、ウシ胎盤胞の内部細胞塊細胞に由来する、永久的といわれる細胞株の分離および同定を報告した。著者らは、８あるいは９日目のウシ胚盤胞より、最も効果的にウシＩＣＭ細胞の接着および外殖を助けるフィーダー細胞および培地の判定を目的として、様々な条件下でＩＣＭを分離して培養した。著者らは、その結果に基づき、培養ＩＣＭ細胞の接着および外殖は、ＳＴＯ（マウス線維芽細胞）フィーダー細胞（ウシ子宮上皮細胞の代用）の使用、および培地に添加するためのチャコール処理血清（通常血清より優れている）の使用により促進されると結論付けた。しかしＶａｎ Ｓｔｅｋｅｌｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌは、その細胞株が多能性ＩＣＭ細胞よりも上皮細胞に類似していると報告した。（Ｉｄ．）
【００１１】
またさらに、１９９４年１０月２７日に公表されたＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ９４／２４２７４、１９９０年４月５日に公表されたＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ９０／０３４３２、１９９４年１１月２４日に公表されたＷｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ９４／２６８８９では、トランスジェニック動物の生成に使用できるといわれている動物幹細胞の分離、選択および増殖を報告している。また１９９０年４月５日に公表されたＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ９０／０３４３２では、トランスジェニック動物の生成に有用であることが確実であるブタおよびウシに由来する多能性であるといわれている胚幹細胞の生成を報告した。さらに、１９９４年１１月２４日に公表されたＷｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ９４／２６８８４では、キメラおよびトランスジェニック有蹄類の製造に有用であることが確実である胚幹細胞を開示した。このため、前述の事項に基づいて、数多くのグループが、例えばクローン化あるいはトランスジェニック胚の生成および核移植への応用の可能性などにより、ＥＳ細胞株の生成を試みていることは明らかである。
【００１２】
有蹄類ＩＣＭ細胞の核移植への使用についても報告されている。例えば、Ｃｏｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３８：２６４−２６７（１９９４）では、溶解したドナー細胞を除核した成熟卵細胞にマイクロインジェクションすることによる、ウシＩＣＭの核移植を開示している。該参照文献では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚を７日間培養して１５個の胚盤胞を生成し、これをウシレシピエントに移植して妊娠４例と産子２例を得たことを開示した。またＫｅｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５０：９３５−９３９（１９９４）では、胚盤胞の生成を目的とした核移植操作におけるウシＩＣＭ細胞のドナー核としての使用によって生成した胚幹細胞を、ウシレシピエントに移植したところ、数匹の産子が得られたことを開示している。さらに、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：６１４３−６１４７（１９９３）では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで短期間培養したウシＩＣＭ細胞から除核した成熟卵細胞への核移植による仔ウシの生産を開示した。
【００１３】
また、培養した杯盤細胞の核移植後の子ヒツジの生産が報告されている（Ｃｈａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８０：６４−６８（１９９６））。またさらに、核移植におけるウシ多能性胚細胞の使用およびキメラ胎児の生成も報告されている（Ｓｔｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５４：１００−１１０（１９９６））；Ｃｏｌｌａｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３８：２６４−２６７（１９９４）。
【００１４】
さらに、異種間ＮＴ単位の生成が過去に試みられている（Ｗｏｌｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，３３：３５０（１９９０）。具体的には、ウシ胚細胞をヤギュウの卵母細胞と融合し、内部細胞塊を有していると思われる異種間ＮＴユニットをいくつか生成した。しかし、核移植操作におけるドナー核としては、成体細胞ではなく胚細胞を用いた。原則は、胚細胞は生体細胞よりも容易にリプログラミングされることであった。これは、カエルを用いた初期のＮＴ研究にさかのぼる（ＤｉＢｅｒａｒｄｉｎｏによる総説，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，１７：１７−３０（１９８０））。また、この研究は系統発生論的に極めて類似した動物（ウシ細胞核とヤギュウ卵母細胞）が関与するものであった。対比してみると、これまではＮＴにより融合する種の差が大きくなると（ウシ細胞核をハムスター卵母細胞に移植）、内部細胞塊構造は得られらなかった。さらに、ＮＴユニット由来の内部細胞塊細胞を用いて、増殖可能なＥＳ細胞様コロニーを形成するできることは、これまで報告されていない。
【００１５】
また、Ｃｏｌｌａｓ ｅｔ ａｌ（Ｉｄ．）は、ウシ核移植胚の生成を目的とした顆粒膜細胞（成体体性細胞）の使用を報告した。しかし、本発明とは異なり、これらの実験は異種間の細胞核移植に関するものではなかった。また本発明とは異なり、ＥＳ−様細胞コロニーは得られなかった。
【００１６】
最近、１９９８年１２月１日にＪａｍｅｓ Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎに対して発行し、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎに譲渡された米国特許第５，８４３，７８０号では、（ｉ）１年以上にわたってｉｎ ｖｉｔｒｏ培養における増殖が可能で、（ｉｉ）霊長類種の特徴を有する染色体が全て存在し、長期間の培養でも顕著に変化せずに核型を維持し、（ｉｉｉ）培養を通じて内胚葉、中胚葉、外胚葉組織の派生物に分化する可能性を維持し、（ｉｖ）線維芽細胞フィーダー層上で培養したとき分化しない霊長類精製胚幹細胞の調製の開示を意図している。これらの細胞は、報告によるとＳＳＥＡ−１マーカー陰性、ＳＥＡ−３マーカー陽性、ＳＳＥＡ−４マーカー陽性であり、アルカリフォスファターゼ活性を示し、多能性であり、霊長類種の特徴を有する全染色体の存在を含み、染色体のいずれもが変化しない核型を有している。さらに、これらの細胞はＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１マーカーにそれぞれ陽性である。細胞をＳＣＩＤマウスに注入すると、内胚葉、中胚葉、および外胚葉細胞に分化するといわれている。また、ヒトあるいは霊長類胚の胚盤胞に由来するといわれる胚幹細胞株については、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ９２：７８４４−７８４８（１９９５）に論じられている。
【００１７】
このように、Ｔｈｏｍｓｏｎはヒト以外の霊長類およびヒト胚あるいは幹様細胞といわれるものおよびその生成法を開示している。しかし、その顕著な治療および診断における可能性を考えた場合、意図する移植レシピエントにとって自己由来であるヒト胚あるいは幹様細胞を生成する方法の大きな必要性はまだ存在する。
【００１８】
この点に関して、細胞移植によって治療できると思われるヒトの疾患が数多く同定されている。例えば、パーキンソン病は黒質内のドパミン作動性ニューロンの変性に起因する。パーキンソン病の標準的治療法には、ドパミンの消失を一時的に改善するＬ−ＤＯＰＡの投与が含まれるが、重度の副作用を引き起こし、最終的には疾患の進行を回復させることはできない。パーキンソン病の異なる治療法は、数多くの脳疾患および中枢神経損傷の治療への幅広い応用性が期待され、動物の胎児あるいは新生児の細胞あるいは組織の成人脳への移植を含んでいる。脳の様々な領域より採取した胎児ニューロンは、成人脳に組み込まれることが可能である。このような移植片は、実験動物に対して実験的に誘発した、複合認知機能を含む行動欠損を軽減することが証明されている。ヒト臨床試験の最初の試験結果も有望であった。しかし、流産により得られるヒト胎児細胞あるいは組織の供給は極めて限られている。さらに、流産した胎児から細胞あるいは組織を採取することには激しい異論がある。
【００１９】
現在該患者から「胎児様」細胞を生成できる方法はない。さらに、同種移植組織片の確保は容易ではなく、また同種移植片および異種移植片組織は移植片拒絶反応を被る。さらに、移植前の細胞あるいは組織に遺伝子的修飾を施すことが有益と思われる場合もある。しかし、このような修飾が望ましい細胞あるいは組織の多くは、培養時に良好に分割せず、大部分の遺伝子変異の型は急速に分裂する細胞を必要とする。
【００２０】
このため、移植および細胞および遺伝子治療における使用を目的とした、ヒト胚あるいは幹様未分化細胞の供給には、明らかな技術上の必要性がある。
【００２１】
（発明の目的）
本発明の目的は、胚あるいは幹様細胞を生成する新規かつ改善された方法の提供である。
【００２２】
本発明のより具体的な目的は、哺乳動物あるいはヒトの細胞核の、種の異なる除核卵母細胞への移植を包含する、胚あるいは幹様細胞を生成する新規かつ改善された方法の提供である。
【００２３】
本発明のもう１つの具体的な目的は、ヒト以外の霊長類あるいはヒトの細胞核の、例えば有蹄類、ヒトあるいは霊長類の除核卵母細胞などの動物あるいはヒトの除核卵母細胞への移植を包含する、ヒト以外の霊長類あるいはヒト胚あるいは幹様細胞を生成する新規の方法を提供することである。
【００２４】
本発明のもう１つの目的は、ドナー細胞あるいは細胞核と互換性のある（同種の）卵母細胞、割球あるいはその他の胚細胞から細胞質を誘導することにより、異種間核移植の効率を高めることである。
【００２５】
本発明のより具体的な目的は、細胞質がドナー細胞あるいは細胞核と互換性のある（同種あるいは近縁種の）１個あるいはそれ以上の未成熟卵母細胞より細胞質を誘導することにより、異種間核移植の効率を高めることである。このような未成熟卵母細胞は、細胞質の採取およびレシピエント除核卵母細胞への細胞質の導入の前に、任意にｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟、および／あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性化を行っても良い。
【００２６】
本発明のもう１つの目的は、ドナー細胞と同種あるいは近縁種（同種が好ましい）に由来するミトコンドリアＤＮＡを、除核前あるいは除核後に、核移植に使用する異種の卵母細胞に添加、あるいは核移植ユニットに添加（ドナー細胞の誘導後）して異種間核移植の効率を高めることである。
【００２７】
さらに本発明のもう１つの目的は、除核した体性細胞（例えば除核したヒト体性細胞）（核体）を、活性化した、あるいは活性化していない、除核あるいは除核しない、例えばウシなどの異種卵母細胞に融合させるか、あるいは活性化したあるいは活性化していない開裂してもしなくともよい異種間ＮＴユニットと融合することにより、異種間核移植の効率を高めることである。
【００２８】
本発明のもう１つの目的は、例えば成人細胞などの、ヒト以外の霊長類あるいはヒトの細胞核の、ヒト以外の霊長類あるいはヒトの除核卵母細胞への移植を包含する、ヒト以外の霊長類あるいはヒトの系統欠損胚あるいは幹様細胞の新規の製造法を提供することであり、この場合、このような細胞は、例えばアンチセンスあるいはリボジームテロメラーゼ遺伝子の発現の操作など、遺伝子的に加工を受けて、個別の細胞系統への分化が不可能となっているか、あるいは修飾を受けて細胞が「致死的」となっているために、産子が生じなくなっている。
【００２９】
さらに本発明のもう１つの目的は、核移植の効率を高めること、具体的には例えばＭＨＣ Ｉファミリー、また特にＱ７および／あるいはＱ９などのＰｅｄ遺伝子などの、胚の発生を促進する遺伝子の発現をもたらすことを目的とした核移植に用いた遺伝子操作ドナー体性細胞による核移植により生成した着床前の胚の発生の促進である。
【００３０】
本発明のもう１つの目的は、ＢＡＸ，Ａｐａｆ−１などの細胞死遺伝子あるいはカプサーゼあるいはその一部、あるいはデメチラーゼをコードするアンチセンスＤＮＡの発現をもたらす核移植前あるいは核移植後の導入遺伝子の導入により、例えば異種間核移植胚などの核移植胚の生成を促進することである。
【００３１】
さらに本発明のもう１つの目的は、ＩＶＰによる核移植胚の生成、より具体的には、例えばＢｃｌ−２あるいはＢｃｌ−２ファミリー遺伝子などのアポトーシスを阻害する遺伝子の発現をもたらすＤＮＡ構成の導入、および／あるいは胚発生の初期段階でアポトーシスを誘導する遺伝子に特異的なアンチセンスリボジームの発現などにより、核移植に用いるドナー細胞の遺伝子を変化させてアポトーシスに耐性とすることによる核移植胚の生成の促進である。
【００３２】
さらに本発明のもう１つの目的は、例えばＧ１期などの特定の細胞周期にあるドナー細胞の改善された選別法によって、ＤＮＡ構成が、例えば視覚化（例えば蛍光タグなど）マーカー蛋白などの検出可能なマーカーと結合した特定のサイクリンをコードするようなドナー細胞の遺伝子操作による核移植の効率を改善することである。
【００３３】
また本発明の目的は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成した胚を、好ましくは１種類あるいはそれ以上のカプサーゼ阻害物質である、１種類あるいはそれ以上のプロテアーゼ阻害物質の存在下で培養してアポトーシスを阻害することにより、こうした胚の発生を促進することである。
【００３４】
本発明のもう１つの目的は、動物あるいはヒト細胞核の異種の除核卵母細胞への移植により生成した胚あるいは幹様細胞を提供することである。
【００３５】
本発明のより具体的な目的は、霊長類あるいはヒト細胞核の、例えばヒト、霊長類あるいは有蹄類除核卵細胞などの除核動物卵母細胞への移植により生成した霊長類あるいはヒト胚あるいは幹様細胞を提供することである。
【００３６】
本発明のもう１つの目的は、このような胚あるいは幹様細胞を治療あるいは診断目的で使用することである。
【００３７】
本発明の具体的な目的は、このような霊長類あるいはヒト胚あるいは幹様細胞を、細胞、組織あるいは臓器の移植が治療上あるいは診断上有益である何らかの疾患の治療あるいは診断を目的として使用することである。
【００３８】
本発明のもう１つの具体的な目的は、本発明に従って生成した胚あるいは幹様細胞を、分化細胞、組織あるいは臓器の生成を目的として使用することである。
【００３９】
本発明のより具体的な目的は、本発明に従って生成した霊長類あるいはヒト胚あるいは幹様細胞を、ヒト分化細胞、組織あるいは臓器の生成を目的として使用することである。
【００４０】
本発明のもう１つの具体的な目的は、本発明に従って生成した胚あるいは幹様細胞を、例えば遺伝子治療の用途を有する、遺伝子操作したあるいは形質転換した分化ヒト細胞、組織あるいは器官の生成に用いることができる細胞より構成される、遺伝子操作した胚あるいは幹様細胞の生成を目的として使用することである。
【００４１】
本発明のもう１つの具体的な目的は、本発明に従ってｉｎ ｖｉｔｒｏで生成した胚あるいは幹様細胞を、例えば細胞の分化および薬物の試験などのための分析を目的として使用することである。
【００４２】
本発明のもう１つの目的は、本発明に従って生成した胚あるいは幹様細胞より生成した同系の細胞、組織あるいは臓器の利用を具備する、改善された移植療法を提供することである。このような治療法は、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄損傷、多発性硬化症、筋ジストロフィー症、糖尿病、肝疾患、心疾患、軟骨の置換、熱傷、血管疾患、尿路疾患の他とりわけ免疫欠損、骨髄移植、癌などを含む疾患および損傷の治療を例として含んでいる。
【００４３】
本発明のもう１つの目的は、本発明に従って生成した、形質転換あるいは遺伝子操作胚あるいは幹様細胞を、遺伝子治療、特に上で特定した疾患および損傷の治療および／あるいは予防を目的として使用することである。
【００４４】
本発明のもう１つの目的は、本発明に従って生成した胚あるいは幹様細胞、あるいは本発明に従って生成したトランスジェニックあるいは遺伝子操作胚あるいは幹様細胞を、核移植用の核ドナーとして使用することである。
【００４５】
さらに本発明のもう１つの目的は、本発明に従って生成した遺伝子操作ＥＳ細胞を、例えばヒト以外の霊長類、げっ歯類、有蹄類などのトランスジェニック動物の生成を目的として使用することである。このようなトランスジェニック動物は、ヒト疾患の動物モデルなどの生成を目的として、あるいは治療用あるいは栄養薬学用などの所望のポリペプチドの生成を目的として使用することができる。
【００４６】
本発明の前述およびその他の目的、長所および特徴を以下で明らかにすれば、後述の発明の好ましい態様の詳細な説明、および添付した請求項を参照することにより、本発明の性質をさらに明らかに理解することができる。
【００４７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、胚あるいは幹様細胞、より具体的には、核移植によるヒト以外の霊長類あるいはヒトの胚あるいは幹様細胞の新規生成法を提供する。標題の出願においては、核移植あるいはＮＴは互換的に使用される。
【００４８】
上述のように、核移植による胚あるいは幹様細胞の分離の実現については報告されていない。むしろ、これまでに報告されたＥＳ様細胞の分離は、受精胚由来のものであった。また、遺伝的に類似していない種の細胞あるいはＤＮＡ、あるいはより具体的には、ある種（例えばヒトなど）の成体細胞あるいはＤＮＡおよび他の非近縁種の卵母細胞による核移植の成功は報告されていない。むしろ、例えばウシ−ヤギおよびウシ−ヤギュウなどの近縁種の細胞の融合により生成した胚について報告されているが、これらはＥＳ細胞を生成しなかった。（Ｗｏｌｆｅ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，３３（１）：３５０（１９９０））。また、非胎児組織源に由来する霊長類あるいはヒトＥＳ細胞の生成法も報告されていない。むしろ、現在入手できる限られたヒト胎児細胞および組織は、自然流産組織および流産胎児より入手あるいは由来しなければならない。
【００４９】
また、本発明以前には、異種間核移植によって胚あるいは幹様細胞を得た者はいなかった。
【００５０】
非常に予測し難いことであったが、本発明者は、ヒト胚あるいは幹様細胞および細胞コロニーがヒト細胞核の移植によって得られること、例えば分化した成人細胞を核移植（ＮＴ）ユニットの生成に使用する除核した動物卵母細胞に移植し、これらの細胞を培養するとヒト胚および幹様細胞あるいは細胞コロニーが生成することなどを発見した。この結果は、分化したドナー細胞あるいは核を、遺伝的に類似していない種の除核した卵母細胞に導入する、例えば分化した動物あるいはヒト細胞の核、例えば成体細胞を他種の動物の除核した卵に移植するなどして、適切な条件下で培養すれば胚あるいは幹様細胞及び細胞コロニーを生成する細胞を含む核移植ユニットを生成することを含む、有効な異種間核移植の最初の証明であるため、非常に驚異的なものである。
【００５１】
レシピエント卵母細胞は、好ましくは（ｉ）ドナー細胞あるいは細胞核および（ｉｉ）互換性のあるミトコンドリアＤＮＡあるいは互換性のある細胞質のうち少なくとも１つを組み合わせて移植する。本明細書中の「互換性がある」という用語は、ミトコンドリアＤＮＡあるいは細胞質がドナー細胞あるいは細胞核と同種、あるいはドナー細胞あるいは細胞核と極めて近い種の細胞に由来することを意味する。例えば、ドナー細胞あるいは細胞核がヒト細胞あるいは細胞核である場合、ミトコンドリアＤＮＡあるいは細胞質はヒト由来、あるいは例えばチンパンジー、ゴリラ、あるいはヒヒなどの高等霊長類のものとなるであろう。同様に、ドナー細胞あるいは細胞核がウシ細胞あるいは細胞核であれば、互換性のある細胞質は近縁種である有蹄類、例えば水牛などの細胞質となるであろう。最も好ましくは、互換性のあるミトコンドリアＤＮＡおよび／あるいは細胞質がドナーと同種の細胞に由来し、また最も好ましくは、ドナー細胞あるいは細胞核と同一の個体に由来する。
【００５２】
好ましい実施態様では、細胞質は未熟卵母細胞あるいは割球に由来し、このような未熟卵母細胞より細胞質を採取する前に、これを適宜ｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟および／あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化させてもよい。ヒト卵母細胞を含む卵母細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化する方法については後述する。同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで卵母細胞を成熟させる方法は文献に報告されている。
【００５３】
好ましくは、ＥＳ様細胞の生成に用いられているＮＴユニットは、細胞の個数が少なくとも２〜４００個となる大きさ、好ましくは４〜１２８個、最も好ましくは少なくとも約５０個となる大きさまで培養する。
【００５４】
本発明では、胚あるいは幹様細胞は本発明に従って生成した細胞を意味する。本明細書では、このような細胞が代表的に生成される方法、すなわち異種間核移植による生成から、これを幹細胞ではなく幹様細胞と呼ぶ。これらの細胞は通常の幹細胞と類似した分化能を有することが予測されるが、その生成方法によりわずかな差を有することがある。例えば、これらの幹様細胞は核移植に用いた卵母細胞のミトコンドリアを有すると思われるので、従来の胚幹細胞と同一の挙動を示さないか、あるいは形態学的に同一でない場合がある。
【００５５】
この発見は、成人細胞核の核移植、具体的にはヒトドナーの口腔より採取したヒト上皮細胞を、除核したウシ卵母細胞に移植すると、核移植ユニットを形成し、その細胞を培養するとヒト幹様あるいは胚細胞およびヒト胚あるいは幹様細胞コロニーを形成するという所見に基づいてなされた。最近この結果は、成人から採取した角化細胞を除核ウシ卵母細胞に移植して、胚盤胞およびＥＳ細胞株の生成に成功したことにより、再現された。これに基づき本発明者らは、ウシ卵母細胞とヒト卵母細胞、またおそらく一般的哺乳類卵母細胞は、胚発生中に成熟過程を経なければならず、ウシ卵母細胞がヒト卵母細胞の有効な置換物あるいは代替物として機能できるように、この過程が十分に類似しているかあるいは維持されているという仮説を立てている。明らかに、一般的な卵母細胞は自然の状態でおそらくはタンパク質あるいは核酸である因子を具備し、これが適当な条件下で胚の発生を誘発し、これらの機能は異種間で同じであるか、あるいは極めて類似している。これらの因子はＲＮＡ物質および／あるいはテロメラーゼを具備していると思われる。
【００５６】
ヒト細胞核をウシ卵母細胞に有効に移植することができるという事実に基づけば、ヒト細胞を、例えば有蹄類その他の動物などの、他の非近縁種卵母細胞に移植できると予測することは妥当である。特に、例えばブタ、ヒツジ、馬、ヤギなどの他の有蹄類の卵母細胞がふさわしいはずである。また例えばチンパンジー、マカク類、ヒヒ、ゴリラ、アカゲザルなどの他の霊長類に由来する卵母細胞、両生類、げっ歯類、ウサギ、モルモットなどの他の動物に由来する卵母細胞もふさわしいはずである。さらに、同様の方法を用いて、ヒト細胞あるいはヒト細胞核をヒト卵母細胞に移植し、生成した胚盤胞を用いてヒトＥＳ細胞を生成することも可能なはずである。
【００５７】
このため、その最も広範な実施態様においては、本発明は動物あるいはヒト細胞核、または動物あるいはヒト細胞の、ドナー細胞核と異なる種の（好ましくは除核した）卵母細胞への、注入あるいは融合による移植、さらに胚あるいは幹様細胞および／あるいは細胞培養を得るのに用いることのできる細胞を含んだＮＴユニットを生成することを目的とした前記レシピエント卵母細胞への、好ましくはドナー細胞あるいは細胞核と同種である互換性のあるミトコンドリアＤＮＡおよび／あるいは細胞質の注入を適宜含む。除核（卵母細胞内の細胞核の除去）は核移植の前あるいは核移植後に実施することができる。例えば本発明は、有蹄類細胞核あるいは有蹄類細胞の、注入あるいは融合による、例えば他の有蹄類あるいは非有蹄類などの異種の除核卵母細胞への移植を含むことがあり、この注入あるいは融合により細胞および／あるいは細胞核を結合してＮＴユニットを生成し、次に、好ましくは少なくとも約２〜２００個、より好ましくは４〜１２８個、最も好ましくは少なくとも約５０個の細胞を含む多細胞ＮＴユニットを得るのに適した条件下で培養する。このようなＮＴユニットの細胞は、培養時に胚あるいは幹様細胞あるいは細胞コロニーを生成するのに用いることができる。
【００５８】
本発明の好ましい該実施態様は、ドナーヒト細胞核あるいはヒト細胞を、例えば有蹄類卵母細胞などの除核したヒト、霊長類、あるいは霊長類以外の動物の卵母細胞に、また好ましい実施態様においては、ウシ除核卵母細胞に移植することによる、ヒト以外の霊長類あるいはヒト胚あるいは幹様細胞の生成を具備している。好ましくは、除核卵母細胞に、ヒト細胞質（例えば少なくとも１個以上の未成熟あるいは成熟卵母細胞あるいは割球）を注入、あるいは核体？？？？？（除核ヒト卵母細胞あるいは割球、あるいは高等霊長類の卵母細胞あるいは割球）および／あるいはヒトミトコンドリアＤＮＡと融合せしめる。
【００５９】
一般的に、胚あるいは幹様細胞は、以下の手順からなる核移植操作により生成される：
（ｉ）ドナー細胞核源として用いる所望のヒトあるいは動物細胞を採取する（遺伝的に改変が加えられていても良い）；
（ｉｉ）例えば哺乳類、より好ましくは霊長類あるいはウシなどの有蹄類の卵母細胞源などの適当な採取源より卵母細胞を採取する；
（ｉｉｉ）前期卵母細胞から細胞内の核を除去して除核する；
（ｉｖ）ヒトあるいは動物の細胞、あるいは細胞核を、ドナー細胞あるいは細胞核と異種の除核卵母細胞に、例えば融合あるいは注入などにより移植、ただし手順（ｉｉｉ）および（ｉｖ）はどちらを先に実施しても良い；
（ｖ）生成したＮＴ生成物あるいはＮＴユニットを培養して、複数の細胞からなる構造物（識別可能な内部細胞塊を有する胚様体構造物）を生成；
（ｖｉ）前記胚から得られた細胞を培養して胚あるいは幹様細胞および幹様細胞コロニーを得る。
【００６０】
前述のように、核移植操作には、好ましくは互換性のある、すなわちドナー細胞あるいは細胞核と同種あるいは近縁種に由来するミトコンドリアＤＮＡおよび／あるいは細胞質の導入も含める。この実施はドナー細胞あるいは細胞核のレシピエント卵母細胞への導入の前でも、同時でも、あるいは後でも良い。好ましくは、互換性のある細胞質および／あるいはミトコンドリアＤＮＡは、ドナー細胞あるいは細胞核のレシピエント卵母細胞への導入後早い時点、すなわちこのような導入より約２４時間以内に、より好ましくはこのような導入より約６時間以内に、最も好ましくはこのような導入より約２〜４時間以内に導入する。
【００６１】
互換性のある細胞質の採取源には、卵母細胞から多数得ることができる未成熟卵母細胞を特に含める。例えばヒトの場合は、例えば子宮摘出術を受けた女性など同意を得たドナーの卵巣から卵母細胞を採取することができる。
【００６２】
このような未熟な卵母細胞から細胞質を採取する前に、これをｉｎ ｖｉｔｒｏで適宜成熟させる。卵母細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させる方法は、その全文を本明細書に参照文献として引用している米国特許第５，９４５，５７７号に記載されている。
【００６３】
さらに、このような未成熟の卵母細胞から細胞質を採取する前に、これをさらにｉｎ ｖｉｔｒｏで適宜活性化することができる。ヒト卵母細胞を含む卵母細胞を単為発生的に活性化させる方法は周知である。Ｉｎ ｖｉｖｏでの卵母細胞活性化法の例は、その全文を本明細書に参照文献として引用している米国出願番号Ｎｏ．０８／８８８，０５７に記載されている。Ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化させる好ましい方法には、ＤＭＡＰとイオノマイシンの使用、およびシクロヘキサミドとイオノマイシンの使用が含まれる。
【００６４】
レシピエント卵母細胞に導入する細胞質の量は、好ましくは細胞の容積を最大で５倍にし、好ましくは約２倍を上回らず、最も好ましくは約１ １／２倍を上回らない量とする。これは、互換性のある卵母細胞に由来する細胞質をレシピエント卵母細胞に注入するか、あるいはその代わりに互換性のある卵体（レシピエント卵母細胞と同種であるか、極めて近縁である種の除核卵母細胞）のレシピエント卵母細胞と融合することにより実施することができる。適宜、レシピエント卵母細胞の細胞質の全体あるいは一部を除去し、互換性のある卵体を導入する容積を増加せしめることができる。文献では、そのことに関して、適切な細胞核／細胞質の比率および細胞の容積の維持が、胚盤胞の形成および発生において重要であることが示唆されている（Ｋａｒｙｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ，Ｒｅｐｒｏｄ，Ｎｕｔｒ．Ｄｅｖｅｌ．３８（６）：６６５−６７０）。
【００６５】
本発明者らはその考えに従うことを望まないが、卵母細胞の細胞質内には胚形成を助ける、例えば核酸配列および／あるいはタンパク質などの成分が存在するという仮説があり、このような因子は系統発生的に異なる種間である程度保たれていると考えられ、種の相違は異種間核移植の有効性を妨げるほどに重要であるという理論がある。よって、本発明者らは、このような有効性の問題を、胚形成を促進する同種あるいは極めて近い種の成分を含んでいると思われる互換性のある細胞質を導入することで軽減することを意図している。
【００６６】
上記のように、互換性のある、すなわちドナー細胞あるいは細胞核と同種あるいは極めて近い種のミトコンドリアＤＮＡを導入することにより、クローン化の有効性も改善することができる。この導入の実施は、ドナー細胞あるいは細胞核の導入前でも、導入と同時でも、あるいは導入後でも可能である。本質的に、本発明のもうひとつの目的は、ドナー細胞あるいは細胞核と同種あるいは極めて近い種のミトコンドリアＤＮＡを、移植の前後、活性化の前後、および融合と開裂の前後にレシピエント卵母細胞に導入することによる、例えば異種間核移植などの核移植の有効性の改善である。好ましくは、ドナー細胞がヒト細胞であれば、ヒトミトコンドリアＤＮＡを、同じドナーに由来する例えば肝細胞および組織などから採取する。
【００６７】
ミトコンドリアの分離法は技術上周知である。ミトコンドリアは組織培養中の細胞、あるいは組織より分離することができる。個々の細胞あるいは組織は個々のドナー細胞に依存する。ミトコンドリア採取源として使用できる細胞あるいは組織の例には、線維芽細胞、上皮、肝臓、肺、角化細胞、胃、心臓、膀胱、膵臓、食道、リンパ球、単球、単核球、卵丘細胞、子宮細胞、胎盤細胞、腸細胞、造血細胞、卵母細胞、およびこのような細胞を含む組織が含まれる。
【００６８】
例えば、ミトコンドリアは組織培養細胞およびラット肝臓から分離することができる。同一のあるいは類似した操作を用いて、他の細胞および組織、すなわちヒト細胞および組織からミトコンドリアを分離することができると予測される。上記のように、好ましいミトコンドリア採取源には、ヒト肝臓組織が含まれるが、これは、こうした細胞が多数のミトコンドリアを含んでいるからである。当業者は、個別の細胞株あるいは組織に応じて、該操作に必要な改変を行うことができる。分離したＤＮＡは、所望すれば例えば密度勾配遠心法などの既知の方法でさらに精製することもできる。
【００６９】
生成した分離ミトコンドリアＤＮＡは、レシピエント卵母細胞に注入するのが好ましい。好ましくは、１個あるいは数個の細胞から分離したミトコンドリアＤＮＡを全て導入して、レシピエント卵母細胞に互換性のあるミトコンドリアＤＮＡの完全な成分を確保せしめる。好ましくは、ミトコンドリアＤＮＡは自己採取源、すなわちドナー細胞あるいは細胞核の採取源であるヒト被験者、あるいは近縁者などこの被験者と遺伝的に互換性のあるヒトから採取した細胞あるいは組織から得る。また、互換性のあるミトコンドリアを未成熟卵母細胞より採取し、互換性のある細胞質とともに導入することができる。
【００７０】
本発明で利用することのできる個別の核移植は、文献に報告されており、発明の背景の項で引用されている様々な参照文献に記載されている。特に、その全文を本明細書に参照文献として引用しているＣｈａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，４３：１８１（１９９５）：Ｃｏｌｌａｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔ Ｄｅｖ．，３８：２６４−２６７（１９９４）；Ｋｅｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５０：９３５−９３９（１９９４）；Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：６１４３−６１４７（１９９３）；ＷＯ ９４／２６８８４；ＷＯ ９４／２４２７４およびＷＯ ９０／０３４３２を参照のこと。また米国特許第４，９４４，３８４号および５，０５７，４２０号は、ウシ核移植の操作について記載している。また、いずれもその全文を本明細書に参照文献として引用しているＣｉｂｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８０：１２５６−１２５８（１９９８），米国特許第５，９４５，５７７号；ＷＯ ９７／０７６６９；ＷＯ ９７／０７６６８およびＷＯ ９６／０７７３２も参照のこと。
【００７１】
ヒト、あるいは好ましくは哺乳類細胞である動物細胞は、周知の方法により採取し、培養することができる。本発明において有用であるヒトおよび動物細胞には、例として、上皮、神経細胞、表皮細胞、角化細胞、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴリンパ球）、その他の免疫細胞、赤血球、マクロファージ、メラニン細胞、単球、単核球、幹細胞、線維芽細胞、心筋細胞、およびその他の筋肉細胞などが含まれる。さらに、核移植に用いられるヒト細胞は、皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器官、膀胱、腎臓、尿道、および他の泌尿器などの様々な臓器より得ることができる。これらは適したドナー細胞の実例である。
【００７２】
適したドナー細胞、すなわち標題の発明に有用な細胞は、身体のあらゆる細胞あるいは臓器から得ることができる。これには全ての体性細胞および胚細胞が含まれる。好ましくは、ドナー細胞あるいは細胞核は活発に分裂、すなわち非休止期にある（Ｇ１，ＳあるいはＭ細胞周期）細胞を含み、このような細胞はクローン化効率を高めると報告されている。さらにより好ましくは、このようなドナー細胞はＧ１細胞周期にある。しかし、休止期のドナー細胞（Ｇ０）も本発明の範囲内にある。例えば適切な培養条件で、血清の欠乏により、休止期細胞を採取することができる。
【００７３】
生成した胚盤胞は、その全文を本明細書に参照文献として引用しているＴｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：１１４５−１１４７（１９９８）およびＴｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９２：７５４４−７８７８（１９９５）で報告されている培養法に従い、胚幹細胞株を得るのに用いることができる。
【００７４】
一方、識別可能な内部細胞塊を有する生成した胚盤胞は、その全文を本明細書に参照文献として引用している米国特許第５，９０５，０４２号に開示された方法に従い培養することができる。この方法は、フィーダー層上での内部細胞塊の全体あるいはその一部の培養を本質的に具備し、このとき該フィーダー層との接触は培養期間を通して維持されている。この培養法は、培養を続けると培養した内部細胞塊の一部、すなわちＥＳ様の外観を有する細胞を含む培養された内部細胞塊の最外部の選択的除去をさらに具備する。次にこの細胞コロニーの最外部を、代表的には胎児線維芽細胞であるもう１つのフィーダー層上に導入する。この方法は、組織培養において未分化（胚幹）細胞、すなわちＥＳ様の形態を示し、フィーダー層より除去すると他の細胞型に分化する細胞の維持をもたらすことが判明している。
【００７５】
後述の例では、核移植ドナーとして使用される細胞はヒトドナーの口腔から採取した上皮細胞、および成人角化細胞であった。しかし、論じたように、開示された方法は他のヒト細胞あるいは細胞核に適用可能である。さらに、細胞核はヒト体性細胞からも、胚細胞からも採取することができる。
【００７６】
また、技術上既知の適当な方法を用いて、核移植前にドナー細胞を有糸分裂期で停止させることも可能である。様々な段階で細胞周期を止める方法は、その全文を参照文献として本明細書中に引用している米国特許第５，２６２，４０９号で幅広く検討されている。特に、シクロヘキサミドは有糸分裂阻害作用を有すると報告されているが（Ｂｏｗｅｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ（１９５５） Ｊ．Ｈｅｒｅｄｉｔｙ，４５：３−９）、電気パルス処理と組み合わせた場合は、成熟ウシ濾胞卵母細胞の活性化の改善に用いることもある（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，４２（Ｓｕｐｐｌ．１）：１１７）。
【００７７】
接合体遺伝子活性化はヒストンＨ４の過アセチル化を伴う。トリコスタチンＡは、ヒストンデアセチラーゼを、他の化合物と同様に可逆的に阻害することが証明されている（Ａｄｅｎｏｔ ｅｔ ａｌ，“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｈ４ ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｅｒｎａｌ ａｎｄ ｍａｔｅｒｎａｌ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｐｒｅｃｅｄｅｓ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｐｒｏｎｕｃｌｅｉ ｏｆ １−ｃｅｌｌ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ．”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ （Ｎｏｖ．１９９７）１２４（２２）：４６１５−４６２５；Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．“Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ Ａ ａｎｄ ｔｒａｐｏｘｉｎ：ｎｏｖｅｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ”Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ （Ｍａｙ，１９９５） １７（５）：４２３−４３０）。
【００７８】
例えば、酪酸もヒストンデアセチラーゼを阻害することによりヒストン過アセチル化を惹起すると考えられている。酪酸は、全般的に遺伝子の発現を変化せしめ、ほとんど全ての場合これを細胞培養に添加することにより細胞の成長を止めると見られる。細胞の成長停止を目的とした酪産の使用は、その全文を本明細書に参照文献として引用している米国特許第５，６８１，７１８号に記載されている。よってドナー細胞は、融合前にトリコスタチンＡあるいはその他の適切なデアセチラーゼ阻害物質に曝露するか、あるいはゲノムを活性化する前にこの様な化合物を培地に添加しても良い。
【００７９】
さらに、ＤＮＡの脱メチル化は、転写因子がＤＮＡ調節配列に適切に接触するための要件と考えられている。着床前の胚の８細胞期〜胚盤胞期におけるＤＮＡ全体の脱メチル化については、すでに報告されている（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．＆ Ｄｅｖ．，４７（４）：４２１−４２９）。また、Ｊａｅｎｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９７）は、５−アザシチジンを用いて細胞内のＤＮＡのメチル化レベルを低下させることにより、転写因子のＤＮＡ調節配列への接触が増大する可能性があると報告している。よって、融合前のドナー細胞を５−アザシチジン（５−Ａｚａ）に曝露するか、あるいは８細胞期〜胚盤胞期の培地に５−Ａｚａを添加しても良い。これに替えて、ＤＮＡを脱メチル化する他の既知の方法を用いても良い。
【００８０】
核移植のレシピエントとして、あるいは互換性のある細胞質の回収に用いられる卵母細胞は、哺乳類および両生類を含む動物から採取することができる。卵母細胞の採取に適した哺乳動物には、ヒツジ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヤギ、モルモット、マウス、ハムスター、ラット、霊長類、ヒトなどが含まれる。好ましい該実施態様では、霊長類、あるいは例えばウシなどの有蹄類より卵母細胞を採取する。ヒト卵母細胞の場合、適当な採取源には、子宮摘出術を受ける患者など同意を得た女性から採取した卵巣が含まれる。
【００８１】
卵母細胞の分離法は技術上周知である。これは、本質的に例えばウシなどの哺乳類あるいは両生類の卵巣あるいは生殖管からの卵母細胞の分離を具備する。ウシ卵母細胞が容易に入手できる採取源は、屠畜場から得られる材料である。
【００８２】
遺伝子操作、核移植およびクローン化などの技術を成功裏に使用するために、核移植のレシピエントとして使用できるようになるまで卵母細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させるのが好ましい。この操作は、全般的に、例えば屠畜場より入手したウシ卵巣などの動物の卵巣より未成熟（第Ｉ相）の卵母細胞を採取し、受精あるいは除核前に卵母細胞を成熟培地内で成熟させて、卵母細胞を、ウシ卵母細胞の場合は一般的に吸引後１８〜２４時間で起こる減数第二分裂中期とする必要がある。本発明の用途では、この期間は「成熟期間」として知られる。本明細書で期間の計算に用いられているように、「吸引」は、卵胞からの未成熟卵母細胞の吸引を意味する。
【００８３】
さらに、ｉｎ ｖｉｖｏで成熟させた減数第二分裂中期卵母細胞は、核移植術で成功裏に使用されている。例えば、成熟減数第二分裂中期卵母細胞は、非過剰排卵あるいは過剰排卵雌ウシあるは若雌ウシから、発情開始、あるいはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）あるいは類似のホルモンの注射より３５〜４８時間後に外科的に採取することができる。また、例えばヒツジ、ヤギ、ブタなどの他の種からもｉｎ ｖｉｖｏ成熟卵母細胞を採取することができる。
【００８４】
除核時および核移植時の卵母細胞の成熟段階は、ＮＴ法の成功にとって重要であると報告されている。（例えばＰｒａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，４８，１−８，１９９１などを参照のこと）。全般的に、過去の哺乳類胚クローン化の成功例では、減数第二分裂中期においては卵母細胞は導入した核を受精精子と同様に扱えるまでに「活性化」が可能で、あるいは十分に「活性化」されると考えられるので、この段階の卵母細胞がレシピエント卵母細胞として使用された。家畜、特にウシでは、卵母細胞の活性化期は一般的に吸引より約１６〜５２時間後、好ましくは吸引より約２８〜４２時間後である。
【００８５】
例えば、未成熟卵母細胞は、Ｓｅｓｈａｇｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，４０．５４４−６０６，１９８９に報告されているように、ＨＥＰＥＳ緩衝化ハムスター胚培養培地（ＨＥＣＭ）内で洗浄し、３９℃でウシ胎児血清を１０％含んだ５０μｌの組織培養培地（ＴＣＭ）１９９に黄体形成ホルモン（ＬＨ）および卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）などの適切なゴナドトロピンを含ませた成熟培地数滴の中に移し、軽量パラフィンあるいはシリコン層の下にエストラジオールを入れる。
【００８６】
代表的には約１０〜４０時間、また好ましくは約１６〜１８時間であり、ｉｎ ｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれで行っても良い一定の成熟期間の後で、卵母細胞を除核するのが好ましいであろう。除核の前に、好ましくは卵母細胞を取り出して１ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼを含んだＨＥＣＭに入れたのち卵丘細胞を摘出する。これは、内径の極めて小さいピペットによる反復ピペッティングか、あるいは短時間の振盪により行う。次に皮膜を取った卵母細胞を極体によってスクリーニングし、極体があれば減数第二分裂中期卵母細胞であると判定してこれを選択し、引き続き核移植に使用する。代表的にはこの時期に除核を実施する。しかし、ドナー細胞核は内生細胞核と容易に識別できるので、除核の実施はドナー細胞あるいは細胞核の導入前でも導入後でも良い。
【００８７】
除核は、その全文を本明細書に参照文献として引用している米国特許第４，９９４，３８４号に記載されているような既知の方法で実施することができる。例えば、減数第二分裂中期卵母細胞は、迅速除核用に適宜７．５μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢを含んだＨＥＣＭに入れるか、あるいは、例えばＣＲ １ａａに１０％発情期雌ウシ血清を加えたものなどの適当な培地に入れても良く、その後好ましくは２４時間未満経過後、より好ましくは１６〜１８時間後に除核してもよい。
【００８８】
除核は、マイクロピペットを用いた顕微手術により、極体および付属する細胞質を除去して行うことができる。次に卵母細胞をスクリーニングし、除核に成功した卵母細胞を同定することができる。このスクリーニングは、１μｇ／ｍｌの３３３４２ Ｈｏｅｃｈｓｔ染色剤のＨＥＣＭ溶液で卵母細胞を染色し、卵母細胞に紫外線を１０秒未満照射して観察することで実施できる。除核に成功した卵母細胞は、次に適切な培地に移すことができる。
【００８９】
本発明では、レシピエント卵母細胞は、代表的にはｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟開始より約１０〜約４０時間後の間、より好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟開始より約１６〜約２４時間後、最も好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟開始より約１６〜１８時間後に除核する。除核の実施は核移植前でも、核移植と同時でも、あるいは核移植後でもよい。また、除核の実施は活性化の前でも、活性化の後でも、あるいは活性化と同時でも良い。
【００９０】
代表的には除核した卵母細胞と異種である１個の動物あるいはヒト細胞あるいはその細胞核は、その後代表的には除核されているＮＴユニットの生成を目的として用いられる卵母細胞の囲卵腔に移植する。しかし、その代わりに、核移植後に内生核の除去を実施しても良い。動物あるいはヒト細胞あるいは細胞核および除核した卵母細胞は、技術上既知の方法に従いＮＴユニットを生成することを目的として用いられる。例えば、細胞を電気融合法で融合してもよい。電気融合は、原形質膜を一過的に破壊するのに十分な電気パルスを与えて行う。原形質膜は速やかに修復されるため、この原形質膜の破壊はきわめて短時間である。本質的に、隣接する２枚の膜の破壊が誘導されれば、修復時に脂質２層膜が混合し、２個の細胞の間に小さなチャネルが開くであろう。このような小さな開口部は熱力学的に不安定であるため、２個の細胞が１つになるまで拡大する。この過程についての更なる議論についての参照文献は、Ｐｒａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．による米国特許第４，９９７，３８４号（その全文を参照文献として本明細書に引用）である。例えばショ糖、マンニトール、ソルビトール、およびリン酸緩衝化溶液を含む様々な電気融合培地を用いることができる。センダイウイルスを細胞融合誘導物質として用いて融合を行うこともできる（Ｇｒａｈａｍ，Ｗｉｓｔｅｒ Ｉｎｏｔ．Ｓｙｍｐ．Ｍｏｎｏｇｒ．９，１９，１９６９）。
【００９１】
また一部の例（例えばドナー細胞核が小さい場合など）では、細胞核を電気穿孔融合法を用いることなく、直接卵母細胞に注入するのが好ましいであろう。このような方法は、Ｃｏｌｌａｓ ａｎｄ Ｂａｒｎｅｓ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３８：２６４−２６７（１９９４）に開示されており、その全文が本明細書中に参照文献として引用されている。
【００９２】
好ましくは、ヒトあるいは動物細胞および卵母細胞を、卵母細胞の成熟開始より約２４時間後に９０〜１２０Ｖの電気パルスを１５μ秒間適用して５００μｍチャンバー内で電気融合する。融合後、生成した融合ＮＴユニットは、好ましくは活性化するまで、例えば上記で指定した培地などの適切な培地内に入れておく。代表的には、この後すぐに活性化を、代表的には２４時間未満経過後、好ましくは４〜９時間後に実施するであろう。しかし、核移植の前あるいは直前（同時）に、除核されている、あるいはされていないレシピエント卵母細胞を活性化することも可能である。例えば、核移植より約１２時間前〜核移植より約２４時間後に活性化を実施してもよい。より代表的には、核移植と同時あるいは直後、例えば約４〜９時間後などに活性化を実施する。
【００９３】
ＮＴユニットは既知の方法で活性化してよい。このような方法には、例えば低温とするか、あるいは実際に低温のショックをＮＴユニットに実質的に適用することによる、亜生理的温度でのＮＴユニットの培養が含まれる。これは、胚が通常曝露されている生理的温度条件よりも低温である室温でＮＴユニットを培養することにより最も簡便に実施できる。
【００９４】
一方、既知の活性化物質により活性化を実施することができる。例えば、受精時の精子の卵母細胞への進入によって融合前の卵母細胞が活性化されることにより、核移植後のウシの生存子妊娠が増加し、かつ遺伝的に同一の子ウシが複数得られることが証明されている。また、電気的および化学的ショック、あるいはシクロヘキサミド処理などの処理も、融合後のＮＴ胚の活性化を目的として用いることができる。適切に卵母細胞を活性化する方法は、その全文が本明細書中に参照文献として引用されている、Ｓｕｓｋｏ−Ｐａｒｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，に対する米国特許第５，４９６，７２０号の標題である。
【００９５】
例えば、卵母細胞の活性化は同時に行っても、順に行ってもよく：
（ｉ）卵母細胞内の２価陽イオンの濃度を高め、
（ｉｉ）卵母細胞内の細胞蛋白のリン酸化を低下させる。
【００９６】
これは、全般的に、卵母細胞の細胞質内に、例えばマグネシウム、ストロンチウム、バリウムあるいはカルシウムなどの２価の陽イオンを、例えばイオノフォアの形などで導入して実施されるであろう。２価陽イオンレベルを上昇せしめる方法には、電気ショックの使用、エタノール処理、およびケージドキレーター処理が含まれる。
【００９７】
リン酸化は、例えば６−ジメチルアミノプリン、スタウロスポリン、２−アミノプリン、およびスフィンゴシンなどのセリン−トレオニンキナーゼ阻害物質などのキナーゼ阻害物質の添加などによる既知の方法で低下せしめてもよい。
【００９８】
一方、細胞蛋白のリン酸化は、例えばフォスファターゼ２Ａおよびフォスファターゼ２Ｂなどのフォスファターゼを卵母細胞内に導入して阻害してもよい。
【００９９】
以下に具体的な活性化法を列挙する。
１． イオノマイシンおよびＤＭＡＰによる活性化
１− イオノマイシン（５μＭ）および２ｍＭ ＤＭＡＰの溶液に卵母細胞を４分間入れる；
２− ＤＭＡＰを２ｍＭ含む培地に該卵母細胞を移し、４時間置く；
３− ４回すすいだ後培養する。
２． イオノマイシンＤＭＡＰおよびロスコビチンによる活性化
１− イオノマイシン（５μＭ）および２ｍＭ ＤＭＡＰ溶液に卵母細胞を４分間入れる；
２− 該卵母細胞をＤＭＡＰ ２ｍＭおよびロスコビチン２００μＭを含んだ培地に移し、３時間置く；
３− ４回すすいだ後培養する。
３． イオノマイシン曝露後のサイトカラシンおよびシクロフォスファミドによる活性化
１− 卵母細胞をイオノマイシン（５μＭ）中に４分間入れる；
２− 卵母細胞を、サイトカラシンＢ ５μｇ／ｍｌおよびシクロヘキサミド５μｇ／ｍｌを含んだ培地に移し、５時間置く；
３− ４回すすいだ後培養する。
４． 電気パルスによる活性化
１− １００μＭ ＣａＣｌ２を含んだマンニトール培地に卵を入れる；
２− １．０ ｋＶｃｍ−１のパルスを２０μ秒間、各パルス間の間隔を２２分として３回通電する；
３− 卵母細胞を、サイトカラシンＢ ５μｇ／ｍｌを含んだ培地に移し、３時間置く。
５． エタノール曝露後のサイトカラシンおよびシクロヘキサミドによる活性化
１− 卵母細胞を７％エタノール中に１分間入れる；
２− 卵母細胞を、サイトカラシンＢ ５μｇ／ｍｌおよびシクロヘキサミド５μｇ／ｍｌを含んだ培地に移し、５時間置く；
３− ４回すすいだ後培養する。
６． アデノフォスチンのマイクロインジェクションによる活性化
１− 卵母細胞に、アデノフォスチン１０μＭを含んだ溶液を１０〜１２ｐｌ注入する；
２− 卵母細胞を培養する。
７． 精子因子のマイクロインジェクションによる活性化
１− 卵母細胞に、例えば霊長類、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、マウス、ラット、ウサギ、あるいはハムスターなどから分離した精子因子を１０〜１２ｐｌ注入する。
２− 卵母細胞を培養する
８． 組換え精子因子のマイクロインジェクションによる活性化
９． ＤＭＡＰ曝露後のシクロヘキサミドおよびサイトカラシンＢによる活性化
代表的には成熟の２２〜２８時間後に、卵母細胞あるいはＮＴユニットを約２ｍＭのＤＭＡＰ中に約１時間入れ、その後サイトカラシンＢ ５μｇ／ｍｌおよびシクロヘキサミド２０μｇ／ｍｌ中で２〜１２時間、好ましくは約８時間インキュベーションする。
【０１００】
上記の活性化プロトコルは、例えば霊長類あるいはヒトドナー細胞あるいは卵母細胞の使用を含む操作などの核移植操作に用いられているプロトコルの例である。しかし、上記の活性化プロトコルは、ドナー細胞および核が、例えばヒツジ、ヤギュウ、ウマ、ヤギ、ウシ、ブタなどの有蹄類由来で、かつ／あるいは卵母細胞が例えばヒツジ、ブタ、ヤギュウ、ウマ、ヤギ、ウシのほか他の種類の有蹄類由来のいずれかあるいは両者である場合に使用できる。
【０１０１】
前述のように、活性化の実施は、核移植前でも、核移植と同時でも、あるいは核移植後でもよい。活性化は、一般的には核移植および融合の約４０時間前〜核移植および融合の約４０時間後に、より好ましくは核移植および融合の約２４時間前〜約２４時間後に、最も好ましくは核移植および融合の約４〜９時間前〜核移植および融合の約４〜９時間後に実施する。活性化は、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ ｖｉｖｏで卵母細胞成熟後あるいは直前直後、例えばほぼ同時あるいは成熟より約４０時間以内などに、より好ましくは成熟より約２４時間以内に実施する。
【０１０２】
活性化されたＮＴユニットは適切なｉｎ ｖｉｔｒｏ培地において、胚あるいは幹様細胞および細胞コロニーが生成するまで培養することができる。胚の培養および成熟に適した培地は技術上周知である。ウシ胚の培養および維持に用いられる既知の培地の例には、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１０＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ），Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ−１９９（ＴＣＭ−１９９）＋１０％ウシ胎児血清、Ｔｙｒｏｄｅｓ−Ａｌｂｕｍｉｎ−Ｌａｃｔａｔｅ−Ｐｙｒｕｖａｔｅ（ＴＡＬＰ），Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）、Ｅａｇｌｅ’ｓ ａｎｄ Ｗｈｉｔｔｅｎｓ’ｓ ｍｅｄｉａが含まれる。卵母細胞の採取と維持に最も多く用いられる培地の１つはＴＣＭ−１９９、およびウシ胎児血清、新生児血清、発情牝ウシ血清、子ヒツジ血清あるいは去勢ウシ血清などの血清の１〜２０％添加物である。好ましい維持培地にはＥａｒｌ ｓａｌｔ、１０％ウシ胎児血清、０．２Ｍａピルビン酸、および５０μｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシンを含むＴＣＭ−１９９が含まれる。上記の培地は、いずれも、顆粒層細胞、卵管細胞、ＢＲＬ細胞および子宮細胞およびＳＴＯ細胞などの様々な種類の細胞による共培養にも使用できる。
【０１０３】
特に、着床前期および着床期中のヒト子宮内膜上皮細胞は白血病阻害因子（ＬＩＦ）を分泌する。このため、培地へのＬＩＦの添加は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける再構築された胚の発生の促進において重要となるであろう。ＬＩＦの胚あるいは幹様細胞培養への使用については、その全文が本明細書中に参照文献として引用されている米国特許第５，７１２，１５６号に記載されている。
【０１０４】
もう１つの維持培地については、その全文が本明細書中に参照文献として引用されている、Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｓ Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，に対する米国特許第５，０９６，８２２号に記載されている。この胚培地の名称はＣＲ１であり、胚を維持するのに必要な栄養素を含んでいる。ＣＲ１はＬ−酪酸ヘミカルシウムを１．０ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは１．０ｍＭ〜５．０ｍＭ含んでいる。Ｌ−酪酸ヘミカルシウムは、Ｌ−酪酸にヘミカルシウム塩が結合したものである。
【０１０５】
また、培養ヒト胚細胞の維持に適した培地については、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：１１４５−１１４７（１９９８）およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９２：７８４４−７８４８（１９９５）に記載されている。さらに、該ＮＴユニットは腹水、羊水、硝子体／房水およびリンパ液などの生物学的液体で培養することもできる。
【０１０６】
その後に、培養した１つあるいは複数のＮＴユニットは、好ましくは洗浄し、その後例えばＣＲＩａａ培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１０，Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ−１９９（ＴＣＭ−１９９）、Ｔｙｒｏｄｅｓ−Ａｌｂｕｍｉｎ−Ｌａｃｔａｔｅ−Ｐｙｒｕｖａｔｅ（ＴＡＬＰ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）、Ｅａｇｌｅ’ｓ、あるいは好ましくは１０％ＦＣＳを含むＷｈｉｔｔｅｎｓ’ｓ培地などの、上記で指定した培地などの適切な培地に移す。このような培養は、好ましくは適切な集密化フィーダー層を含んだウェルプレート内で実施する。適切なフィーダー層には、例えば有蹄類由来の線維芽細胞および子宮上皮細胞、ニワトリ線維芽細胞、ネズミ科（例えばマウスあるいはラット）線維芽細胞、ＳＴＯおよびＳＩ−ｍ２２０フィーダー細胞株、およびＢＲＬ細胞などの、線維芽細胞および上皮細胞が例として含まれる。
【０１０７】
好ましい該実施態様では、フィーダー細胞はマウス胚線維芽細胞を具備している。適切な線維芽細胞のフィーダー層を調製する方法は、後述の例に記載されており、十分に通常の技術者の熟練の範囲内である。
【０１０８】
該ＮＴユニットは、該ＮＴユニットが胚幹様細胞あるいは細胞コロニーの生成を目的として使用できる細胞を採取するのに適した大きさに達するまで、該フィーダー層上で培養する。これらのＮＴユニットは、好ましくは細胞数が少なくとも約２〜４００個、より好ましくは約４〜１２８個、最も好ましくは少なくとも約５０個となる大きさに達するまで培養する。当該培養は、適切な条件下、すなわち約３８．５℃でＣＯ２濃度５％とし、成長を適正化するために、代表的には２〜５日ごとに、好ましくは約３日ごとに培地を交換しながら実施する。
【０１０９】
ヒト細胞／除核ウシ卵母細胞由来のＮＴユニットの場合は、代表的には約５０個であるＥＳ細胞コロニーを生成するのに十分な細胞が、卵母細胞活性化より約１２日後に採取される。しかし、これは核ドナーとして用いる個々の細胞、個々の卵母細胞の種、および培養条件によって異なることがある。当業者は、望ましい十分な個数の細胞が得られた場合、培養されたＮＴユニットの形態によって、肉眼で容易に確認できる。
【０１１０】
ヒト／ヒト核移植胚、あるいはヒト以外の霊長類ドナーあるいは卵母細胞を用いて生成したその他の胚の場合、組織培養中でヒトあるいは他の霊長類細胞を維持するのに有用であることが知られている培地を用いるのが有益であると思われる。ヒト胚培養に適した培地の例には、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄ．，１３（１）：１６９−１７７（１９９８）に報告された培地、いずれも、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａより入手可能なＰ１−カタログ＃９９２４２培地、およびＰ−１カタログ＃９９２９２培地、およびその全文が本明細書中に参照文献として引用されているＴｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）および（１９９５）によって使用されている培地が含まれる。
【０１１１】
もう１つの好ましい培地は、ＡＣＭ＋ウリジン＋ブドウ糖＋ＬＩＦ １０００ＩＵを具備する。
【０１１２】
さらに適当な培地の他の例には、腹水、硝子体／房水、羊水およびリンパ液などの自然に発生する生物学的液体が含まれる。
【０１１３】
上述のように、本発明で使用する細胞は、好ましくは哺乳類体性細胞を、最も好ましくは細胞が活発に増殖する（非静止期）哺乳類細胞培養に由来する細胞を具備している。特に好ましい実施態様では、所望のＤＮＡ配列の追加、欠失あるいは置換によってドナー細胞が遺伝的に修飾されている。例えば、ヒト、霊長類あるいはウシなどに由来する角化細胞あるいは線維芽細胞などのドナー細胞は、例えば治療用ポリペプチドなどの所望の遺伝子産物の発現をもたらすＤＮＡ構成に形質転換あるいは変換することができる。その例には、例えばＩＧＦ−Ｉ，ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン、コロニー刺激因子などのリンフォカイン、コラーゲンなどの結合組織ポリペプチド、遺伝因子、凝固因子、酵素、酵素阻害物質などが含まれる。また、所望の遺伝子は、相同的組換えにより「ノック・イン」あるいは「ノック・アウト」することができる。
【０１１４】
また、上述のように、核移植の前に、例えば細胞の系統発生の障害、胚発生の促進および／あるいはアポトーシスの阻害などを目的としてドナー細胞を修飾することができる。望ましい修飾については後述する。
【０１１５】
本発明の態様の１つでは、例えばヒト細胞などのドナー細胞を遺伝的に修飾し、系統欠損とし、核移植に用いる場合には生産児を生じせしめない。これは、特にヒト核移植胚の場合に、倫理的な理由により生存胚の生成が望まれない場合に望ましい。これは、ヒト細胞を遺伝的に操作して、核移植に用いる際に特定の系統細胞への分化を不能とすることにより実施できる。特に、細胞を遺伝的に修飾し、核移植ドナーとして用いる場合には、生成した「胚」が中胚葉、内胚葉あるいは外胚葉組織のうち少なくとも１つを含まないか、相当量を欠損せしめることができる。
【０１１６】
これは、例えばノック・アウト、あるいは中胚葉、内胚葉あるいは外胚葉のうち１つあるいはそれ以上に特異的な遺伝子の発現を障害することなどにより実施できる。その例には、
中胚葉： ＳＲＦ，ＭＥＳＰ−１，ＨＮＦ−４，β−Ｉインテグリン、ＭＳＤ；
内胚葉： ＧＡＴＡ−６，ＧＡＴＡ−４；
外胚葉： ＲＮＡヘリカーゼＡ，Ｈβ５８
が含まれる。
【０１１７】
上記のリストは、例示することを意図したもので、中胚葉、内胚葉および外胚葉の発生に関与する既知の遺伝子を網羅するものではない。中胚葉欠損、内胚葉欠損、および外胚葉欠損細胞および胚の生成は、すでに文献に報告されている。例えばＡｒｓｅｎｉａｎ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．，Ｖｏｌ．１７（２）：６２８９−６２９９（１９９８）；Ｓａｇａ Ｙ．Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．７５（１−２）：５３−６６（１９９８）；Ｈｏｌｄｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２０（５）：１３５５−１３４６（１９９４）；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．Ｖｏｌ．８（２０）：２４６６−２４７７（１９９４）；Ｒｏｈｗｅｄｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２０１（２）：１６７−１８９（１９９８）（中胚葉）；Ｍｏｒｒｉｓｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｓ，Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１２（２２）：３５７９−３５９０（１９９８）；Ｓｏｕｄａｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２１（１１）：３８７７−３８８８（１９９５）（内胚葉）；およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９５：（２３）：１３７０９−１３７１３（１９９８）；およびＲａｄｉｃｅ ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１１１（３）：８０１−８１１（１９９１）（外胚葉）などを参照のこと。
【０１１８】
全般的に、例えばヒト角化細胞、上皮細胞あるいは線維芽細胞などの所望の体性細胞を遺伝子操作すると、特定の細胞系統に特異的な１つあるいはそれ以上の遺伝子が「ノック・アウト」され、かつ／あるいはこうした遺伝子の発現が顕著に障害される。これは、例えば相同組換えなどの既知の方法によって実施することができる。所望の遺伝子を「ノック・アウト」するための好ましい遺伝子系は、Ｃａｐｅｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ，によって、米国特許第５，６３１，１５３号および第５，４６４，７６４号によって開示され、所望の哺乳類ゲノム中の標的とするＤＮＡ配列の修飾を可能にする陽性−陰性選択（ＰＮＳ）ベクターが報告されている。こうした遺伝子修飾により、核移植ドナーとして用いた場合に特定の細胞系統への分化が不可能な細胞が生成するであろう。
【０１１９】
この遺伝子修飾された細胞は、系統欠損核移植胚、すなわち機能的中胚葉、内胚葉、あるいは外胚葉のうち少なくとも１つが発生しない胚を生成するのに用いられる。このため、生成した胚は、例えばヒト子宮などに移植しても、生産児を生じせしめないであろう。しかし、こうした核移植により発生したＥＳ細胞は、１つまたは２つの残った未障害系統の細胞を生成する上でまだ有用である。例えば、外胚葉欠損ヒト核移植胚は、まだ中胚葉および内胚葉由来の分化細胞を生成する。外胚葉欠損細胞は、ＲＮＡヘリカーゼＡあるいはＨβ５８遺伝子の一方あるいは両者の欠失あるいは障害により生成することができる。
【０１２０】
これらの系統欠損ドナー細胞を遺伝子修飾して、もう１つの所望のＤＮＡ配列を発現せしめることも出来る。このため、遺伝子修飾されたドナー細胞は、系統欠損胚盤胞を生成し、これを平板培養すると、多くとも２つの胚葉に分化する。
【０１２１】
一方、ドナー細胞を修飾し、「不死性」とすることができる。これはアンチセンスあるいはリボジームテロメラーゼ遺伝子を発現せしめることにより達成できる。これは、アンチセンスＤＮＡあるいはリボジームの発現をもたらす既知の遺伝的方法、あるいは遺伝子ノック・アウトにより実施できる。これらの「不死性」細胞は、核移植に用いた場合、分化して産子となることができないであろう。
【０１２２】
本発明のもう１つの好ましい実施態様は、組織培養中でより効率的に成長する核移植胚の生成である。これは、ＥＳ細胞および／あるいは産子（胚盤胞が代理雌に移植される場合）を生成するのに必要な時間および必要な融合を減少せしめる上で有利である。このことが望ましい理由は、核移植により生じた胚盤胞とＥＳ細胞が発生能力を障害されていることがあることが認められているためである。これらの問題は、多くの場合組織培養条件を変えることで軽減されるが、もう１つの解決法は、胚発生に関与する遺伝子の発現を促進することで胚発生を促進することである。
【０１２３】
例えば、ＭＨＣ Ｉグループの一員であるＰｅｄ型遺伝子産物は、胚の発育にとって重要であることが報告されている。より具体的には、マウスの着床前胚の例において、Ｑ７およびＱ９遺伝子が「急速成長」表現型を発現させることが報告されている。したがって、これらおよび関連する遺伝子を発現させるＤＮＡ、もしくはヒトあるいは他の哺乳類の同種ＤＮＡをドナー細胞に導入することによって、より速く成長する核移植胚が得られることが期待される。これは特に、異種間での核移植胚が同一動物種の細胞もしくは核の融合によって産生される核移植胚よりも組織培養液中での発育効率が悪い場合に、望ましい手法である。
【０１２４】
核移植の前に、Ｑ７かつ／またはＱ９遺伝子を含有するＤＮＡ構築物をドナー体細胞中に導入するのが望ましい。例えば、哺乳類の強力な構成プロモーターをＱ７かつ／またはＱ９遺伝子、ＩＲＥＳ、ネオマイシンのような１つ以上の適切な選択用マーカー、ＡＤＡ、ＤＨＦＲ、およびｂＧＨポリＡ配列のようなポリＡ配列に機能的に結合させた発現用構築物を作成することが可能である。また、孤立遺伝子を加えることは、Ｑ７およびＱ９遺伝子の発現をさらに促進するために有益であると考えられる。これらの遺伝子は異なる動物種、例えばウシ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコおよびヒトにおける保存度がきわめて高いため、未分化胚芽細胞の発育の初期の段階で発現されると予想される。また、胚の発育を促進する他の遺伝子にも影響を与えるよう、ドナー細胞を設計することも可能であると考えられる。このように、遺伝子操作を施したこれらのドナー細胞は、未分化胚芽細胞および着床前段階の胚をより効率良く産生することができるはずである。
【０１２５】
本発明のさらに別の局面として、アポトーシス、すなわちプログラムされた細胞死に対して耐性をもつドナー細胞の構築が含まれる。着床前段階の胚の中に細胞死に関連する遺伝子が存在することが文献中で報告されている（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１（５３８１）：１３２２−１３２６（１９９８））。アポトーシスを誘発することが報告されている遺伝子として、Ｂａｄ、Ｂｏｋ、ＢＨ３、Ｂｉｋ、Ｈｒｋ、ＢＮＩＰ３、ＢｉｍＬ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、およびＥＧＬ−１などが挙げられる。一方、プログラムされた細胞死から細胞を保護することが報告されている遺伝子には、例えばＢｃＬ−ＸＬ、Ｂｃ１−ｗ、Ｍｃ１−１、Ａ１、Ｎｒ−１３、ＢＨＲＦ−１、ＬＭＷ５−ＨＬ、ＯＲＦ１６、Ｋｓ−Ｂｅｌ−２、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ、およびＣＥＤ−９などがある。
【０１２６】
したがって、胚の発育中にアポトーシスを誘発する遺伝子が「ノックアウト」されるように、あるいは細胞をアポトーシスから保護する遺伝子の発現を促進する、もしくは発現を引き起こすように、ドナー細胞を構築することが可能である。
【０１２７】
例えば、胚の発育の間にこのような保護遺伝子（例としてＢｃｌ−２）もしくは関連遺伝子を調節して発現させるＤＮＡ構築物を導入することによってこれを実現することができる。これにより、特定の発育条件下で胚を培養することによって遺伝子の「スイッチを入れる」ことが可能である。別の方法として、構成プロモーターに結合させてもよい。
【０１２８】
より具体的には、Ｂｃｌ−２遺伝子を含有するＤＮＡ構築物をＰＧＫ、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ユビキチンのような調節可能プロモーターもしくは構成プロモーター、あるいはβ−アクチン、ＩＲＥＳ、適切な選択マーカー、およびポリＡ配列に機能的に結合させた構築物を作成し、目的とするドナー哺乳類細胞、例えばヒトケラチノサイトや線維芽細胞の中に導入することが可能である。
【０１２９】
これらのドナー細胞を利用して核移植胚を作成すれば、アポトーシスに耐性を有するはずであるから、組織培養中でより効率良く分化すると考えられる。それによって、核移植により産生される適切な着床前胚の速さかつ／または数が増加するであろう。
【０１３０】
これと同様の成果を得るための別の方法として、アポトーシスを誘発する１種類以上の遺伝子の発現を阻害する、というものがある。これは、胚の中で発現し発育の初期の段階でアポトーシスを誘発する遺伝子をノックアウトするか、あるいはアンチセンスもしくは遺伝子に対するリボザイムを用いるかによって実現可能である。これらの例は上述のとおりである。アンチセンスの方向で発現すると思われる細胞死遺伝子には、ＢＡＸ、Ａｐａｆ−１、およびカプサーゼがある。また、センスあるいはアンチセンスの方向にメチラーゼもしくはデメチラーゼをコードするトランスジーンを導入することも可能である。メチラーゼおよびデメチラーゼの酵素をコードするＤＮＡに関しては、本分野においてよく知られている。さらに別の方法として、両方の調節、すなわちアポトーシス誘発遺伝子の阻害と、アポトーシスを阻害するあるいは予防する遺伝子の発現の促進とを含有するようにドナー細胞を構築することもできる。アポトーシスに影響を及ぼす遺伝子の構築および選択、そしてこのような遺伝子を発現する細胞株については、米国特許Ｎｏ．５，６４６，００８中に開示されており、この特許は引用文により本特許に含まれる。アポトーシスを促進する、あるいは阻害する多くのＤＮＡが報告されており、それに関する特許も数多く申請されている。
【０１３１】
クローニング効率を上げるための別の方法として、ドナー細胞と同一の特定の細胞周期にある細胞を選択するというものがある。これによって核移植効率が健著に上昇することが報告されている。（Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖｅｌ．、３６（１）：３３−４１（１９９３））。特定の細胞周期にある細胞を選択するための方法として種々のものが報告されており、血清枯渇（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：６４−６６（１９９６）；Ｗｉｌｍｕｔ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３８５：８１０−８１３（１９９７））、および化学物質による同調（Ｕｒｂａｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、２１９（１）：１５９−１６８（１９９５）などがある。例えば、特定のサイクリンＤＮＡを検出用マーカー（例として緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ））と共に調節配列に機能的に結合させ、その後ろにサイクリン破壊ボックス、そして任意で孤立配列を連結し、サイクリンおよびマーカー蛋白質の発現を促進させることができる。これによって、目的とする細胞周期にある細胞を肉眼で容易に検出することができ、核移植ドナーとして選択することが可能である。その例として、Ｇ１期にある細胞を選択するためのサイクリンＤ１遺伝子が挙げられる。しかし、本発明においてはどのようなサイクリン遺伝子でも使用可能なはずである。（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、第７巻（９）：１３４３−１３５７（１９９６）などを参照のこと）。
【０１３２】
しかし、目的とする細胞周期にある細胞を産生するために、できるだけ侵襲性が少なくより効率の高い方法が必要である。これは、検出可能な条件下で特定のサイクリンを発現するようにドナー細胞の遺伝子を修飾することによって実現可能であると期待される。それによって特定の細胞周期にある細胞を他の細胞周期にある細胞から用意に識別することができる。
【０１３３】
サイクリンは、細胞周期のうちの特定の段階においてのみ発現される蛋白質である。例としてＧ１期のサイクリンＤ１、Ｄ２およびＤ３、Ｇ２／Ｍ期のサイクリンＢ１およびＢ２、そしてＳ期のサイクリンＥ、ＡおよびＨがある。これらの蛋白質はサイトゾル中で容易に翻訳され破壊される。これらの蛋白質がこのように「一時的に」発現する理由の１つは、「破壊ボックス」の存在である。これは、ユビキチン経路を通じてこれらの蛋白質の速やかな破壊を指令するタグとして機能する蛋白質の一部である短いアミノ酸配列である。（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１（５３２１）：１３２２−１３２６（１９９８））。
【０１３４】
本発明では、容易に検出できる条件下、望ましくは例えば蛍光標識を用いることによって肉眼で検出可能な条件下で、このようなサイクリン遺伝子を１つあるいはそれ以上発現するようにドナー細胞を構築する。例として、特定のサイクリンＤＮＡを検出用マーカー（例として緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ））と共に調節配列に機能的に結合させ、その後ろにサイクリン破壊ボックス、そして任意で孤立配列を連結し、サイクリンおよびマーカー蛋白質の発現を促進させることができる。これによって、目的とする細胞周期にある細胞を肉眼で容易に検出することができ、核移植ドナーとして選択することが可能である。その例として、Ｇ１期にある細胞を選択するためのサイクリンＤ１遺伝子が挙げられる。しかし、本発明においてはどのようなサイクリン遺伝子でも使用可能なはずである。（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、第７巻（９）：１３４３−１３５７（１９９６）などを参照のこと）。
【０１３５】
上述のように、本発明は、特に異種間核移植過程における核移植効率を上げるための種々の方法を提供するものである。本発明の発明者らは、ある動物種の核あるいは細胞を別の動物種の脱核卵母細胞に挿入もしくは融合させた場合に、未分化胚芽細胞を産生する核移植胚が得られ、その核移植胚がＥＳ細胞株にまで生育することを実証しているが、このような手法の効率はきわめて低い。このため、培養することによってＥＳ細胞およびＥＳ細胞株を産生し得る細胞である未分化胚芽細胞を産生するために、多くの融合を行う必要があるのが普通である。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて核移植胚の生育を促進するための別の方法として、培養条件を最適化することが挙げられる。このための１つの手段は、アポトーシスを阻害する条件下でＮＴ胚を培養することである。本発明のこの態様に関して、カプサーゼのようなプロテアーゼは、他の細胞種と同様のアポトーシスによって卵母細胞の死を誘発する可能性があることが報告されている。（Ｊｕｒｉｓｉｃｏｓｖａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖｅｌ．、５１（３）：２４３−２５３（１９９８）を参照。）
【０１３６】
未分化胚芽細胞の発育は、核移植および未分化胚芽細胞の維持、あるいは着床前段階の胚の培養のために使用する培地中に１種類以上のカプサーゼ阻害剤を添加することによって促進されると考えられる。このような阻害剤の例として、カプサーゼ−４阻害剤Ｉ、カプサーゼ−３阻害剤Ｉ、カプサーゼ−６阻害剤ＩＩ、カプサーゼ−９阻害剤ＩＩ、およびカプサーゼ−１阻害剤Ｉがある。アポトーシスを阻害するために必要なこれら阻害剤の量は、例えば培地の重量の０．００００１から５．０％であり、より望ましくは培地の重量の０．０１％から１．０％である。このように、前述の方法を用いて組織培養中における未分化胚芽細胞および胚のその後の発育を促進することにより、核移植の効率を上昇させることができる。
【０１３７】
目的とする大きさのＮＴユニットが得られた後、細胞を物理的にゾーンから除去し、胚細胞あるいは幹様細胞および細胞株を産生するために使用する。これは、ＮＴユニットを含有する細胞を通常５０個以上含む細胞塊を洗い、例えば放射線照射した線維芽細胞のような支持細胞層上にこれらの細胞をプレーティングすることによって行うのが望ましい。一般に、幹様細胞もしくは細胞コロニーを産生するために使用する細胞は、最低５０個の細胞から構成されるのが望ましい培養ＮＴユニットの最も内部から採取する。しかし、細胞数がそれ以下もしくはそれ以上のＮＴユニットでも、またＮＴユニットの他の部分から採取した細胞でも、ＥＳ様細胞および細胞コロニーを産生するために使用できると思われる。
【０１３８】
さらに、ドナー細胞のＤＮＡを卵母細胞のサイトゾルにより長時間接触させることによって、分化の過程が起こり易くなると推測される。これは、再クローニング、すなわち再構築した胚から割球を摘出し、新しい脱核卵母細胞と融合させることによって実現可能である。これとは別に、ドナー細胞を脱核卵母細胞と融合させ、４〜６時間後に活性化することなく染色体を摘出し、より若い卵母細胞と融合させるという方法もある。活性化はその後に起こると考えられる。
【０１３９】
細胞は、適切な生育用培地中の支持細胞層の中で維持する。培地の例として、１０％ＦＣＳおよび０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）とＬ−グルタミンを添加したαＭＥＭ培地が挙げられる。生育用培地は、最大限に生育させるために必要な頻度、例えば約２〜３日毎に交換する。
【０１４０】
この培養過程によって、胚細胞あるいは幹様細胞もしくは細胞株が産生される。ヒト細胞／ウシ卵母細胞由来のＮＴ胚の場合には、α−ＭＥＭ培地中で培養を開始してから約２日後にコロニーが観察される。しかし、この時期は、個々の核ドナー細胞、卵母細胞および培養条件によって変動すると思われる。本分野の専門家であれば、特定の胚細胞あるいは幹様細胞を最大限に生育させるために、必要に応じて培養条件を変更することができるであろう。他の適切な培地もここに開示する。
【０１４１】
得られた胚細胞あるいは幹様細胞および細胞コロニーは、ドナー卵母細胞の動物種ではなく核細胞ドナーとして用いた動物種の胚あるいは幹様細胞と同様の外観を呈するのが普通である。例えば、ヒトの核ドナー細胞を脱核したウシ卵母細胞中に移植して得られた胚細胞あるいは幹様細胞の場合には、細胞はウシのＥＳ様細胞ではなくマウスの胚性幹細胞に似た形態を示す。
【０１４２】
より具体的には、ヒトＥＳ細胞株の細胞コロニーの個々の細胞は明瞭に識別することができず、コロニーの周囲は屈折性で滑らかな外観をもつ。さらに、細胞コロニーの細胞倍化時間は長く、マウスのＥＳ細胞の倍化時間の約２倍である。また、ウシおよびブタ由来のＥＳ細胞とは異なり、コロニーは上皮様外観をとらない。
【０１４３】
前述のように、米国特許５，８４３，７８０号の中でＴｈｏｍｓｏｎにより、霊長類の幹細胞はＳＳＥＡ−１（−）、ＳＳＥＡ−４（＋）、ＴＲＡ−１−６０（＋）、ＴＲＡ−１−８１（＋）およびアルカリ性ホスファターゼ（＋）であることが報告されている。本発明の方法に従って作成したヒトおよび霊長類のＥＳ細胞も、同様あるいは同一のマーカー発現を示すものと予想される。
【０１４４】
これとは別に、これらの細胞が中胚葉、外胚葉および内胚葉のどれにでもなり得る能力を有することに基づき、このような細胞が実際のヒトあるいは霊長類の胚性幹細胞であることが確認される。これは、本発明に従い、適切な条件下（例として米国特許５，８４３，７８０号の中でＴｈｏｍｓｅｎが開示した条件、引用文によりそのすべてが本特許に含まれる）で作成したＥＳ細胞を培養することによって実証されるであろう。これとは別に、本発明に従って作成した細胞が多能性であるという事実は、このような細胞を動物、例えばＳＣＩＤマウス、あるいは大型の家畜などに注射し、その後当該着床細胞から生じる組織を採取することによって確認できると考えられる。これらの着床ＥＳ細胞は、あらゆる種類の分化細胞、すなわち中胚葉、外胚葉、および内胚葉組織に生育するはずである。
【０１４５】
このようにして得られた胚細胞あるいは幹様細胞および細胞株、望ましくはヒトの胚細胞あるいは幹様細胞および細胞株は、治療上および診断上非常に応用範囲が広い。特に、このような胚細胞あるいは幹様細胞は細胞移植療法のために利用可能である。ヒトの胚細胞あるいは幹様細胞は、各種疾患の治療において応用性をもつ。
【０１４６】
この点に関して、マウスの胚性幹（ＥＳ）細胞はほとんどあらゆる種類の細胞、例えば造血幹細胞などに分化し得ることが知られている。したがって、本発明に従って作成したヒト胚細胞あるいは幹様細胞も、同様の分化能を有するはずである。本発明に従って作成した胚細胞あるいは幹様細胞は、既知の方法を用いて誘導することにより目的とする細胞種に分化するものと考えられる。例えば、主題のヒト胚細胞あるいは幹様細胞を分化用培地中で細胞分化を起こす条件下において培養することによって、造血幹細胞、筋細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞、尿路細胞などに分化させることが可能である。胚性幹細胞の分化を引き起こすための培地および方法、そして適切な培養条件については、本分野においてよく知られている。
【０１４７】
例えば、Ｐａｌａｃｉｏｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９２：７５３０−７５３７（１９９５）は、幹細胞の凝集塊を最初にレチン酸を含まない懸濁培養液中で培養した後、レチン酸を含有する同培養液中で培養し、さらに細胞を付着させる基質に細胞凝集塊を移すという誘導手順を用いることにより、胚細胞株から造血幹細胞を作成することができると報告している。
【０１４８】
さらに、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．、６：５４３−５５２（１９９４）は、胚性幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させ、造血幹細胞、筋、心筋、神経細胞などの各種分化細胞型を作成するための方法を開示した数多くの文献を引用する総説論文である。
【０１４９】
また、Ｂａｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、１６８：３４２−３５７（１９９５）は、ニューロンの特性を有する神経細胞を作成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける胚性幹細胞の分化について述べている。これらの参考文献は、胚細胞あるいは幹様細胞から分化した細胞を作成するための方法として報告されたものの代表例である。これらの参考文献、およびその中でも特に胚性幹細胞を分化させるための方法に関連する開示内容は、引用文によりすべて本特許に含まれる。
【０１５０】
このように、本分野の専門家であれば、既知の方法および培地を用いることにより、主題の胚細胞あるいは幹様細胞を培養して目的とする分化した細胞種、例えば神経細胞、筋細胞、造血幹細胞などを作成することができる。また、特定の細胞系列のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける生育を促進するために、誘導可能なＢｃｌ−２あるいはＢｃｌ−ｘｌを用いるのも有用であると考えられる。ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＢｃｌ−２は、リンパ系および神経系の発達の間に起こるアポトーシスによる細胞死のすべてではないが多くの型を防止する。Ｂｃｌ−２の発現をどのように利用してドナー細胞のトランスフェクションの後の目的とする細胞系のアポトーシスを阻害し得るか、についの詳細な議論は、米国特許Ｎｏ．５，６４６，００８の中で開示されており、引用文により本発明に含まれる。
【０１５１】
主題の胚細胞あるいは幹様細胞を利用して、希望するあらゆる種類の分化細胞を作成することができると考えられる。このような分化したヒト細胞の治療上の使途は計り知れないものがある。例えば、ヒトの造血幹細胞は、骨髄移植を必要とする治療のために使用可能である。このような手法は、卵巣ガンおよび白血病などの末期ガン、ＡＩＤＳのような免疫不全疾患など、多くの疾患の治療に利用されている。造血幹細胞は、例えばガンあるいはＡＩＤＳ患者の成熟した体細胞（例として上皮細胞もしくはリンパ球）を脱核した卵母細胞（例としてウシ卵母細胞）と融合させて上述のようにして胚細胞あるいは幹様細胞を作成し、造血幹細胞が得られるまで分化に適した条件下でそれらの細胞を培養することによって得ることができる。こうして得られた造血細胞は、ガンおよびＡＩＤＳを含めた疾患の治療のために利用可能である。
【０１５２】
これとは別に、神経疾患のある患者からの成熟した体細胞を脱核した動物卵母細胞（例として霊長類またはウシの卵母細胞）と融合させ、これらの細胞を分化する条件下で培養し神経細胞系を作成することも可能である。このようなヒト神経細胞の移植によって治療可能な疾患の具体的な例として、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＡＬＳおよび脳性小児麻痺など多くの疾患がある。パーキンソン病の場合には、移植した胎児脳の神経細胞が周囲の細胞と正しく連結し、ドパミンを産生することが確認されている。これによって、パーキンソン病の症状を長期的に改善することができる。
【０１５３】
分化した細胞を特異的に選択するために、誘導可能なプロモーターを通じて発現する選択的マーカーを用いてドナー細胞をトランスフェクトすることにより、分化が起きた時点で特定の細胞系統を選択、もしくは濃縮することが可能である。例えば、ＣＤ３４−ｎｅｏは造血細胞の選択に使用することができ、Ｐｗ１−ｎｅｏは筋細胞、Ｍａｓｈ−１−ｎｅｏは交感神経ニューロン、Ｍａｌ−ｎｅｏはヒト大脳皮質の灰白質ＣＮＳニューロンの選択に使用することができる、などである。また、組織の発達を助ける基質を用いることも有益であろう。
【０１５４】
本発明の大きな長所は、移植に適した同系（イソジェニック即ちシンジェニック）のヒト細胞をほぼ無限に供給できる、という点である。したがって、現時点での移植法における重大な問題、すなわち宿主対移植片あるいは移植片対宿主拒絶反応が原因で起こる可能性のある移植組織の拒絶を回避することができる。従来、拒絶反応はシクロスポリンなどの拒絶反応防止薬を投与することによって予防、あるいは軽減している。しかし、このような薬剤には免疫抑制、発ガン性などの重大な副作用があり、また非常に高価である。本発明によって、シクロスポリン、イムラン、ＦＫ−５０６、グルココルチコイド、ラパマイシン、およびその誘導体などの拒絶反応防止薬を投与する必要性がなくなる、あるいは少なくとも低くなるはずである。
【０１５５】
イソジェニック細胞療法によって治療が可能であるその他の疾患や病態の例として、脊髄損傷、多発性硬化症、筋ジストロフィー、糖尿病、肝臓疾患、すなわち高コレステロール血症、心臓疾患、軟骨置換、火傷、脚部潰瘍、胃腸疾患、血管疾患、腎臓疾患、尿路疾患、および老化に起因する疾患や病態などが挙げられる。
【０１５６】
また、本発明に従って作成したヒトの胚細胞あるいは幹様細胞は、遺伝子操作した、もしくはトランスジェニックなヒト分化細胞を作成するためにも利用可能である。実際には、目的とする１個もしくは複数の遺伝子（異種でもかわまない）を導入するか、本発明に従って作成したヒト胚細胞あるいは幹様細胞の内在性遺伝子の全部または一部を除去し、これらの細胞を目的とする細胞型に分化させることによってこれが可能となるであろう。このような修飾を行うための望ましい方法とは、同種間での組換えである。何故なら、この手法を幹様細胞のゲノム中の特異的な部位（１個でも複数でも）にある１個もしくは複数の遺伝子を挿入、欠損、または修飾するために用いることができるからである。
【０１５７】
この方法を利用して、欠損した遺伝子、例えば欠損した免疫系遺伝子、嚢胞性線維症遺伝子などを補充したり、成長因子、リンホカイン類、サイトカイン類、酵素などの治療上有用な蛋白質の発現を引き起こす遺伝子を導入したりすることができる。例えば、脳由来の成長因子をコードする遺伝子をヒトの胚細胞あるいは幹様細胞中に導入し、それらの細胞を神経細胞に分化させてパーキンソン病の患者に移植すれば、この疾患の間に起こる神経細胞の消失を遅らせることが可能である。
【０１５８】
以前は、ＢＤＮＦによってトランスフェクトする細胞の種類は、初代の細胞から無限に増殖する細胞株まで、また神経細胞に由来する細胞や非神経系の細胞（筋原細胞および線維芽細胞）など、さまざまであった。例えば、星状神経膠細胞はレトロウイルスベクターを用いてＢＤＮＦ遺伝子によりトランスフェクトされ、これらの細胞はパーキンソン病モデルのラットに移植された（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６９１：２５−３６、（１９９５））。
【０１５９】
このｅｘ ｖｉｖｏ治療法により、移植後３２日目にはラットにおけるパーキンソン病様の症状が４５％まで軽減した。また、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子を星状神経膠細胞中に導入した場合にも、同様の結果が得られた（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１３９：３９−５３（１９９６）参考文献はここに引用する）。
【０１６０】
しかし、このようなｅｘ ｖｉｖｏ系には問題点がある。特に、現在使用されているレトロウイルスベクターはｉｎ ｖｉｖｏでダウンレギュレートされるため、トランスジーンは一時的にしか発現しない（Ｍｕｌｌｉｇａｎによる総説、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０：９２６−９３２（１９９３））。また、これらの研究では初代の細胞、星状神経膠細胞を使用したが、これらの寿命は有限で、複製速度も遅い。この特性はトランスフェクション率に悪影響を及ぼし、安定してトランスフェクトされた細胞の選択を妨害する。さらに、遺伝子の標的となる初代の細胞を大量に増殖させ同種組換え手法において使用することはほぼ不可能である。
【０１６１】
これに対して、レトロウイルス系に起因する問題点は、ヒトの胚細胞あるいは幹様細胞を使用することによって解消するはずである。主題の讓受人によって以前に、ウシおよびブタの胚細胞株をトランスフェクトし異種ＤＮＡが安定して組み込まれた細胞を選択し得ることが実証された。この方法については、米国特許Ｎｏ．５，９０５，０４２に記載されており、引用文によりそのすべてが本特許に含まれる。したがって、これらの方法あるいはその他の既知の方法を用いることにより、目的とする遺伝子を主題のヒト胚細胞あるいは幹様細胞中に導入し、それらの細胞を目的とする細胞型、例えば造血細胞、神経細胞、膵臓細胞、軟骨細胞などに分化させることが可能となる。
【０１６２】
主題の胚細胞あるいは幹様細胞中に導入することのできる遺伝子の例として、上皮増殖因子、基礎型線維芽細胞増殖因子、神経膠由来神経栄養増殖因子、インシュリン様増殖因子（ＩおよびＩＩ）、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン４／５、毛様体神経栄養因子、ＡＦＴ−１、サイトカイン遺伝子（インターロイキン、インターフェロン、コロニー形成促進因子、腫瘍壊死因子（αおよびβ）など）、治療用の酵素をコードする遺伝子、コラーゲン、ヒト血清アルブミンなどが挙げられる。
【０１６３】
また、必要に応じて患者から治療用の細胞を除去するために、本分野において知られた負の選択系のうちのいずれかを利用することも可能である。例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子によってトランスフェクトしたドナー細胞は、ＴＫ遺伝子を含有する胚細胞を産生するようになる。これらの細胞が分化すれば、やはりＴＫ遺伝子を発現する当該治療用細胞を分離することができる。これらの細胞は、患者に対してガンシクロビルを投与することによりどの時点においても患者から選択的に除去することが可能である。このような負の選択系については、米国特許Ｎｏ．５，６９８，４４６に記載されており、引用文により本特許に含まれる。
【０１６４】
主題の胚細胞あるいは幹様細胞、望ましくはヒトの細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分化モデルとして、特に初期発育の調節に関与する遺伝子の研究のために利用することができる。
【０１６５】
また、主題の胚細胞あるいは幹様細胞を用いて分化させた細胞組織および臓器は、薬物試験においても使用可能である。
【０１６６】
さらに、主題の細胞は組換えＤＮＡを発現させるために使用することもできる。
【０１６７】
さらにまた、主題の胚細胞あるいは幹様細胞は、他の胚細胞あるいは幹様細胞および細胞コロニーを作成するための核ドナーとして用いることができる。
【０１６８】
また、本発明に従って作成した培養内細胞塊、あるいは幹細胞を腎臓カプセルもしくは筋肉内投与により例えばＳＣＩＤマウス、ウシ、ブタなどの動物に導入し、そこで奇形腫を誘発させるために使用することができる。この奇形腫は、種々の組織型を派生させるために用いることができる。また、Ｘ−種核移植によって作成した内細胞塊を、生体内で分解される生体適合性のポリマー基質と共に導入し、３次元の組織を形成させることが可能である。組織が形成された後、ポリマーは分解し、ドナーの組織、例えば心臓、膵臓、神経、肺、肝臓などをそのまま残すのが理想である。場合によっては、成長因子および血管新生を促進する蛋白質を含めるのが有用であるかもしれない。これとは別に、適切な培養用培地および条件、成長因子および生体内で分解するポリマー基質を使用することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて完全に組織を形成させることが可能である。
【０１６９】
本発明をより明確に説明するために、以下の例を挙げる。
【０１７０】
例１
材料および方法
核移植のためのドナー細胞
同意を得た成人の口腔内壁から、標準スライドグラスを用いて上皮細胞を軽く掻き取る。細胞をスライドから洗出し、ＣａあるいはＭｇを含まないリン酸緩衝溶液の入ったペトリ皿に入れる。細胞を径の細いピペットで吸って細胞塊を壊し、１個ずつの細胞の懸濁液とする。次に、脱核したウシ卵母細胞中に核移植するためのオイルの下で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＴＬ−ＨＥＰＥＳ培地のマイクロドロップ中に細胞を移す。
【０１７１】
核移植の手順
核移植の基本的な手順については以前に報告したとおりである。簡単に述べると、屠殺場で採取した卵母細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させた後、成熟後約１８時間目に（ｈｐｍ）卵母細胞から堆積細胞を除去し、斜面マイクロピペットを用いて脱核した。ビスベンツイミド（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、３μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を添加したＴＬ−ＨＥＰＥＳ培地中で脱核を確認した。その後、個々のドナー細胞を受容側の卵母細胞の卵黄周囲腔内に注入した。電気細胞融合法を用いて、ウシ卵母細胞の細胞質とドナーの核（ＮＴユニット）を一緒に融合させる。ＮＴユニットに対して、１回に９０Ｖの融合パルスを１５μ秒間与えた。成熟開始後２４時間目（ｈｐｍ）の卵母細胞を用いてこれを行った。ＮＴユニットを２８ｈｐｍまでＣＲ１ａａ培地中で維持した。
【０１７２】
卵母細胞を人工的に活性化するための方法は、別の所に報告されている。ＮＴユニットの活性化は２８ｈｐｍにおいて行った。活性化の手順に関する簡単な説明は次のとおりである：１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを添加したＴＬ−ＨＥＰＥＳ中でＮＴユニットをイオノマイシン（５μＭ；ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に４分間曝露させた後、３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを添加したＴＬ−ＨＥＰＥＳ中で５分間洗浄した。次に、０．２ｍＭのＤＭＡＰ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＣＲ１ａａ培地のマイクロドロップ中にＮＴユニットを移し、５％ＣＯ２存在下で３８．５℃において４〜５時間培養した。ＮＴユニットを洗浄した後、マウス胚線維芽細胞の集密支持細胞層を形成させた４穴プレート中のＣＲ１ａａ培地＋１０％ＦＣＳおよび６ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡに移した（以下に説明）。５％ＣＯ２存在下で３８．５℃においてＮＴユニットをさらに３日間培養した。活性化の時点から１２日後まで、培地を３日毎に交換した。この時点で、ＮＴユニットは目的とする細胞数、すなわち約５０個に到達しており、物理的にゾーンから除去し、胚細胞株を作成するために使用した。上述のようにして作成したＮＴユニットの写真を図１に示す。
【０１７３】
線維芽細胞による支持細胞層
第１４〜１６日のマウス胎児から、胚線維芽細胞の初代培養を作成した。頭、肝臓、心臓および消化管を無菌的に除去した後、胚を細かく刻んで、予め加温したトリプシンＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ；ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で３７℃において３０分間インキュベートした。線維芽細胞を組織培養用フラスコに入れ、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇｅｎ、ＵＴ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５０μｌ／ｍｌ）を添加したα−ＭＥＭ培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中で培養した。３〜４日継代した後、胚線維芽細胞を３５×１０Ｎｕｎｃ培養用ディッシュ（Ｂａｘｔｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭｃＧａｗ Ｐａｒｋ、ＩＬ）中で照射した。照射した線維芽細胞は、５％ＣＯ２存在下の加湿空気中で３７℃において生育させ維持した。均一な細胞単層が形成された培養プレートを用いて胚細胞株の培養を行った。
【０１７４】
胚細胞株の作成
上述のようにして作成したＮＴユニット細胞を洗浄し、照射した線維芽細胞の支持層の上に直接プレーティングした。これらの細胞は、ＮＴユニットの内部のものを用いた。１０％ＦＣＳおよび０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を添加した生育用培地中で細胞を維持した。生育用培地は２〜３日毎に交換した。培養第２日に１個目のコロニーが観察された。コロニーは増殖し、以前に開示したマウス胚性幹（ＥＳ）細胞と同様の形態を示すようになる。コロニー内の個々の細胞は明瞭に識別することができず、コロニーの周囲は屈折性で滑らかな外観をもつ。細胞コロニーの細胞倍化時間はマウスのＥＳ細胞よりも長いようである。また、ウシおよびブタ由来のＥＳ細胞とは異なり、コロニーはこれまでのところ上皮様外観を呈していない。上述のようにして得られたＥＳ様細胞コロニーの写真を図２から５に示す。
【０１７５】
分化したヒト細胞の作成
作成したヒト胚細胞を分化用培地に移し、分化したヒト細胞型が得られるまで培養する。
【０１７６】
結果
１６個以上の細胞をもつ構造まで発育したＮＴユニット１個を、線維芽細胞支持層の上にプレーティングした。この構造体を支持細胞層に付着させ、ＥＳ細胞様の形態をもつコロニーを形成するまで増殖させた（例として図２を参照）。さらに、４〜１６細胞期の構造体を用いてＥＳ細胞コロニーの作成を試すことはしなかったが、この期でもＥＳ細胞あるいはＥＳ様細胞株を作成し得ることが以前に示されている（マウス、Ｅｉｓｔｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｄｅｖｅｌ．Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒ．、３１：２７５−２８２（１９８９）；ウシ、Ｓｔｉｃｅ ｅｔ ａｌ．、１９９６））。したがって、４〜１６細胞期のＮＴユニットからも胚細胞あるいは幹様細胞および細胞コロニーを作成し得るはずであると期待される。
【０１７８】
また、ヒト成人のケラチノサイト細胞株を脱核したウシ卵母細胞と融合させ、ＡＣＭ、ウリジン、グルコース、および１０００ＩＵのＬＩＦを含有する培地中で培養した場合にも、同様の結果が得られた。再構築した胚５０個のうち、２２個が細胞分裂し、１個が約１２日目に未分化胚芽細胞にまで発育した。この未分化胚芽細胞をプレーティングし、現在ＥＳ細胞株を作成中である。
【０１７９】
例２
Ａ．細胞からミトコンドリアを分離する手順
この例は、ミトコンドリアの分離と、異種間核移植の効率を上昇させるためのその利用に関するものである。細胞１個当たりのミトコンドリアの数は、細胞株によって異なる。例えば、マウスのＬ細胞の１細胞当たりのミトコンドリア含有数は〜１００個であるのに対して、ＨｅＬａ細胞では少なくともその２倍はある。低張緩衝液中で細胞を膨張させ、造作のきつい乳棒を用いてＤｏｕｎｃｅホモジナイザーの中で数回ストロークすることによって細胞を破壊し、分画遠心によりミトコンドリアを分離する。
【０１８０】
溶液、試験管、およびホモジナイザーは、氷上で予冷しておかなければならない。遠心手順はすべて４０℃において行う。本手順は、洗浄した１〜２ｍｌの細胞ペレットから開始するものである。細胞ペレットを１１ｍｌの氷冷ＲＳＢ中に再懸濁し、１６ｍｌ Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーに移す。
【０１８１】
ＲＳＢ緩衝液
ＲＳＢ（組織培養細胞を膨張させるための低張緩衝液）
１０ｍＭ ＮａＣｌ
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５
ＭｇＣｌ２
【０１８２】
細胞を５〜１０分間膨張させる。位相差顕微鏡を用いて膨張の進行を確認する。膨張した細胞を、望ましくは乳棒の数回のストロークにより、破壊する。直後に、８ｍｌの２．５×ＭＳ緩衝液を添加し、最終濃度が１×ＭＳとなるようにする。次にホモジナイザーの上部をＰａｒａｆｉｌｍで覆い、数回反転させることによって混合する。
【０１８３】
２．５×ＭＳ緩衝液
５２５ｍＭマンニトール
１７５ｍＭショ糖
１２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５
２１５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ ７．５
【０１８４】
１×ＭＳ緩衝液
２１０ｍＭマンニトール
７０ｍＭショ糖
５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５
１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５
【０１８５】
ＭＳ緩衝液は、細胞小器官の張度を維持し、凝集を防ぐための等浸透圧性緩衝液である。
【０１８６】
その後、ホモジネートを遠心チューブに移し、分画遠心を行う。ホモジナイザーを少量のＭＳ緩衝液ですすぎ、ホモジネートに添加する。ＭＳ緩衝液を用いて容積を３０ｍｌにする。次に、ホモジネートを１３００ｇにおいて５分間遠心し、核、破壊した細胞、および大きい膜断片を除去する。その後、上清を清潔な遠心チューブに移す。核スピンダウンを２回繰り返す。さらに、上清を清潔な遠心チューブに移し、ミトコンドリアを含む沈渣を１７，０００ｇで１５分間遠心する。上清を捨て、チューブの内側をＫｉｍｗｉｐｅで拭う。沈渣を１×ＭＳに再懸濁し、１７，０００ｇでの遠心を繰り返すことによってミトコンドリアを洗浄する。上清を捨て、沈渣を緩衝液中に再懸濁する。ミトコンドリアは、−８０℃において長期間、例えば１年間程度保管することができるが、ＮＴのためにはすぐに使用するのが望ましい。
【０１８７】
この基本手順は、変更可能である。特に、ミトコンドリアのＤＮＡをさらに分離し、ＮＴのために同様に使用するのが望ましい。この場合には、細胞小器官ではなく核の混入が問題となる可能性があるため、次のような変更を加えるのがよい。例えば、ほとんどの細胞が活発に分裂していない定常期に細胞を回収し、ＭｇＣｌ２の代わりにＣａＣｌ２を添加したＲＳＢ中で核膜を安定化させる。密度勾配精製法の場合と同様に、ミトコンドリア沈渣の洗浄は省略する。その代わりに、ミトコンドリア沈渣を単純に再懸濁させて溶解し、残っている核ＤＮＡからミトコンドリアのＤＮＡを精製する。前述のとおり、ミトコンドリアおよびミトコンドリアＤＮＡを精製するために適した方法は、本分野においてよく知られている。
【０１８８】
最も効率良くホモジナイズすることができるのは、細胞沈渣の容積の少なくとも５〜１０倍の溶液に再懸濁した場合であり、また細胞懸濁液がホモジナイザーの少なくとも半分を満たしている場合である。ホモジナイザーの乳棒をチューブに向って真っ直ぐに押し、安定した強い圧力を維持する。Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーは、膨張した組織培養細胞を圧力の変化によって破壊するものである。乳房を押し下げた時には、細胞周辺の圧力が上昇する；細胞が乳棒の端をすべって通過する再に圧力が突然低下し、細胞が崩壊する。乳棒の造作が非常にきつければ、同時に物理的な破壊も起こるであろう。
【０１８９】
Ｂ．組織からのミトコンドリア分離
ミトコンドリア分離手順は、個々の組織に応じて選択する。例えば、組織に応じて最適なホモジナイズ用緩衝液、最適なホモジナイズ法を使用する必要がある。最適な方法については、この分野でよく知られている。
【０１９０】
ラット肝臓は、入手が容易であり、ホモジナイズし易く、細胞中に多数のミトコンドリア（一細胞当たり１０００〜２０００個）が含まれるため、ミトコンドリア調製のために最もよく用いられる組織である。例えば、ラット肝臓をホモジナイズするためには、モーター駆動式テフロン（登録商標）ガラスＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーを使用することができる。一方、組織が柔らかい場合には、ゆるい乳棒のついたＤｏｕｎｃｅホモジナイザーを使用する。ミトコンドリア調製の回収率および純度は、調製方法、調製の速さ、動物の年齢および生理学的状態によって変動する。前述のように、ミトコンドリアを精製するための方法は良く知られている。
【０１９１】
緩衝液、チューブ、およびホモジナイザーを予冷しておくのが望ましい。ガラステフロン（登録商標）型のホモジナイザーを予冷することによって、チューブと乳棒の間に適正な空隙ができる。遠心過程は、４０℃で行うのが望ましい。
【０１９２】
基本的な手順として、胆嚢を破裂させないように注意しながら肝臓を摘出することが重要である。摘出した肝臓を氷上のビーカーに入れ、結合組織を除去する。組織を確認し、ビーカーに戻す。例えば非常に鋭利な鋏、小刀、あるいは剃刀の刃を用いて１〜２片に切断する。次に断片をホモジナイズ用緩衝液（１×ＭＳ）で望ましくは２回すすいで血液の大半を除去し、組織をホモジナイザーのチューブに移す。ホモジナイズ用緩衝液を１：１０（ｗ／ｖ）ホモジネートの比率になるよう添加する。
【０１９３】
ＮＴ効率を上昇させるための分離ミトコンドリアまたはミトコンドリアＤＮＡの使用
発明者らは、ドナー細胞もしくは核と同一動物種のミトコンドリアあるいはミトコンドリアＤＮＡを導入することによって異種間核移植の効率が上昇する可能性がある、との理論づけをしている。その結果、得られたＮＴユニットの核ＤＮＡが種適合性をもつようになると考えられる。
【０１９４】
上述の方法、もしくは他に知られた方法によって分離したミトコンドリアは、次のうちのいずれか（ヒトドナー細胞／ウシ卵母細胞核移植の場合）に導入する（一般に、注射による）：
（ｉ）活性化していない、脱核していないウシ卵母細胞；
（ｉｉ）活性化していない、脱核したウシ卵母細胞；
（ｉｉｉ）活性化し、脱核したウシ卵母細胞；
（ｉｖ）活性化していない、融合した（ヒトドナー細胞または核と）ウシラン母細胞；
（ｖ）活性化し、融合して切断して再構築した（ウシ卵母細胞／ヒト細胞）胚；もしくは
（ｖｉ）活性化し、融合した１細胞再構築（ウシ卵母細胞／ヒト細胞）胚。
これと同一の手順によって、他の異種間ＮＴも促進することができる。基本的には、ミトコンドリアを同様にドナー細胞あるいは核と同じ動物種の（ｉ）から（ｖｉ）のいずれかに導入し、異なる動物種に由来する卵母細胞を使用する。一般に、約１〜２００ピコリットルのミトコンドリア懸濁液を、上記のいずれかに注射する。このようにミトコンドリアを導入することによって、ミトコンドリアＤＮＡとドナーＤＮＡが適合するＮＴユニットが得られる。
【０１９５】
例３
異種間核移植の効率を上昇させるための別の方法として、１個または複数個の脱核した体細胞（一般にはヒト、ドナー細胞または核と同一の動物種の細胞）を次のうちのいずれかと融合させる、というものがある：
（ｉ）活性化していない、脱核していない（例えばウシの）卵母細胞；
（ｉｉ）活性化していない、脱核した（例えばウシの）卵母細胞；
（ｉｉｉ）活性化し、脱核した（例えばウシの）卵母細胞；
（ｉｖ）活性化していない、融合した（ヒト細胞と）卵母細胞（一般にウシ）；
（ｖ）活性化し、融合して切断して再構築した（例えばウシ卵母細胞／ヒト細胞）胚；
（ｖｉ）活性化し、融合した１細胞再構築（ウシ卵母細胞／ヒト細胞）胚。 （ｖｉｉ）活性化していない、融合した（例えばヒト細胞と）卵母細胞（一般にウシ卵母細胞）。
【０１９６】
融合は、電気パルスを用いて、あるいはＳｅｎｄａｉウイルスを用いて行うのが望ましい。脱核した細胞（例えばヒト細胞）を作成するための方法は、本分野においてよく知られている。望ましい手順を以下に記載する。
【０１９７】
脱核の手順
サイトカラシンＢを用いて細胞の大規模な脱核を行うための方法は、本分野においてよく知られている。脱核は、単層法を用いて行うのが望ましい。この方法は培養ディスクの生育表面に付着した少数の細胞を利用するもので、ドナー細胞が限られた数しか入手できない場合に理想的である。もう１つの適切な手段である勾配法では、Ｆｉｃｏｌｌ勾配によって細胞を遠心する必要があるため、大量（＞１０７）の細胞の脱核に最も適している。
【０１９８】
単層法。単層法は、生育表面に付着して増殖する細胞であれば、ほぼすべての細胞に適している。
【０１９９】
ポリカーボネート製あるいはポリプロピレン製のねじ蓋付き広口遠心チューブ（容積２５０ｍｌ）をオートクレーブにより滅菌する。キャップは、遠心ボトルへの損傷を防ぐために、ボトルとは別にオートクレーブすることが望ましい。各ボトルに３０ｍｌ ＤＭＥＭ、２ｍｌウシ血清、および０．３２ｍｌサイトカラシンＢ（１ｍｇ／ｍｌ）を無菌的に添加し、脱核手順のための準備をする。ボトルにキャップをはめ、使用時までボトルを３７℃に保温する。
【０２００】
脱核を行う細胞（数百個〜１０５個の細胞）を培養ディッシュ（３５×１５ｍｍ；Ｎｕｎｃ Ｉｎｃ．、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）上に接種する。一般に、細胞を生育表面に最大限に付着させるために、細胞を少なくとも２４時間、ディッシュ上で生育させる。細胞が集密状態にならないようにするのが望ましい。滅菌の目的のため、培養ディッシュ（細胞を含む）の外側の下半分を７０％（ｖ／ｖ）エタノールで拭って遠心の準備をする。これ以外に、細胞培養の間にディッシュをさらに大きい無菌の培養ディッシュ内にいれておくことにより、ディッシュを無菌状態に保つことも可能である。ディッシュから培地を捨て、ディッシュ（蓋なし）を遠心ボトル内で上下逆になるよう置く。
【０２０１】
ローター（ＧＳＡ、ＤｕＰｏｎｔ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）および遠心機は、８０００ｒｐｍで３０〜４５分間遠心することにより、３７℃まで予熱しておくのが望ましい。これ以外に、ＨＳ−４スイングバケットローター（ＤｕＰｏｎｔ）を使用してもよい。最適な遠心時間および速度は、細胞の種類によって異なる。筋原細胞および線維芽細胞の場合には、培養ディッシュの入った遠心ボトルを予熱したローターに入れ、約２０分間遠心する（ローターが目的とする速度に到達してから遠心機のスイッチを切るまでの時間）。６５００から７２００ｒｐｍの速度を用いるのが望ましい。
【０２０２】
遠心が終了した後、遠心ボトルをローターから取り出し、鉗子を用いてボトルから培養プレートを取り出す。細胞の生存能を維持するため、細胞の水分を保つようプレート中に少量の培地を残す。ディッシュの外側を蓋の端も含めて滅菌ワイパーで拭き取った後、９５％（ｖ／ｖ）エタノールを添加し、残りの培地を除去して乾燥させる。滅菌した蓋をディッシュにかぶせる。脱核した細胞の準備がすぐにできない場合には、完全培地（適切な濃度の血清を添加した培地）をディッシュに添加し、細胞をＣＯ２インキュベーター内で維持しなければならない。得られた脱核細胞（核質）を上記の（ｉ）から（ｖｉｉｉ）のいずれかと融合させる。
【０２０３】
本発明に関して、各種の具体的な材料、手順、および例を引用してここに説明し例示しているが、本発明は特定の材料、材料の組み合わせ、および当該目的のために選択した手順に限定されるものではない。このような具体例には数多くの変法があり、本分野における専門家であればその真価が理解できるはずである。
【図面の簡単な説明】
【図１】成人細胞核を、除核ウシ卵母細胞に移植して生成した核移植（ＮＴ）ユニットの写真である。
【図２】図１に示すようなＮＴユニットに由来する胚幹様細胞の写真である。
【図３】図１に示すようなＮＴユニットに由来する胚幹様細胞の写真である。
【図４】図１に示すようなＮＴユニットに由来する胚幹様細胞の写真である。
【図５】図１に示すようなＮＴユニットに由来する胚幹様細胞の写真である。
Claims (54)
- （ｉ）ドナーである未分化ヒト細胞もしくは哺乳類細胞または細胞核を受容側の動物卵母細胞に挿入する方法で、卵母細胞は核移植（ＮＴ）ユニットの作成に適した条件下でヒトもしくは哺乳類細胞以外の動物種から採取し、ドナーの細胞または核の導入前、同時、あるいは後に内在する卵母細胞核を除去するか不活化すること
（ｉｉ）作成した核移植ユニットを活性化すること
（ｉｉｉ）ドナーの細胞または核と同一の動物種の卵母細胞もしくは割球に由来する当該卵母細胞細胞質（「適合する細胞質」）中に挿入すること
（ｉｖ）活性化した当該核移植ユニットを、２細胞期以上になるまで培養すること
（ｖ）培養した当該ＮＴユニットから作成した細胞を培養し、胚細胞あるいは幹様細胞を作成すること
から構成される胚細胞あるいは幹様細胞作成のための方法。 - ドナーの細胞あるいは核と同一種のミトコンドリアＤＮＡを受容側の卵母細胞中に導入する（「適合するミトコンドリア」）手順をさらに含有する請求項１に記載の方法。
- 当該細胞質をドナーの細胞あるいは核の導入前、同時、もしくは後に導入する請求項１に記載の方法。
- 当該導入をドナーの細胞あるいは核の導入後約６時間以内に行う請求項４に記載の方法。
- 当該卵母細胞が未成熟な卵母細胞である請求項４に記載の方法。
- 当該卵母細胞が未成熟なヒト卵母細胞である請求項５に記載の方法。
- 当該未成熟ヒト卵母細胞から細胞質を分離する前にｉｎ ｖｉｔｒｏで卵母細胞を成熟させる請求項５に記載の方法。
- 当該未成熟卵母細胞から細胞質を分離する前にｉｎ ｖｉｔｒｏで卵母細胞を活性化する請求項４に記載の方法。
- 当該卵母細胞をカルシウム量を上昇させる物質と接触させることによって当該ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化を行う請求項８に記載の方法。
- 細胞質を導入する前に、ドナーの細胞あるいは核と同一種の最低１個の卵母細胞もしくは割球から受容側卵母細胞の細胞質の全部または一部を除去する請求項２に記載の方法。
- 脱核した動物卵母細胞中に挿入する細胞がヒトの細胞である請求項１に記載の方法。
- 当該ヒト細胞が成人細胞である請求項１１に記載の方法。
- 当該ヒト細胞が上皮細胞、ケラチノサイト、リンパ球あるいは線維芽細胞である請求項１１に記載の方法。
- 卵母細胞を哺乳類から採取する請求項１１に記載の方法。
- 動物の卵母細胞を有蹄類から採取する請求項１４に記載の方法。
- 当該有蹄類をウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギ、およびスイギュウのグループから選択する請求項１５に記載の方法。
- 脱核する卵母細胞を脱核の前に成熟させる請求項１に記載の方法。
- 融合した核移植ユニットをｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化させる請求項１に記載の方法。
- 活性化した核移植ユニットを支持細胞層上で培養する請求項１に記載の方法。
- 支持細胞層が線維芽細胞である請求項１９に記載の方法。
- （ｖ）段階で１６個以上の細胞を持つＮＴユニットからの細胞を支持細胞層上で培養する請求項１に記載の方法。
- 当該支持細胞層が線維芽細胞である請求項２１に記載の方法。
- 当該線維芽細胞がマウス胚線維芽細胞である請求項２２に記載の方法。
- 作成した胚細胞あるいは幹様細胞を誘導して分化させる請求項１に記載の方法。
- 作成した胚細胞あるいは幹様細胞を誘導して分化させる請求項１１に記載の方法。
- 融合を電気融合によって行う請求項１に記載の方法。
- 請求項１に記載の方法に従って作成した胚細胞あるいは幹様細胞。
- 請求項１１に記載の方法に従って作成したヒトの胚細胞あるいは幹様細胞。
- 請求項１２に記載の方法に従って作成したヒトの胚細胞あるいは幹様細胞。
- 請求項１３に記載の方法に従って作成したヒトの胚細胞あるいは幹様細胞。
- 請求項１４に記載の方法に従って作成したヒトの胚細胞あるいは幹様細胞。
- 請求項１５に記載の方法に従って作成したヒトの胚細胞あるいは幹様細胞。
- 請求項２５に記載の方法に従って作成したヒト分化細胞。
- 神経細胞、造血細胞、膵臓細胞、筋肉細胞、軟骨細胞、尿路細胞、肝臓細胞、脾臓細胞、生殖細胞、皮膚細胞、腸細胞、および胃細胞から選択する請求項３３に記載のヒト分化細胞。
- 挿入した遺伝子を含有し発現する請求項３３に記載のヒト分化細胞。
- 当該胚細胞あるいは幹様細胞において目的とする遺伝子を挿入、除去、もしくは修飾した請求項１に記載の方法。
- 目的とする遺伝子が治療用酵素、成長因子、あるいはサイトカインをコードする請求項３６に記載の方法。
- 当該胚細胞あるいは幹様細胞がヒト胚細胞あるいは幹様細胞である請求項３７に記載の方法。
- 目的とする遺伝子を同種組換えによって除去、修飾、あるいは欠損させた請求項３６に記載の方法。
- 内胚葉、外胚葉および中胚葉のうち少なくとも１つの発生を阻害するためにドナー細胞を遺伝的に修飾した請求項１に記載の方法。
- 分化効率を上昇させるためにドナー細胞を遺伝的に修飾した請求項１に記載の方法。
- 培養核移植ユニットを少なくとも１種類のカプサーゼ阻害剤を含有する培地中で培養する請求項４０に記載の方法。
- ドナー細胞が特定のサイクリンの発現を示す標識を検出可能な程度に発現する請求項１に記載の方法。
- ドナー細胞をＳＲＦ、ＭＥＳＰ−１、ＨＮＦ−４、β−１、インテグリン、ＭＳＤ、ＧＡＴＡ−６、ＧＡＴＡ−４、ＲＮＡヘリカーゼＡ、およびＨβ５８から選択した遺伝子の発現が変化するよう修飾した請求項４０に記載の方法。
- 当該ドナー細胞をＱ７かつ／またはＱ９遺伝子を発現するＤＮＡを導入するよう遺伝的に修飾した請求項４１に記載の方法。
- 当該遺伝子（１個または複数）を調節可能なプロモーターに機能的に結合させた請求項４５に記載の方法。
- ドナー細胞をアポトーシスを阻害するよう遺伝的に修飾した請求項１に記載の方法。
- Ｂａｄ、Ｂｏｋ、ＢＨ３、Ｂｉｋ、Ｂｌｋ、Ｈｒｋ、ＢＮＩＰ３、ＧｉｍＬ、Ｂｉｄ、ＥＧＬ−１、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１、Ａ１、Ｎｒ−１３、ＢＨＲＦ−１、ＬＭＷ５−ＨＬ、ＯＲＦ１６、Ｋｓ−Ｂｃｌ−２、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ、およびＣＥＤ−９の中から選択した１種類以上の遺伝子の発現を変化させることによってアポトーシスを低下させる請求項４７に記載の方法。
- 当該遺伝子のうち少なくとも１つを誘導可能なプロモーターに機能的に結合させた請求項４８に記載の方法。
- 検出可能なマーカーをコードし、その発現が特定のサイクリンにリンクしているＤＮＡを発現する哺乳類体細胞。
- サイクリンＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｂ１、Ｂ２、Ｅ、ＡおよびＨの中からサイクリンを選択する請求項５０に記載の細胞。
- 検出可能なマーカーが蛍光ポリペプチドである請求項５０に記載の細胞。
- 当該哺乳類細胞をヒト、霊長類、げっ歯類、有蹄類、イヌ、およびネコの細胞から選択する請求項５２に記載の細胞。
- 当該細胞がヒト、ウシあるいは霊長類の細胞である請求項５２の細胞。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US46707699A | 1999-12-20 | 1999-12-20 | |
| PCT/US2000/012631 WO2001046401A1 (en) | 1999-12-20 | 2000-05-10 | Embryonic or stem-like cells produced by cross species nuclear transplantation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004500066A true JP2004500066A (ja) | 2004-01-08 |
Family
ID=23854253
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001546899A Pending JP2004500066A (ja) | 1999-12-20 | 2000-05-10 | 異種間核移植により生成する胚あるいは幹様細胞 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1240318A4 (ja) |
| JP (1) | JP2004500066A (ja) |
| CN (1) | CN1425064A (ja) |
| AU (1) | AU784731B2 (ja) |
| BR (1) | BR0016561A (ja) |
| CA (1) | CA2394614A1 (ja) |
| IL (2) | IL150065A0 (ja) |
| MX (1) | MXPA02006093A (ja) |
| NZ (1) | NZ519346A (ja) |
| WO (1) | WO2001046401A1 (ja) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7696404B2 (en) | 1996-08-19 | 2010-04-13 | Advanced Cell Technology, Inc. | Embryonic or stem-like cell lines produced by cross species nuclear transplantation and methods for enhancing embryonic development by genetic alteration of donor cells or by tissue culture conditions |
| BR0012099A (pt) * | 1999-06-30 | 2003-07-29 | Advanced Cell Tech Inc | Transferência citoplásmica para de-diferenciar células recipientes |
| CA2384413A1 (en) * | 1999-09-14 | 2001-03-22 | James Robl | Embryonic or stem-like cell lines produced by cross species nuclear transplantation and methods for enhancing embryonic development by genetic alteration of donor cells or by tissue culture conditions |
| AUPR247901A0 (en) * | 2001-01-10 | 2001-02-01 | Garelag Pty Ltd | Activation of nuclear transfer embryos |
| AU2002313817A1 (en) | 2001-08-27 | 2003-03-10 | Advanced Cell Technology, Inc. | Trans-differentiation and re-differentiation of somatic cells and production of cells for cell therapies |
| EP1486563A4 (en) * | 2002-02-27 | 2008-01-09 | Yasumitsu Nagao | EMBRYONALLY MODIFIED ANIMAL AND METHOD OF CONSTRUCTING THEM |
| AU2004238375A1 (en) * | 2003-05-13 | 2004-11-25 | The Regents Of The University Of Colorado | Diagnostic and therapeutic treatments related to mitochondrial disorders |
| US7893315B2 (en) | 2004-11-04 | 2011-02-22 | Advanced Cell Technology, Inc. | Derivation of embryonic stem cells and embryo-derived cells |
| CA2588088C (en) | 2004-11-04 | 2018-10-09 | Advanced Cell Technology, Inc. | Derivation of embryonic stem cells |
| ES2933478T3 (es) | 2005-08-03 | 2023-02-09 | Astellas Inst For Regenerative Medicine | Métodos mejorados de reprogramación de células somáticas animales |
| US8372644B2 (en) * | 2006-02-06 | 2013-02-12 | Transplantation Limited | Method for growing adult cells |
| WO2008103462A2 (en) | 2007-02-23 | 2008-08-28 | Advanced Cell Technology, Inc. | Highly efficient methods for reprogramming differentiated cells and for generating animals and embryonic stem cells from reprogrammed cells |
| US10865383B2 (en) | 2011-07-12 | 2020-12-15 | Lineage Cell Therapeutics, Inc. | Methods and formulations for orthopedic cell therapy |
| AU2016235176B2 (en) | 2015-03-23 | 2022-05-19 | Astellas Institute For Regenerative Medicine | Improved assays for potency of human retinal pigment epithelium (RPE) cells and photoreceptor progenitors |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998007841A1 (en) * | 1996-08-19 | 1998-02-26 | University Of Massachusetts | Embryonic or stem-like cell lines produced by cross species nuclear transplantation |
| WO1999045100A1 (en) * | 1998-03-02 | 1999-09-10 | University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus | Embryonic or stem-like cell lines produced by cross-species nuclear transplantation |
| WO1999055841A2 (en) * | 1998-04-29 | 1999-11-04 | University Of Edinburgh | Process for obtaining stem cells |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5061620A (en) * | 1990-03-30 | 1991-10-29 | Systemix, Inc. | Human hematopoietic stem cell |
| AU8587598A (en) * | 1997-07-26 | 1999-02-16 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Trans-species nuclear transfer |
| JP2003503044A (ja) * | 1999-06-30 | 2003-01-28 | ワン，ウー−サク | 種間核移植技術を用いたヒトクローン胚の作製方法 |
| CA2384413A1 (en) * | 1999-09-14 | 2001-03-22 | James Robl | Embryonic or stem-like cell lines produced by cross species nuclear transplantation and methods for enhancing embryonic development by genetic alteration of donor cells or by tissue culture conditions |
-
2000
- 2000-05-10 AU AU48309/00A patent/AU784731B2/en not_active Ceased
- 2000-05-10 JP JP2001546899A patent/JP2004500066A/ja active Pending
- 2000-05-10 BR BR0016561-1A patent/BR0016561A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-05-10 IL IL15006500A patent/IL150065A0/xx unknown
- 2000-05-10 CN CN00818280A patent/CN1425064A/zh active Pending
- 2000-05-10 CA CA002394614A patent/CA2394614A1/en not_active Abandoned
- 2000-05-10 MX MXPA02006093A patent/MXPA02006093A/es not_active Application Discontinuation
- 2000-05-10 NZ NZ519346A patent/NZ519346A/en unknown
- 2000-05-10 EP EP00930498A patent/EP1240318A4/en not_active Withdrawn
- 2000-05-10 WO PCT/US2000/012631 patent/WO2001046401A1/en active IP Right Grant
-
2002
- 2002-06-06 IL IL150065A patent/IL150065A/en active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998007841A1 (en) * | 1996-08-19 | 1998-02-26 | University Of Massachusetts | Embryonic or stem-like cell lines produced by cross species nuclear transplantation |
| WO1999045100A1 (en) * | 1998-03-02 | 1999-09-10 | University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus | Embryonic or stem-like cell lines produced by cross-species nuclear transplantation |
| WO1999055841A2 (en) * | 1998-04-29 | 1999-11-04 | University Of Edinburgh | Process for obtaining stem cells |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2001046401A8 (en) | 2001-07-26 |
| IL150065A (en) | 2009-09-22 |
| IL150065A0 (en) | 2002-12-01 |
| CN1425064A (zh) | 2003-06-18 |
| NZ519346A (en) | 2004-02-27 |
| CA2394614A1 (en) | 2001-06-28 |
| MXPA02006093A (es) | 2004-08-23 |
| AU4830900A (en) | 2001-07-03 |
| WO2001046401A1 (en) | 2001-06-28 |
| EP1240318A1 (en) | 2002-09-18 |
| EP1240318A4 (en) | 2004-12-08 |
| AU784731B2 (en) | 2006-06-08 |
| BR0016561A (pt) | 2002-09-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20050250203A1 (en) | Embryonic or stem-like cell lines produced by cross species nuclear transplantation | |
| CA2317494A1 (en) | Cloning using donor nuclei from differentiated fetal and adult cells | |
| JP2007167078A (ja) | 分化した胎仔および成体ドナー細胞による核移植 | |
| US20010012513A1 (en) | Embryonic or stem-like cell lines produced by cross species nuclear transplantation | |
| JP2002537803A (ja) | 異種間核移植により産生される胚性細胞株あるいは幹様細胞株 | |
| US7696404B2 (en) | Embryonic or stem-like cell lines produced by cross species nuclear transplantation and methods for enhancing embryonic development by genetic alteration of donor cells or by tissue culture conditions | |
| JP2004500066A (ja) | 異種間核移植により生成する胚あるいは幹様細胞 | |
| AU759322B2 (en) | Embryonic or stem-like cell lines produced by cross-species nuclear transplantation | |
| US20040040050A1 (en) | Production of agricultural animals from embryonic stem (es) cells | |
| JP2003514515A (ja) | 核移行のためのドナー細胞の調製と選択 | |
| AU2008229989A1 (en) | Embryonic or stem-like cell lines produced by cross species nuclear transplantation and methods for enhancing embryonic development by genetic alteration of donor cells or by tissue culture conditions | |
| JP2003509031A (ja) | ドナー細胞又は分化細胞からの核を使用する豚のクローニング並びに多能性豚の産生 | |
| JP2003525031A (ja) | 交雑種核移植によって産生された胚細胞または幹様細胞系及びドナー細胞の遺伝子改変または組織培養条件によって胚発達を増強する方法 | |
| KR20040070353A (ko) | 체세포 기원 배아 줄기 세포 및 그의 분화된 세포 | |
| MXPA00008602A (en) | Embryonic or stem-like cell lines produced by cross-species nuclear transplantation | |
| AU2006201208A1 (en) | Embryonic or stem-like cells produced by cross species nuclear transpantation | |
| AU2005225103A1 (en) | Embryonic or stem-like cell lines produced by cross species nuclear transplantation and methods for enhancing embryonic development by genetic alteration of donor cells or by tissue culture conditions | |
| JP2005523031A (ja) | 冷却死骸からのクローン化された仔の生産 | |
| MXPA99001706A (es) | Lineas celulares embrionicas o similares a las desoporte producidas por transplante nuclear de especies cruzadas |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070509 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100604 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20101029 |