ES2933478T3 - Métodos mejorados de reprogramación de células somáticas animales - Google Patents

Métodos mejorados de reprogramación de células somáticas animales Download PDF

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Abstract

Esta invención generalmente se refiere a métodos para obtener células y tejidos de mamíferos con patrones de expresión génica similares a los de un embrión o feto de mamífero en desarrollo, y el uso de tales células y tejidos en el tratamiento de enfermedades humanas y condiciones relacionadas con la edad. Más particularmente, la invención se refiere a métodos para identificar, expandir en cultivo y formular células madre pluripotentes de mamíferos y células diferenciadas que difieren de las células del ser humano adulto en su patrón de expresión génica y, por lo tanto, ofrecen características únicas que proporcionan estrategias terapéuticas novedosas en el tratamiento de enfermedades degenerativas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos mejorados de reprogramación de células somáticas animales
Campo de la invención
Byrne et al. informan que “los núcleos de células somáticas de mamíferos adultos se reprograman directamente para la expresión del gen de células madre oct-4 por ovocitos de anfibios” (Current Biology, 13(14):1206-1213, 15 de julio de 2003). Marshall et al. informan sobre “el ensamblaje de la envoltura nuclear después de la mitosis” (Trends in Cell Biology, 7(2):69-74, 1997). El documento WO 2005/049788 A informa sobre “la reprogramación de núcleos de células somáticas”. Ambrosi et al. informan sobre “la reprogramación mediada por la fusión de células madre” (Journal of Cellular and Molecular Medicine, 9(2):320-330, 2 de junio de 2005). Do et al. informan sobre “núcleos de células madre embrionarias que reprograman células somáticas” (Stem Cells, 22(6):941-949, 2004).
Esta invención se refiere en general a métodos para reprogramar una célula somática animal desde un estado diferenciado concreto a otro estado. Tales células y tejidos se pueden utilizar en el tratamiento de enfermedades humanas y afecciones relacionadas con la edad. Más concretamente, la invención se refiere a un método mejorado que utiliza un procedimiento de tres etapas mediante el cual la envoltura nuclear del núcleo de la célula somática se remodela primero a la de una célula no diferenciada antes de la segunda etapa de transferencia del núcleo remodelado al citoplasma de una célula no diferenciada. Esta etapa de remodelación nuclear mejora notablemente la eficacia de la reconstitución celular cuando el núcleo remodelado se transfiere al citoplasma embrionario con el propósito de obtener células madre. Además, la eliminación de los componentes de la envoltura nuclear específicos de las células diferenciadas, tales como la lamina A, y la reprogramación de la cromatina dan como resultado una reactivación de la actividad telomerasa, un alargamiento de la longitud de los telómeros y mecanismos de recombinación homóloga que reparan las secuencias de ADN repetidas en tándem. Las células madre pluripotentes derivadas de la presente invención se pueden utilizar en nuevas estrategias terapéuticas en el tratamiento de trastornos cardíacos, neurológicos, endocrinológicos, vasculares, retinianos, dermatológicos, musculoesqueléticos, y otras enfermedades.
Antecedentes de la invención
Los avances en la tecnología de células madre, tales como el aislamiento y el uso de células madre embrionarias humanas (hES), se han convertido en un nuevo tema importante de investigación médica. Las células hES tienen un potencial demostrado para diferenciarse hacia todos y cada uno de los tipos de células del organismo humano, incluidos tejidos complejos. Esta capacidad de las células hES ha llevado a la sugerencia de que muchas enfermedades resultantes de la disfunción de las células pueden ser susceptibles de tratamiento mediante la administración de células derivadas de hES de varios tipos diferenciados (Thomson et al., Science 282:1145-7, (1998)). Los estudios de transferencia nuclear han demostrado que es posible transformar una célula somática diferenciada de nuevo hacia un estado totipotente como el de las células ES o ED (Cibelli et al., Nature Biotech 16:642-646, (1998)). El desarrollo de tecnologías para reprogramar las células somáticas de nuevo a un estado de células ES totipotentes, tal como por transferencia nuclear, ofrece un medio para suministrar células somáticas derivadas de ES con un genotipo nuclear del paciente (Lanza et al., Nature Medicine 5:975-977, (1999)). Se espera que tales células y tejidos no sean rechazados, a pesar de la presencia de mitocondrias alogénicas (Lanza et al., Nature Biotech 20:689-696, (2002)). La transferencia nuclear también permite la reconstrucción de la longitud de repetición de los telómeros en las células a través de la reactivación del componente catalítico de la telomerasa en el embrión temprano (Lanza et al., Science 288:665-669, (2000)). No obstante, sigue existiendo la necesidad de mejorar los métodos para reprogramar células animales que aumenten la frecuencia de una reprogramación completa y exitosa y reduzcan la dependencia de la disponibilidad de ovocitos humanos.
Debido a la relativa dificultad de obtener un gran número de ovocitos humanos, ha habido un interés considerable en determinar si otras células de la línea germinal, tales como las células ES cultivadas, o el citoplasma de dichas células, se podrían utilizar para reprogramar células somáticas. Tales células tendrían una ventaja importante sobre los ovocitos como medio de inducir la reprogramación, ya que pueden expandirse fácilmente en número in vitro. Se ha observado la restauración de la expresión de al menos algunos genes específicos de embriones medidos en células somáticas después de la fusión con células ES (Do y Scholer, Stem Cells 22:941-949, (2004); Do y Scholer, Reprod. Fertilizar. Dev. 17:143-149, (2005)). Sin embargo, las células resultantes son híbridos, a menudo con un genotipo tetraploide y, por lo tanto, no son adecuadas como células normales o histocompatibles con fines de trasplante. De hecho, uno de los propósitos propuestos para generar células totipotentes autólogas es prevenir el rechazo de células derivadas de ES. Utilizando las técnicas descritas en estos estudios publicados, las células madre embrionarias utilizadas para reprogramar la célula de un paciente probablemente añadirían alelos que podrían generar una respuesta inmunitaria que conduciría a rechazo. Sin embargo, la evidencia de que las células madre embrionarias pueden reprogramar los cromosomas de células somáticas ha emocionado a los investigadores y ha generado un nuevo campo de investigación llamado "biología de fusión" (Dennis, Nature 426:490-491, (2003)). Otra fuente potencial de células capaces de reprogramar células somáticas humanas con mayor facilidad de disponibilidad que los ovocitos humanos son los ovocitos de especies animales. La demostración de la restauración de la totipotencia en las células somáticas por transferencia nuclear entre especies (Lanza et al., Cloning 2:79-90, (2000)) abre la posibilidad de identificar ovocitos animales que se pueden obtener fácilmente para su uso en la reprogramación de células humanas (Byrne et al., Curr Biol 13:1206-1213, (2003)). Sin embargo, probablemente debido a las diferencias moleculares entre las especies, la transferencia nuclear entre especies, aunque posible, a menudo es incluso más ineficaz que la transferencia nuclear entre las mismas especies.
Entre las muchas alteraciones moleculares que se producen después de la transferencia nuclear de células somáticas, algunas de las alteraciones más críticas son la reprogramación de la cromatina a través de mecanismos poco conocidos en el ovocito receptor y la remodelación de las proteínas de la envoltura nuclear. La envoltura nuclear incluye la membrana nuclear interna (MNI) y la membrana nuclear externa (MNE), los complejos de poros nucleares (CPN) y la lámina nuclear. Las proteínas de la envoltura nuclear, en particular las proteínas de la lámina, difieren entre las células somáticas y de la línea germinal y desempeñan un papel importante en la regulación del ciclo celular, el seguimiento de las vías de control del daño del ADN y la regulación de la diferenciación celular. En particular, las subunidades proteicas de la lámina incluyen las proteínas de filamento intermedio de tipo V, lamina A/C y B, que forman una malla interna de la MNI (Foisner, J. Cell Sci. 114:3791-3792, (2001)). Algunas de estas proteínas, tales como lamina A/C, desempeñan un papel importante en la regulación de la integridad cromosómica, los puntos de control de daño del ADN y la señalización del estado de los telómeros a través de sus interacciones con la helicasa WRN, POT1, Tell y Tel2. En las células de la línea germinal que son telomerasa positiva, o donde se utiliza telomerasa, la matriz nuclear carece de lamina A/C o permite que las secuencias de ADN repetidas en tándem se reparen y, en el caso del telómero, se alargue mediante la telomerasa. Otras proteínas asociadas con la MNI incluyen la familia de polipéptidos asociados a lamina (LAP), incluida la proteína 1 asociada a lamina (LAP1, de la cual hay al menos tres isoformas (a, p y y)), LAP2 (con al menos seis isoformas) y emerina (que cuando muta conduce a una diferenciación muscular anormal y distrofia muscular de Emery-Dreifuss). Otras proteínas asociadas con la MNI incluyen la proteína de unión al dedo anular (RFBP), otefina, germ cell-less (GCL) y nurim. Se sabe que las laminas juegan un papel importante en la regulación de la función de reguladores transcripcionales tales como la proteína del retinoblastoma (pRB) y LBR que a su vez pueden unir la proteína heterocromatina 1 (HP1). A modo de ejemplo de la necesidad de remodelar la envoltura nuclear para reprogramar una célula somática diferenciada hacia un estado no diferenciado, las células de la línea germinal no diferenciadas generalmente carecen de la presencia de lamina A, mientras que las células de la línea germinal contienen proteínas tales como germ-cell less (GCL) y lamina C2, que a menudo no se expresan en células somáticas diferenciadas (Furukawa et al., Exp. Cell Res.
212:426-430, 1994). La remodelación incompleta de la envoltura nuclear contribuiría a la ineficacia o reprogramación incompleta de las células utilizando las tecnologías existentes.
Por lo tanto, cada una de las tecnologías para reprogramar células somáticas humanas conocidas en la técnica tiene sus propias dificultades únicas. La TNCS proporciona un nivel satisfactorio de reprogramación, pero está limitada por la cantidad de ovocitos humanos disponibles para los investigadores. Las tecnologías de transferencia nuclear y fusión celular entre especies no están generalmente limitadas en las células utilizadas en la reprogramación, pero están limitadas por el grado de reprogramación satisfactoria o la solidez del crecimiento de las células reprogramadas resultantes. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de tecnologías mejoradas tanto para aumentar la frecuencia y la calidad de la reprogramación de células somáticas diferenciadas como para producir células reprogramadas que sean capaces de expandirse in vitro con el fin de obtener un número útil de células para investigación, pruebas de control de calidad. y para su uso en terapia celular. La presente invención combina aspectos de varias tecnologías existentes ya conocidas en la técnica de una manera novedosa y no obvia para proporcionar un medio de reprogramar células diferenciadas de manera tan eficaz o más eficaz que la TNCS y proporcionar un sustituto más aceptable y rentable para los ovocitos como vehículo de reprogramación. La presente invención logra estos objetivos en parte mediante el uso de células que se obtienen fácil y económicamente en cantidades ilimitadas y una tecnología que se puede ajustar de manera que se pueden realizar miles o millones de fusiones simultáneamente, aumentando así la probabilidad de un resultado final satisfactorio. Además, el método de la presente invención proporciona una técnica que facilita la reactivación de la telomerasa y la extensión de la longitud de los telómeros, restaurando de ese modo la vida útil replicativa de la célula. El método de la presente invención se puede utilizar adicionalmente para proporcionar un ensayo que permita el análisis de qué componentes en células no diferenciadas y de línea germinal son críticos para la reprogramación nuclear. El método de la invención se puede automatizar mediante robótica para reducir costes y mejorar el control de calidad.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona un método para reprogramar una célula somática diferenciada animal en una célula madre pluripotente no diferenciada, que comprende las etapas de:
(a) aislar el núcleo, el ADN o la cromatina de dicha célula somática diferenciada y encapsular in vitro dichos núcleo, ADN o cromatina en una nueva envoltura nuclear utilizando un extracto sin células de células no diferenciadas para formar un núcleo remodelado, en donde el extracto sin células es capaz de formar envolturas nucleares alredeor del ADN desnudo o cromatina, en donde el extracto sin células es un extracto de células madre embrionarias, un extracto de células germinales embrionarias, un extracto de células de carcinoma embrionario o un extracto de ovocitos; y
(b) transferir o fusionar el núcleo remodelado resultante de la etapa (a) al citoplasma enucleado de una célula embrionaria no diferenciada seleccionada de una célula madre embrionaria, una célula germinal embrionaria o una célula de carcinoma embrionario para formar una célula madre pluripotente no diferenciada y permitir que la célula madre pluripotente no diferenciada resultante crezca.
Se proporcionan adicionalmente métodos para la obtención, formulación y uso de las células reprogramadas resultantes y los tejidos modificados genéticamente en modalidades de terapia para la prevención y el tratamiento de enfermedades. Más específicamente, la invención proporciona un medio mejorado para reprogramar células diferenciadas hacia un estado no diferenciado, extendiendo la longitud de los telómeros y, por lo tanto, la vida útil replicativa y, en consecuencia, produciendo células madre y células diferenciadas resultantes de muchos tipos con un genotipo nuclear idéntico al genotipo de la célula diferenciada original. La presente invención se puede utilizar para analizar los mecanismos de reprogramación nuclear y/o la producción de células diferenciadas para uso en investigación y terapia.
Los métodos de esta invención representan una mejora sobre las técnicas existentes, tales como la transferencia nuclear de células somáticas humanas (TNCS), utilizadas para desdiferenciar células somáticas animales a un estado embrionario, produciendo así células hES. La presente invención proporciona métodos para mejorar tales técnicas existentes mediante la separación de la reprogramación celular en al menos dos, o preferiblemente tres, etapas separadas.
En una realización de la invención, las células somáticas diferenciadas se reprograman a un estado no diferenciado mediante una nueva técnica de reprogramación que comprende las siguientes tres etapas:
En la primera etapa, denominada etapa de remodelación nuclear, se incrementa el grado de reprogramación del genoma de la célula somática y se alivia el problema de acceso a ovocitos de la misma especie que la célula somática mediante el uso de cualquiera o una combinación de varios procedimientos de reprogramación novedosos. En todos estos nuevos procedimientos, el núcleo de la célula somática se remodela para reemplazar los componentes de la envoltura nuclear con los componentes de una célula no diferenciada. Simultáneamente, o en un momento lo suficientemente temprano para evitar la incorporación de componentes diferenciados de células somáticas a la envoltura nuclear, la cromatina de dicha célula se reprograma para expresar genes de una célula no diferenciada. La primera etapa es ventajosa con respecto a la tecnología TNCS actual en el sentido de que no se requieren ovocitos de la misma especie que la célula somática; además, se puede lograr una calidad mejorada de reprogramación.
En la segunda etapa, de acuerdo con la etapa (b) de la reivindicación 1, que se designa en la presente memoria como etapa de reconstitución celular, el núcleo, que contiene la envoltura nuclear remodelada de la etapa uno, se transfiere a un citoplasma enucleado de una célula embrionaria no diferenciada, o se fusiona con una ampolla citoplásmica que contiene un aparato mitótico requerido que es capaz, junto con el núcleo transferido, de producir una población de células madre pluripotentes no diferenciadas tales como células ES o similares a ED capaces de proliferar. La segunda etapa tiene la ventaja sobre la TNCS de que un gran número de núcleos o grupos de cromosomas remodelados en la etapa uno, se pueden fusionar simultáneamente con ampollas citoplásmicas en la etapa dos para aumentar la probabilidad de obtener células reprogramadas capaces de proliferar con éxito in vitro, dando como resultado un gran número de células reprogramadas cultivadas.
En la tercera etapa, las colonias de células que surgen de una o varias células resultantes de la etapa dos se caracterizan por el grado de reprogramación y por la normalidad del cariotipo y se seleccionan colonias de alta calidad. Si bien esta tercera etapa no es necesaria para reprogramar células con éxito y no es necesaria en algunas aplicaciones de la presente invención, tales como en el análisis de los mecanismos moleculares de reprogramación, para muchos usos, tal como cuando se reprograman células para su uso en trasplantes humanos, se prefiere la inclusión de la tercera etapa de control de calidad. Las colonias de células reprogramadas que tienen un cariotipo normal pero no un grado suficiente de reprogramación pueden reciclarse repitiendo las etapas 1-2 o 1-3.
En otra realización de la invención, el genoma de una célula somática se remodela en la etapa uno mediante condensación a una acumulación de cromosomas mediante la exposición de núcleos de células somáticas aisladas a un extracto de células mitóticas, tales como ovocitos en metafase II, o células de la línea germinal en metafase tales como la línea celular de EC NTera-2, de la misma o diferente especie. A continuación, dichas acumulaciones de cromosomas se procesan adicionalmente en las etapas dos y tres y se repiten las etapas anteriores si las células no muestran un grado aceptable de reprogramación.
En otra realización de la invención, el genoma de una célula somática se remodela en la etapa uno por condensación a una acumulación de cromosomas mediante la exposición de núcleos de células somáticas aisladas a un extracto de células mitóticas, tales como ovocitos en metafase II, o células de la línea germinal en metafase tales como la línea celular de EC NTera-2, de la misma o diferente especie. Posteriormente, dichas acumulaciones de cromosomas se encapsulan in vitro en una nueva envoltura nuclear utilizando extractos de células no diferenciadas. Los núcleos remodelados resultantes se procesan posteriormente en las etapas dos y tres y se repiten las etapas anteriores si las células no muestran un grado aceptable de reprogramación. Además, los núcleos y células remodelados se pueden utilizar en ensayos para analizar los mecanismos de reprogramación.
En otra realización de la invención, uno o más factores expresados en células no diferenciadas (p. ej., células EC, células ES, etc.) se expresan transitoriamente o se expresan en exceso en los extractos de células no diferenciadas o células de la etapa 1 y/o etapa 2 o se añaden como proteínas a dichos extractos celulares. La expresión de estos factores puede conferir características de una célula no diferenciada a la célula somática y facilitar la reprogramación de la célula somática. Tales factores incluyen, por ejemplo, NANOG, SOX2, d Nm T3B, CrOc4, H2AFX, HIST1H2AB, HIST1H4J, HMGB2, LEFTB, MYBL2, MYC, MYCN, NANOG, OCT3/4 (POU5F1), OTX2, SALL4, TERF1, TERF1, o cualquier otro factor (tales como reguladores transcripcionales) que confieren las características de un estado celular no diferenciado. Adicionalmente, se puede utilizar cualquier número o combinación de los factores mencionados anteriormente.
En otra realización de la invención, los diversos tipos de reprogramación in vitro de la etapa uno de la presente invención, se utilizan como un modelo in vitro de reprogramación nuclear útil para analizar los mecanismos moleculares de la reprogramación. Por ejemplo, se pueden añadir o eliminar componentes moleculares concretos del extracto para determinar el papel de ciertos componentes en la reprogramación.
En otra realización de la invención, los diversos componentes que se determina que desempeñan un papel importante en la reprogramación identificados en el ensayo anterior o por otros medios se incorporan o eliminan correspondientemente del extracto de reprogramación para aumentar la eficacia de la reprogramación en el mismo o en el protocolo de reprogramación de especies cruzadas. Tales moléculas incluyen, pero no se limitan a, componentes de proteínas humanas, ARN purificado, incluido miARN de ovocitos, blastómeros, mórulas, ICM, disco embrionario, células ES, células EG, células EC u otras células de la línea germinal. Los componentes se pueden añadir o eliminar durante cualquiera de las etapas 1-3. Los componentes concretos se pueden eliminar mediante métodos tales como, por ejemplo, inmunoprecipitación.
En otra realización de la invención, las etapas 1-2 se repiten como etapa uno seguida de etapa dos, seguida de etapa uno, seguida de etapa dos, hasta que la caracterización en la etapa tres demuestra una reprogramación satisfactoria de las células somáticas.
En otro aspecto de la invención, los citoplastos de células no diferenciadas de acuerdo con la reivindicación 1 sufren un empobrecimiendo de mitocondrias para formar líneas celulares a las que se pueden añadir mitocondrias de células donantes antes, durante o después de la etapa dos para dar como resultado células reprogramadas en las que el genotipo mitocondrial también, así como el genotipo nuclear son idénticos a los de la célula diferenciada donante.
En otra realización de la invención, factores celulares no diferenciados tales como, por ejemplo, SOX2, NANOG, DNMT3B, CROC4, H2AFX, HIST1H2AB, HIST1H4J, HMGB2, LEFTB, MYBL2, MYC, MYCN, NANOG, OCT3/4 (POU5F1), OTX, SALL4, TERF1, TERT, ZNF206, se añaden a los citoplastos o ampollas citoplásmicas de células no diferenciadas (según la reivindicación 1) de la etapa 2. En realizaciones concretas, se añaden dos, tres, cuatro o cinco de los factores a los citoplastos. En otras realizaciones, se añaden seis o más de los factores a los citoplastos. Las células reprogramadas resultantes del uso de las etapas 1-2 o 1-3 se pueden diferenciar en una variedad de condiciones de diferenciación in vitro para producir células de cualquiera o una combinación de las tres capas germinales primarias endodermo, mesodermo o ectodermo, incluidos tejidos complejos tales como los tejidos formados en los teratomas. En ciertas realizaciones, los tipos de células diferenciadas se obtienen a partir de las células reprogramadas producidas utilizando el método de la presente invención sin la generación de una línea de células ES. Por ejemplo, se pueden obtener células diferenciadas cultivando células reprogramadas no diferenciadas en presencia de al menos un factor de diferenciación y seleccionando células diferenciadas del cultivo. La selección de células diferenciadas se puede basar en el fenotipo, tal como la expresión de ciertos marcadores celulares presentes en las células diferenciadas, o mediante ensayos funcionales (p. ej., la capacidad para realizar una o más funciones de un tipo celular diferenciado concreto). Las células diferenciadas derivadas de los métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, células beta pancreáticas y células precursoras pancreáticas. En otra realización, las células reprogramadas de acuerdo con el método de la presente invención se modifican genéticamente mediante la adición, deleción o modificación de su o sus secuencias de ADN. Tales modificaciones se pueden realizar mediante la incorporación aleatoria de un vector exógeno, mediante el direccionamiento de genes o mediante el uso de cromosomas artificiales.
En otra realización de la presente invención, el núcleo que se está remodelando en la etapa uno se modifica mediante la adición de extractos de células tales como, por ejemplo, DT40, que se sabe que tiene un alto nivel de recombinación homóloga. La adición de construcciones de direccionamiento de ADN y los extractos de células que permiten un alto nivel de recombinación homóloga producirá células después de la reconstitución en la etapa 2 y el escrutinio en la etapa 3 que tienen una modificación genética deseada.
Otro tema propuesto por la descripción es un modelo de negocio para comercializar células producidas a partir del uso de dicha invención. El modelo de negocio incluye la transferencia de células diferenciadas somáticas humanas a centros regionales donde se realizan las etapas de reprogramación 1, 2, 1-2 o 1-3.
En otra realización de la invención, las células somáticas diferenciadas o las células reprogramadas resultantes de la aplicación de las etapas 1-2 o 1-3 se criopreservan y almacenan para uso futuro.
En otra realización de la presente invención, las células reprogramadas resultantes de la aplicación de las etapas 1­ 2 o 1-3 se envían a instalaciones sanitarias donde se diferencian hacia tipos de células médicamente útiles para su uso en investigación y trasplantes.
En otro tema propuesto por la descripción, los kits que contienen ingredientes útiles para realizar las actividades de las etapas 1, 2 o 3 se envían a centros de investigación, biomédicos o de atención médica donde se utilizan para reprogramar células diferenciadas en tipos de células para su uso en investigación y trasplante.
En otra realización de la presente invención, las células reprogramadas resultantes de la aplicación de las etapas 1­ 2 o 1-3 se envían a instalaciones sanitarias después de haber sido diferenciadas hacia una composición útil de tipos de células.
Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción y de las reivindicaciones.
Descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra, como un ejemplo comparativo que no forma parte de la presente invención, la remodelación de múltiples núcleos de células somáticas dentro de un ovocito, la posterior lisis del ovocito para recuperar núcleos remodelados y su fusión con ampollas citoplásmicas de células ES para producir líneas celulares ES.
La Figura 2 muestra un diagrama que presenta la modificación de cromosomas, cromatina o núcleos aislados in vitro. La recombinasa purificada o el extracto libre de células se muestran como esferas.
Descripción detallada
Tabla de abreviaturas utilizadas en esta descripción
TC - Transferencia de cromatina
TCit - Transferencia citoplásmica
DMAP - Dimetilaminopurina
Células EC - Células de Carcinoma Embrionario
Células ED: Células derivadas de embriones. Las células hED son células derivadas de embriones humanos. Células ES: Células madre embrionarias. Las células hES son células madre embrionarias humanas.
GCL: Germ-cell less
HSE: los equivalentes de piel humana son mezclas de células y matrices biológicas o sintéticas fabricadas con fines de prueba o para aplicaciones terapéuticas para promover la reparación de heridas.
MCI: masa celular interna del embrión en estadio de blastocisto de mamífero.
MNI - Membrana nuclear interna
MBS - Solución salina tamponada con magnesio
MiARN - Micro ARN
CPN - Complejo de poros nucleares
TN - Transferencia nuclear
MNO - Membrana nuclear exterior
PEG - Polietilenglicol
Fibroblastos PS: los fibroblastos pre-cicatrizantes son fibroblastos derivados de la piel de piel de gestación temprana o derivados de células ED que muestran un patrón prenatal de expresión génica que promueve la curación rápida de heridas dérmicas sin formación de cicatrices.
TNCS - Transferencia nuclear de células somáticas
SLO - Estreptolisina O
LPE - Libre de patógenos específicos
La presente invención proporciona métodos mejorados para la reprogramación de células diferenciadas hacia un estado más pluripotente mediante la utilización de un procedimiento de múltiples etapas que incluye una etapa de remodelación nuclear distinta y una etapa de reconstitución celular.
El término "reconstitución celular" se refiere a la transferencia de un núcleo o cromatina al citoplasma celular para obtener una célula funcional.
El término "transferencia de cromatina" (CT) se refiere a la reconstitución celular de la cromatina condensada.
El término "cromatina condensada" se refiere a ADN no encerrado por una envoltura nuclear. La cromatina condensada puede ser el resultado, por ejemplo, de la exposición de un núcleo a un extracto mitótico tal como el de un ovocito M1 o MII u otro extracto de células mitóticas.
La cromatina condensada se refiere a los cromosomas que se encuentran en un mayor grado de compactación que el grado de compactación que se produce en cualquier fase del ciclo celular que no sea la metafase.
El término "ampolla citoplásmica" se refiere al citoplasma de una célula unida por una membrana plasmática intacta, o permeabilizada, pero por lo demás intacta pero que carece de núcleo. Se utiliza indistintamente y como sinónimo del término "citoplasto enucleado" y "citoplasma enucleado", a menos que el término "citoplasma enucleado" se utilice explícitamente en el contexto de un extracto en el que se ha eliminado la membrana plasmática.
El término "célula diferenciada" se refiere a cualquier célula de cualquier especie de vertebrado en el procedimiento de diferenciación hacia un linaje celular somático o de haberse diferenciado terminalmente hacia el tipo de célula que será en el organismo adulto.
El término "células madre pluripotentes" se refiere a células animales capaces de diferenciarse hacia más de un tipo de célula diferenciada. Tales células incluyen células ES, células EG, células similares a ED y células derivadas de adultos, incluidas células madre mesenquimales, células madre neuronales y células madre derivadas de médula ósea. Las células madre pluripotentes pueden estar modificadas genéticamente o no.
El término "compuesto fusigénico" se refiere a un compuesto que aumenta la probabilidad de que una cromatina condensada o un núcleo se fusionen con una ampolla citoplásmica receptora y se incorporen a ella, dando como resultado una célula viable capaz de la división celular posterior. Tales compuestos fusigénicos pueden, a modo de ejemplo no limitante, incrementar la afinidad de una cromatina condensada o un núcleo con la membrana plasmática. Alternativamente, el compuesto fusigénico puede aumentar la probabilidad de la unión de la bicapa lipídica de la ampolla citoplasmática diana con la cromatina condensada, la envoltura nuclear de un núcleo aislado o la membrana plasmática de una célula donante.
El término "heteroplasmón" se refiere a una célula resultante de la fusión de una célula que contiene un núcleo y un citoplasma con el citoplasto de otra célula.
El término "células de tipo derivado de embriones humanos" (de tipo hED) se refiere a células madre pluripotentes producidas por la presente invención que no se cultivan para conservar las características de las células Es , pero que al igual que las células derivadas de mórula, las células, incluidas las de la masa celular interna, el escudo embrionario o el epiblasto, u otras células madre pluripotentes del embrión temprano, incluidos el endodermo, el ectodermo y el mesodermo primitivos y sus derivados, que no se han cultivado para mantener estables las líneas de hES, son capaces de diferenciarse hacia cualquiera de los tipos diferenciados de células somáticas. Las células de tipo hED se pueden obtener con modificaciones genéticas, incluso modificadas para que carezcan de genes de la región MHC, para que sean hemicigóticas u homocigotas en esta región.
El término "remodelación nuclear" se refiere a la alteración artificial de la composición molecular de la lámina nuclear o la cromatina de una célula.
El término "permeabilización" se refiere a la modificación de la membrana plasmática de una célula de forma que se produzca una formación de poros agrandados o generados en ella o una eliminación parcial o completa de la membrana plasmática.
El término "pluripotente" se refiere a la característica de una célula madre que dicha célula madre es capaz de diferenciarse en una multitud de tipos de células diferenciadas.
Como se indica en las reivindicaciones, el término "célula no diferenciada", como se emplea en la presente memoria, se refiere a un ovocito, una célula ES, una célula EG o una célula EC.
A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones, se entenderá que la palabra "comprenden", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros. Adicionalmente, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos singulares incluirán los plurales y los términos plurales incluirán el singular.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos empleados en la presente memoria tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones.
Etapa 1: Remodelación nuclear
La presente invención utiliza un procedimiento de tres etapas para mejorar la eficacia de la reprogramación células diferenciadas a un estado no diferenciado.
En la primera etapa, denominada etapa de remodelación nuclear, la envoltura nuclear y la cromatina de una célula diferenciada se remodelan para parecerse más a la composición molecular de la envoltura nuclear y la cromatina, respectivamente, de una célula no diferenciada o de la línea germinal. Esta etapa de remodelación se puede realizar de numerosas formas, pero la característica única y no obvia de esta invención es que esta etapa de remodelación se realiza en una etapa separada de la transferencia del genoma remodelado a un citoplasto; adicionalmente, el citoplasto es un citoplasto que está fácilmente disponible, tal como los citoplastos preparados a partir de líneas de células de carcinoma embrionario (EC), incluidas las líneas de células de EC modificadas genéticamente para producir extractos y citoplastos con capacidad mejorada de reprogramación según la presente invención y que a continuación producirán los tipos de células proliferantes finales. La remodelación del núcleo de la célula somática podría realizarse en extractos dispersos de células capaces de reconstituir una envoltura nuclear no diferenciada o de línea germinal alrededor de lo que originalmente era un genoma de una célula diferenciada.
La separación de la etapa de remodelación nuclear de la etapa de reconstitución celular resuelve problemas inherentes a las tecnologías de reprogramación existentes. Si la remodelación nuclear se realiza en una etapa separada de la etapa de reconstitución celular para generar células capaces de proliferar, es posible eliminar la dependencia de los ovocitos de la misma especie que la célula diferenciada y aumentar la eficacia.
En el caso de la TNCS, que no es el objeto de esta invención, el ovocito es una célula relativamente grande y, como resultado, cuando una célula diferenciada se transfiere a un ovocito en metafase II, la consiguiente ruptura de la envoltura nuclear y la condensación del cromosoma, y el reensamblaje de la envoltura nuclear en gran parte a partir de componentes derivados de óvulos, da como resultado la formación de una envoltura nuclear remodelada, así como la transmisión de factores reguladores nucleares, tales como factores de transcripción, útiles para reprogramar la cromatina. Si el óvulo se activa aproximadamente en el momento de la transferencia nuclear, también se puede producir la división celular, lo que da como resultado un embrión capaz de dar lugar a un cultivo de células ES. Sin embargo, los problemas inherentes a la transferencia nuclear son que, a pesar del volumen relativamente grande del ovocito y la incorporación de componentes nucleares de la célula del ovocito a la célula reconstruida, la transferencia nuclear requiere la micro-manipulación, que es un procedimiento altamente calificado, así como la producción en serie utilizando una célula a la vez. Adicionalmente, la transferencia nuclear está limitada por el número de ovocitos disponibles. En la presente invención, estas dificultades se abordan utilizando tecnologías alternativas de remodelación nuclear que, aunque requieren más de una etapa para obtener células intactas susceptibles de división celular, permiten sin embargo un fácil acceso al citoplasma y son capaces de remodelar un núcleo. Además, estas técnicas alternativas permiten la remodelación simultánea de muchos núcleos o genomas.
Una modalidad para realizar la primera etapa de la remodelación nuclear es mediante el uso de ovocitos de peces o anfibios. Los ovocitos o huevos de la especie Xenopus laevis tienen la ventaja de que están ampliamente estudiados, aunque la mayoría de los otros ovocitos o huevos de especies de vertebrados funcionarán de manera similar con la excepción de los óvulos con gran cantidad de yema. Si bien los ovocitos de Xenopus son solo marginalmente útiles para reprogramar la cromatina de los núcleos de células diferenciadas de mamíferos (Byrne et al., Curr Biol 13:1206-1213, (2003)), estos se pueden utilizar para reensamblar casi por completo una envoltura nuclear de línea germinal alrededor de un gran número de células somáticas diferenciadas. Específicamente, utilizando extracto de ovocitos de Xenopus, la envoltura nuclear y cromatina de la célula somática se remodelan en presencia de tales proteínas no diferenciadas o de la línea germinal a través de una variedad de medios.
Se pueden añadir otras proteínas no diferenciadas u otros factores al extracto de ovocitos.
La célula diferenciada que se reprograma puede ser cualquier célula diferenciada de una especie de vertebrado, tal como células somáticas humanas, caninas, equinas o felinas, incluidos fibroblastos, queratinocitos, linfocitos, monocitos, células epiteliales, células hematopoyéticas u otras células.
De acuerdo con la presente invención, la envoltura nuclear y la cromatina se remodelan en extractos sin células capaces de formar envolturas nucleares alrededor de ADN desnudo o cromatina. Los mecanismos para ensamblar envolturas nucleares alrededor de ADN o cromatina se conocen en la técnica (Marshall y Wilson, T rends in Cell Biol 7:69-74, (1997)). Tales extractos se pueden aislar, por ejemplo, de ovocitos de Xenopus como es bien conocido en la técnica (Lohka, Cell Biol Int. Rep. 12:833-848 (1988)). Alternativamente, se pueden utilizar extractos de células no diferenciadas de la misma especie, tales como ovocitos MII, ovocitos en otras etapas de desarrollo, células ES, células EC o células EG.
Las células EC proporcionan la ventaja de que se pueden propagar fácilmente en grandes cantidades y las células EC humanas en lugar de las no humanas disminuyen las preocupaciones sobre la transmisión de patógenos no caracterizados. Los ejemplos no limitantes de tales células EC humanas incluyen NTera-2, NTera-2 c 1. D1, NCCIT, Cates-1B, Tera-1, Y Te RA-2 y los ejemplos no limitantes de líneas EC murinas incluyen MPRO, EML, F9, F19, D1 ORL UVA, NFPE, NF-1 y PFHR9. Las líneas EC se obtienen fácilmente de fuentes tales como la Colección Americana de Cultivos Tipo y se cultivan a 37°C en cultivo monocapa en medio caracterizado para ese tipo de célula y fácilmente disponible en Internet, (http://stemcells.atcc.org) (medio completo).
En ciertas realizaciones de la invención, el genoma del núcleo remodelado se puede modificar. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, la corrección de mutaciones que afectan a la enfermedad y otras modificaciones genéticas que alivian los síntomas o las causas de la enfermedad (p. ej., en genes que de otro modo serían dirigidos o utilizados en terapia génica). El núcleo que se está remodelando en la etapa uno se puede modificar mediante la adición de extractos de células tales como DT40 que se sabe que tiene un alto nivel de recombinación homóloga. La adición de construcciones de direccionamiento de ADN y los extractos de células que permiten un alto nivel de recombinación homóloga producirá células después de la reconstitución en la etapa 2 y el escrutinio en la etapa 3 que tienen una modificación genética deseada. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, se pueden utilizar células reprogramadas para generar células o tejidos para terapias basadas en células y/o trasplantes.
En otras realizaciones de la invención, uno o más factores se expresan o expresan en exceso en las células no diferenciadas (por ejemplo, en células EC) utilizadas para obtener el extracto de remodelación nuclear o se pueden añadir uno o más factores a las células no diferenciadas. Tales factores incluyen, por ejemplo, SOX2, NANOG, cMYC, OCT4, DNMT3B, histonas embrionarias, así como otros factores enumerados en la Tabla 1 y sus contrapartes no humanas. El aumento de la expresión de estos factores puede conferir características de una célula no diferenciada a los núcleos de la célula somática y/o eliminar factores celulares diferenciados, mejorando así la frecuencia de reprogramación. Por consiguiente, la invención también incluye añadir, expresar o expresar en exceso cualquier otra proteína que confiera características de una célula no diferenciada. Además de las proteínas mencionadas anteriormente, la presente invención incluye otros factores (tales como reguladores transcripcionales y ARN regulador) que inducen o aumentan la expresión de proteínas expresadas en células no diferenciadas y que mejoran la frecuencia de reprogramación. Además, se puede utilizar cualquier combinación de los factores mencionados anteriormente. Por ejemplo, las células no diferenciadas de la presente invención se pueden modificar para tener un aumento de expresión de dos, tres, cuatro o más de cualquiera de los factores enumerados en la Tabla 1. Asimismo, se pueden añadir al extracto de remodelación dos, tres, cuatro o más de cualquiera de los factores que se enumeran en la Tabla 1.
En otras realizaciones de la invención, el nivel de uno o más factores
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las células no diferenciadas utilizadas para obtener el extracto de remodelación nuclear se reduce con relación a los niveles encontrados en las células no modificadas. Tales disminuciones en el nivel de un factor celular se pueden lograr mediante métodos conocidos, tales como, por ejemplo, mediante el uso de reguladores de la transcripción, ARN regulador o anticuerpos específicos para el factor celular.
En ciertas realizaciones, las construcciones génicas que codifican las proteínas enumeradas en la Tabla 1 u otros factores, o proteínas reguladoras o ARN que inducen la expresión de estos factores, se transfectan a las células mediante técnicas convencionales. Tales técnicas incluyen infección viral (p. ej., lentivirus, virus del papiloma, adenovirus, etc.) y transfección de plásmidos y otros vectores por transfección química (por ejemplo, a través de fosfato de calcio, lípidos, dendrímeros, etc.), electroporación y microinyección. Alternativamente, las construcciones que se dirigen a los promotores endógenos de los factores se pueden utilizar para inducir o aumentar la expresión de los factores. Otras realizaciones pueden utilizar cromosomas artificiales que comprenden uno o más de estos factores. En realizaciones adicionales, la transferencia de genes mediada por cromosomas o la fusión celular/fusión de microceldas se utilizan para introducir estos factores en una célula no diferenciada. En otras realizaciones, la recombinación homóloga para modificar secuencias reguladoras de genes puede lograr una mayor expresión de uno o más de estos factores.
En algunas realizaciones, un transgén que codifica el factor celular de interés se puede administrar a la célula mediante microinyección pronuclear de ADN que está recubierto con recombinasa. Véase, por ejemplo, Maga et al., Transgenic Research 12:485-496 (2003). Otros métodos conocidos para mejorar la eficacia de la generación de células transgénicas también pueden ser útiles para los propósitos de esta invención. Alternativamente, los ovocitos y/o extractos de células no diferenciadas de la presente invención se pueden obtener de animales transgénicos que expresan factores de reprogramación humanos (tales como los factores enumerados en la Tabla 1). Por ejemplo, los animales transgénicos se generan utilizando construcciones de expresión que portan uno o más de los genes enumerados en la Tabla 1.
En algunas realizaciones, los factores celulares, o agentes que alteran los niveles intracelulares de los factores celulares, se pueden introducir en células no diferenciadas mediante administración intracelular directa. Por ejemplo, los factores se pueden administrar utilizando dominios de transducción de proteínas o péptidos que penetran en las células, tales como, por ejemplo, poliarginina. Véase Noguchi et al., Acta Med. Okayama 60:1-11 (2006). Por tanto, las células en las que se han introducido los factores pueden ser útiles en los métodos anteriores para la remodelación nuclear.
En realizaciones alternativas, los factores celulares no diferenciados (tales como las proteínas y los equivalentes de proteínas enumerados en la Tabla 1), o agentes que afectan a los niveles de los factores celulares, se introducen directamente en el extracto de remodelación nuclear. En ciertas realizaciones, se añaden proteínas recombinantes al extracto para mejorar la eficacia de la reprogramación.
Las células diferenciadas que se pueden reprogramar eficazmente utilizando la presente invención incluyen células diferenciadas de cualquier tipo de cualquier vertebrado (incluido el ser humano), incluyendo, entre otros, fibroblastos cutáneos, queratinocitos, células epiteliales de la mucosa o células sanguíneas nucleadas periféricas, utilizando las siguientes etapas.
Preparación de extracto de remodelación nuclear
Los extractos de células de la línea germinal, tales como células ES, EG o EC, incluidas, entre otras, células NTera-2, se preparan en la prometafase como se conoce en la técnica (Burke y Gerace, Cell 44: 639-652, (1986)). Brevemente, después de dos días y mientras todavía está en un estado de crecimiento logarítmico, el medio se reemplaza por 100 mL de medio completo que contiene timidina 2 mM (que secuestra las células en la fase S). Después de 11 horas, las células se enjuagan una vez con 25 mL de medio completo, a continuación, se incuban con 75 mL de medio completo durante cuatro horas, momento en el que se agrega nocodazol a una concentración final de 600 ng/mL de solución madre 10.000X en DMSO. Después de una hora, las células fijadas laxamente se eliminan mediante sacudida mitótica (Tobey et al., J. Cell Physiol. 70:63-68, (1967)). Esta primera colección de células extraídas se descarta, el medio se reemplaza por 50 mL de medio completo que también contiene 600 ng/mL de nocodazol. Las células de la prometafase se recogen a continuación mediante agitación 2-2,5 horas más tarde. Las células recolectadas se incuban a continuación a 37°C durante 45 minutos en 20 mL de medio completo que contiene 600 ng/mL de nocodazol y 20 pM de citocalasina B. Después de esta incubación, las células se lavan dos veces con PBS de Dulbecco enfriado en hielo, a continuación, una vez en KHM (KCl 78 mM, Hepes-KOH 50 mM [pH 7,0], MgCl24,0 mM, EGTA 10 mM, CaCh 8,37 mM, DTT 1 mM, citocalasina B 20 pM). A continuación, las células se centrifugan a 1000 g durante cinco minutos, el sobrenadante se descarta y las células se resuspenden en el volumen original de KHM. A continuación, las células se homogeneizan en un homogeneizador Dounce sobre hielo con aproximadamente 25 carreras y se determina el progreso mediante observación microscópica. Cuando al menos 95% de las células se homogeneizan, los extractos se mantienen en hielo para su uso en el reensamblaje de la envoltura o se criopreservan como es bien conocido en la técnica.
Preparación de cromatina condensada a partir de células diferenciadas.
Las células diferenciadas del donante están expuestas a condiciones que eliminan la membrana plasmática, lo que da como resultado el aislamiento de los núcleos. Estos núcleos, a su vez, están expuestos a extractos de células que provocan la disolución de la envoltura nuclear y la condensación de la cromatina. Esta disolución y condensación da como resultado la liberación de factores de cromatina tales como ARN, proteínas de la envoltura nuclear y reguladores de la transcripción, tales como factores de transcripción, que son perjudiciales para el procedimiento de reprogramación. Las células diferenciadas se cultivan en un medio de cultivo apropiado hasta que llegan a la confluencia. A continuación, se recolectan 1 x 106 células mediante tripsinización como es bien conocido en la técnica, la tripsina se inactiva y las células se suspenden en 50 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS), se sedimentan centrifugando las células a 500 g durante 10 minutos a 4°C, el PBS se descarta y las células se colocan en 50 x el volumen del sedimento en PBS enfriado con hielo y se centrifugan como antes. Después de esta centrifugación, el sobrenadante se descarta y el sedimento se resuspende en 50 x el volumen del sedimento de tampón hipotónico (HEPES 10 mM, pH 7,5, MgCh 2 mM, KCl 25 mM, DtT 1 mM, aprotinina 10 pM, leupeptina 10 pM, pepstatina A 10 pM, inhibidor de tripsina de soja 10 pM y PMSF 100 pM) y se centrifugaron de nuevo a 500 g durante 10 min a 4°C. Se descarta el sobrenadante y se añade 20 x el volumen del sedimento de tampón hipotónico y las células se resuspenden cuidadosamente y se incuban en hielo durante una hora. A continuación, las células se lisan físicamente utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica. En resumen, se colocan 5 mL de la suspensión celular en un homogeneizador Dounce de vidrio y se homogeneiza con 20 carreras. La lisis celular se controla microscópicamente para observar el punto en el que resultan núcleos aislados y aún intactos. Se añade sacarosa para obtener una concentración final de sacarosa 250 mM (1/8 volumen de solución madre 2 M en tampón hipotónico). La solución se mezcla cuidadosamente mediante inversión suave y a continuación se centrifuga a 400 g a 4°C durante 30 minutos. El sobrenadante se descarta y los núcleos se resuspenden a continuación suavemente en 20 volúmenes de tampón nuclear (HEPES 10 mM, pH 7,5, MgCl22 mM, sacarosa 250 mM, KCl 25 mM, DTT 1 mM, aprotinina 10 jM, leupeptina 10 jM, pepstatina A 10 jM, inhibidor de tripsina de soja 10 jM y PMSF 100 jM). Los núcleos se vuelven a centrifugar como anteriormente y se resuspenden en 2 x el volumen del sedimento en tampón nuclear. Los núcleos resultantes se pueden utilizar a continuación directamente en la remodelación nuclear como se describe a continuación o se pueden criopreservar para uso futuro.
Preparación de extracto de condensación
El extracto de condensación, cuando se añade a los núcleos de células diferenciadas aisladas, dará como resultado la ruptura de la envoltura nuclear y la condensación de la cromatina. Debido a que el propósito de la etapa 1 es remodelar los componentes nucleares de una célula somática diferenciada con los de una célula no diferenciada, el extracto de condensación utilizado es de células no diferenciadas que pueden ser o no también las células utilizadas para obtener el extracto para la reconstitución anterior de la envoltura nuclear. Esto da como resultado una dilución de los componentes de la célula diferenciada en extractos que contienen los componentes correspondientes deseables en la reprogramación de células a un estado no diferenciado. Las células de la línea germinal tales como las células ES, EG o EC tales como las células NTera-2 cl. D1 se obtienen fácilmente de fuentes tales como la Colección Americana de Cultivos Tipo y se cultivan a 37°C en cultivo de monocapa en medio apropiado (medio completo). Mientras están en un estado de crecimiento logarítmico, las células se colocan en placas a 5 x 106 células por cm2 de matraz de cultivo de tejidos en 200 mL de medio completo. Los métodos para obtener extractos capaces de inducir la ruptura de la envoltura nuclear y la condensación cromosómica son bien conocidos en la técnica (Collas et al., J. Cell Biol. 147:1167-1180, (1999)). Brevemente, la mitosis de las células de la línea germinal en crecimiento logarítmico como se describió anteriormente se sincronizan mediante incubación en 1 jig/ml de nocodazol durante 20 horas. Las células que se encuentran en la fase mitótica del ciclo celular se desprenden mediante sacudida mitótica. Las células desprendidas recolectadas se centrifugan a 500 g durante 10 minutos a 4°C. Las células se resuspenden en 50 mL de PBS frío y se centrifugan a 500 g durante 10 min más a 4°C. Esta etapa de lavado con PBS se repite una vez más. El sedimento celular se resuspende a continuación en 20 volúmenes de tampón de lisis celular enfriado con hielo (HEPES 20 mM, pH 8,2, MgCh 5 mM, EDTA 10 mM, DTT 1 mM, aprotinina 10 jiM, leupeptina 10 jiM, pepstatina A 10 jiM, inhibidor de tripsina de soja 10 jiM, PMSF 100 jiM y 20 jig/ml de citocalasina B, y las células se centrifugan a 800 g durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante se descarta y el sedimento celular se resuspende cuidadosamente en un volumen de tampón de lisis celular. Las células se colocan en hielo durante una hora y a continuación se lisan con un homogeneizador Dounce. El progreso se controla mediante análisis microscópico hasta que se lisan más de 90% de las células y los núcleos celulares. El producto lisado resultante se centrifuga a 15.000 g durante 15 minutos a 4°C. A continuación, se retiran los tubos y se colocan inmediatamente sobre hielo. El sobrenadante se elimina suavemente con una punta de pipeta de pequeño calibre y el sobrenadante de varios tubos se mezcla en hielo. Si no se utilizan inmediatamente, los extractos se someten a congelación ultrarrápida inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenan a -80°C hasta su uso. A continuación, el extracto celular se coloca en un tubo de ultracentrífuga y se centrifuga a 200.000 g durante tres horas a 4°C para sedimentar las vesículas de la membrana nuclear. A continuación, se retira suavemente el sobrenadante y se coloca en un tubo sobre hielo y se utiliza inmediatamente para preparar cromatina condensada o criopreservada como se describe anteriormente.
Métodos de uso del extracto de condensación.
Si comienza con una alícuota congelada sobre extracto de condensación, el extracto congelado se descongela en hielo. A continuación, se añade al extracto un sistema generador de ATP de modo que las concentraciones finales sean ATP 1 mM, fosfato de creatina 10 mM y creatina quinasa 25 jg/ml. Los núcleos aislados de las células diferenciadas como se describió anteriormente se añaden a continuación al extracto a 2.000 núcleos por 10 j l de extracto, se mezclan suavemente y se incuban en un baño de agua a 37°C. El tubo se retira de vez en cuando para resuspender suavemente las células dando golpecitos en el tubo. Los tiempos de ruptura de la envoltura nuclear y condensación cromosómica de los extractos y las fuentes celulares varían. Por lo tanto, el progreso se controla mediante muestras de control periódicas microscópicamente. Cuando la mayoría de las células han perdido su envoltura nuclear y hay evidencia del comienzo de la condensación cromosómica, el extracto que contiene las masas cromosómicas en condensación se coloca en un tubo de centrífuga con un volumen igual de solución de sacarosa 1 M en tampón nuclear. Las masas de cromatina se sedimentan mediante centrifugación a 1.000 g durante 20 minutos a 4°C. El sobrenadante se descarta y las masas de cromatina se resuspenden suavemente en el extracto de remodelación nuclear obtenido anteriormente. A continuación, la muestra se incuba en un baño de agua a 33°C durante hasta dos horas y se verifica periódicamente microscópicamente para detectar la formación de envolturas nucleares remodeladas alrededor de la cromatina condensada y remodelada como se describe (Burke y Gerace, Cell 44:639-652, (1986). Una vez que se ha encapsulado un gran porcentaje de cromatina en envolturas nucleares, los núcleos remodelados se pueden utilizar en la reconstitución celular utilizando cualquiera de las técnicas descritas a continuación en la etapa 2.
Etapa 2: Reconstitución celular
La etapa 2, también denominada "reconstitución celular" en la presente invención, se lleva a cabo utilizando núcleos o cromatina remodelados mediante cualquiera de las técnicas descritas en la presente invención, como en el Ejemplo 2.
Una forma de realizar la etapa 2 utilizando núcleos remodelados en la etapa 1 de la presente invención es fusionar los núcleos remodelados con citoplastos enucleados de células de la línea germinal seleccionadas de
células ES (incluidas células hES), células EG y células EC como se conoce en la técnica (Do & Scholer, Stem Cells 22:941-949 (2004).)). Brevemente, las células Es humanas se cultivan en condiciones convencionales (Klimanskaya et al. Lancet 365:4997 (1995))). El volumen citoplásmico de las células se incrementa añadiendo citocalasina B 10 |jM durante 20 horas antes de la manipulación. Los citoplastos se preparan centrifugando células tratadas con tripsina a través de un gradiente de densidad de Ficoll utilizando una solución de partida de solución de Ficoll-400 sometida a autoclave al 50% (peso/volumen) en agua. La solución de partida de Ficoll 400 se diluye en DMEM y con una concentración final de citocalasina B 10 j M. Las células se centrifugan a través de un gradiente de solución de Ficoll-400 al 30%, 25%, 22%, 18% y 15% a 36°C. En la parte superior hay una capa de 0,5 mL de solución de Ficoll-400 al 12,5% con 10 x 106 células madre embrionarias. Las células se centrifugan a 40.000 rpm a 36°C. en un rotor MLS-50 durante 30 minutos. Los citoplastos se recogen de las regiones de gradiente de 15% y 18% marcadas en los tubos, se aclaran en PBS y se mezclan a una razón 1:1 con núcleos remodelados de la etapa uno de la presente invención o criopreservados. La fusión de los citoplastos con los núcleos se realiza utilizando una serie de mecanismos conocidos en la técnica, incluido polietilenglicol (véase Pontecorvo "Polyethylene Glycol (PEG) in the Production of Mammalian Somatic Cell Hybrids" Cytogenet Cell Genet. 16(1-5):399-400 (1976)), la inyección directa de núcleos, la fusión mediada por virus sendai u otros mecanismos conocidos en la técnica. Los citoplastos y los núcleos se colocaron brevemente en 1 mL de polietilenglicol 1500 (Roche) al 50% precalentado durante un minuto. A continuación, se añadieron 20 mL de DMEM durante un período de cinco minutos para eliminar lentamente el polietilenglicol. Las células se centrifugan una vez a 130 g durante cinco minutos y a continuación se recuperan en 50 j l de medio de cultivo de células ES y se colocan debajo de una capa alimentadora de fibroblastos en condiciones para promover el crecimiento de una colonia de células ES.
Otra técnica para realizar la etapa 2, también denominada "reconstitución celular" en la presente invención, consiste en fusionar los núcleos remodelados con ampollas citoplásmicas anucleadas de células de la línea germinal, seleccionadas entre células ES (tales como células hES), células EG y Células EC, unidas a un sustrato físico como es bien conocido en la técnica (Wright y Hayflick, Exp. Cell Res. 96:113-121, (1975)); & Wright y Hayflick, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 72:1812-1816, (1975). Brevemente, el volumen citoplasmático de las células de la línea germinal se incrementa añadiendo citocalasina B 10 j M durante 20 horas antes de la manipulación. A continuación, las células se tripsinizan y se vuelven a sembrar en cubreobjetos estériles de 18 mm, cilindros u otro sustrato físico recubierto con material que promueve la unión. Las células se siembran en placa a una densidad tal que después de una incubación durante la noche a 37°C y un lavado suave con medio, las células cubren una porción, preferiblemente alrededor de 90%, de la superficie del cubreobjetos u otro sustrato. A continuación, los sustratos se colocan en un tubo de centrífuga en una posición tal que la centrifugación dé como resultado la eliminación de los núcleos del citoplasto que contiene 8 mL de solución de Ficoll-400 al 10% y se centrifuga a 20.000 g a 36°C durante 60 minutos. Los núcleos remodelados resultantes de la etapa uno de la presente invención, se extienden a continuación sobre el cubreobjetos o sustrato con una densidad de al menos la de los citoplastos, preferiblemente al menos cinco veces la densidad de los citoplastos. La fusión de los citoplastos con los núcleos se realiza utilizando polietilenglicol (véase Pontecorvo "Polyethylene Glycol (PEG) in the Production of Mammalian Somatic Cell Hybrids" Cytogenet Cell Genet.
16(1-5):399-400 (1976). Brevemente, en 1 mL de polietilenglicol 1500 (Roche) al 50% precalentado en medio de cultivo se coloca sobre el cubreobjetos o sustrato durante un minuto. A continuación, se añaden gota a gota 20 mL de medio de cultivo durante un período de cinco minutos para eliminar lentamente el polietilenglicol. A continuación, todo el medio se aspira y se reemplaza por medio de cultivo. También se pueden utilizar técnicas distintas de la centrifugación, tales como la vibración o la eliminación física de los núcleos utilizando una micropipeta.
En ciertas realizaciones de la presente invención, las células no diferenciadas utilizadas en la etapa 2 se pueden manipular primero para expresar o expresar en exceso factores tales como, por ejemplo, SOX2, NANOG, cMYC, OCT4, DNMT3B, cualquier otro factor enumerado en la Tabla 1 y sus homólogos no humanos y/u otros factores (p. ej., ARN regulador o construcciones dirigidas a los promotores de los genes enumerados en la Tabla 1 y sus homólogos no humanos) que confieren un comportamiento celular no diferenciado y facilitan la reprogramación. Las construcciones que codifican tales factores se pueden transfectar a las células no diferenciadas (es decir,
células ES, incluidas células hES, células EG o células EC) mediante mecanismos convencionales conocidos en la técnica. En el Etapa 1 se describen ejemplos de manipulación de células no diferenciadas para expresar factores celulares. En realizaciones alternativas, tales factores se introducen en las células no diferenciadas mediante inyección u otros métodos. Los ejemplos de tales métodos para manipular células no diferenciadas también se describen anteriormente en la Etapa 1.
En realizaciones alternativas de la presente invención, la reconstitución de la envoltura nuclear se produce después de reacciones de recombinación homóloga que tienen cromosomas diana modificados. Por tanto, en una realización, como etapa opcional después de la ruptura de la envoltura nuclear y la condensación de la cromatina, pero antes de la reconstitución de la envoltura nuclear, se añaden extractos de DT40 u otros extractos o preparaciones de proteínas con capacidad de recombinación a los cromosomas condensados junto con construcciones de direccionamiento de ADN de manera que la recombinación dará lugar a la sustitución de una o más secuencias de ADN genómico por la secuencia o secuencias proporcionadas en las construcciones. En los Ejemplos 3, 4, 5 y 6 se proporcionan realizaciones ilustrativas de tales métodos.
Etapa 3: Análisis del cariotipo y extensión de la reprogramación
Las células reconstituidas siguiendo las etapas 1 y 2 de la presente invención se pueden caracterizar para determinar el patrón de expresión génica y si las células reprogramadas muestran un patrón de expresión génica similar al patrón de expresión esperado de células no diferenciadas tales como líneas de células ES utilizando mecanismos bien conocidos en la técnica, incluida la transcriptómica (Klimanskaya et al., Cloning and Sem Cells, 6(3): 217-245 (2004)). El análisis cariotípico se puede realizar mediante extensiones cromosómicas de células mitóticas, cariotipificación espectral, ensayos de longitud de telómeros, hibridación genómica total u otros mecanismos bien conocidos en la técnica. En caso de que el cariotipo sea normal, pero la longitud de los telómeros o la extensión de la reprogramación no sea completa, las células se pueden utilizar como donantes nucleares y las etapas 1 y 2 se pueden repetir cualquier número de veces.
Por ejemplo, el patrón de expresión génica de las células reprogramadas se puede comparar con el patrón de expresión génica de las células madre embrionarias u otras células no diferenciadas. Si los patrones de expresión génica no son similares, la célula reprogramada se puede utilizar en etapas de reprogramación posteriores hasta que su expresión génica sea similar al patrón de expresión de una célula no diferenciada (p. ej., célula madre embrionaria). La célula madre embrionaria o no diferenciada con la que se compara la célula reprogramada puede ser de la misma especie que la célula somática diferenciada del donante; alternativamente, la célula madre no diferenciada o embrionaria con la que se compara la célula reprogramada puede ser de la misma especie que el citoplasto o la ampolla citoplasmática utilizada en la etapa 2. En algunas realizaciones, existe una similitud en el patrón de expresión génica entre una célula reprogramada y una célula no diferenciada (p. ej., célula madre embrionaria) si ciertos genes expresados en una célula no diferenciada también se expresan en la célula reprogramada. Por ejemplo, ciertos genes (p. ej., Telomerasa) que normalmente son indetectables en células somáticas diferenciadas se pueden utilizar para controlar el grado de reprogramación. Asimismo, para ciertos genes, la ausencia de expresión se puede utilizar para evaluar el alcance de la reprogramación. En ciertas realizaciones, una célula se puede considerar reprogramada si expresa (1) ARNm de E-cadherina (para células humanas, CDH1; Número de acceso NM_004360.2) a niveles de al menos 5% del nivel de expresión del gen constitutivo GAPD (para células humanas, NM_002046.2) (datos no mostrados); (2) ARNm de transcriptasa inversa de telomerasa detectable o exhibe actividad de telomerasa según lo evaluado por el ensayo TRAP (TRAPeze); y (2) LIN28 (NM_024674.3; o su equivalente no humano para células no humanas) a niveles de al menos 5% del gen constitutivo GAPD (para células humanas, NM_002046.2) (datos no mostrados).
Otros ejemplos de las formas en que se pueden combinar los diferentes medios para realizar las etapas 1 y 2 incluyen la permeabilización de células somáticas mediante SLO, el resellado de las células y el aislamiento de los núcleos parcialmente remodelados resultantes y a continuación el uso de los núcleos en la reconstitución celular de la etapa dos. Asimismo, la cromatina remodelada obtenida aislando núcleos de células diferenciadas, a continuación, exponiendo los núcleos a extractos de células en la fase mitótica del ciclo celular para causar la ruptura de la envoltura nuclear y la condensación de cromatina, se puede transferir al citoplasto de una célula ES, célula EC o célula EG sin reformar la envoltura nuclear antes de la reconstitución celular. Además, la célula somática diferenciada se puede permeabilizar como se describió anteriormente y exponer a extractos de ovocitos o células de la línea germinal. Después, se puede obtener la cromatina condensada de tales células, y a continuación esa cromatina se puede fusionar con los citoplastos receptores para producir células reprogramadas. La fusión de la cromatina con los citoplastos se logra mediante microinyección o es ayudada por compuestos fusigénicos como se conoce en la técnica (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Núm. 4.994.384 y 5.945.577). Los reactivos fusigénicos incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), compuestos lipófilos tales como Lipofectin®, Lipofectamin®, Do Ta P®, DOSPA.RTM o DOPE.RTM. Para la inserción de la cromatina a los citoplastos, la cromatina recubierta se coloca junto a la membrana del citoplasto y los complejos se mantienen a una temperatura de 20-30°C y se controlan utilizando un microscopio. Una vez que se ha producido la fusión, el medio se reemplaza por medio de cultivo para el cultivo de células no diferenciadas y en condiciones de cultivo que promueven el crecimiento de dichas células no diferenciadas.
Los factores celulares y los métodos de uso enumerados en la presente memoria se pueden utilizar en técnicas de reprogramación alternativas, tal como en los métodos descritos por Collas and Robl, US 2005/0014258 A1 (Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 10/910.156). Los factores pueden, por ejemplo, añadirse a los medios (o, alternativamente, expresarse en células utilizadas para obtener medios de extracción) utilizados para incubar un núcleo o masa de cromatina de una célula donante en condiciones que permitan añadir componentes nucleares o citoplasmáticos de una célula no diferenciada al núcleo o masa de cromatina donantes.
La remodelación in vitro del ADN derivado de células somáticas en la etapa uno de la presente invención se utiliza como modelo de reprogramación de una célula somática y un ensayo útil para analizar los mecanismos moleculares de reprogramación. La adición, alteración, eliminación o secuestro selectivos de componentes moleculares concretos y la puntuación posterior del grado de reprogramación o el grado de activación de la telomerasa y la extensión de la longitud de los telómeros permiten la caracterización del papel de moléculas concretas en la reprogramación que se produce. Las moléculas críticas caracterizadas en esta aplicación del método de la presente invención se utilizan a continuación mediante su correspondiente adición o deleción (p. ej., mediante su adición si facilitan la reprogramación, o mediante su deleción si inhiben la reprogramación). La deleción se puede lograr, por ejemplo, mediante el empobrecimiento inmunitario, reprogramando los extractos utilizados en la etapa uno. Se pueden introducir alteraciones moleculares específicas mediante mecanismos bien conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, la adición de componentes proteicos, la eliminación de componentes proteicos, por ejemplo, mediante inmunoprecipitación, la adición de otros componentes celulares tales como lípidos, iones, ADN, o ARN.
Una característica común de la presente invención es que, independientemente de las técnicas que se utilicen para remodelar la envoltura nuclear y la cromatina de una célula diferenciada, se utilizan al menos dos, y en algunas realizaciones tres, etapas: una etapa en la que la cromatina y/o la envoltura nuclear se remodelan, una segunda etapa en la que la cromatina y/o la envoltura nuclear remodeladas se reconstituyen hacia un citoplasto para preparar una célula susceptible de división celular, y una tercera etapa en la que las células reprogramadas proliferantes resultantes se analizan para determinar el grado de reprogramación y el cariotipo. Si no hay un grado suficiente de reprogramación, las células vuelven a la etapa uno.
Las células somáticas reprogramadas como se describe en la presente memoria se pueden utilizar para generar células ES o líneas de células ES que incluyen, pero no se limitan a, líneas de células ES humanas. Dado que las células madre embrionarias humanas aisladas tienen una baja eficacia en la generación de líneas celulares, las células reprogramadas de la presente invención se pueden agregar entre sí para facilitar la generación de líneas celulares ES estables. Tal agregación puede incluir cultivar en placa las células a alta densidad, colocar las células en una depresión en la placa de cultivo de manera que la gravedad acerque estrechamente las células, o las células se pueden cultivar conjuntamente con células alimentadoras o con líneas de células ES existentes.
Se pueden cultivar células embrionarias humanas, p. ej., células ES humanas, en células alimentadoras, p. ej., fibroblastos embrionarios de ratón, o células alimentadoras humanas tales como fibroblastos (p. ej., fibroblastos de prepucio humano, fibroblastos de piel humana, fibroblastos endometriales humanos, fibroblastos oviductales humanos) y células placentarias. En una realización, las células alimentadoras humanas pueden ser células alimentadoras autólogas derivadas del mismo cultivo de células reprogramadas mediante diferenciación directa y aislamiento clonal de células útiles en la obtención de células ES. Las células embrionarias humanas se cultivan en medio de células ES o en cualquier medio que soporte el crecimiento de las células embrionarias, por ejemplo, Knockout DMEM (Núm. de Cat. Invitrogen 10829-018).
Alternativamente, las células reprogramadas obtenidas a partir de los métodos de la presente invención se pueden cultivar conjuntamente en yuxtaposición con líneas de células ES existentes. Las células embrionarias humanas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, células madre embrionarias, tales como de líneas ya establecidas, células de carcinoma embrionario, fibroblastos embrionarios murinos, otras células de tipo embrión, células de origen embrionario o células derivadas de embriones, muchas de las cuales son conocidos en la técnica y están disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA 20110-2209, EE.UU., y en otras fuentes.
Las células embrionarias se pueden añadir directamente a las células reprogramadas cultivadas o se pueden cultivar muy cerca de las células reprogramadas cultivadas, pero no en contacto directo con ellas. El método comprende la etapa de poner en contacto directa o indirectamente las células cultivadas reprogramadas con células embrionarias. Alternativamente, el cultivo de células reprogramadas y el cultivo de células embrionarias están indirectamente conectados o fusionados. Esto se puede lograr mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, la utilización de aceite mineral ligero tal como Cooper Surgical ACT Núm. ART4008, aceite de parafina o aceite de Squibb. Las conexiones se pueden realizar utilizando un capilar de vidrio o un dispositivo similar. Tales conexiones indirectas entre las células cultivadas reprogramadas y las células embrionarias permiten la mezcla gradual del medio embrionario (en el que se cultivan las células reprogramadas) y el medio de células ES (en el que se cultivan las células embrionarias humanas).
En otra realización, las células reprogramadas se pueden cultivar conjuntamente con células embrionarias de una especie distinta a la humana, por ejemplo, primate no humano o ratón. Por ejemplo, las células reprogramadas se cultivan conjuntamente con el embrión no humano en un sistema de cultivo de microgotitas u otro sistema de cultivo conocido en la técnica, pero que no permite el contacto célula-célula, pero podría permitir el contacto célula-factor secretado y/o célula-matriz. El volumen de la microgotita se puede reducir, por ejemplo, de 50 microlitros a aproximadamente 5 microlitros para intensificar la señal.
Después de aproximadamente 3-4 días, las células reprogramadas exhiben propiedades de células madre embrionarias. Sin desear estar ligado a ninguna teoría en particular, se cree que durante un período de días o semanas las células reprogramadas cultivadas exhiben un crecimiento de células ES facilitado quizás como resultado de factores secretados por las células embrionarias humanas o por la matriz extracelular. Los métodos descritos anteriormente para producir células madre embrionarias se describen en el documento WO 2006/052646 A2 (solicitud PCT/US05/39776), y el documento US 2006/0206953 A1 (US 11/267.555).
Las propiedades de las células ES o de una línea celular ES pueden incluir, sin limitación, la expresión de la telomerasa y/o actividad de la telomerasa, y la expresión de uno o más marcadores de células ES conocidos.
En ciertas realizaciones, las condiciones de cultivo celular reprogramado pueden incluir poner en contacto las células con factores que pueden inhibir o potenciar de otro modo la diferenciación de las células, p. ej., prevenir la diferenciación de las células en células que no son ES, trofectodermo u otros tipos de células. Tales condiciones pueden incluir poner en contacto las células cultivadas con heparina o introducir factores de reprogramación en las células o extractos como se describe en la presente memoria. En otra realización más, la expresión de cdx-2 se evita por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, la introducción de ARNi de CDX-2 en las células reprogramadas, inhibiendo así la diferenciación de las células reprogramadas hacia células TS, asegurando así que dichas células podrían no conducir a un embrión competente.
En otra realización de la presente invención, las células reprogramadas resultantes de las etapas 1 y 2 de los métodos de esta invención se utilizan directamente para producir una progenie diferenciada sin la producción de una línea de células ES. Por tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona un método para producir células progenitoras diferenciadas, que comprende:
(i) obtener células reprogramadas utilizando las etapas 1-2 o 1-3 de los métodos de esta invención; y (ii) inducir la diferenciación de las células reprogramadas para producir células progenitoras diferenciadas
sin producir una línea de células madre embrionarias. Las células progenitoras diferenciadas se pueden utilizar para obtener células, tejidos y/u órganos que se utilizan ventajosamente en la zona del trasplante de células, tejidos y/u órganos que incluyen todas las células y aplicaciones descritas en la presente memoria para células y tejidos derivados de ES.
En el pasado, el cultivo a largo plazo de células de masa celular interna se utilizaba para producir líneas de células madre embrionarias. Posteriormente, las células madre embrionarias se cultivaron y modificaron genéticamente condicionalmente, y se indujo su diferenciación con el fin de producir células para producir células para terapia. La solicitud pendiente de Estados Unidos de titularidad compartida Publicada como documento US 2005/0265976 A1 describe un método para producir células progenitoras diferenciadas a partir de células de masa celular interna o células derivadas de mórula induciendo directamente la diferenciación de esas células sin producir una línea de células madre embrionarias. La solicitud también describe el uso de dichas células, tejidos y órganos diferenciados en la terapia de trasplante. En el método de la presente invención, se induce la diferenciación directa de las células reprogramadas obtenidas a partir de las etapas 1-2 o 1-3 como se describe en la presente memoria a células progenitoras diferenciadas que a continuación se utilizan para terapia celular y para la generación de células, tejidos y órganos para trasplante. Si se desea, se pueden introducir modificaciones genéticas, por ejemplo, en células somáticas antes de la reprogramación o en la cromatina en los extractos como se describe en la presente memoria. Por tanto, las células progenitoras diferenciadas producidas utilizando el método de la presente invención no poseen la pluripotencia de una célula madre embrionaria o una célula germinal embrionaria y son, en esencia, células diferenciadas parcial o totalmente específicas de tejido. Estas células progenitoras diferenciadas pueden dar lugar a células de cualquiera de las tres capas germinales embrionarias, es decir, endodermo, mesodermo y ectodermo. Por ejemplo, las células progenitoras diferenciadas se pueden diferenciar hacia hueso, cartílago, músculo liso, dermis con un patrón prenatal de expresión génica y capaz de promover la reparación de heridas sin cicatrices, y células hematopoyéticas o hemangioblásticas (mesodermo); endodermo definitivo, hígado, intestino primitivo, células beta pancreáticas, progenitores de células beta pancreáticas y epitelio respiratorio (endodermo); o neuronas, células gliales, folículos pilosos o células oculares, incluidas las neuronas retinianas y el epitelio pigmentario de la retina utilizando mecanismos conocidos en la técnica, o utilizando mecanismos descritos en las solicitudes pendientes PCT/US2006/013573 presentada el 11 de abril de 2006 y la Solicitud de Estados Unidos Núm. 60/811.908, presentada el 7 de junio de 2006.
Una ventaja de los métodos de la presente invención es que las células obtenidas mediante las etapas 1-2 o 1-3 se pueden diferenciar sin purificación previa o establecimiento de una línea celular. Las células obtenidas mediante los métodos descritos en la presente memoria se pueden diferenciar sin la selección o purificación de las células. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, una población heterogénea de células que comprenden células reprogramadas se diferencia hacia un tipo de célula deseado. En una realización, una mezcla de células obtenidas de las etapas 1-2 como se describe en la presente memoria se expone a uno o más factores de diferenciación y se cultiva in vitro. Por tanto, en determinadas realizaciones, no es necesario purificar las células reprogramadas o establecer una línea celular ES u otra antes de la diferenciación. En una realización, se permeabiliza una población heterogénea de células que comprende células reprogramadas para facilitar el acceso a factores de diferenciación y la posterior diferenciación.
Además, no es necesario que las células progenitoras diferenciadas producidas utilizando el método de la presente invención expresen el componente catalítico de la telomerasa (TERT) y sean inmortales, o que las células progenitoras expresen marcadores de superficie celular que se encuentran en células madre embrionarias tales como marcadores de superficie celular característicos de las células madre embrionarias de primates: positivos para SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, actividad de fosfatasa alcalina y negativos para SSEA-1. Además, las células progenitoras diferenciadas producidas mediante el método de la presente invención pueden ser distintas de los cuerpos embrioides, es decir, los cuerpos embrioides se obtienen a partir de células madre embrionarias, mientras que las células madre diferenciadas producidas mediante el método de la presente invención se pueden obtener a partir de células reprogramadas sin la producción de líneas de células ES.
Aplicaciones
Las células resultantes de las etapas 1 y 2 de los métodos de esta invención se cultivan en placas en condiciones que promueven el crecimiento de células madre embrionarias, tales como células hES, como es bien conocido en la técnica. Brevemente, las células se pueden dejar en el sustrato en el que se preparan los citoplastos enucleados, o se pueden tripsinizar y centrifugar a 700xg durante 3 minutos y recoger en una pipeta Pasteur estéril y colocar debajo de una monocapa de alimentación para concentrar y co-localizar las células. Las células se pueden cultivar conjuntamente con otras líneas de células Es de crecimiento vigoroso que se pueden eliminar fácilmente por medios tales como la inducción del suicidio después de estimular el crecimiento de las células madre reprogramadas. Las células reprogramadas también se pueden concentrar en una pequeña zona superficial de la superficie de crecimiento colocándolas en placas en un pequeño cilindro de clonación y también se pueden cultivar mediante otros mecanismos bien conocidos en la técnica.
En otro aspecto de la invención, el método comprende la utilización de células derivadas de las células reprogramadas producidas utilizando el método de la presente invención en investigación y en terapia. Tales células pluripotentes reprogramadas se pueden diferenciar hacia cualquiera de las células del organismo, incluyendo, sin limitación, células de piel, cartílago, músculo esquelético óseo, músculo cardíaco, renales, hepáticas, de sangre y formadoras sangre, precursoras vasculares y endoteliales vasculares, beta pancreáticas, neuronas, de la glía, de la retina, del folículo del oído interno, intestinales, de pulmón.
En una realización concreta, las células reprogramadas se pueden diferenciar hacia células con un patrón prenatal dermatológico de expresión génica que es altamente elastogénico o capaz de regenerarse sin causar la formación de cicatrices. Los fibroblastos dérmicos de la piel fetal de mamíferos, especialmente los correspondientes a zonas donde el tegumento se beneficia de un alto nivel de elasticidad, tal como en las regiones que rodean las articulaciones, son responsables de sintetizar de novo la intrincada arquitectura de fibrillas elásticas que funcionan durante muchos años sin recambio. Además, la piel embrionaria temprana es capaz de regenerarse sin formación de cicatrices. Las células de este punto del desarrollo embrionario obtenidas a partir de las células reprogramadas producidas utilizando el método de la presente invención son útiles para promover la regeneración sin cicatrices de la piel, incluida la formación de una arquitectura de elastina normal. Esto es concretamente útil para tratar los síntomas del curso del envejecimiento humano normal, o en el daño cutáneo actínico, en donde puede haber una elastólisis profunda de la piel que da como resultado un aspecto envejecido que incluye flacidez y arrugas de la piel.
En otra realización de la invención, las células reprogramadas se exponen a inductores de diferenciación para producir otras células terapéuticamente útiles tales como epitelio pigmentario retiniano, endodermo definitivo, células beta pancreáticas y precursores de células beta pancreáticas, precursores hematopoyéticos y progenitores hemangioblásticos, neuronas, células respiratorias, progenitores musculares, células formadoras de cartílago y hueso, células del oído interno, células de la cresta neural y sus derivados, células gastrointestinales, células hepáticas, células renales, células del músculo liso y cardíaco, progenitores dérmicos, incluidos los que tienen un patrón prenatal de expresión génica útil para promover la reparación de heridas sin cicatrices, así como muchos otros tipos de células útiles del endodermo, mesodermo y endodermo. Tales inductores incluyen, pero no se limitan a: citocinas tales como interleucina-alfa A, interferón-alfa A/D, interferón-beta, interferón-gamma, proteína-10 inducible por interferón-gamma, interleucina-1-17, factor de crecimiento de queratinocitos, leptina, factor inhibidor de la leucemia, factor estimulante de colonias de macrófagos y proteína inflamatoria de macrófagos-1 alfa, 1-beta, 2, 3 alfa, 3 beta y proteína quimiotáctica de monocitos 1-3, 6kina, activina A, anfirregulina, angiogenina, factor endotelial de crecimiento de células B, beta celulina, factor neurotrófico derivado de cerebro, C10, cardiotrofina-1, factor neurotrófico ciliar, quimioatrayente de neutrófilos inducido por citocinas-1, eotaxina, factor de crecimiento epidérmico, péptido activador de neutrófilos epiteliales 78, eritropoyetina, receptor de estrógeno alfa, receptor de estrógeno beta, factor de crecimiento de fibroblastos (ácido y básico), heparina, ligando FLT-3/FLK-2, factor neurotrófico derivado de la línea celular glial, Gly-His-Lys, factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, GRO-alfa/MGSA, GRO-beta, GRO-gamma, HCC-1, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina, factor de crecimiento de hepatocitos, heregulina-alfa, insulina, proteína 1 de unión al factor de crecimiento insulínico, proteína-1 de unión al factor de crecimiento de tipo insulínico, factor de crecimiento de tipo insulínico, factor de crecimiento de tipo insulínico, factor de crecimiento nervioso, neurotofina3,4, oncostatina M, factor de crecimiento placentario, pleiotrofina, rantes, factor de células madre, factor 1B derivado de células estromales, tromopoyetina, factor de crecimiento transformador-(alfa, beta1,2,3,4,5), factor de necrosis tumoral (alfa y beta), factores de crecimiento endotelial vascular y proteínas morfogénicas óseas, enzimas que alteran la expresión de hormonas y antagonistas de hormonas tales como 17B-estradiol, hormona adrenocorticotrópica, adrenomedulina, hormona estimulante de alfa-melanocitos, gonadotropina coriónica, globulina transportadora de corticosteroides, corticosterona, dexametasona, estriol, hormona estimulante del folículo, gastrina 1, glucagones, gonadotropina, L-3,3',5'-triyodotironina, hormona luteinizante, L-tiroxina, melatonina, MZ-4, oxitocina, hormona paratiroidea, PEC-60, hormona de crecimiento de la pituitaria, progesterona, prolactina, secretina, globulina transportadora de hormonas sexuales, hormona estimulante de la tiroides, factor liberador de tirotropina, globulina transportadora de tiroxina y vasopresina, componentes de la matriz extracelular tales como fibronectina, fragmentos proteolíticos de fibronectina, laminina, tenascina, trombospondina y proteoglicanos tales como agrecano, proteoglicano de heparán sulfato, proteoglicano de controitín sulfato y sindecano. Otros inductores incluyen células o componentes derivados de células de tejidos definidos utilizados para proporcionar señales inductivas a las células diferenciadoras derivadas de las células reprogramadas producidas utilizando el método de la presente invención. Tales células inductoras se pueden obtener de seres humanos, mamíferos no humanos o aves, tales como células embrionarias o adultas libres de patógenos específicos (LPE).
La progenie diferenciada también puede obtener a partir de líneas de células ES reprogramadas o diferenciarse directamente de células reprogramadas utilizando procedimientos de aislamiento clonal como se describe en la solicitud pendiente PCT/US2006/013573 presentada el 11 de abril de 2006 y la Solicitud de Estados Unidos Núm.
60/811.908, presentada el 7 de junio de 2006. Los métodos de diferenciación de células reprogramadas obtenidos mediante los métodos descritos en la presente memoria pueden comprender una etapa de permeabilización de la célula reprogramada. Por ejemplo, las líneas de células ES generadas por las técnicas de reprogramación descritas en la presente memoria, o alternativamente una mezcla heterogénea de células que comprenden células reprogramadas, se pueden permeabilizar antes de la exposición a uno o más factores de diferenciación o extracto celular u otra preparación que comprenda factores de diferenciación. Las técnicas de permeabilización incluyen, por ejemplo, la incubación de la célula o células con un detergente, tal como digitonina, o una toxina bacteriana, tal como Estreptolisina O, o mediante métodos como los descritos en el documento PCT/US2006/013573 presentado el 11 de abril de 2006 y la Solicitud de Estados Unidos Núm. 60/811.908, presentada el 7 de junio de 2006. En ciertas realizaciones, las células reprogramadas se permeabilizan y a continuación se exponen a extracto de células beta (p. ej., células beta bovinas).
Los métodos de la presente invención también permiten la generación de líneas celulares homocigotas o hemicigotas para antígenos MHC. Se pueden generar líneas celulares HLA hemicigóticas u homocigotas en líneas celulares diferenciadas que se desdiferencian para generar una línea celular pluripotente que es homocigota en el locus HLA. Véase, por ejemplo, la Publicación de Patente de Estados Unidos Núm. US 2004/0091936, presentada el 14 de mayo de 2004. Por ejemplo, las células diferenciadas se pueden desdiferenciar utilizando los métodos de reprogramación descritos en la presente memoria para generar una célula madre pluripotente. Las células madre pluripotentes homocigotas para antígenos de histocompatibilidad, por ejemplo, antígenos MHC, se pueden producir remodelando el núcleo de una célula somática homocigota para los antígenos y a continuación reconstituyendo el núcleo remodelado como se describe en la presente descripción. El citoplasma de una célula no diferenciada se puede añadir a núcleos aislados o cromatina de células diferenciadas, o células diferenciadas que están permeabilizadas. Después de la reprogramación de la célula somática, la célula homocigota desdiferenciada, pluripotente, madre o similar a madre resultante se puede diferenciar hacia un tipo de célula deseado. Los métodos para inducir la re-diferenciación en un tipo de célula diferente al de las células diferenciadas iniciales se describen, por ejemplo, en la publicación de Estados Unidos de titularidad compartida co-pendiente Núm. 20030027330, presentada el 2 de abril de 2002. Adicionalmente, durante la etapa 1 de la desdiferenciación, el núcleo remodelado en la etapa uno se puede modificar mediante recombinación homóloga. La adición de extractos de células tales como DT40 que se sabe que tienen un alto nivel de recombinación homóloga junto con construcciones de direccionamiento de ADN producirá células después de la reconstitución en la etapa 2 y el escrutinio en la etapa 3 que tienen una modificación genética deseada y que son homocigotas para el antígeno del MHC.
Muchos de las etapas de la presente invención requieren mucho tiempo y requieren técnicos expertos para realizar las etapas con un alto nivel de calidad. Para reducir los costes y aumentar la calidad y la reproducibilidad, muchas de las etapas descritas anteriormente se pueden automatizar mediante el uso de la robótica. Las plataformas robóticas pueden, por ejemplo, cultivar células, introducir tampones y otros reactivos, descongelar e introducir extractos y reconstituir las células en la etapa 2.
La presente invención es comercializada por centros regionales que reciben células diferenciadas de animales o seres humanos que necesitan terapia celular y realizan las etapas 1-2 o 1-3 de los métodos de la presente invención, y devuelven las células madre pluripotentes reprogramadas a un centro clínico, donde se diferencian hacia un tipo de célula terapéuticamente útil, o la diferenciación se realiza en el centro regional y las células listas para trasplante se envían en cultivos vivos o en un estado criopreservado al proveedor de atención médica.
Ejemplos
Ejemplo 1: Remodelación nuclear: Ejemplo Comparativo
La primera etapa (también denominada en la presente memoria "etapa de reprogramación nuclear") se realiza utilizando células mononucleares de sangre periférica humana que se purifican a partir de sangre mediante centrifugación en gradiente de Ficoll para producir una capa leucocitaria compuesta principalmente de linfocitos y monocitos, como es bien conocido en la técnica. El uso de linfocitos con un locus de inmunoglobulina reordenado como donantes dará como resultado células madre con los mismos loci reorganizados. En el caso de que el resultado deseado del experimento no sean células con un reordenamiento preformado en los genes de inmunoglobulina, los monocitos se purifican a partir de los linfocitos mediante citometría de flujo como es bien conocido en la técnica y se almacenan a temperatura ambiente en medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) o criopreservados hasta su uso. Los ovocitos de Xenopus de hembras maduras anestesiadas con MS222 se extraen quirúrgicamente en tampón MBS y se inspeccionan para determinar su calidad como es bien conocido en la técnica (Gurdon, Methods Cell Biol 16:125-139, (1977)). Después, los ovocitos se lavan dos veces en MBS y se almacenan durante la noche a 14°C en MBS. Al día siguiente, se seleccionan ovocitos de buena calidad en estadio V o VI (Dumont, J. Morphol. 136:153-179, (1972)) y las células foliculares se extraen bajo un microscopio de disección en MBS. Después de la desfoliculación, los ovocitos se almacenan nuevamente a 14°C durante la noche en MBS con 1 ug/ml de gentamicina (Sigma). Al día siguiente, los ovocitos con una morfología saludable se lavan nuevamente en MBS y se almacenan en MBS a 14°C hasta su uso ese día. Aproximadamente 1 x 104 monocitos son permeabilizados por el tratamiento con SLO como describen Chan y Gurdon, Int. J. Dev. Biol. 40:441-451, (1996)). Brevemente, las células se suspenden en tampón de lisis helado [1 x MBS libre de Ca2+ que contiene EGTA 10 mM (Gurdon, (1977)]. Se añade SLO (diagnóstico Wellcome) a una concentración final de 0,5 unidades/mL. La suspensión se mantiene en hielo durante 7 minutos, a continuación, se añaden cuatro volúmenes de 1 x MBS libre de Ca2+ que contiene albúmina de suero bovino al 1% (Sigma). A continuación, se pueden eliminar alícuotas de las células, diluidas 1 x MBS libre de Ca2+ que contiene albúmina de suero bovino al 1% y se incuba a temperatura ambiente durante cinco minutos para activar la permeabilización. A continuación, las células se vuelven a colocar sobre hielo para transferirlas a los ovocitos de Xenopus. Las células permeabilizadas se transfieren después a los ovocitos de Xenopus como es bien conocido en la técnica (Gurdon, J. Embryol. Exp. Morphol. 36:523-540, (1976). Brevemente, los ovocitos preparados como se describe anteriormente se colocan en agar en MBS con alto contenido de sal (Gurdon, J. Embryol. Exp. Morphol. 36:523-540, (1976)). El ADN de los óvulos se inactiva mediante UV como se describe (Gurdon, Methods in Cell Biol 16:125-139, 1977) con la excepción de que no se realiza la segunda exposición a la fuente de UV de Hanovia. Brevemente, los óvulos se colocan en un portaobjetos de vidrio con el polo del animal hacia arriba y se exponen a una lámpara UV Mineralite durante 1 minuto para inactivar la vesícula germinal femenina. Los monocitos permeabilizados se recogen en serie en una pipeta de trasplante 3-5 veces el diámetro de los monocitos y se inyectan en el ovocito, preferiblemente apuntando hacia el pronúcleo inactivado. El huevo que contiene los núcleos se incuba durante una hora a 7 días, preferiblemente 7 días, después se retira y se utiliza en la etapa 2. Si se desea, los ovocitos se pueden manipular antes de utilizarlos para alterar los niveles de uno o más factores celulares como se describe anteriormente.
Ejemplo 2: Remodelación nuclear
En este ejemplo, la etapa uno de la remodelación nuclear se lleva a cabo en un extracto de células no diferenciadas de la misma especie que la célula diferenciada; los núcleos de fibroblastos dérmicos humanos se remodelan in vitro utilizando extractos de células mitóticas de la línea celular de carcinoma embrionario humano NTera-2. Sin embargo, alternativamente se pueden utilizar extractos de células de una especie diferente.
Preparación de extracto de remodelación nuclear
NTera-2 cl. Las células D1 se obtienen fácilmente de fuentes tales como la Colección de cultivos Tipo Americana (CRL-1973) y se cultivan a 37°C en cultivo monocapa en DMEM con L-glutamina 4 mM, 1,5 g/L de bicarbonato de sodio y 4,5 g/L de glucosa, suero bovino fetal al 10% (medio completo). Mientras están en un estado de crecimiento logarítmico, las células se colocan en placas a 5 x 106 células por cm cuadrado de matraz de cultivo de tejidos en 200 mL de medio completo. Los extractos de células en la prometafase se preparan como se conoce en la técnica (Burke y Gerace, Cell 44:639-652, (1986)). Brevemente, después de dos días y mientras todavía está en un estado de crecimiento logarítmico, el medio se reemplaza por 100 ml de medio completo que contiene timidina 2 mM (que secuestra las células en la fase S). Después de 11 horas, las células se enjuagan una vez con 25 mL de medio completo, después las células se incuban con 75 mL de medio completo durante cuatro horas, momento en el cual se añade nocodazol a una concentración final de 600 ng/mL de la solución de partida 10.000X en DMSO. Después de una hora, las células sueltas se eliminan mediante sacudida mitótica (Tobey et al., J. Cell Physiol. 70: 63-68, (1967)). Esta primera colección de células eliminadas se descarta, el medio se reemplaza por 50 mL de medio completo que también contiene 600 ng/mL de nocodazol. Las células en prometafase se recogen a continuación mediante agitación 2-2,5 horas más tarde. Las células recolectadas se incuban después a 37°C durante 45 minutos en 20 mL de medio completo que contiene 600 ng/mL de nocodazol y citocalasina B 20 pM. Después de esta incubación, las células se lavan dos veces con PBS de Dulbecco enfriado en hielo, después una vez en KHM (KCl 78 mM, Hepes-KOH 50 mM [pH 7,0], MgCh 4,0 mM, EGTA 10 mM, CaCh 8,37 mM, DTT 1 mM, citoclasina B 20 pM). Las células se centrifugan a 1000 g durante cinco minutos, se desecha el sobrenadante y las células se resuspenden en el volumen original de KHM. A continuación, las células se homogeneizan en un homogeneizador Dounce sobre hielo con aproximadamente 25 golpes y se determina el progreso mediante observación microscópica. Cuando al menos 95% de las células se ha homogeneizado, los extractos se mantienen sobre hielo para su uso en el reensamblaje de la envoltura o se criopreservan como es bien conocido en la técnica.
Preparación de cromatina condensada a partir de células diferenciadas
Los fibroblastos dérmicos de los donantes estarán expuestos a condiciones que eliminan la membrana plasmática, dando como resultado el aislamiento de los núcleos. Estos núcleos, a su vez, estarán expuestos a extractos de células que dan como resultado la disolución de la envoltura nuclear y la condensación de la cromatina. Esto da como resultado la liberación de factores de cromatina como ARN, proteínas de la envoltura nuclear y reguladores de la transcripción, tales como factores de transcripción, que son perjudiciales para el procedimiento de reprogramación. Los fibroblastos dérmicos se cultivan en DMEm con suero de ternera fetal al 10% hasta que las células alcanzan la confluencia. A continuación, se recolectan 1 x 106 células mediante tripsinización como es bien conocido en la técnica, la tripsina se inactiva y las células se suspenden en 50 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS), se sedimentan centrifugando las células a 500 g durante 10 minutos a 4°C, el PBS se descarta y las células se suspenden en 50x el volumen del sedimento en PBS helado y se centrifugan como se indicó anteriormente. Después de esta centrifugación, el sobrenadante se descarta y el sedimento se resuspende en 50 x el volumen del sedimento de tampón hipotónico (HEPES 10 mM, pH 7,5, MgCh 2 mM, KCl 25 mM, DTT 1 mM, aprotinina 10 pM, leupeptina 10 pM, pepstatina A 10 pM, inhibidor de tripsina de soja 10 pM y PMSF 100 pM) y se centrifuga de nuevo a 500 g durante 10 min a 4°C. Se descarta el sobrenadante y se añade 20 x el volumen del sedimento de tampón hipotónico y las células se resuspenden cuidadosamente y se incuban en hielo durante una hora. A continuación, las células se lisan físicamente utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica. En resumen, se colocan 5 ml de la suspensión celular en un homogeneizador Dounce de vidrio y se homogeneizan con 20 golpes. La lisis celular se controla microscópicamente para observar el punto en el que resultan núcleos aislados y aún intactos. Se añade sacarosa para obtener una concentración final de sacarosa 250 mM (1/8 volumen de la solución de partida 2 M en tampón hipotónico). La solución se mezcla cuidadosamente mediante inversión suave y a continuación se centrifuga a 400 g a 4°C durante 30 minutos. El sobrenadante se descarta y los núcleos se resuspenden a continuación suavemente en 20 volúmenes de tampón nuclear (HEPES 10 mM, pH 7,5, MgCh 2 mM, Sacarosa 250 mM, KC1 25 mM, DTT 1 mM, aprotinina 10 pM, leupeptina 10 pM, pepstatina A 10 pM, inhibidor de tripsina de soja 10 pM y PMSF 100 pM). Los núcleos se vuelven a centrifugar como anteriormente y se resuspenden en 2 x el volumen del sedimento en tampón nuclear. Los núcleos resultantes pueden se pueden utilizar después directamente en la remodelación nuclear como se describe a continuación o criopreservarse para uso futuro.
Preparación de extracto de condensación
El extracto de condensación, cuando se añada a los núcleos de células diferenciadas aisladas, dará como resultado la ruptura de la envoltura nuclear y la condensación de la cromatina. Dado que el propósito de la etapa 1 es remodelar los componentes nucleares de una célula somática diferenciada con los de una célula no diferenciada, el extracto de condensación utilizado en este ejemplo se obtiene de las células NTera-2 que también son las células utilizadas para obtener el extracto para la reconstitución de la envoltura de las células nucleares anterior. Esto da como resultado una dilución de los componentes de la célula diferenciada en extractos que contienen los componentes correspondientes deseables en la reprogramación de células a un estado no diferenciado. Las células NTera-2 cl. D1 se obtienen fácilmente de fuentes tales como la Colección de Cultivos Tipo Americana (CRL-1973) y se cultivan a 37°C en cultivo monocapa en DMEM con L-glutamina 4 mM, 1,5 g/L de bicarbonato de sodio y 4,5 g/L de glucosa, suero bovino fetal al 10% (medio completo). Mientras están en un estado de crecimiento logarítmico, las células se colocan en placas a 5 x 106 células por cm cuadrado de matraz de cultivo de tejidos en 200 mL de medio completo. Los métodos para obtener extractos capaces de inducir la ruptura de la envoltura nuclear y la condensación cromosómica son bien conocidos en la técnica (Collas et al., J. Cell Biol. 147:1167-1180, (1999)). Brevemente, las células NTera-2 en crecimiento logarítmico como se describió anteriormente se sincronizan en la mitosis mediante incubación en 1 pg/ml de nocodazol durante 20 horas. Las células que se encuentran en la fase mitótica del ciclo celular se desprenden mediante sacudida mitótica. Las células desprendidas recolectadas se centrifugan a 500 g durante 10 minutos a 4°C. Las células se resuspenden en 50 ml de PBS frío y se centrifugan a 500 g durante 10 min más a 4°C. Esta etapa de lavado con PBS se repite una vez más. El sedimento celular se resuspende después en 20 volúmenes de tampón de lisis celular enfriado con hielo (HEPES 20 mM, pH 8,2, MgCh, 5 mM EDTA 10 mM, DTT 1 mM, aprotinina 10 j M, leupeptina 10 j M, pepstatina A 10 j M, inhibidor de tripsina de soja 10 jiM, PMSF 100 jiM y citocalasina B 20 jig/ml, y las células se centrifugan a 800 g durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante se descarta y el sedimento celular se resuspende cuidadosamente en un volumen de tampón de lisis celular. Las células se colocan sobre hielo durante una hora y a continuación se lisan con un homogeneizador Dounce. El progreso se controla mediante análisis microscópico hasta que se lisa más de 90% de las células y los núcleos celulares. El producto lisado resultante se centrifuga a 15.000 g durante 15 minutos a 4°C, después se retiran los tubos y se colocan inmediatamente sobre hielo. El sobrenadante se retira suavemente con una punta de pipeta de pequeño calibre y el sobrenadante de varios tubos se mezcla sobre hielo. Si no se utilizan inmediatamente, los extractos se congelan instantáneamente sobre nitrógeno líquido y se almacenan a -80°C hasta su uso. A continuación, el extracto celular se coloca en un tubo de ultracentrífuga y se centrifuga a 200.000 g durante tres horas a 4°C para sedimentar las vesículas de la membrana nuclear. A continuación, se retira suavemente el sobrenadante y se coloca en un tubo sobre hielo y se utiliza inmediatamente para preparar cromatina condensada o se criopreserva como se describe anteriormente.
Métodos de uso del extracto de condensación
Si se comienza con una alícuota congelada sobre extracto de condensación, el extracto congelado se descongela sobre hielo. A continuación, se añade al extracto un sistema generador de ATP de modo que las concentraciones finales sean ATP 1 mM, fosfato de creatina 10 mM y creatina quinasa 25 jig/ml. Los núcleos aislados de las células diferenciadas como se describió anteriormente se añaden después al extracto a 2.000 núcleos por 10 j l de extracto, se mezclan suavemente y se incuban en un baño de agua a 37°C. El tubo se retira ocasionalmente para resuspender suavemente las células dando golpecitos en el tubo. Los extractos y las fuentes celulares tienen tiempos variables de ruptura de la envoltura nuclear y condensación cromosómica. Por lo tanto, el progreso se controla mediante el seguimiento microscópico de muestras periódicas. Cuando la mayoría de las células ha perdido su envoltura nuclear y hay evidencia del comienzo de la condensación cromosómica, el extracto que contiene las masas cromosómicas en condensación se coloca en un tubo de centrífuga con un volumen igual de solución de sacarosa 1 M en tampón nuclear. Las masas de cromatina se sedimentan mediante centrifugación a 1.000 g durante 20 minutos a 4°C. El sobrenadante se descarta y las masas de cromatina se resuspenden suavemente en el extracto de remodelación nuclear obtenido anteriormente. A continuación, la muestra se incuba en un baño de agua a 33°C hasta durante dos horas y se controla periódicamente microscópicamente para detectar la formación de envolturas nucleares remodeladas alrededor de la cromatina condensada y remodelada como se ha descrito (Burke y Gerace, Cell 44:639-652, (1986). Una vez que se ha encapsulado un gran porcentaje de cromatina en envolturas nucleares, los núcleos remodelados se pueden utilizar en la reconstitución celular utilizando cualquiera de las técnicas descritas en la presente invención.
Modificación de extractos celulares
Como una modificación opcional de los métodos descritos en la presente memoria, uno o más factores se expresan o expresan en exceso en las células no diferenciadas (por ejemplo, en EC u otras células) utilizadas para obtener los extractos de remodelación y/o condensación nucleares. Tales factores incluyen, por ejemplo, SOX2, NANOG, cMYC, OCT4, DNMT3B, histonas embrionarias, así como otros factores enumerados en la Tabla 1 a continuación y ARN regulador que inducen o aumentan la expresión de proteínas expresadas en células no diferenciadas y que mejoran la frecuencia de reprogramación. Se puede utilizar cualquier combinación de los factores mencionados anteriormente. Por ejemplo, las células no diferenciadas de la presente invención se pueden modificar para que tengan una expresión aumentada de dos, tres, cuatro o más de cualquiera de los factores enumerados en la Tabla 1. Alternativamente, el nivel de uno o más factores en las células no diferenciadas utilizadas para obtener el extracto de remodelación nuclear puede disminuir en relación con los niveles encontrados en células no modificadas. Tales disminuciones en el nivel de un factor celular se pueden lograr mediante métodos conocidos, tales como, por ejemplo, mediante el uso de reguladores de la transcripción, ARN regulador o anticuerpos específicos para el factor celular.
Las construcciones génicas que codifican las proteínas enumeradas en la Tabla 1 o sus homólogos no humanos, o las proteínas reguladoras o ARN que alteran la expresión de estos factores, se transfectan en las células mediante técnicas convencionales. Alternativamente, se añaden directamente a los extractos proteínas recombinantes u otros agentes.
Ejemplo 3: Modificación genética de núcleos remodelados o cromatina
Los núcleos aislados o la cromatina condensada se pueden modificar opcionalmente mediante métodos que implican vectores u oligonucleótidos de direccionamiento tratados con recombinasa. El ADN de los cromosomas libres de células y la cromatina se puede modificar genéticamente enzimáticamente con vectores u oligonucleótidos de direccionamiento, utilizando recombinasas purificadas, proteínas de reparación de ADN purificadas o preparaciones de proteínas o extractos celulares que comprenden tales proteínas. Los ADN de direccionamiento pueden tener decenas de kilopares de bases para oligonucleótidos de al menos 50 pares de bases de homología con la diana cromosómica. Los intermedios de recombinación catalizados por recombinasa formados entre los cromosomas diana y el ADN del vector se pueden resolver enzimáticamente en extractos libres de células con otras proteínas de recombinación purificada o de reparación del ADN para producir cromosomas modificados genéticamente. Estos cromosomas modificados se pueden reintroducir en las células o utilizar en la formación de núcleos in vitro antes de su introducción en las células; la cromatina condensada modificada se puede utilizar en la reconstitución de la envoltura nuclear (véase la etapa 2 a continuación). El vector u oligonucleótidos tratados con recombinasa también se pueden introducir directamente en núcleos aislados mediante microinyección o mediante difusión en núcleos permeabilizados para permitir la formación in situ de intermedios de recombinación que se pueden resolver in vitro, mediante transferencia nuclear a células intactas o mediante fusión con células del receptor.
En este enfoque, los filamentos de nucleoproteína enzimáticamente activos se forman primero entre el vector de direccionamiento, u oligonucleótidos, y proteínas recombinasas. Las proteínas recombinasas son proteínas celulares que catalizan la formación de intermedios de recombinación heterodúplex intracelularmente y pueden formar intermedios similares en sistemas libres de células. Bien estudiadas, las recombinasas prototipo son la proteína RecA de E. coli y la proteína Rad51 de organismos eucarióticos. Las proteínas recombinasas se unen cooperativamente al ADN monocatenario y catalizan activamente la búsqueda de secuencias de ADN homólogas en otros ADN cromosómicos diana. También se pueden formar y resolver estructuras heterodúplex utilizando extractos libres de células de células con fenotipos recombinogénicos (por ejemplo, extractos DT40). En una segunda etapa, los intermediarios heterodúplex pueden resolverse en extractos libres de células mediante tratamiento con recombinación purificada y proteínas de reparación del ADN para recombinar el ADN del vector de direccionamiento del donante o el oligonucleótido en el ADN cromosómico diana (Figura 2). La resolución también se puede lograr utilizando extractos libres de células de células normales o extractos de células con un fenotipo recombinogénico. Finalmente, la membrana nuclear se reforma alrededor de los cromosomas modificados y el complemento cromosómico celular no modificado restante para su introducción en las células receptoras.
Existen varias técnicas disponibles que se pueden utilizar en la modificación genética de la célula reprogramada. Una técnica es el sistema de direccionamiento Cre-Lox. La recombinasa Cre se ha utilizado para eliminar eficazmente cientos de pares de bases a megapares de ADN en células de mamíferos. Las secuencias de reconocimiento de recombinasa LoxP y FRT permiten modificaciones génicas mediadas por recombinasa de células recombinantes homólogas.
Formación de filamentos de nucleoproteína recubiertos de recombinasa
Los vectores de direccionamiento de ADN circular se linealizan primero mediante tratamiento con endonucleasas de restricción, o alternativamente se producen moléculas de ADN lineales mediante PCR a partir de ADN genómico o ADN de vector. Todos los vectores de direccionamiento de ADN y las construcciones de ADN tradicionales se eliminan de las secuencias de vectores mediante electroforesis en gel de agarosa y se purifican con columnas Elutip-D (Schleicher & Schuell, Keene, NH). Para el recubrimiento de ADN con proteína RecA, el ADN lineal de doble hebra (200 ng) se desnaturaliza con calor a 98°C durante 5 minutos, se enfría en hielo durante 1 minuto y se añade a la mezcla de recubrimiento de proteína que contiene tampón Tris-acetato, acetato de magnesio 2 mM y ATPyS 2,4 mM. La proteína RecA (8,4 pg) se añade inmediatamente, la reacción se incuba a 37°C durante 15 minutos y la concentración de acetato de magnesio se aumenta hasta una concentración final de 11 mM. El recubrimiento de ADN con proteína RecA se controla mediante electroforesis en gel de agarosa con ADN de doble hebra sin recubrimiento como control. La movilidad electroforética de RecA-DNA se retrasa significativamente en comparación con el DNA de doble hebra no recubierto.
El aislamiento de los cromosomas libres de células y la cromatina se logra como se describió anteriormente. El extracto de condensación, cuando se añade a los núcleos de células diferenciadas aisladas, dará como resultado la ruptura de la envoltura nuclear y la condensación de la cromatina. Los núcleos resultantes se pueden utilizar a continuación directamente para modificaciones de genes como se acaba de describir, remodelación nuclear o criopreservar para uso futuro. Se utiliza un extracto separado para la reconstitución de la envoltura nuclear después de que las reacciones de recombinación homóloga libres de células hayan modificado los cromosomas diana. El extracto para la ruptura de la envoltura nuclear y la condensación de la cromatina y para la reconstitución de la envoltura nuclear se puede preparar a partir de cualquier línea celular de mamífero competente. Sin embargo, los extractos de la línea celular de carcinoma embrionario humano NTera-2 se pueden utilizar potencialmente para el extracto de condensación y para el extracto de reconstitución de la envoltura nuclear, así como para remodelar la cromatina diferenciada a un estado no diferenciado, mejorando así la producción de células madre embrionarias humanas genéticamente modificadas a partir de células dérmicas humanas diferenciadas.
Formación de intermedios de recombinación heterodúplex entre vectores de direccionamiento de nucleoproteínas recubiertos de recombinasa preformados y oligonucleótidos y cromosomas y cromatina libres de células
La formación de heterodúplex de vectores/cromosomas de direccionamiento se realiza añadiendo aproximadamente 1-3 ug de ADN cromosómico de doble hebra o masas de cromatina a los filamentos de nucleoproteína recubiertos de RecA descritos anteriormente, e incubando a 37°C durante 20 minutos. Si las estructuras de heterodúplex de nucleoproteínas se deben desproteinizar antes de etapas adicionales de recombinación in vitro, se tratan con la adición de SDS hasta una concentración final del 1,2%, o mediante la adición de proteinasa K a 10 mg/ml con incubación durante 15 a 20 minutos a 37°C, seguido de la adición de SDS hasta una concentración final de 0,5 a 1,2% (peso/volumen). El SDS residual se elimina antes de las etapas posteriores mediante microdiálisis frente a 100 a 1000 volúmenes de mezcla de recubrimiento de proteínas.
Resolución de intermedios de recombinación con extractos libres de células
Los extractos libres de células se pueden preparar a partir de líneas celulares de fibroblasto normal o hES, o se pueden preparar a partir de células que han demostrado tener fenotipos recombinogénicos. Las líneas celulares que exhiben altos niveles de recombinación in vivo son la línea de células pre-B de pollo DT40 y la línea celular linfoide humana DG75. La preparación de extractos libres de células se realiza a 4°C. Aproximadamente 108 células en crecimiento activo se recogen de placas o de cultivos en suspensión. Las células se lavan tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PbS; NaCl 140 mM, KCl 3 mM, NaH2PO48 mM, K2HPO41 mM, MgCh 1 mM, CaCh 1 mM), se resuspenden en 2 a 3 mL de tampón hipotónico A (Tris-hidrocloruro 10 mM [pH 7,4], MgCh 10 mM, KCl 10 mM, ditiotreitol 1 mM) y se mantienen en hielo durante 10 a 15 minutos. Se añade fluoruro de fenilmetilsulfonilo a una concentración de 1 mM, y las células se rompen mediante 5 a 10 carreras en un homogeneizador Dounce, maja B. Los núcleos liberados se centrifugan a 2600 rpm en una centrífuga Beckman TJ-6 durante 8 min. El sobrenadante se retira con cuidado y se almacena en glicerol al 10%-NaCl 100 mM a -70°C (fracción citoplásmica). Los núcleos se resuspenden en 2 mL de tampón A que contiene 350 mM de NaCl y se añaden los siguientes inhibidores de proteinasa: pepstatina a una concentración de 0,25 ug/ml, leupeptina a una concentración de 0,1 ug/ml, aprotinina a una concentración de 0,1 ug/ml y fluoruro de fenilmetilsulfonilo a una concentración de 1 mM (todos de Sigma Chemicals). Después de 1 h de incubación a 0°C, los núcleos extraídos se centrifugan a 70.000 rpm en un rotor Beckman TL-100/3 a 2°C. El sobrenadante transparente se ajusta a glicerol al 10%, p-mercaptoetanol 10 mM y se congela inmediatamente en nitrógeno líquido antes de almacenarlo a -70°C (fracción 1 ).
Para resolver los intermedios de recombinación in vitro, los intermedios heterodúplex cromosómicos se incuban con 3 a 5 ug de proteína de extracto en una mezcla de reacción que contiene NaCl 60 mM, 2-mercaptoetanol 2 mM, KCl 2 mM, Tris-hidrocloruro 12 mM (pH 7,4), ATP 1 mM, 0,1 mM de desoxirribonucleósido trifosfato (dNTP), fosfato de creatina 2,5 mM, MgCh 12 mM, espermidina 0,1 mM, glicerol al 2% y ditiotreitol 0,2 mM. Después de 30 minutos a 37°C, la reacción se detiene mediante la adición de EDTA a una concentración de 25 pM, dodecilsulfato de sodio (SDS) a una concentración de 0,5% y 20 ug de proteinasa K y se incuba durante 1 hora a 37°C. El SDS se elimina antes de las etapas siguientes mediante microdiálisis. Se añade un volumen igual de sacarosa 1 M a las masas de cromatina tratadas y se sedimenta mediante centrifugación a 1.000 x g durante 20 minutos a 4°C.
Reforma de envolturas nucleares alrededor de cromosomas recombinantes y cromatina
El sobrenadante se descarta y las masas de cromatina se resuspenden suavemente en el extracto de remodelación nuclear descrito anteriormente. A continuación, la muestra se incuba en un baño de agua a 33°C durante hasta dos horas y se controla microscópicamente periódicamente para detectar la formación de envolturas nucleares remodeladas alrededor de la cromatina condensada y remodelada como se describe (Burke y Gerace, Cell 44: 639­ 652, (1986). Una vez que se ha encapsulado un gran porcentaje de cromatina en las envolturas nucleares, los núcleos remodelados se pueden utilizar para la reconstitución celular utilizando cualquiera de las técnicas descritas en la presente invención.
Detección de células que contienen cromosomas modificados genéticamente.
Las células reconstituidas se cultivan durante 7 a 14 días y se escrutan en busca de recombinantes utilizando PCR e hibridación Southern.
Ejemplo 4. Modificación de cromosomas y cromatina en núcleos aislados con vectores de direccionamiento u oligonucleótidos para modificar genéticamente células
Los cromosomas y la cromatina se pueden modificar genéticamente en núcleos aislados de células. En este enfoque, los núcleos intactos se aíslan de las células en crecimiento y se permeabilizan de forma reversible para permitir la difusión de los vectores y oligonucleótidos dirigidos a nucleoproteínas hacia el interior del núcleo. Los intermedios heterodúplex formados entre vectores de direccionamiento de nucleoproteínas y oligonucleótidos y ADN cromosómico se pueden resolver mediante tratamiento con extractos de células competentes en recombinación, recombinación purificada y proteínas de reparación de ADN, o mediante reconstitución celular con los núcleos en células competentes en recombinación.
Aislamiento y permeabilización de núcleos
La preparación de poblaciones sincrónicas de cultivo celular de núcleos y la sincronización se llevan a cabo como se describió anteriormente (Leno et al., Cell 69:151-158 (1992)). Los núcleos se preparan como se describe excepto que todas las incubaciones se llevan a cabo en tampón HE (Hepes-KOH 50 mM, pH 7,4, KCl 50 mM, MgCh 5 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM, 1 ug/ml de aprotinina, pepstatina, leupeptina, quimostatina).
Los núcleos preparados con estreptolisina O (SLO) de Permeabilización de la Membrana Nuclear (Leno et al., Cell 69:151-158 (1992)) se incuban con 20 ug/ml de lisolecitina (Sigma Immunochemicals) y 10 ug/ml de citocalasina B en HE a una concentración de -1,5 x 104 núcleos/ml durante 10 min a 23°C con mezclado suave ocasional. Las reacciones se detienen mediante la adición de BSA sin nucleasa al 1% (Sigma Immunochemicals). Los núcleos se sedimentan suavemente mediante centrifugación en un rotor RC5B (Sorvall Instruments, Newton, CT) a 500 rpm durante 5 min y a continuación se lavan tres veces mediante dilución en 1 mL de HE. Los núcleos granulados se recuperan en un pequeño volumen de tampón y se resuspenden a ~1 x 104 núcleos/ul.
Formación de intermedios de recombinación heterodúplex entre vectores de direccionamiento de nucleoproteínas recubiertos de recombinasa preformados y oligonucleótidos y cromosomas y cromatina libres de células
La formación de heterodúplex de vector/cromosoma de direccionamiento se realiza añadiendo aproximadamente de 1 x 105 a 1 x 106 núcleos permeabilizados a los filamentos de nucleoproteína recubiertos de RecA descritos anteriormente, e incubando a 37°C durante 20 minutos.
Resolución de intermedios de recombinación con extractos libres de células
Se pueden preparar extractos libres de células a partir de líneas celulares de fibroblastos normales o hES, o se pueden preparar a partir de células que se ha demostrado que tienen fenotipos recombinogénicos. Las líneas celulares que exhiben altos niveles de recombinación in vivo son la línea de células pre-B de pollo DT40 y la línea celular linfoide humana DG75. La preparación de extractos libres de células se realiza a 4°C. Aproximadamente 108 células en crecimiento activo se recogen de placas o de cultivos en suspensión. Las células se lavan tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PbS; NaCl 140 mM, KCl 3 mM, NaH2PO48 mM, K2HPO41 mM, MgCh 1 mM, CaCl21 mM), se resuspenden en 2 a 3 mL de tampón hipotónico A (Tris-hidrocloruro 10 mM [pH 7,4], MgCh 10 mM, KCl 10 mM, ditiotreitol 1 mM) y se mantienen en hielo durante 10 a 15 minutos. Se añade fluoruro de fenilmetilsulfonilo a 1 mM y las células se rompen mediante 5 a 10 carreras en un homogeneizador Dounce, maja B. Los núcleos liberados se centrifugan a 2600 rpm en una centrífuga Beckman TJ-6 durante 8 min. El sobrenadante se retira con cuidado y se almacena en glicerol al 10%-NaCl 100 mM a -70°C (fracción citoplásmica). Los núcleos se resuspenden en 2 mL de tampón A que contiene 350 mM de NaCl y se añaden los siguientes inhibidores de proteinasa: pepstatina a 0,25 ug/ml, leupeptina a 0,1 ug/ml, aprotinina a 0,1 ug/ml y fluoruro de fenilmetilsulfonilo a 1 mM (todos de Sigma Chemicals). Después de 1 h de incubación a 0°C, los núcleos extraídos se centrifugan a 70.000 rpm en un rotor Beckman TL-100/3 a 2°C. El sobrenadante transparente se ajusta a glicerol al 10%, pmercaptoetanol 10 mM y se congela inmediatamente en nitrógeno líquido antes de almacenarlo a -70°C (fracción 1 ). Para resolver los intermedios de recombinación en núcleos permeabilizados, los núcleos que contienen intermedios de heterodúplex cromosómicos se incuban con 3 a 5 pg de extracto de proteína en una mezcla de reacción que contiene NaCl 60 mM, 3-mercaptoetanol 2 mM, KCl 2 mM, Tris-hidrocloruro 12 mM (pH 7,4), ATP 1 mM, desoxirribonucleósido trifosfato (dNTP) 0,1 mM, fosfato de creatina 2,5 mM, M gC 12 mM, espermidina 0,1 mM, glicerol al 2% y ditiotreitol 0,2 mM. Después de 30 minutos a 37°C, se detiene la reacción.
Reparación de la envoltura nuclear. Preparación y fraccionamiento de extracto de reparación nuclear Los extractos de huevo de Xenopus a baja velocidad (LSS) 1 se preparan esencialmente de acuerdo con el procedimiento descrito por Blow y Laskey Cell 21; 47:577-87 (1986)). El tampón de extracción (Hepes-KOH 50 mM, pH 7,4, KCl 50 mM, MgCl25 mM) se descongela y se complementa con DTT 1 mM, 1 ug/ml de leupeptina, pepstatina A, quimostatina, aprotinina y 10 ug/ml de citocalasina B (Sigma Immunochemicals, St. Louis, MO) inmediatamente antes de su uso. Los extractos se complementan con glicerol al 2% y se someten a congelación ultrarrápida como cuentas de 10-20 ul en nitrógeno líquido o se someten a fraccionamiento adicional. El sobrenadante de alta velocidad (HSS) y la membrana fraccionada se preparan a partir de extracto de huevo a baja velocidad como se describe (Sheehan et al., J Cell Biol. 106:1-12 (1988)). El material membranoso, aislado por centrifugación de 1-2 mL de extracto de baja velocidad, se lava al menos dos veces mediante dilución en 5 mL de tampón de extracción. Las membranas diluidas se centrifugan durante 10 minutos a 10k rpm en un rotor SW50 (SW50; Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA) para producir la fracción de vesículas 1. El sobrenadante se centrifuga a continuación durante 30 minutos más a 30k rpm para producir la fracción de vesículas 2. Las membranas lavadas se complementan con glicerol al 5% y se congelan rápidamente en cuentas de 5 ul en nitrógeno líquido. Las fracciones de vesículas 1 y 2 se mezclan en proporciones iguales antes de su uso en reacciones de reparación de la membrana nuclear.
Tratamiento para reparación de la envoltura nuclear
Los núcleos permeabilizados con lisolecitina se reparan mediante incubación con componentes de membrana preparados a partir de extractos de huevo de Xenopus. Los núcleos a una concentración de aproximadamente 5000/pl se mezclan con un volumen igual de las fracciones vesiculares agrupadas 1 y 2 y se complementan con GTP y ATP 1 mM. Las reacciones de 10-20 pl se incuban a 23°C durante un máximo de 90 min con una mezcla suave ocasional. Se toman alícuotas a intervalos y se analizan para determinar la permeabilidad nuclear.
Una vez que se encapsula un gran porcentaje de cromatina en envolturas nucleares, los núcleos remodelados se pueden utilizar para la reconstitución celular utilizando cualquiera de las técnicas descritas en la presente invención.
Detección de células que contienen cromosomas modificados genéticamente
Las células reconstituidas se cultivan durante 7 a 14 días y se seleccionan en busca de recombinantes utilizando PCR e hibridación Southern.
Ejemplo 5. Modificación de cromosomas, cromatina y núcleos aislados utilizando extractos libres de células para modificar genéticamente células con material genético exógeno
En este enfoque, los vectores de diana o los oligonucleótidos y el ADN cromosómico diana se tratan directamente con extractos libres de células competentes en recombinación de células con fenotipos recombinogénicos tales como la línea de células pre-B de pollo DT40 y la línea de células linfoides humanas DG75. Estos extractos libres de células se pueden utilizar en cromosomas y cromatina aislados o en núcleos permeabilizados aislados. Esencialmente, el vector de direccionamiento/oligonucleótidos se incuban con cromosomas aislados, cromatina o núcleos y extracto de recombinación libre de células. La envoltura nuclear se reconstituye alrededor de cromosomas recombinantes o cromatina, o la envoltura nuclear de núcleos recombinantes, permeabilizados, se repara antes de la reconstitución celular con los núcleos reconstituidos o reparados.
Preparación de extractos libres de células
Los extractos libres de células de células DT40 o DG75 se preparan como se describe anteriormente.
Preparación de cromosomas, cromatina o núcleos.
Los cromosomas aislados, la cromatina y los núcleos permeabilizados de fibroblastos, líneas de células hES o líneas de células germinales son los descritos anteriormente.
Recombinación entre vectores de direccionamiento y oligonucleótidos, y cromosomas libres de células y cromatina utilizando extractos libres de células de células recombinogénicas
Los vectores de direccionamiento de ADN circular se linealizan primero mediante tratamiento con endonucleasas de restricción, o alternativamente se producen moléculas de ADN lineales mediante PCR a partir de ADN genómico o ADN de vector. Todos los vectores de direccionamiento de ADN y las construcciones de ADN tradicionales se eliminan de las secuencias de vectores mediante electroforesis en gel de agarosa y se purifican con columnas Elutip-D (Schleicher & Schuell, Keene, NH). El ADN de doble hebra (200 ng) se desnaturaliza por calor a 98°C durante 5 minutos, se enfría en hielo durante 1 minuto y se añade a aproximadamente 1-3 pg de ADN cromosómico de doble hebra o masas de cromatina, o aproximadamente 1 x 105 a 1 x 106 núcleos permeabilizados, y de 3 a 5 pg de extracto de proteína en una mezcla de reacción que contiene NaCl 60 mM, 3-mercaptoetanol 2 mM, KCl 2 mM, Tris-hidrocloruro 12 mM (pH 7,4), ATP 1 mM, desoxirribonucleósido trifosfato (dNTP) 0,1 mM, fosfato de creatina 2,5 mM, MgCl212 mM, espermidina 0,1 mM, glicerol al 2% y ditiotreitol 0,2 mM. Las mezclas de reacción se incuban a 37°C durante al menos 30 minutos y se procesan como se describe anteriormente antes de reconstituir las envolturas celulares o reparar los núcleos permeabilizados.
Reforma de envolturas nucleares alrededor de cromosomas recombinantes y cromatina
Las envolturas nucleares se reconstituyen alrededor de cromosomas recombinantes y cromatina y los núcleos reconstituidos se utilizan para la reconstitución celular como se describe anteriormente.
Reparación de envoltura nuclear
Los núcleos recombinantes permeabilizados se reparan y los núcleos recombinantes reparados se utilizan para la reconstitución celular como se describió anteriormente.
Detección de células que contienen cromosomas modificados genéticamente.
Las células reconstituidas se cultivan durante 7 a 14 días y se escrutan en busca de recombinantes utilizando PCR e hibridación Southern.
Ejemplo 6. Modificación de cromosomas y cromatina en células intactas con vectores de direccionamiento tratados con recombinasa u oligonucleótidos para modificar genéticamente células con material genético exógeno
En este enfoque, los vectores de direccionamiento de doble hebra, los fragmentos de ADN de direccionamiento u los oligonucleótidos se recubren con recombinasa bacteriana o eucariótica y se introducen en células de mamífero. El filamento de nucleoproteína activado forma compuestos intermedios de recombinación heterodúplex con el ADN diana cromosómico que posteriormente se resuelve hacia una estructura recombinante homóloga mediante la recombinación homóloga celular o las vías de reparación del ADN. Si bien la administración más directa de filamentos de nucleoproteína es mediante microinyección nuclear/pronuclear directa, se pueden utilizar otras tecnologías de administración, incluida la electroporación, la transfección química y la electroporación unicelular. Para formar filamentos de nucleoproteína Rad51 humanos, se desnaturaliza con calor ADN lineal de doble hebra (200 ng) a 98°C durante 5 minutos, se enfría en hielo durante 1 minuto y se añade a una mezcla de recubrimiento de proteína que contiene Tris-acetato 25 mM (pH 7,5), 100 ug/ml de bSa , DTT 1 mM, KCl 20 mM (añadido con la reserva de proteína), ATP 1 mM y CaCl25 mM, o Am P-PNP y MgCl25 mM. La proteína hRad51 (1 uM) se añade inmediatamente y la reacción se incuba durante 10 minutos a 37°C. El revestimiento de proteína hRad51 del ADN se controla mediante electroforesis en gel de agarosa con ADN de doble hebra sin recubrir como control. La movilidad electroforética del filamento de nucleoproteína hRad51-ADN se retrasa significativamente en comparación con el ADN de doble hebra no recubierto. Los filamentos de nucleoproteína hRad51-ADN se diluyen a una concentración de 5 ng/ul y se utilizan para la microinyección nuclear de fibroblastos humanos o células somáticas.
Detección de células que contienen cromosomas modificados genéticamente.
Las células inyectadas se cultivan durante 7 a 14 días y se escrutan en busca de recombinantes utilizando PCR e hibridación Southern.
Ejemplo 7 de referencia: Reconstitución celular
La etapa 2, también denominada "reconstitución celular" en la presente invención, se lleva a cabo utilizando núcleos o cromatina remodelados mediante cualquiera de las técnicas descritas en la presente invención, tal como en el Ejemplo 2 anterior.
Durante la reconstitución celular en este ejemplo, los núcleos remodelados se fusionan con citoplastos enucleados de células hES como se conoce en la técnica (Do & Scholer, Stem Cells 22:941-949 (2004).)). Brevemente, la línea de células ES humanas H9 se cultiva en condiciones convencionales (Klimanskaya et al., Lancet 365:4997 (1995)). El volumen citoplásmico de las células se incrementa añadiendo citocalasina B 10 pM durante 20 horas antes de la manipulación. Los citoplastos se preparan centrifugando células tripsinizadas a través de un gradiente de densidad de Ficoll utilizando una solución de partida de solución de Ficoll-400 esterilizada en autoclave al 50% (peso/volumen) en agua. La solución de partida de Ficoll 400 se diluye en DMEM y con una concentración final de 10 pm de citocalasina B. Las células se centrifugan a través de un gradiente de solución de Ficoll-400 al 30%, 25%, 22%, 18% y 15% a 36°C. En la parte superior hay una capa de 0,5 mL de solución de Ficoll-400 al 12,5% con 10x 106 células ES. Las células se centrifugan a 40.000 rpm a 36°C en un rotor MLS-50 durante 30 minutos. Los citoplastos se recogen de las regiones de gradiente del 15% y 18% marcadas en los tubos, se aclaran en PBS y se mezclan a una razón 1:1 con núcleos remodelados de la etapa uno de la presente invención o criopreservados. La fusión de los citoplastos con los núcleos se realiza utilizando polietilenglicol (véase Pontecorvo "Polyethylene Glycol (PEG) in the Production of Mammalian Somatic Cell Hybrids" Cytogenet Cell Genet. 16 (1-5):399-400 (1976), brevemente en 1 mL de polietilenglicol 1500 (Roche) al 50% precalentado durante un minuto. A continuación, se añadieron 20 mL de DMEM durante un período de cinco minutos para eliminar lentamente el polietilenglicol. Las células se centrifugaron una vez a 130 g durante cinco minutos y a continuación se recogieron en 50 pl de medio de cultivo de células ES y se colocaron debajo de una capa alimentadora de fibroblastos en condiciones para promover el crecimiento de una colonia de células ES.
Ejemplo 8 de referencia: Reconstitución celular
La etapa 2, también denominada "reconstitución celular" en la presente invención también se lleva a cabo utilizando núcleos remodelados mediante cualquiera de las técnicas descritas en la presente invención, en este ejemplo como en el Ejemplo 2 anterior y la etapa de reconstitución celular que sigue. Los núcleos se fusionan con ampollas citoplásmicas anucleadas de células hES como es bien conocido en la técnica (Wright y Hayflick, Exp. Cell Res.
96:113-121, (1975); & Wright y Hayflick, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 72:1812-1816, (1975). Brevemente, el volumen citoplasmático de las células hES aumenta añadiendo citocalasina B 10 pM durante 20 horas antes de la manipulación. Las células se tripsinizan y se vuelven a sembrar en cubreobjetos estériles de 18 mm recubiertos con matriz extracelular del alimentador de fibroblastos embrionarios de ratón como se describe (Klimanskaya et al., Lancet 365:4997 (2005). Las células se siembran en placa a una densidad tal que después de una incubación durante la noche a 37°C y un lavado suave con medio, las células cubren aproximadamente 90% de la superficie del cubreobjetos. A continuación, los cubreobjetos se colocan boca abajo en un tubo de centrífuga que contiene 8 mL de solución de Ficoll-400 al 10% y se centrifugan a 20.000 g a 36°C durante 60 minutos. Los núcleos remodelados resultantes de la etapa uno de la presente invención, se extienden a continuación sobre el cubreobjetos con una densidad de al menos la de los citoplastos, preferiblemente al menos cinco veces la densidad de los citoplastos. La fusión de los citoplastos con los núcleos se realiza utilizando polietilenglicol (véase Pontecorvo "Polyethylene Glycol (PEG) in the Production of Mammalian Somatic Cell Hybrids" Cytogenet Cell Genet. 16 (1-5):399-400 (1976). Brevemente, en 1 mL de polietilenglicol al 50% precalentado 1500 (Roche) en medio de cultivo se coloca sobre el cubreobjetos durante un minuto. A continuación, se añaden gota a gota 20 mL de medio de cultivo durante un período de cinco minutos para eliminar lentamente el polietilenglicol. A continuación, todo el medio se aspira y se reemplaza con medio de cultivo.
Ejemplo 9: Análisis de los mecanismos moleculares de la reprogramación
La remodelación in vitro del ADN derivado de células somáticas como se describe en el ejemplo 2 de la presente invención se utiliza como modelo de reprogramación de una célula somática y un ensayo útil para analizar los mecanismos moleculares de reprogramación. Se sigue el protocolo del ejemplo 2 hasta el momento inmediatamente anterior al que se añaden extractos de células mitóticas NTera2. Antes de la adición de extracto de células mitóticas NTera2, se añade proteína lamina A purificada de fibroblastos de piel humana en cantidades correspondientes a 10" 6, 10"4, 10"3, 10"2, 10"1, 1X y 10X la concentración en el extracto de células mitóticas de fibroblastos humanos. La lamina A reduce el grado de reprogramación satisfactoria después de la reconstitución celular de la etapa 2, y el uso de este sistema de ensayo determina el grado de interferencia de la lamina A en la reprogramación exitosa.
Ejemplo 10: Factores de Reprogramación
La frecuencia de obtención de células reprogramadas se puede mejorar aumentando la expresión de factores celulares no diferenciados en las células no diferenciadas o extractos celulares de las etapas 1 y 2 de la presente invención. Estos factores pueden introducirse en los extractos de la etapa 1, o en los citoplastos enucleados de la etapa 2 utilizando mecanismos bien conocidos en la técnica y descritos en la presente memoria. La concentración final de dicho factor debería ser al menos la concentración observada en cultivos de células ES humanas cultivadas en condiciones convencionales, o preferiblemente una concentración de 2 a 50 veces mayor que la observada en dichos cultivos de células ES convencionales. La Tabla 1 proporciona una lista de factores celulares no diferenciados ilustrativos. La tabla proporciona los nombres y nombres de acceso de los genes humanos; sin embargo, también se pueden utilizar homólogos encontrados en otras especies:
Tabla 1
Nombre del gen Número de acceso
BARX1 NM_021570.2
CROC4 NM_006365.1
DNMT3B NM_175849.1
H2AFX NM_002105.1
HHEX NM_002729.2
HIST1H2AB NM_003513.2
HIST1H4J NM_021968.3
HMGB2 NM_ 002129.2
hsa-miR-18a M10000072
hsa-miR-18b M10001518
hsa-miR-20b M10001519
hsa-miR-96 M10000098
hsa-miR-106a M10000113
hsa-miR-107 M10000114
(continuación)
Nombre del gen Número de acceso hsa-miR-141 M10000457
hsa-miR-183 M10000273
hsa-miR-187 M10000274
hsa-miR-203 M10000283
hsa-miR-211 M10000287
hsa-miR-217 M10000293
hsa-miR-218-1 M10000294
hsa-miR-218-2 M10000295
hsa-miR-302a M10000738
hsa-miR-302c M10000773
hsa-miR-302d M10000774
hsa-miR-330 M10000803
hsa-miR-363 M10000764
hsa-miR-367 M10000775
hsa-miR-371 M10000779
hsa-miR-372 M10000780
hsa-miR-373 M10000781
hsa-miR-496 M10003136
hsa-miR-508 M10003195
hsa-miR-512-3p
hsa-miR-512-5p
hsa-miR-515-3p
hsa-miR-515-5p
hsa-miR-516-5p
hsa-miR-517
hsa-miR-517a M10003161
hsa-miR-518b M10003156
hsa-miR-518c M10003159
hsa-miR-518e M10003169
hsa-miR-519e M10003145
hsa-miR-520a M10003149
hsa-miR-520b M10003155
hsa-miR-520e M10003143
hsa-miR-520g M10003166
hsa-miR-520h M10003175
hsa-miR-523 M10003153
hsa-miR-524 M10003160
hsa-miR-525 M10003152
hsa-miR-526a-1 M10003157
hsa-miR-526a-2 M10003168
LEFTB NM_020997.2
LHX1 NM_005568.2
LHX6 NM_014368.2
LIN28 NM_024674.3 MYBL2 NM_002466.2
MYC NM_002467.2
MYCN NM_005378.3 NANOG NM_024865.1
NFIX NM_002501.1 OCT3/4 NM_002701.2 (POU5F1)
OCT6 (POU3F1) NM_002699.2
OTX2 NM_172337.1
PHC1 NM_004426.1
SALL4 NM_020436.2
SOX2 NM_003106.2 TERF1 NM_003218.2
TERT NM_198254.1
TGIF NM_003244.2 (continuación)
Nombre del gen Número de acceso
VENTX2 NM_014468.2
ZIC2 NM_007129.2
ZIC3 NM_003413.2
ZIC5 NM_033132.2
ZNF206 NM_032805.1
Los métodos para expresar proteínas o ARN regulador que aumenta la expresión de estas proteínas dentro de las células o los medios para introducir estos factores en extractos celulares son bien conocidos en la técnica e incluyen una variedad de mecanismos que incluyen, sin limitación:
Infección viral para la expresión estable y transitoria de proteínas y ARN reguladores, incluyendo tales virus, sin limitación: papiloma bovino lentivirus y otros virus del papiloma, adenovirus y virus adenoasociados. Además, los genes o a Rn se pueden introducir mediante transfección para la expresión transitoria y estable de proteínas y ARN reguladores mediante el uso de vectores plásmidos, cromosomas artificiales de mamíferos BACS/PACS, la adición directa de las proteínas codificadas en los genes enumerados, los miARN o ARNm enumerados, utilizando endocitosis mediada por precipitado de CaPO4, dendrímeros, lípidos, electroporación, microinyección, recombinación homóloga para modificar el gen o su promotores o potenciadores, transferencia de genes mediada por cromosomas, fusión celular, fusión de microcélulas o la adición de extractos celulares que contienen dichos factores útiles, todas estos mecanismos son bien conocidos en la técnica y los protocolos para llevar a cabo dichos mecanismos para administrar dichos factores son fácilmente disponibles para los investigadores en la bibliografía y en Internet.
Ejemplo 11: Diferenciación de células beta por inducción de células reprogramadas sin la generación de líneas de células ES
Las células nucleadas de sangre periférica se obtienen a partir de un paciente que necesita células beta pancreáticas. Las células se purifican utilizando citometría de flujo para obtener monocitos utilizando mecanismos bien conocidos en la técnica. Los núcleos de los monocitos se preparan a continuación colocando las células en tampón hipotónico y homogeneizando las células como se describe en la técnica. Los núcleos de monocitos aislados del paciente se exponen a continuación a un extracto mitótico de la línea celular EC humana Tera-2 y se incuban mientras se controlan las muestras del extracto para observar la ruptura de la envoltura nuclear y la posterior reformación de la envoltura nuclear como se describe en la presente memoria. Los núcleos celulares reprogramados resultantes se fusionan a continuación con citoplastos de células EC de la línea celular EC Tera-2 que se han transfectado con plásmidos para expresar en exceso los genes OCT4, SOX2 y NANOG como se describe en la presente memoria. Las células reconstituidas resultantes en una mezcla heterogénea de células reprogramadas y no reprogramadas se permeabilizan y exponen a extractos de células beta aisladas de páncreas bovino como se describe en la presente memoria y a continuación se diferencian directamente en linajes endodérmicos sin la producción de una línea de células ES. A continuación, se añade un millón de la mezcla heterogénea de células a las células alimentadoras inactivadas mitóticamente que expresan niveles altos de NODAL o líneas celulares que expresan miembros de la familia TGF beta que activan el mismo receptor que NODAL, tales como las células CM02 que expresan niveles relativamente altos de Activina-A, pero niveles bajos de Inhibinas o folistatina. A continuación, las células se incuban durante un período de cinco días en medio DMEM con suero humano al 0,5%. Después de cinco días, las células resultantes que incluyen células endodérmicas definitivas se purifican mediante citometría de flujo u otras técnicas de separación celular basadas en afinidad, tales como la clasificación con cuentas magnéticas utilizando anticuerpos específicos del receptor CXCR4 y a continuación se clonan utilizando técnicas descritas en las solicitudes de patente pendientes PCT/US2006/013573 presentada el 11 de abril de 2006; y la Solicitud de Estados Unidos Núm. 60/811.908, presentada el 7 de junio de 2006.
A continuación, estas células se diferencian directamente hacia células beta pancreáticas o precursores de células beta utilizando mecanismos conocidos en la técnica para diferenciar dichas células de líneas de células madre embrionarias humanas o cultivando las células en líneas celulares mesodérmicas de células inductoras como se describe en el documento PCT/US2006/013573 presentado el 11 de abril de 2006 y la Solicitud de Estados Unidos Núm. 60/811.908 presentada el 7 de junio de 2006.
Se prevé que los métodos mejorados descritos para la reprogramación de células somáticas animales sean generalmente útiles en la terapia de células de mamíferos y seres humanos, tales como células humanas útiles en el tratamiento de trastornos dermatológicos, cardiovasculares, neurológicos, endocrinológicos, esqueléticos y de células sanguíneas.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un método para reprogramar una célula somática diferenciada animal en una célula madre pluripotente no diferenciada, que comprende las etapas de:
(a) aislar el núcleo, el ADN o la cromatina de dicha célula somática diferenciada y encapsular in vitro dichos núcleo, ADN o cromatina en una nueva envoltura nuclear utilizando un extracto sin células de células no diferenciadas para formar un núcleo remodelado, en donde el extracto sin células es capaz de formar envolturas nucleares alrededor de ADN denudo o cromatina, en donde el extracto sin células es un extracto de células madre embrionarias, un extracto de células germinales embrionarias, un extracto de células de carcinoma embrionario o un extracto de ovocitos; y
(b) transferir o fusionar el núcleo remodelado resultante de la etapa (a) al citoplasma enucleado de una célula embrionaria no diferenciada selecciona de una célula madre embrionaria, una célula germinal embrionaria o una célula de carcinoma embrionario para formar una célula madre pluripotente no diferenciada y permitir que crezca la célula madre pluripotente no diferenciada resultante.
2. Un método según la reivindicación 1, caracterizado por que la célula embrionaria no diferenciada de la etapa (b) se selecciona de una célula madre embrionaria y una célula de carcinoma embrionario.
3. El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado por que la especie de la que se origina la célula somática diferenciada y la especie de la que se origina el extracto sin células de la etapa (a) son diferentes.
4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el extracto sin células de la etapa (a) es de células de carcinoma embrionario, preferiblemente de células de carcinoma embrionario humano.
5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el extracto sin células de la etapa (a) es un extracto de células madre embrionarias, un extracto de células germinales embrionarias o un extracto de células de carcinoma embrionario.
6. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende adicionalmente incrementar el nivel de uno o más factores en uno o ambos de los extractos de la etapa (a) y el citoplasma enucleado de la etapa (b), en donde el uno o más factores están codificados por genes seleccionados del grupo que consiste en los siguientes genes humanos o sus homólogos no humanos: CROC4, DNMT3B, H2AFX, HIST1H2AB, HIST1H4J, HMGB2, LEFTB, LIN28, MYBL2, MYC, MYCN, NANOG, OCT3/4 (POU5F1), OTX2, SALL4, SOX2, TERF1, TERT, ZNF206.
7. El método de según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el métofo comprende adicionalmente una etapa en donde el genoma de las células somáticas diferenciadas se modifica mediante recombinación homóloga, en donde la ecombinación homóloga comprende la adición de una o más construcciones de direccionamiento de ADN y de una preparacion de proteína o de extracto adecuada para la recombinación homóloga.
8. El método según la reivindicación 7, en donde dicha preparación de proteína o de extraco adecuada para la recombinación homóloga es un extracto de la línea de células pre-B de pollo DT40 y de la línea celular linfoide humana DG75.
9. El método según una cualquiera de de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha célula somática diferenciada animal es una célula humana.
10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente las etapas de:
(c) analizar el cariotipo de las células madre pluripotentes no diferenciadas resultantes de la etapa (b), y analizar el patrón de expresión génica de dichas células madre no diferenciadas resultantes para determinar si dichas células madre pluripotentes no diferenciadas resultantes muestran un patrón de expresión génica esperado de las células madre embrionarias células; y
(d) si dichas células resultantes no muestran un patrón de expresión génica que se espera de las células madre embrionarias, repetir las etapas (a) a (c) una o más veces hasta que el patrón de expresión génica de las células resultantes de la etapa (b) muestre un patrón de expresión génica que sea el patrón esperado de las células madre embrionarias.
11. El método según la reivindicación 6, caracterizado por que la concentración final del uno o más factores es al menos la concentración observada en las células ES humanas cultivadas en condiciones convencionales, o la concentración final de dichos uno o más factores es de 5 a 50 veces mayor que la concentración observada en las células ES humanas cultivadas en condiciones convencionales.
12. El método según la reivindicación 6 o la reivindicación 11, en donde se mejora la frecuencia de obtención de células madre pluripotentes.
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