KR100715366B1

KR100715366B1 - 세포 배양방법

Info

Publication number: KR100715366B1
Application number: KR1020050130529A
Authority: KR
Inventors: 김창현
Original assignee: 김창현; 변호산
Priority date: 2004-12-27
Filing date: 2005-12-27
Publication date: 2007-05-07
Also published as: KR20060074893A

Abstract

본 발명은 미세전류(micro-current) 또는 음이온(negative ion)을 이용한 체세포 복제 수정란의 체외배양방법 및 배아줄기세포의 배양방법을 제공한다.

본 발명의 체세포 복제 수정란의 체외배양방법은 단일세포로 분리된 공여핵 체세포 및 체세포 복제 수정란을 미세전류 또는 음이온 처리하는 단계를 포함하며, 이는 체세포 복제 수정란의 배반포로의 발달율을 향상시키는 작용효과를 나타낸다.

또한, 본 발명의 배아줄기세포 배양방법은 내세포괴가 이식된 세포 배양시 미세전류 또는 음이온을 처리하는 단계를 포함하며, 배아줄기세포의 확립 및 증식효율을 향상시키는 작용효과를 나타낸다.

이러한 본 발명의 배양방법은 체세포 복제 동물의 생산효율을 향상시키고, 다양한 세포로 분화할 수 있는 배아줄기세포를 다량으로 수득할 수 있어 체세포 복제동물 생산 및 배아줄기세포를 이용한 치료 및 연구 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세포 배양방법{Cell culture method}

도 1은 일반적인 전기석의 이온분포와 전기장 형성을 나타낸 도이다.

도 2,도 3은 하나의 전기석을 이용한 세포배양 실시예를 나타낸 도이다.

도 4는 도 2, 도 3의 실시예에 의한 세포배양 형태 사진이다.

도 5, 도 6은 두 개의 전기석을 이용한 세포배양 실시예를 나타낸 도이다.

도 7은 전기석에 의한 전기장 형성 및 이의 세포배양 실시예를 나타낸 도이다.

도 8은 도 7의 실시예에 의한 세포배양 형태 사진이다.

도 9는 본 발명의 실시예에 의한 만들어진 복제동물 배반포 사진이다.

도 10은 본 발명의 실시예에 의해 만들어진 배아줄기세포 사진이다.

도 11은 본 발명의 미세전류 통전 장치의 사시도이다.

도 12는 본 발명의 미세전류 통전 장치의 정면도이다.

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

10:배양접시 20:전기석 20':전기석 분말

30:배양드롭 40:미네럴오일

55:전자 60: 전기선

70:배양액 80: 이중금속 82: 백금 85:은

87:연결선 89:부도체

90:배양판 94:배양면

본 발명은 체세포 복제 수정란의 체외배양방법 및 배아줄기세포 배양방법에 관한 것이다.

최근 생명공학 또는 유전자 조작 기술의 발달에 따라 체세포 복제동물 생산 및 배아줄기세포배양에 성공하는 사례들이 보고되고 있다.

일반적으로, 체세포핵을 이식한 수정란 제작 및 이로부터 생산된 복제동물/배아줄기세포(embryonic stem cell) 제작은 아래와 같은 과정으로 진행된다.

1) 수핵난자의 준비, 2) 체세포의 휴지기(G0)로의 유도를 통한 공여핵의 준비, 2) 수핵난자에서 난구세포 제거, 3) 수핵난자의 투명대 절개, 4) 수핵난자에서의 탈핵, 5) 공여핵을 수핵난자 내 이식하여 체세포 복제 수정란 제작, 6) 전기자극 등을 이용한 체세포 복제 수정란의 세포융합, 7) 전기자극 또는 칼슘이온운반체+단백질합성억제제 병행처리를 통한 체세포 복제 수정란 세포질 활성화, 8) 체세포 복제 수정란의 체외배양, 9-1) 대리모에의 이식 및 산자생산 또는 9-2) 체외 배양 후 배아줄기세포 배양.

상기 과정에서 이식된 공여핵이 수핵난자의 세포질과 조화롭게 융합하고 활성화되어, 리프로그래밍(reprogramming)이라고 하는 일반적인 수정란에서 나타나는 분할 및 이후의 발생과정이 정상적으로 진행되는 것이 중요하다. 리프로그래밍이 순조롭게 이루어진 체세포 복제 수정란의 경우 배반포기(blastocyst)까지 체외에서 배양하며, 이후 대리모 이식을 통하여 개체로 발생시키거나, 배반포에서 내세포괴(inner cell mass, ICM)를 분리하여 배아줄기세포를 배양하게 된다.

따라서, 체세포 복제 수정란의 정상적인 리프로그래밍을 유도하기 위해서, 즉 체세포 복제 수정란의 배발생의 기준 지표인 배반포 발달율을 증가시키기 위해서 많은 연구가 진행되고 있다.

한국공개특허공보 제10-2004-60348호는, 체세포 복제 수정란의 체외배양시 배양액에 항산화제 및 산화질소 제거자를 함유시킴으로써 체세포 복제 수정란의 배발달 단계에서 배아 할구의 아폽토시스 발생을 효과적으로 저하시켜 배반포 발달율을 효과적으로 향상시키는 효과를 나타냄을 개시하고 있다.

한국공개특허공보 제2005-81524호는 양수세포를 인간배아 줄기세포 배양을 위한 영양세포층으로 이용하는 방법과, 양수세포를 배양한 후 수거한 배양액을 인간배아 줄기세포의 배양액으로 이용하는 방법을 개시하고 있다. 이러한 방법으로 배양된 인간배아줄기세포는 미분화 세포의 세포학적, 면역학적, 유전학적 특징을 유지하고, 분화 조건에서 배아체를 잘 형성하여, 다양한 조직으로 분화되는 능력을 지니는 것으로 기재되어 있다.

그러나, 현재까지 배반포 발달율을 효과적으로 향상시키는 기술이 확립되어 있지 않으며, 이에 대한 체세포 복제 수정란 체외 배양의 최적의 조건 및 배아줄기세포 배양기술의 개발이 요구되고 있다.

한편, 미세한 전류 즉 ㎂단위의 작은 전류가 높은 세기의 전류보다 치료에 더욱 높은 효과가 있다는 것이 여러 학자에 의해 밝혀졌다. 미세전류 자극에 대한 세포내 효과에 대해서, Bourguignon과 Bourguignon (1987)은 고전압맥동전류 (EGS 100-2)의 맥동빈도와 정점강도를 다양하게 바꾸어 섬유모세포를 자극하고 단백합성능과 DNA 합성능을 분석한 결과, 맥동빈도 100 pps, 정점강도 250 V에서는 단백합성능과 DNA 합성능이 억제되었으나 정점강도 50V와 75V에서 단백합성능과 DNA합성능이 증가함을 보고한 바 있다. 또한, Bourguignon 등 (1989)은 위와 같은 조건으로 사람의 섬유모세포에 전기자극을 가한 결과 섬유모세포의 원형질막에서 Ca++ 통로가 열려 세포내 Ca++이 증가되고 인슐린수용체결합이 상승되어 단백 및 DNA합성이 증가됨에 따라 치주조직의 치유가 촉진된다고 보고하였다. 미국의 정형외과 의사인 로버트 베커는 뼈의 재생실험에서, 쳉은 생쥐 피부의 ATP 생산 실험에서, 스필홀츠는 동물의 건(tendon) 치료에서 각각 약한 전류가 큰 세기의 전류보다 효과적이라는 사실을 증명하였다. 즉 각 생물체에 흐르는 전류의 세기가 가장 좋은 효과를 내는 것이다.

또한, 맥동자기장 등 다양한 형태의 미세전류자극이 말초신경손상, 척수손상의 치유를 촉진시킨다고 알려져 있으며, 전기자극에 의한 신경재생 촉진 기전은 명확하게 밝혀지지 않았지만 미세전류가 세포의 Ca++ 및 cAMP를 변화시키고 콜라겐, 프로테오글리칸(proteoglycan), DNA 및 RNA의 합성능을 증가시키며 이외에도 효소와 호르몬에 영향을 주어 신경재생이 촉진될 것이라고 보고 있다.

이렇게 미세전류에 의해 세포 및 조직의 생리기전이 변화될 수 있음이 알려 져 있으며, 치료촉진은 매우 일반적인 사항으로 알려져 있으나, 임상에서 보이는 치료에 대한 기전은 명확히 밝혀져 있지 않다.

한편, 전기석(tourmaline)은 토르말린이라고도 하며 육방정계에 속하는 광물이다. 화학성분은 철 ·마그네슘 ·알칼리금속 등과 알루미늄의 복잡한 붕규산염이다. 이 전기석은 마찰에 의해서 전기가 생기며, 가열하면 양끝이 양 ·음으로 대전(帶電)하고, 약 100도로 가열하면 먼지를 끌어들이는 초전기성(Pyroelectricity)을 보여, '전기석'이란 이름이 붙여졌다. 철전기석, 마그네슘전기석, 알칼리전기석 등으로 분류되고, 알칼리 전기석으로는 홍전기석(루벨라이트), 남전기석(인디고라이트), 녹전기석(벨데라이트 또는 브라질에메랄드)이 포함된다.

전기석을 0.1㎛ 정도까지 미립자화 하면 결정 양단에 정극과 부극이 생기고 이를 소위 영구전극이라 하는데, 수십 ㎂와 거의 같은 레벨의 미세전류를 흘리는 작용을 한다. 그리고, 이들의 작용은 외부로부터 에너지를 공급하지 않아도 영구적으로 계속되는데, 여기에 온도변화나 진동, 마찰을 주게 되면 평상시보다 두 배 이상의 전자를 발생하여 이것이 대기 중의 산소와 결합하여 음이온화한다. 이러한 음이온은 세포기능을 활성화하며, 활성산소의 과잉발생을 억제해 몸이 산성화되는 것을 막고, 혈액순환 촉진, 면역기능과 혈액정화, 자율신경안정 기능이 있어 인체의 신진대사를 촉진시킨다고 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 배반포 발달율을 향상시킬 수 있고, 배아줄기세포 증식율을 높일 수 있는 방법을 개발하고자 꾸준히 연구한 결과, 공여핵 체세포의 체외 배양시 또는 체세포 복제 수정란의 체외배양시 또는 내세포괴에서 배아줄기세포 배양시 미세전류 또는 음이온을 공급함으로써 체세포 복제 수정란의 배반포 발달율 및 배아줄기세포 증식율이 향상됨을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 미세전류(micro-current) 또는 음이온(negative ion)을 이용한 체세포 복제 수정란의 체외세포배양방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 미세전류 또는 음이온을 이용한 배아줄기세포 배양방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 미세전류(micro-current) 또는 음이온(negative ion)을 이용한 체세포 복제 수정란의 체외배양방법을 제공한다.

1) 체세포를 배양한 후 단일세포로 분리하여 공여핵 체세포를 준비하는 단계, 2) 공여핵 체세포를 미세전류 처리 및 음이온 처리 중 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 처리하는 단계, 3) 채취한 난자를 체외성숙시키는 단계, 4) 체외성숙난자에서 난구세포를 제거하는 단계, 5) 상기 4)단계의 난자에서 탈핵시켜 수핵난자를 준비하는 단계, 6) 수핵난자에 공여핵을 이식하여 공여핵 이식란을 제조하는 단계, 7) 공여핵 이식란을 세포융합하여 체세포 복제 수정란을 제조하는 단계, 8) 체세포 복제 수정란을 미세전류 처리 및 음이온 처리 중 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 처리하면서 활성화시키는 단계 및 9) 체세포 복제 수정란을 체외배양하는 단계로 이루어진다.

본 발명에서 사용된 '체세포'는 생식세포 이외의 세포를 의미한다.

본 발명의 '공여핵 체세포'는 체세포의 핵 이식시 수핵난자로 핵 내 유전물질을 제공하는 세포를 의미한다.

본 발명의 '수핵난자'는 체세포의 핵 이식시 공여핵 체세포로부터 핵을 이식받는 난자로서, 공여핵 체세포의 핵 이식을 위하여 난자 내 핵이 제거되고 세포질을 제공하는 난자를 의미한다.

본 발명의 '체세포 복제 수정란'은 체세포의 공여핵을 핵이 제거된 수핵난자에 주입한 후, 물리적 또는 화학적 방법에 의하여 핵과 세포질이 융합된 난자를 의미한다.

본 발명의 '체세포'는 동물세포로, 어류, 양서류, 조류 및 포유동물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 포유동물, 예컨대, 인간을 포함한 영장류, 소, 돼지, 곰, 고양이, 개, 말 및 설치류 등의 체세포이고, 가장 바람직하게는 소 또는 인간의 체세포이다.

본 발명에서 '미세전류 처리'는 nA 또는 ㎂ 단위의 미세전류를 처리하는 것을 의미한다. 본 발명에서 미세전류는 전기적 특징을 갖는 전기석 또는 은-백금 결합체인 이중금속(bimetallic device)을 둘 이상 사용하여 직렬 또는 병렬로 배열, 연결함으로써 발생시킨다.

본 발명에서는 전극으로 은 및 백금으로 이루어진 전지를 사용하는 것이 바 람직하며, 더욱 바람직하게는 은-백금 결합체인 이중금속을 사용하고, 각 단계의 배양액이 전해질로서 작용한다.

본 발명의 세포 배양시, 세포는 상기 전기석과 전기석 사이 또는 둘 이상의 은-백금 결합체인 이중금속 사이에서 배양됨으로써 그 사이에서 흐르는 미세전류의 영향을 받게 된다.

또한, 미세전류를 통전하는 전극을 다수의 병렬 또는 직렬로 연결함으로써, 배양접시 크기에 따라 배양액 내 원하는 미세전류 값을 조정할 수 있다.

먼저, 전기석에 의한 미세전류의 처리방법에 대하여 자세히 설명한다.

본 발명의 체세포 복제 수정란의 체외배양방법의 상기 2)단계에서는, 단일세포로 분리된 공여핵 체세포를 배양할 때 전기석이 배열된 배양접시 내에서 5분 내지 15분 동안 정치시켜 미세전류를 공급하여 배양한 후에 공여핵 원으로 사용하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 10분 동안 처리한다.

또한, 본 발명의 체세포 복제 수정란의 체외배양방법의 상기 8)단계에서는, 상기 8)단계에서 체세포 복제 수정란을 활성화시킬 때, 전기석이 배열된 배양접시 내에서 3분 내지 10분 동안 미세전류를 처리하면서 화학적 활성화를 동시에 실시시키는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 4~5분 동안 처리한다.

도 5, 도 6 및 도 7은 본 발명의 체세포 복제 수정란의 체외배양시 전기석의 배열의 바람직한 실시예로, 두 개의 전기석을 사용한 것이다.

두 개의 전기석을 사용하는 경우, 이들 사이에 음이온인 전자의 흐름이 생겨 약 0.06 mA의 미세전류가 발생되고 전기장이 형성되게 된다.

도 5에서는, 전기석(20)은 배양접시(10) 상측 및 하측에 위치한다.

배양접시(10) 하측에 위치한 전기석(20)의 상측이 음극(- 극)으로 배열되어, 음이온인 전자(55)가 배양접시 쪽으로 방출되고, 이 전자(55)를 배양접시(10) 상측에 위치한 전기석(20)의 하측인 양극(+ 극)이 받게 된다. 이때 전자가 방출되면서 전자(음이온)의 흐름이 발생되어 미세전류 및 전기장이 형성되고, 배양드롭(30) 내의 세포가 음이온, 미세전류 및 전기장의 영향을 받게 된다.

도 6에서는, 전기석(20)은 배양접시(10) 상측 및 하측에 위치한다.

배양접시(10) 하측에 위치한 전기석(20)의 상측이 양극(+ 극)으로 배열되어, 음이온인 전자(55)가 전기석 쪽으로 방출되고, 이 전자(55)를 배양접시(10) 하측에 위치한 전기석(20)의 상측인 양극(+ 극)이 받게 된다. 이때 전자(음이온)의 흐름이 발생되어 미세전류 및 전기장이 형성되고, 배양드롭(30) 내의 세포가 음이온, 미세전류 및 전기장의 영향을 받게 된다.

도 7에서는, 전기석(20)은 배양접시(10)의 양측 옆면에 위치한다.

배양접시(10)에 접하고 있는 전기석(20)의 면이 음극(- 극)인 전기석에서 음이온인 전자(55)가 방출되어 다른 전기석의 양극(+ 극)으로 들어가게 된다. 이때 전자(음이온)의 흐름이 발생되어 미세전류 및 전기장이 형성되고, 배양액(70) 내의 세포가 음이온, 미세전류 및 전기장의 영향을 받게 된다.

상기 전기석(20)은 배양접시(10)의 상측 또는 하측 또는 좌우면에서 상하좌우로 위치를 변화시켜 음이온, 미세전류 및 전기장의 강도를 조절할 수 있다.

또한, 은-백금 결합체인 이중금속을 사용한 미세전류 처리방법에 대하여 자세히 설명한다.

본 발명에서 은-백금 결합체인 이중금속을 사용한 미세전류 처리는 두 개 금속의 전위차로 전기가 흐르는 갈바니 전지(galvanic cell)의 원리를 이용한다. 갈바니 전지는 여러 종류의 다른 전도체가 직렬로 연결되어 있고, 그 중 적어도 1개는 전해질(電解質) 또는 그 용액으로 되어 있으며, 양단(兩端)의 화학적 조성이 같은 계(系)로 된 전지이다. M을 다른 종류의 금속, S를 다른 종류의 전해질 용액으로 하면, 예를 들면 M1|S1|M2|M1과 같은 것이다. 갈바니 전지의 단자(端子)를 단락(短絡)하거나 단자 사이에 적당한 외부저항을 접속하면, 전지계에 전류가 흘러 전기반응이 일어나게 된다(두산세계대백과사전).

갈바니 전지 전극의 종류는 다양하며, 금, 백금, 은, 수은, 구리, 납, 주석, 니켈, 철, 아연, 알루미늄, 마그네슘, 나트륨, 칼슘, 칼륨 등에서 2개를 선택하여 사용할 수 있고, 선택된 금속 중 이온화 경향이 상대적으로 작은 것이 환원전극이 되며, 이온화경향이 상대적으로 큰 것이 산화전극이 된다. 전극을 이루는 금속의 종류에 따라 그 미세전류의 값에도 차이가 난다.

본 발명의 체세포 복제 수정란의 체외배양방법의 상기 2)단계에서, 단일세포로 분리된 공여핵 체세포를 배양할 때, 은-백금 결합체인 이중금속 사이에서 배양하여 미세전류를 5분 내지 15분 동안 처리하면서 배양한 후에 공여핵 원으로 사용 하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 10분 동안 처리한다.

또는, 본 발명의 체세포 복제 수정란의 체외배양방법의 상기 8)단계에서, 체세포 복제 수정란을 활성화시킬 때 은-백금 결합체인 이중금속 사이에서 미세전류를 3분 내지 10분 동안 처리하면서 화학적 활성화를 동시에 실시하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 4~5분 동안 처리한다.

도 11 및 도 12는 본 발명의 체세포 복제 수정란의 체외배양시 은-백금 결합체인 이중금속을 이용한 미세전류 통전 장치를 이용한 바람직한 실시예이다.

유리 또는 플라스틱인 배양판(90) 상에 은(85)-백금(82) 결합체인 이중금속(80, 80') 두 개를 나란히 설치 및 고정한다. 각 이중금속 전극 사이 간격에 따라 미세전류 값이 차이가 생기며, 본 발명에서 간격은 0.5~3mm이며, 1mm 의 간격이 바람직하다.

여기에 이중금속의 수직 방향으로 이중금속 사이에 부도체(89)를 양 끝에 설치한다. 이로써 생기는 공간은 배양면(94)으로, 배양액을 넣어 공여핵 체세포 및 체세포 복제수정란 등의 미세전류를 처리하는 공간이다. 배양판에 두 개의 이중금속 및 부도체를 고정시켜 배양면(94)에 배양액을 채워 넣었을 때 새거나 흘러나오지 않도록 한다.

하나의 이중금속(80)의 한쪽 말단에서 백금(82) 부분 및 다른 이중금속(80')의 은(85)부분을 연결선(87)으로 연결한다. 이 실시예에서 은은 산화전극이고, 백금은 환원전극이 된다.

상기와 같은 미세전류 통전 장치에 배양액을 배양면에 채우면 갈바니 전지 원리에 따라 미세전류가 흐르며, 전극 사이의 배양액의 저항이 3.9 Mohm일 때 23.6 nA의 미세전류가 흐른다.

본 발명에서 '음이온 처리'는, 체세포 복제 수정란 배양시 배양접시 주위에 음이온을 방출하는 물질을 하나 이상 배열함으로써 음이온이 흐르도록 하는 것을 의미하며, 음이온의 흐름에 의해 전기장(electric field)이 형성되게 된다. 본 발명의 음이온 처리는 음이온을 방출하는 전기석(tourmaline)을 이용하는 것이 바람직하다. 전기석은 결정 자체를 사용할 수도 있고, 분말화하여 사용할 수도 있으며, 세포를 배양하는 배양접시 크기에 따라 세포에 작용하는 음이온 공급을 위하여 전기석이 다수의 병렬 또는 직렬로 연결될 수 있다.

본 발명의 전기석에 의한 음이온의 처리방법에 대하여 자세히 설명한다.

본 발명의 체세포 복제 수정란의 체외배양방법의 상기 2)단계에서는, 단일세포로 분리된 공여핵 체세포를 배양할 때 전기석이 배열된 배양접시 내에서 5분 내지 15분 동안 정치시켜 음이온을 공급하여 배양한 후에 공여핵 원으로 사용하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 10분 동안 처리한다.

또한, 본 발명의 체세포 복제 수정란의 체외배양방법의 상기 8)단계에서는, 상기 8)단계에서 체세포 복제 수정란을 활성화시킬 때, 전기석이 배열된 배양접시 내에서 3분 내지 10분 동안 음이온을 처리하면서 화학적 활성화를 동시에 실시시키는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 4~5분 동안 처리한다.

도 2, 도 3은 본 발명의 체세포 복제 수정란의 체외배양시 전기석의 배열의 바람직한 실시예로, 하나의 전기석을 사용한 예이다.

도 2에서는, 전기석(20)은 배양접시(10) 하측에 위치하며, 배양접시(10)를 향한 전기석(20)의 상측이 음극(- 극)으로 배열되어, 음이온인 전자(55)가 배양접시 쪽으로 방출되면서 전자(음이온)의 흐름이 발생되어 전기장(electric field)이 형성되고, 배양드롭(30) 내의 세포가 음이온 및 전기장의 영향을 받게 된다.

도 3에서는, 전기석(20)은 배양접시(10) 하측에 위치하며, 배양접시(10)를 향한 전기석(20)의 상측이 양극(+ 극)으로 배열되어, 음이온인 전자(55)가 전기석 쪽으로 방출되면서 전자(음이온)의 흐름이 발생되어 전기장이 형성되고, 배양드롭(30) 내의 세포가 음이온 및 전기장의 영향을 받게 된다.

또한, 본 발명의 체세포 복제 수정란의 체외배양방법의 상기 9)단계에서 체세포 복제 수정란은 체외배양되어 2세포기, 4세포기, 8세포기, 16세포기를 지나 배반포 상태로 발달되며, 이 단계에서도 본 발명의 '미세전류처리', '음이온처리' 중 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수시간 내지 5~6일간 처리할 수 있다.

또한, 본 발명은 미세전류 또는 음이온을 이용한 배아줄기세포 배양방법을 제공한다.

본 발명의 배아줄기세포 배양방법은, 1) 체세포 복제 수정란을 체외 배양하여 배반포(blastocyst) 상태로 배양하는 단계, 2) 배반포로부터 내세포괴(inner cell mass)를 분리하는 단계, 3) 배양된 바탕 영양세포에 내세포괴를 이식하는 단계 및 4) 내세포괴가 이식된 세포에 미세전류 처리 및 음이온 처리 중 선택된 하나 이상을 처리하면서 배양하는 단계로 이루어진다.

본 발명의 '세포'는 동물세포로, 어류, 양서류, 조류 및 포유동물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 포유동물, 예컨대, 인간을 포함한 영장류, 소, 돼지, 곰, 고양이, 개, 말 및 설치류 등의 세포이고, 가장 바람직하게는 소 또는 인간의 세포이다.

본 발명의 '배반포'는 수정 후 5~6일이 지난 상태로, 100∼200개의 세포로 이루어져 있으며, 내세포괴와 이것을 싸는 벽층인 영양배엽으로 된 태생포유류의 특징있는 구조를 의미한다.

본 발명의 배아줄기세포 배양방법에서, '음이온 처리'는 상기 기재된 체세포 복제 수정란의 체외배양방법의 '음이온 처리'와 동일하고, '미세전류 처리'는 상기 기재된 체세포 복제 수정란의 체외배양방법의 '미세전류 처리'와 동일하다. 단, '미세전류 처리'시 은-백금 결합체인 이중금속을 사용할 때 전극 사이의 간격은 5~20mm, 특히 10mm 인 것이 바람직하다.

본 발명의 배아줄기세포 배양방법에서 체세포 복제 수정란을 배양하고, 이로부터 수득된 내세포괴를 분리하여 배아줄기세포를 배양하는 기본적인 방법은 당업계에 알려진 통상적인 방법에 따른다.

상기 4단계에서 내세포괴는 분화를 억제하면서 미분화세포의 증식만 일어나 도록 하는 환경 안에서 배양이 되며, 이때 분화억제인자 및 이를 만들어내는 영양세포 또는 특정 지지체, 영양세포배양액이 이용된다. 이를 위해 본 발명에서는 바탕영양세포(feeder cell)를 사용하고, 특히 쥐 태아섬유아세포를 이용하는 것이 바람직하며, 이는 사전에 방사능 처리 또는 마이토마이신 C와 같은 화학적 처리를 하여 분화능력을 떨어뜨린 세포이다. 이러한 세포는 자체 증식이 되지 않으면서 배아줄기세포의 분화억제 및 증식을 돕는 바탕영양세포(feeder cell)로서의 역할을 한다.

상기 4단계를 거쳐 내세포괴가 배양이 되어 세포가 증식이 되고, 이의 밀도 및 크기가 증가하게 되면, 이를 배아줄기세포주가 성립된 것으로 판단한다. 그 다음 배아줄기세포를 더 작은 세포집합체로 분리하고, 이를 다시 같은 조건의 새로운 배양접시로 옮겨 계대배양을 반복하면 미분화 상태를 유지한 채 계속 증식한다. 이와 같은 과정을 반복함으로써 많은 양의 배아줄기세포를 만들어내고 유지시킬 수 있다.

본 발명자는 대한민국 공개특허 제 2002-0080616 호에서 체세포 복제동물 생산방법을 개시한 바 있으며 상기 공개특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어, 본 명세서에 기재되지 않은 본 발명의 특징이 보다 명확하게 설명된다. 또한, 본 발명의 체세포 복제 수정란 제조 및 체외배양, 이로부터 수득된 내세포괴로부터 배아줄기세포를 배양하는 기본적인 방법은 당업계에 알려진 통상적인 방법에 따른다.

이러한 본 발명의 배양방법은 체세포 복제 수정란 제작시 미세전류와 음이온을 공급하여 체세포 복제 수정란의 배반포로의 발달율을 효과적으로 향상시킨다.

또한, 본 발명의 배양방법은 배반포의 내세포괴를 배양시 미세전류와 음이온을 공급하여 배아줄기세포의 확립 및 증식효율을 향상시킨다.

따라서, 본 발명의 배양방법을 이용하면 체세포복제동물의 생산효율을 향상시키고, 다양한 세포로 분화할 수 있는 배아줄기세포를 다량으로 수득할 수 있음으로써 체세포 복제동물 생산 및 배아줄기세포를 이용한 치료 및 연구 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 배양방법에서 미세전류 처리시 은-백금결합체인 이중금속을 사용하여 비교적 적은 비용으로 미세전류 통전을 할 수 있어 경제적이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 참고예 1] 본 발명에서 사용한 체세포 복제동물의 생산방법

본 발명의 체세포 복제동물의 생산방법을 상세히 설명하면 다음과 같다. 도축장에서 난소를 채취한다. 검란 준비를 위해서 1㎝ 간격의 격자 눈금을 그은 60㎜ 디쉬와 10% 혈청 및 1% 항생제가 첨가된 인산염완충용액을 준비한다. 채취한 난소로부터 18게이지 바늘이 장착된 l0㎖ 일회용 주사기를 사용하여 2∼6㎜의 난포를 흡입한다. 먼저 난구세포가 충분히 부착되어 있고 세포질이 균질한 난자를 선발하 여 2∼3회 10% 혈청(Gibco BRL Cat No. 20012-027) 및 1% 항생제가 첨가된 인산염완충용액에서 세정을 한 후 최종 배양인 10% 혈청 및 1% 항생제가 첨가된 TCM-199에 골라 놓고 500㎕ 당 70∼80개의 난자를 넣은 후 미네랄오일(SIGMA, m-3516)로 도포한다. 난구세포 및 체세포를 채취한 후 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 4~5일 동안 배양을 실시하고 인산염완충용액으로 1~2회 세척한 후 0.05% 트립신, 1mM EDTA 용액(Gibco BRL Cat No. 15400-054)을 첨가하여 배양기 안에서 5분간 정치하면 바닥에 붙은 세포가 떨어지게 되는데, 이 세포를 인산염완충용액으로 세정 후 회수하여 원심분리 세척하여 적당량을 새로운 페트리디쉬에 분주하고 배지를 첨가하여 39℃, 5% CO₂의 포화습도 배양기 내에서 배양한다. 페트리디쉬에 세포가 가득 차면 적당량을 분주하여 동결튜브에 나누어서 동결저장을 시키고 필요할 때 하나씩 꺼내어 사용한다. 체외성숙은 5% CO₂, 95% 습도로 조정된 배양기 내에서 20∼22시간 배양한다. 세정용 마우스 피펫(내경 200㎛이상)을 이용하여 TCM-199 배양액에 있던 난자(oocyte) 20~25개 정도를 1개 군으로 하여 PHA-P가 첨가된 TCM-199 배양액으로 이동시킨다. 2개의 피펫을 움직여서 고정용 피펫의 12시 방향에 제1극체(The first polar body)가 위치하도록 하고, 고정용 피펫을 난자의 9시 방향에 밀착시킨 뒤 유압을 걸어 난자를 고정시킨다. 절개용 피펫을 1시 방향에서 찔러서 투명대를 통과시킨 뒤 세포질이 다치지 않도록 주의하며 11시 방향으로 관통시킨다. 고정용 피펫에 양압을 걸어 난자를 분리하고 고정용 피펫을 절개용 피펫이 통과한 제1극체 상단부의 투명대에 접촉시키고 두 피펫을 마찰하여 투명대를 절개한다. 절개한 난자 에 고정용 피펫을 이동시키고 난자의 절개창을 고정용 피펫의 내경에 위치시킨 후 제 1극체를 포함하여 세포질 20~30%를 음압을 주어서 탈핵을 실시한다. 절개창을 양 피펫과 1시 방향에 수직으로 놓고 고정용 피펫으로 고정한다. 이식용 피펫을 절개창으로 주입하고, 유압을 걸어 한 개의 공여핵 세포를 주입시킨다. 주입시 난자의 세포질이 다치지 않도록 주의한다. 핵 이식된 난자를 융합할 때 비전해질 용액인 짐메르만 세포융합 배지를 사용하는데, 4-웰 디쉬의 1번 웰에 짐메르만 세포융합 배지 : TCM-199 = 7:3, 2번 웰에 9:1 로 만들어 분주하고 나머지 2개의 웰에는 100% 짐메르만 세포융합 배지를 분주하여 핵 이식된 난자를 1번→2번→3번→4번 순으로 이동시키면서 평형시킨다. 바늘은 끝 부분이 구부러지지 않은 것을 사용한다. 전기의 방향은 융합할 두 개의 세포막에 직각이 되도록 해야 하며, 융합판에 핵이 치환된 난모세포를 유리관으로 흡입하여 융합판에 올려놓는다. (+)극에 체세포가 위치하도록 하고, (-)극에 세포질이 위치하도록 정렬한 후, 짐메르만 세포융합 배지에서 바로 양압을 주면서 전기를 가한다. 공여핵을 (+)극으로 누른 후 세포질과 밀집성을 높인 다음에 통전을 시키면 융합률이 높아진다. 보통 공여핵이 있는 부분에 직류전기(+)를 가하며, 세포질에 공여핵이 상당히 눌러진 상태가 아닌 자연스런 접촉을 보이는 시점에서 통전을 한다. 전압과 공여핵 크기, 공여핵과 세포질과의 밀착성, 전극과 공여핵과의 위치 등이 융합을 시도하는 체세포 복제 수정란에서 중요한 요소이며, 전압의 세기, 전기를 가하는 횟수 및 지속기간도 중요한 요소이다. 상기 조건들 외에 공여핵과 전극과의 방향성, 공여핵의 크기에 따른 난모세포와의 밀착성 및 공여핵의 G0, G1기 상태의 유도세포 여부도 중요한 요소이다. 많은 실험 을 통해 융합이 잘되는 전압과 간격, 시간의 분포는 대략 융합이 잘되는 전압은 난자의 크기 평균인 135㎛에서 전압이 24.3 volt이다.

[ 실시예 1] 미세전류 또는 음이온을 이용한 체세포 복제 수정란의 체외배양

1-1) 시료의 준비

1-1-가. 세포배양액의 준비

본 발명에서 사용하는 배양액은 다음과 같다.

체세포 배양액은 DMEM(Dulbecco's modified Eagles medium, Gibco BRL Cat No. 11995-065)에 10% FBS(Gibco BRL Cat No. 16000-044)와 1% 항생제(Gibco BRL Cat No. 15240-062)를 첨가하여 사용한다.

난구세포 제거에 사용하는 0.1% 하이알루로니데이즈(Hyaluronidase; SIGMA, H-3506) 용액은 100㎖의 인산염완충용액(PBS; Gibco BRL Cat No. 14190-144)에 하이알루로니데이즈 0.1g을 첨가하여 만들고, 만들어진 액을 2㎖씩 캡튜브에 분주하여 냉동실(-70℃)에 보관하면서 사용한다.

전기융합배지(Electrofusion media) 제조를 위해서는 수크로즈(SIGMA, s-1888) 47.92g, 마그네슘 아세테이트(SIGMA, m-2545) 0.0535g, 칼슘 아세테이트(SIGMA, c-4205) 0.008g, K₂HP0₄(SIGMA, p-3786) 0.087g, 글루타치온(SIGMA, g-6013) 0.0155g 및 BSA(SIGMA, a-4919) 0.005g 으로 이루어진 짐메르만 세포융합배지(Zimmerman Cell Fusion Medium; ZCFM)를 염산으로 최종 pH를 7.2~7.4로 맞추어 냉장실에서 15일 동안 보관하며 사용한다.

탈핵 및 체세포 주입에 사용하는 PHA-P(Phytohematoglutinin; L-9132) 용액은 PHA-A 5㎎을 인산염완충용액 10㎖에 섞어 100㎕씩 에펜도르프 시험관에 분주한 다음, 실험에 사용할 경우 에펜도르프 시험관에 400㎕의 TCM-199를 첨가하여 작업용 미세소적을 만들어 사용한다. 이때 최종 농도는 100㎕/㎖이 되도록 한다.

체세포 주입 후 난자 활성화를 위한 6-DMAP(SIGMA D-2629)는 CR1aa용액 10㎖에 6-DMAP 0.0031g을 첨가하여 용해 및 여과 후(0.22㎛ 필터사용) 에펜도르프 시험관에 분주시키고 냉동보관(1.9mM)한다.

체세포 주입 후 난자 활성화를 위한 Ca² ⁺-Ionophore(A23187)는 DMSO(SIGMA D-5879) 1.66㎖에 Ca² ⁺-Ionophore(A23187) 1㎎을 녹여 1mM을 제조한 다음 최종농도가 5μM 이 되도록 CR1aa 배지 내에 첨가하여 사용하고 원액을 냉동 보관한다.

체외배양액 제조시 사용되는 파이루베이트 저장액(Pyruvate stock; SIGMA, p-5280)은 파이루빈산(pyruvic acid) 66㎎을 증류수 30㎖에 용해시킨 후 여과하여 1.5㎖씩 캡튜브에 분주하여 냉동보관한다(-20℃).

CR1aa 저장액은 NaCl(Sigma s-5886) 3.772g, KCl(Sigma p-5405) 0.132g 및 NaHCO3(Sigma s-5761) 1.254g을 3차 증류수에 넣어 용해한 후 여과하여 냉장 보관한다.

복제수정란 배양시 배양액(culture medium)은 CR1aa용액[CR1aa stock 57㎖ + Hemicalcium lactate(SIGMA, l-4883) 0.033g + Pyruvate stock 1.2㎖ + BME amino acid(SIGMA, b-6766) 1.2㎖ + L-Glutamin(SIGMA, g-5763) 0.0088g + MEM nonessential amino acid(Gibco BRL 07167 Cat No. 11140-050) 0.6㎖ + 항생제(Gibco BRL Cat No. 15240-062) 600㎕]을 사용한다.

또 다른 배양액으로 5% CO₂ , 5% O₂ , 고습도 환경용 mSOF가 있으며, 체외 배양액의 조성은 (NaCl (106mM), KCL (7.2mM), NaHCO3 (25mM), KH2PO4 (1.2mM), 소듐락테이트 (6.6mM), CaCl₂ (1.7mM), MgCl₂ (0.5mM) , 소듐피루베이트 (0.3mM), 글루코오스 (1.5mM), BSA (8mg/ml), MEM 필수아미노산 용액(2% v/v), MEM 비필수 아미노산용액(1% v/v), 글루타민 (1mM), ITS 인슐린, 트렌스페린, 셀레늄 혼합물 (1%,v/v) 이다.

난자 세정용액은 인산염완충용액에 10% FBS(Gibco BRL Cat No. 20012-027)와 1% 항생제를 첨가하여 사용한다. 난자 배양용(IVM) 및 안정화시킬 때는 TCM-199(Gibco BRL Cat No. 12340-030)에 10% FBS와 1% 항생제를 첨가하여 0.22㎛ 주사기 필터를 사용하여 여과시킨 후 사용한다. 탈핵 여부를 확인하기 위해서 사용하는 Hoechst 33342(SIGMA, B-2261)는 25㎎의 Hoechst에 증류수를 5㎖ 섞어 희석(5m/㎖ 의 stock)시킨 다음, Stock 1~2㎕씩 에펜도르프 시험관에 분주, 냉동보관한다. 사용시에는 시험관에 10% FBS를 첨가하고 CR1aa용액 1㎖를 첨가하여 희석시킨 후 사용한다(최종농도 5~10㎍/㎖). 10~15분간 정치한 다음 형광현미경으로 탈핵 여부를 판단한다.

1-1-나. 피펫의 준비

마이크로 피펫은 풀러(Puller; Narishigae, PC-10), 마이크로포지(Microforge; Narishige, MF-9) 등과 같은 기기들을 사용하여 제작한다.

고정용 유리관(Holding pipette)은 나리시게(Narishige) GD-1을 사용하여 추를 부착하지 않고, 풀링단계(Pulling step, 단계 1)에 고정한 후, 온도를 80℃로 조정한다. 절개용 유리관(Cutting pipette)은 나리시게 G-1을 사용하여 추(소 1개, 대 1개)를 부착하고, 풀링단계(단계 1 - 단계 2)에 고정한 후, 온도를 80~101.5℃로 조정한다.

핵 이식용 유리관(Injection pipette)은 나리시게 G-1을 사용하여 추(소 1개)를 부착하고, 풀링단계(단계 1 - 단계 2)에 고정한 후, 온도를 80~101.5℃로 조정한다. 피펫 내부에 세포가 붙는 것을 방지하기 위해 불화수소(Hydrofluoric acid)로 2~3번 세척한 후 증류수로 세척을 하고 I-Gepal(SIGMA, I-3021)로 코팅한다.

난자의 세정 및 운반용 피펫은 알코올 램프를 이용하여 내경이 300㎛ 이상이 되도록 하고, 한번 사용한 것은 폐기한다.

1-2) 체세포 배양

1-2-가) 공여핵 세포 분리

젖소의 귀 선단에서 1~2㎠ 넓이의 피부 조직을 절제한 다음, 50㎖ 시험관에 인산염완충용액을 준비하여 절제된 조직을 넣어 4℃로 냉장 보관하였다. 다시 인산 염완충용액으로 세정한 다음, 멸균된 집게로 고정한 후 체모를 포함한 피부와 연골조직을 멸균된 가위 날(blade)로 분리하여 연골조직과 연한 피부 내측의 조직을 채취하였다. 조직편을 인산염완충용액으로 세정한 후, 칼날로 세절한 다음 2~3회 1800rpm에서 5분간 원심분리하여 세척하였다. 최종 원심세정 후 침전 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM으로 옮겨 39℃, 5% CO₂의 포화습도 배양기 내에서 배양하였다.

1-2-나) 계대배양

상기 1-1-가)의 세포를 배양하고 있던 페트리디쉬에서 배양액을 버리고 인산염완충용액을 사용하여 1~2회 세척한 후, 0.05% 트립신, 1mM EDTA 용액을 첨가하고 배양기 안에서 5분간 정치하였다. 이 세포를 인산염완충용액으로 세정 후 회수하여 1800rpm에서 5분 정도 원심분리 세척하여 적당량을 새로운 페트리디쉬에 분주하고 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 첨가하여 39℃, 5% CO₂의 포화습도 배양기 내에서 배양하였다.

1-2-다) 혈청 기아 배양

상기 1-1-나)에서 배양, 증식 중인 세포주를 0.5% FBS가 첨가된 배양액으로 교체하여 혈청 기아상태(serum deprivation)를 만들고, 3~10일간 배양 후 체세포핵을 공여핵으로 제공하였다.

1-2-라) 세포주의 동결보존 및 융해

배양 중인 세포를 트립신 3㎖로 처리하여 분리시키고, 0.5% 인산염완충용액 7㎖를 첨가하여 총 10㎖로 만든 후 15㎖ 원심분리관에 넣어 원심분리 하였다. 원심 분리 후 상층액을 제거하고 동결액[DMEM 45㎖ + D-글루코스 10g(SIGMA, G-7021) + 헤페스 0.1192g(SIGMA, H-9136) + DMSO 4㎖(SIGMA, D-5879) + FBS 30㎖] 10㎖를 첨가하여 이를 cryotube에 1㎖씩 분주하고 -70℃ 냉동고에 넣어 18~24시간 보관한 후 액체 질소 탱크에 넣어 보관하였다.

상기 세포를 다시 배양할 때에는, 액체질소 탱크에서 cryotube를 꺼내어 37℃ 온수에 넣어 융해시키고 융해된 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM으로 옮겨 39℃, 5% CO₂의 포화습도 배양기 내에서 배양하였다.

1-2-마) 공여핵용 단일 세포의 분리

공여핵 제공용 체세포가 배양된 페트리디쉬 내의 배양액을 버리고 0.05% 트립신, 1mM EDTA 용액을 첨가하여 5분 정치시킨 후, 0.5% FBS가 첨가된 인산염완충용액으로 세정 후 회수하여 1200rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 모았다. 상층액을 모두 버리고 세포의 수가 적당량이 되도록 0.5% 인산염완충용액을 첨가하여 세포를 부유한 후 이식용 디쉬에 옮겨 담았다.

1-3) 난자의 체외성숙

도축장에서 채취해 온 난소에서 난포의 직경이 3~5㎜ 크기의 것만 골라 18게이지 주사바늘과 일회용 주사기를 이용하여 난포액과 함께 난자를 뽑은 후 실체현미경 하에서 세포질과 난구세포가 균일한 미성숙 난포란만 선별하여 10% FBS가 첨가된 TCM-199 배양액에 넣은 후 20~22시간 동안 5% CO₂, 95% 습도로 조정된 배양기 내에서 배양하였다.

1-4) 난구세포 제거

상기 1-3)의 체외성숙시킨 난자를 0.1% 하이알루로니데이즈용액 안에 넣고 5분간 와동(vortexing) 하여 난구세포를 제거하거나, 0.1% 하이알루로니데이즈 용액이 들어있는 4-웰 디쉬 또는 일반 디쉬 안에서 100~200㎕ 피펫을 사용하여 피펫팅을 함으로써 난구세포를 제거하였다. 피펫팅 중간에 난구세포가 제거된 난자는 선별해서 TCM-199 배양액이 있는 다른 디쉬로 옮기고 난구세포가 제거되지 않은 것만 계속 피펫팅을 해주었다. 이 작업 시간은 10~15분 이내로 하였다.

1-5) 수핵난자 절개 및 탈핵

작업용 디쉬에 PHA-P가 첨가된 TCM-199으로 미세소적(micro-droplet)을 만들어 그 안에서 작업을 실시하였다.

1-5-가) 절개 과정

작업용 디쉬를 조작판(manipulator plate) 위에 놓는 다음, 피펫을 장착하였다. 조작장치(Manipulator)의 왼쪽 암(arm)에 고정용 피펫을 장착한 후, 조작장치의 오른쪽 암에 절개용 피펫을 장착하였다. 고정용 피펫은 9시 방향에 위치시키고 절개용 피펫은 3시 방향에 위치시켰다. 피펫 조정기를 중립에 놓아 피펫이 상,하 좌우로 자유롭게 움직일 수 있도록 조정하였다. 두 피펫을 작업용 미세소적 내로 상하 이동시키면서 피펫이 디쉬의 테두리에 닿지 않도록 각도를 조정하고 피펫 끝 을 미세소적의 중앙에 위치시켰다. 세정용 마우스 피펫(내경 200㎛이상)을 이용하여 TCM-199 배양액에 있던 난자 20~25개 정도를 1개 군으로 하여 PHA-P가 첨가된 TCM-199 배양액으로 이동시켰다. 조동나사와 미동나사를 이용하여 난자에 먼저 초점을 맞춘 뒤, 2개의 피펫을 상하로 움직여 초점을 조정하였다. 2개의 피펫을 움직여서 고정용 피펫의 12시 방향에 제1극체(The first polar body)가 위치하도록 하였다. 고정용 피펫을 난자의 9시 방향에 밀착시킨 뒤 유압을 걸어 난자를 고정시켰다. 절개용 피펫을 1시 방향에서 찔러서 투명대를 통과시킨 뒤 세포질이 다치지 않도록 주의하며 11시 방향으로 관통시켰다. 고정용 피펫에 양압을 걸어 난자를 분리하고 고정용 피펫을 절개용 피펫이 통과한 제1극체 상단부의 투명대에 접촉시키고 두 피펫을 마찰하여 투명대를 절개하였다.

1-5-나) 탈핵과정

절개한 난자를 고정용 피펫으로 이동시킨 후 난자의 절개창을 고정용 피펫의 내경에 위치시킨 후 제1극체를 포함하여 세포질 10~30%를 음압을 주어서 탈핵을 실시하였다. 이때 절개한 창은 9시 방향으로 하였다.

다시 양압을 주어 고정되었던 난자와 탈핵된 세포질을 분리시켰다. 탈핵된 난자는 TCM-199으로 2~3회 세척하고 핵 이식 전까지 10% 혈청 및 1% 항생제가 첨가된 TCM-199에 넣어 보관하였다. 이를 하기에서 공여핵을 이식할 수핵난자로 사용하였다.

1-6) 공여핵용 체세포의 음이온 및 미세전류 처리

공여핵원을 이식하기 전에 음이온 처리, 은-백금 결합체 이중금속 사이에서 미세전류 처리, 무처리군을 대조군으로 하였으며 음이온 처리 환경을 위해 사용된 전기석(20)은 도 1에서 보는바 같이 원석의 경우 극성을 가지며 원석을 그대로 가공해서 판형태로 사용하면 전기적 성실을 그대로 이용가능하다. 배양기 내부의 온도는 37-39℃ 사이며 상온보다 높기 때문에 온도가 변하면 전기가 발생하는 현상(Pyroelectric)을 보인다. 전기석 원석을 분말형태로 만들면 각각의 모든 형태는 극성을 가지며 분말을 세라믹으로 구우면 극성이 불규칙적인 판형태의 세라믹 전기석(20')이 된다.

1-6-가) 전기석을 이용한 음이온으로 공여핵원 처리

본 발명에서는 전기석(20)은 극성이 있는 전기석(20)과 극성이 불규칙한 전기석(20') 형태로 나누어지며 두 가지 형태의 전기석은 그 위치에 따라 전기적 흐름이 달라지며 도면의 복잡함을 피하기 위해 실시예제는 전기석(20)으로 표기하였다. 원석의 형태를 알맞은 형태로 절단한 형태에서는 도 1에서 보는 바 같이, 전기장이 형성이 되며 전기석(20)을 상하로 위치시켜서 전자(55)를 통한 음이온의 흐름을 조절하면 위치 변화로 그 작용형태를 조절할 수 있다. 공여핵원은 단일세포 분리 후에 도 7에서 보는 바와 같은 음이온이 흐르는 배양 접시에서 10분간 도 8처럼 전기석(20) 사이에 정치시킨 후에 공여핵원으로 이용하였다.

1-6-나) 은-백금결합체 이중금속을 이용한 미세전류로 공여핵원 처리

도 11에서 보는 바와 같이 배양판(90)에 은(85)-백금(82)결합체 이중금속 두개를 고정한 후에 서로 반대되는 극성을 연결선(87)으로 연결하였다. 배양면(94)에서 배양액이 흘러나오지 못하게 부도체(89)로 양끝을 막은 구조를 가진 챔버를 이용하여 단일세포로 분리된 공여핵원을 핵 이식 시 전까지 10분 정도 정치시킨 후에 공여핵원으로 이용하였다. 두 개의 전극 간격은 1mm 정도이다.

1-7) 수핵난자로의 공여핵 이식

작업용 디쉬를 조작판에 위치시켰다. 절개용 피펫을 이식용 피펫으로 교체시키고, 10% 혈청 및 1% 항생제가 첨가된 TCM-199에서 2~3회 세척 후 주입용 미세소적으로 이동시켰다. 이식용 피펫을 공여핵 세포가 있는 미세소적에 넣고 약 10㎛ 크기의 공여핵 세포를 흡입한 후 피펫을 주입용 미세소적으로 이동시켰다.

유리판에 보통 4~5개의 작업용 드롭을 만들고, 위부터 2개는 탈핵용 미세소적, 2~3개는 이식용 미세소적으로 각각 드롭을 형성시킨 후 미네랄오일로 도포하였다. 탈핵이 끝난 난자를 10% 혈청 및 1% 항생제가 첨가된 TCM-199에서 안정화시킨 후 이식용 드롭으로 옮겼다.

절개창을 양 피펫과 1시 방향에 수직으로 놓고 고정용 피펫으로 고정한 후, 이식용 피펫을 절개창으로 주입하고, 유압을 걸어 한 개의 공여핵 세포를 주입하였다.

1-8) 세포 융합 (cell fusion)

120㎜ 디쉬에 짐메르만 세포융합배지를 절반 정도 채운 후 RMX 2010 (www.biofusiontech.com) 융합기와 연결시켰다. 전기의 방향은 융합할 2개의 세포막에 직각이 되도록 하였다. 융합판에 핵이 치환된 난모세포 전체를 유리관으로 흡입하여 융합 판에 올려놓고, 짐메르만 세포융합배지에서 바로 양압을 주면서 전기를 가하였다. 이때 세포융합 조건은 전압이 DC 22V, 횟수는 1회, 시간은 10㎲로 조정하였다. 바늘 이용한 방법은 (+)극에 체세포가 위치하도록 하고, (-)극에 세포질이 위치하도록 정렬하였다.

1-9) 세포 활성화 (cell activation)

세포 융합 후, 체세포 복제 수정란의 활성화 단계에서 음이온 또는 미세전류를 공급함으로써 미치는 영향을 확인하였다.

이전에 1-6)에서 공여핵을 음이온 처리한 실험군, 공여핵을 미세전류처리한 실험군 및 무처리군으로 나누었고, 이를 세포 활성화 단계에서 음이온 또는 미세전류처리하여 6-9일 사이에 생산된 배반포 및 확장 배반포기 수정란의 생산된 숫자로 효능을 평가하였다.

상기 1-8)에서 융합된 체세포 복제 수정란은 배양용 mSOF로 옮겨 30분간 배양하고, 그 후 정상적으로 융합이 된 난자만 선별하여 아래와 같이 활성화시켰다.

1-9-가) 전기석을 이용한 음이온으로 체세포 복제 수정란 활성화 처리

체세포 복제 수정란의 활성화 처리는 Ca² ⁺-Ionophore(A23187)가 첨가된 mSOF 용액을 이용하여 수행하였고, 이때 다양하게 전기석을 배열하여 음이온이 공급되도록 하였다.

먼저, 도 4와 같이, 배양접시(10)에 복제수정란을 놓아 배양드롭(30)을 형성한 후 미네럴오일(40)을 채우고, 도 2와 같이 배양접시 하단에 전기석(20)을 배열한 상태로 4 분간 활성화시켰다.

1-9-나) 은-백금결합체 이중금속을 이용한 미세전류로 복제수정란의 활성화 처리

상기 1-9-가)와 같이 체세포 복제 수정란의 활성화 처리는 Ca²⁺-Ionophore(A23187)가 첨가된 mSOF 용액을 이용하여 수행하였고, 이 때 이 용액을 도 11에서 보는 바와 같이 두 개의 은-백금결합체 이중금속 사이의 배양면에 채운 후 복제수정란을 배양면에서 4분간 활성화시켰다. 대략 두 개의 은-백금결합체 이중금속 전극 사이의 간격은 1mm 정도이며 그 전극 사이의 간격에 따라서 미세전류 값 차이가 난다. 본 발명에서는 간격 사이의 미세 전류값은 23.6 nA 정도였다.

상기 실시예 1-9-가) 및 1-9-나)에서 활성화가 끝난 체세포 복제 수정란은 6-DMAP가 첨가된 mSOF 용액에서 4시간 동안 활성화 시켰다. 활성화가 끝난 난자를 mSOF 배지에서 2~3회 세척하여 이산화탄소 5%, 산소 5%, 온도 39 ℃, 포화습도 배양기에서 6-9일간 배양을 하였다.

각각의 조건에서 활성화되고 배양된 결과, 난할된 체세포 복제 수정란 및 배반포 상태로 발달된 체세포 복제 수정란의 개수를 세어 하기 표 1에 정리하였다.

표 1에서, 처리 2)의 경우, 공여핵원의 핵 이식 전에 전기석에서 방출되는 음이온을 처리하고, 체세포 복제 수정란을 제조, 세포융합시킨 다음, 다시 전기석의 음이온을 처리하면서 복제 수정란을 활성화(Ca² ⁺-Ionophore(A23187)가 첨가된 mSOF 용액 드롭에 4 분간 활성화)한 실험군이다. 처리 3)의 경우 공여핵원의 핵 이식 전에 미세전류로 처리하고, 체세포 복제 수정란을 제조, 세포융합시킨 다음, 은-백금결합체 이중금속 전극 사이에서 미세전류를 처리하면서 복제수정란을 활성화(Ca²⁺-Ionophore(A23187)가 첨가된 mSOF 용액에서 복제수정란을 4분간 활성화)한 실험군이다.

처리	주입 (갯수)	융합 (갯수(%))	배양 (갯수(%))^A	난할 (갯수(%))	배반포 (갯수(%))^B
1) 무처리군	440	418 (95 %)	406 (97.1 %)	305 (75.1 %)	89 (22 %)
2) 전기석을 이용한 음이온이 흐르는 배양환경	310	298 (96 %)	283 (95 %)	230 (81 %)	79 (28 %)
3) 은-백금결합체 이중금속을 이용한 미세전류가 흐르는 전극사용	520	505 (97.1 %)	490 (97 %)	441 (90 %)	172 (35.1 %)
배반포 (%): 배양갯수 A 에 대한 배반포 갯수 B의 백분율

상기 표 1에서, 처리 2)의 경우, 무처리군 (22%) 보다 높은 28%의 배반포 효율을 보였고, 처리 3)의 경우, 배양갯수에 대한 배반포 개수 백분율이 35.1%로, 가장 높은 배반포 효율을 나타내었다.

도 9를 보면 본 발명의 체세포 복제 수정란의 체외배양 방법으로 배양후 6~7일사이의 탈출 배반포 사진이다. 조금더 검게 보이는 부분이 바로 세포내괴(ICM) 부분이다.

따라서, 복제 수정란의 공여핵 이식시 또는 복제수정란 활성화시 미세전류로 통전, 또는 음이온 처리한 후 배양한 실험군에서 복제수정란의 배발달율이 향상됨을 알 수 있었다.

[ 실시예 2] 본 발명의 미세전류 또는 음이온을 이용한 배아줄기세포의 배양

2-1) 시료의 준비

배아줄기세포 배양(ICM Culture)을 위한 배양액은 Knockout DMEM(Gibco BRL, Cat No 10829-018)에 혈청 교체액(serum replacement, Gibco BRL Cat No 10828-028) 20% , 1mM 글루타민, 0.1 mM β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol), 1% 비필수아미노산(non-essential amino acids (NEAAs), Gibco BRL Cat No 11140-050), 4 ng/ml 인간 염기성 섬유아세포 성장인자(human basic fibroblast growth factor(bFGF), KOMA biotech Inc.)를 추가하여 사용하였다. 기타 배양액은 실시예 1의 것과 동일한 것을 사용하였다.

2-2) 배아줄기세포 배양

본 발명의 배아줄기세포 배양은 일반적 배양환경에 미세전류 통전을 추가하여, 배양환경이 동일할 때 배아줄기세포주 성립확률을 미처리군과 비교하여 그 효능을 평가하였다.

먼저, 상기 1-9)에서 배양하여 배반포(blastocyst)로 성장한 후기 체세포 복제 수정란(도 9 참조)을 0.25% 프로네이즈 (0.25% pronase, sigma P-8811)로 투명대를 녹였다. 이 다음 면역학적인 처리로서 항-인간 혈청 항체(anti-Human Serum Antibody, 1: 20 희석, sigma H8765)로 30 분간 처리 후, 기니피그 혈장 희석액 (Guinea pig complement, 1:10으로 희석, sigma S-1639)에서 2분간 처리하여 내세포괴(inner cell mass, ICM)만 분리하였다.

이렇게 얻어진 내세포괴는 바탕영양세포인 쥐 태아섬유아세포가 자라는 접시에 이식해서 내세포괴가 다른 세포로 변형되지 않고 배아줄기세포 성질을 유지한 채 분화성장하도록 하였다. 상기 쥐 태아섬유아세포는, 임신 10~13일경의 암컷 태아로부터 상기 공여핵원 세포 배양과 동일한 방법으로 조직을 얻어 배양하여 사용하였다.

내세포괴를 쥐 태아섬유아세포에 이식하기 전에, 마이토마이신 씨 (mitomycin C, sigma) 10㎍/㎖ 가 들어 있는 배양액에 쥐 태아섬유아세포를 5-6시간 배양을 하여 분화능력을 떨어트린 후 배아줄기세포 배양액으로 세정하였고, 여기에 내세포괴를 이식하여 5일 정도 배양을 하였다. 그 내세포괴가 접시 밑면에 부착하여 바탕영양세포면 위에서 증식하면서 배양접시면을 따라 그 증식부위를 넓혀갔다(도 10). 도 10에서 조금 더 검은 부분이 바로 내세포괴가 바탕영양세포에 부착하여 배양이 시작된 시작점이다. 세포 숫자가 2 ~ 2.5배 정도로 증가하였고, 이 배아줄기세포를 4-5등분을 하여서 각각 따로 처음 배양을 시작하듯 배양접시에 배양을 하였다.

상기 과정으로 내세포괴가 배양된 세포를 '배아줄기세포'라고 하며, 계대배양 방식과 동일하게 배아줄기세포 배양액이 들어 있는 분화능력이 떨어진 쥐 태아섬유아세포가 자라는 접시에서 계대배양 방식을 반복하면 미분화 상태를 유지한 채 계속하여 증식하게 된다.

상기 내세포괴 배양시 본 발명의 배양방법으로 미세전류를 처리하여 배아줄기세포 배양에 미치는 영향을 확인하였다.

미세전류를 처리하기 위해 도 11, 도 12와 같은 전극을 갖는 배양접시 위에서 내세포괴를 쥐 영양세포(feeder cell)와 함께 배양하였다.

쥐 영양세포가 자라기 위해 유리판이 아닌 플라스틱 접시에 전극을 설치하였으며, 그 전극 사이의 간격은 10mm정도이며 미세전류는 비활성화된 쥐 영양세포면 위를 흐르게 된다.

이 위에서 상기와 같은 배양 방법으로 내세포괴를 추출한 후에 이식하였고, 이 내세포괴는 비활성화된 쥐 영양세포에 부착하여 그 크기가 2-4 배정도 커지도록 배양되었으며, 이를 배아줄기세포주로 확립하였다. 이렇게 커진 배아줄기세포주를 작게 분할하여 계대배양을 실시하였다.

계대배양시에는 미세전류 처리를 하지 않았으며 처음 배아줄기세포주 확립이 될 때까지, 도 11에서 보는 바와 같은 미세전류가 흐르는 전극 사이에 배양을 하였다. 도 11의 배양면(94)에 배양되는 배아줄기세포를 나타낸 사진은 도 10에 나타내었다. 사람의 배아간세포의 경우 배양접시면(사방면)을 따라 배양면을 넓혀 가며, 쥐 또는 설치류 등은 배아줄기세포 배양시, 배양접시 방향의 직각방향(상하방향)으로 그 크기가 커지는 다른 배양방향을 보인다. 포유류마다 그 배양이 되어지는 방향성이 틀리게 나타나는데, 본 발명의 도 9, 도 10 경우 소의 배반포, 배아줄기세포 배양사진이다.

처리	내세포괴 (갯수)^C	증식성공 (갯수)	배아줄기세포주 (갯수)^D	배아줄기세포주 배양 성공률
무처리 내세포괴 (ICM)	36	6	6	16.6%
미세전류 통전 환 경 내세포괴(ICM)	38	11	11	29 %
성공률: 내세포괴 C 에 대한 배아줄기세포주 D의 백분율

상기 표 2에서 보는 바와 같이 추출된 내세포괴는 무처리군에 비해 증식성공율이 유의적으로 높으며, 배아줄기세포주 배양성공률이 무처리군에 비해 유의적으로 높았다.

따라서 본 발명의 미세전류를 이용한 배아줄기세포 배양 방법이 내세포괴에서 배아줄기세포로의 증식성공률을 증가시킴을 알 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 배양방법은 체세포복제란 제작시 미세전류와 음이온을 공급하여 체세포 복제 수정란의 배반포로의 발달율을 효과적으로 향상시킨다.

또한, 본 발명의 배양방법은 배반포의 내세포괴를 배양시 미세전류와 음이온 을 공급하여 배아줄기세포의 확립 및 증식효율을 향상시킨다.

따라서, 본 발명의 배양방법을 이용하면 체세포복제동물의 생산효율을 향상시키고, 다양한 세포로 분화할 수 있는 배아줄기세포를 다량으로 수득함으로써 체세포 복제동물 생산 및 배아줄기세포를 이용한 치료 및 연구 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

하기 단계로 이루어지는 미세전류(micro-current) 또는 음이온(negative ion)을 이용한 체세포 복제 수정란의 체외배양방법;

1) 체세포를 배양한 후 단일세포로 분리하여 공여핵 체세포를 준비하는 단계, 2) 공여핵 체세포를 미세전류 처리 및 음이온 처리 중 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 처리하는 단계, 3) 채취한 난자를 체외성숙시키는 단계, 4) 체외성숙난자에서 난구세포를 제거하는 단계, 5) 상기 4)단계의 난자에서 탈핵시켜 수핵난자를 준비하는 단계, 6) 수핵난자에 공여핵을 이식하여 공여핵 이식란을 제조하는 단계, 7) 공여핵 이식란을 세포융합하여 체세포 복제 수정란을 제조하는 단계, 8) 체세포 복제 수정란을 미세전류 처리 및 음이온 처리 중 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 처리하면서 활성화시키는 단계 및 9) 체세포 복제 수정란을 체외배양하는 단계.
제 1항에 있어서, 상기 2단계에서 공여핵 체세포에 미세전류를 처리하고, 상기 8단계에서 체세포 복제 수정란에 미세전류를 처리하면서 활성화시킴을 특징으로 하는 체세포 복제 수정란의 체외배양방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 미세전류 처리는 두 개 이상의 전기석 사이에서 세포를 배양하여, 전기석 사이에서 흐르는 미세전류를 처리하는 것을 특 징으로 하는 체세포 복제 수정란의 체외배양방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 미세전류 처리는 두 개의 은-백금 결합체인 이중금속 사이에서 세포를 배양하여, 이중금속 사이에서 흐르는 미세전류를 처리하는 것을 특징으로 하는 체세포 복제 수정란의 체외배양방법.
제 1항에 있어서, 상기 2단계에서 공여핵 체세포에 음이온을 처리하고, 상기 8단계에서 체세포 복제 수정란에 음이온을 처리하면서 활성화시킴을 특징으로 하는 체세포 복제 수정란의 체외배양방법.
제 1항 또는 제 5항에 있어서, 상기 음이온 처리는 전기석을 이용하는 것을 특징으로 하는 체세포 복제 수정란의 체외배양방법.
하기 단계로 이루어지는 미세전류 또는 음이온을 이용한 배아줄기세포 확립방법;

1) 체세포 복제 수정란을 체외 배양하여 배반포(blastocyst) 상태로 배양하는 단계, 2) 배반포로부터 내세포괴(inner cell mass)를 분리하는 단계, 3) 배양된 쥐 태아섬유아세포에 내세포괴를 이식하는 단계 및 4) 내세포괴에 갈바니 전지의 원리를 이용하여 제작된 이중금속 사이의 미세전류 처리 및 음이온 처리 중에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 처리하면서 배양하는 단계 및 5) 상기 내세포괴 배양시 세포 증식, 이의 밀도 및 크기 증가를 관찰하여 배아줄기세포주 확립 여부를 판단하는 단계.
제 7항에 있어서, 상기 4단계에서 미세전류를 처리하는 것을 특징으로 하는 배아줄기세포 확립방법.
제 8항에 있어서, 상기 미세전류 처리는 두 개의 은-백금 결합체인 이중금속 사이에서 세포를 배양하여, 이중금속 사이에서 흐르는 미세전류를 처리하는 것을 특징으로 하는 배아줄기세포 확립방법.