CN102625837A - 有效建立诱导的多能干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

提供的是产生iPS细胞的方法，其包括使下述物质与体细胞接触：(a)Oct3/4或编码其的核酸、(b)Klf4或编码其的核酸、和(c)Sox2或编码其的核酸、以及(d1)L-Myc或编码其的核酸和/或(d2)p53的功能抑制剂。优选将(a)编码Oct3/4的核酸、(b)编码Klf4的核酸、(c)编码Sox2的核酸、(d1)编码L-Myc的核酸、和(e)编码Lin28或Lin28b的核酸插入附加型载体内，所述附加型载体具有以相同方向置于对于载体复制必需的载体组成成分的5’和3’侧上的loxP序列，将(d2)编码针对p53的shRNA的核酸插入确保瞬时表达的载体(质粒载体等)内，并且所有这些核酸转移至体细胞。

Description

有效建立诱导的多能干细胞的方法
技术领域
本发明涉及有效建立人工多能干(下文称为iPS)细胞的方法和为此的试剂，更具体而言涉及通过使下述物质与体细胞接触建立iPS细胞的方法：(a)Oct3/4或编码其的核酸、(b)Klf4或编码其的核酸、和(c)Sox2或编码其的核酸、以及(d1)L-Myc或编码其的核酸和/或(d2)p53的功能抑制剂，并且涉及由上文(a)至(c)以及(d1)和/或(d2)组成的iPS细胞诱导剂。本发明还涉及包含上文(a)至(c)的核酸因子以及(d1)和/或(d2)的核酸因子的附加型载体，或其为附加型载体和loxP序列的组合的载体，特别涉及早期自我去除型的附加型载体，和使用附加型载体无需经历核酸因子在基因组中的整合快速建立丧失外源核酸因子的iPS细胞的方法。
发明背景
近年来，小鼠和人iPS细胞已相继地建立。Yamanaka等人通过将Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因引入衍生自小鼠的成纤维细胞内且迫使细胞表达基因而诱导iPS细胞[WO 2007/069666A1；Takahashi，K.和Yamanaka，S.，Cell，126：663-676(2006)]。其后，揭示iPS细胞还可以由除c-Myc基因外的3种因子产生[Nakagawa，M.等人，Nat.Biotechnol.，26：101-106(2008)]。此外，Yamanaka等人通过将与小鼠中使用的那些相同的4种基因引入人表皮成纤维细胞内成功建立了iPS细胞[WO 2007/069666A1；Takahashi，K.等人，Cell，131：861-872(2007)]。另一方面，Thomson等人的团体使用Nanog和Lin28代替Klf4和c-Myc产生了人iPS细胞[WO 2008/118820A2；Yu，J.等人，Science，318：1917-1920(2007)]。
然而，iPS细胞建立的效率低至小于1％。特别地，当它们通过将除c-Myc外的3种因子(Oct3/4、Sox2和Klf4)引入体细胞内产生时，出现iPS细胞建立的极低效率的问题，害怕所述c-Myc在由iPS细胞分化的组织或个体中中引起肿瘤生成。
病毒载体例如逆转录病毒和慢病毒提供了比非病毒载体更高的转染效率，并且因此是有利的，因为它们使得iPS细胞更容易生成。然而，逆转录病毒和慢病毒变得整合在染色体中，造成考虑到iPS细胞的临床应用的安全性问题。为此，使用不在染色体中发生载体整合的腺病毒载体或非病毒载体例如质粒生成的iPS细胞已得到报道[Stadtfeld，M.等人，Science，322：945-949(2008)；Okita，K.等人，Science，322：949-953(2008)；Yu，J.等人，Science，324：797-801(2009)]。然而，这些载体在iPS细胞建立效率中低于逆转录病毒和慢病毒。可能是因为在iPS细胞选择条件下重编程因子的持续高表达的需求，所以即使当使用质粒载体时，获得具有重编程因子以一定效率掺入染色体中的稳定表达系的某些情况也是存在的，所述质粒载体一般公认为不太可能引起掺入[Okita，K.等人，Science，322：949-953(2008)；Kaji，K.等人，Nature，458：771-775(2009)]。
因此，通过首先使用逆转录病毒或慢病毒建立iPS细胞，随后从染色体中去除外源基因，已做出协调高建立效率和安全的尝试。例如，包含慢病毒和Cre-loxP系统的组合的技术已得到报道[Chang，C.W.等人，Stem Cells，27：1042-1049(2009)；Soldner，F.等人，Cell，136：964-977(2009)]。然而，在这些报道中，使用其中loxP序列插入LTR中的复合构建体，以使附近的癌基因通过在loxP序列外的LTR序列激活的危险降到最低，所述LTR序列在Cre重组酶处理后保留，并且其中插入另一个启动子例如CMV或EF 1α用于转录重编程因子；因此，存在关于开发可以更容易地构建的载体的需求。尽管外源核酸因子可以使用piggyBac转座子完全消除[Kaji，K.等人，Nature，458：771-775(2009)]，但扰乱内源基因的可能性无法排除，因为基因组中的瞬时整合是不可避免的。
同时，在涉及使用能够在染色体外稳定自我复制的附加型载体的方法中，除上述低iPS细胞建立效率外，在药物选择中断后载体的自发清除是低效率的，并且花费很长时间[Yu，J.等人，Science，324：797-801(2009)]。为此，存在关于在短时间内以高效率去除载体，同时改善iPS细胞建立效率的方法的需要。
此外，在发现关于人iPS细胞的临床应用中出现另一个问题；细胞可以变得被衍生自其他动物物种的成分污染，所述成分例如在iPS细胞建立和维持培养过程中的血清和饲养细胞。因此，希望从重编程因子转移到人iPS细胞建立和维持培养的所有操作在“无异物(Xeno-free)”条件下(不含异源成分)进行。然而，在无病毒条件下建立的人iPS细胞中，在从重编程因子转移到iPS细胞建立和维持培养的至少一个步骤中使用异源成分已是常规实践[Okita，K.等人，Science，322：949-953(2008)；Yu，J.等人，Science，324：797-801(2009)；Kaji，K.等人，Nature，458：771-775(2009)]。同时，在无异物条件下建立的所有人iPS细胞已借助于逆转录病毒或慢病毒由重编程基因转染，并且其中无一已在无病毒条件下制备[Rodoriguez-Piza，I.等人，Stem Cells，28：36-44(2010)；Ross，P.J.等人，Stem Cells Dev.，2009Dec 23.(在印刷前的电子版)]。
发明概述
本发明涉及有效建立适合于临床应用的安全人iPS细胞。相应地，本发明的第一个目的是提供改善iPS细胞特别是人iPS细胞的建立效率的工具，和通过使用该工具有效产生iPS细胞的方法。本发明的第二个目的是提供快速建立iPS细胞的方法，所述iPS细胞无需经历核酸因子在基因组中的整合已丧失外源核酸因子。本发明的第三个目的是生成人iPS细胞，而在从重编程因子转移到iPS细胞建立和维持培养的时期过程中不使用任何病毒或异源成分(即在无病毒无异物条件下)，以从而提供可以在人临床背景中安全使用的人iPS细胞。
为了解决上述问题，本发明人首先进行研究，以发现使用逆转录病毒载体的重编程基因的合适组合。基于使用附加型载体用于建立人iPS细胞的由Yu，J.等人使用的6种因子[Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、Nanog、Lin28(SV40大T抗原作为建立效率改进剂处理，且从重编程基因中排除)][Science，324：797-801(2009)]，本发明人尝试由人表皮成纤维细胞(HDF)诱导人iPS细胞，使用除Nanog外的5种因子，或使用除Nanog外的5种因子(这包括L-Myc代替c-Myc)。出乎意料的是，使用除Nanog外的5种因子比由6种因子更有效地建立人iPS细胞。此外，由于c-Myc由L-Myc的替换，建立效率得到显著改善。因此，人iPS细胞建立效率实际上在使用6种因子和使用包括L-Myc代替c-Myc的5种因子之间进行比较，使用附加型载体。因此，发现与由6种因子比较，使用包括L-Myc代替c-Myc的5种因子，建立效率得到显著增加。
接下来，将6种因子或除Nanog外且包括L-Myc代替c-Myc的5种因子连同编码针对p53的shRNA的附加型载体一起转移至HDF。由于p53的功能抑制，使用6种因子获得与由包括L-Myc代替c-Myc的5种因子比较至相似程度的iPS细胞。当5种因子与p53的功能抑制组合时，建立效率更加显著地增加。还发现通过使用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)而不是SNL细胞作为在转染后HDF传代时的饲养细胞，人iPS细胞建立效率得到急剧改善。
本发明人已设计了附加型载体，以允许其对于其自我复制必需的组成成分通过Cre重组酶的作用从其中切掉，所述Cre重组酶具有置于载体组成成分的两端的loxP序列，以便允许转移的附加型载体在iPS细胞建立后从iPS细胞中快速脱落。在人iPS细胞建立后，分离细胞的基因组DNA和染色体外DNA且就转基因的存在或不存在分开检查。因此，转移的载体在任一DNA未检测到；出乎意料的是，发现载体是从细胞中快速脱落的早期自我去除载体，无需使用Cre重组酶。
此外，本发明人在从重编程因子转移到iPS细胞建立和维持培养的完全无病毒和无异物条件下成功生成了人iPS细胞，使用上述附加型载体。
根据这些结果，本发明人发现通过从重编程因子中排除Nanog且使用L-Myc代替c-Myc，或使用p53的功能抑制剂代替其，或加上其，人iPS细胞建立效率可以得到显著改善，通过精心设计附加型载体可以快速获得无需经历核酸因子在基因组中的整合已丧失外源核酸因子的iPS细胞，并且通过组合上述重编程因子和附加型载体可以在无病毒和无异物条件下生成人iPS细胞，并且已发展了本发明。
相应地，本发明提供了：
[1]产生iPS细胞的方法，其包括使下述物质与体细胞接触：(a)Oct3/4或编码其的核酸、(b)Klf4或编码其的核酸、和(c)Sox2或编码其的核酸、以及(d1)L-Myc或编码其的核酸和/或(d2)p53的功能抑制剂。
[2]根据上文[1]的方法，其进一步包括使(e)Lin28或Lin28b或编码其的核酸与体细胞接触。
[3]根据上文[1]或[2]的方法，其中p53的功能抑制剂是选自针对p53的siRNA和shRNA和编码其的DNA的核酸。
[4]根据上文[2]或[3]的方法，其包括将下述物质转移至体细胞：(a)编码Oct3/4的核酸、(b)编码Klf4的核酸、(c)编码Sox2的核酸、(d1)编码L-Myc的核酸和/或(d2)编码针对p53的shRNA的核酸、以及(e)编码Lin28或Lin28b的核酸。
[5]根据上文[4]的方法，其中选自前述(a)、(b)、(c)、(d1)和(e)的至少一种核酸以附加型载体的形式转移。
[6]根据上文[4]或[5]的方法，其中(d2)编码针对p53的shRNA的核酸以在细胞中不能自我复制的质粒载体的形式转移。
[7]根据上文[5]或[6]的方法，其中所述附加型载体是以50％或更多的频率到第5次传代时从iPS细胞中脱落的自我去除载体。
[8]根据上文[5]-[7]中任一项的方法，其中所述附加型载体具有以相同方向置于对于核酸复制必需的载体组成成分的5’和3’侧上的loxP序列。
[9]根据上文[8]的方法，其不包括用Cre重组酶处理细胞的过程。
[10]根据上文[1]-[9]中任一项的方法，其中所述体细胞是人细胞。
[11]根据上文[10]的方法，其包括在从前述因子(a)、(b)、(c)、以及(d1)和/或(d2)或另外的(e)与体细胞接触到iPS细胞建立的期间过程中不存在来自非人动物的成分的情况下培养细胞。
[12]根据上文[11]的方法，其中人细胞用作饲养细胞，或其中不使用饲养细胞。
[13]根据上文[12]的方法，其中所述饲养细胞衍生自与所述体细胞相同的个体。
[14]iPS细胞诱导促进剂，其包含(a)编码Oct3/4的核酸、(b)编码Klf4的核酸、(c)编码Sox2的核酸、(d1)编码L-Myc的核酸和/或(d2)编码针对p53的shRNA的核酸、以及(e)编码Lin28或Lin28b的核酸。
[15]根据上文[14]的试剂，其中选自前述(a)、(b)、(c)、(d1)和(e)的至少一种核酸以附加型载体的形式。
[16]根据上文[14]或[15]的试剂，其中(d2)编码针对p53的shRNA的核酸以在细胞中不能自我复制的质粒载体的形式。
[17]根据上文[15]或[16]的试剂，其中所述附加型载体是以50％或更多的频率到第5次传代时从iPS细胞中脱落的自我去除载体。
[18]根据上文[15]-[17]中任一项的试剂，其中所述附加型载体具有以相同方向置于对于前述核酸各自的复制必需的载体组成成分的5’和3’侧上的loxP序列。
[19]无需经历核酸在基因组中的整合已丧失前述核酸的iPS细胞，其通过根据上文[5]-[9]中任一项的方法获得。
[20]根据上文[19]的iPS细胞，其为人iPS细胞。
[21]不含来自非人动物的任何污染成分的人iPS细胞，其通过根据上文[11]-[13]中任一项的方法获得。
[22]根据上文[19]-[21]中任一项的iPS细胞在产生体细胞中的用途。
[23]根据上文[19]-[21]中任一项的iPS细胞，其中所述iPS细胞在产生体细胞中充当细胞来源。
L-Myc代替c-Myc的使用和/或p53的功能抑制剂的使用以及Nanog的不使用，使得能够显著增加iPS细胞建立效率，并且因此在生成人iPS细胞中是特别有用的，特别是不涉及重编程基因在基因组中的整合类型的人iPS细胞，使用在建立效率中已是极低的6种因子(Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc、Nanog、Lin28)。另外，独立开发的附加型载体的使用使得能够建立iPS细胞而无需涉及外源核酸因子在基因组中的整合，并且引起附加体在其建立后从iPS细胞中快速脱落，从而载体可以比常规附加型载体更早从细胞中脱落。此外，因为人iPS细胞可以在从重编程因子转移到iPS细胞建立和维持的期间过程中在完全无病毒和无异物条件下生成，所以本发明的方法在将人iPS细胞应用于再生医学中是高度有用的。
在下文中，通过使用附加型载体建立的iPS细胞在本说明书中有时缩写为“epi-iPS细胞”或“epi-iPSC”。
此外，当引入的基因的组合缩写为“Y1、Y2、Y3、Y4、T1、T2或T3”时，组合如下表1中所示。
表1.质粒混合物的概括
Figure BPA00001503215800071
附图简述
图1是通过使用逆转录病毒将多种基因转移至新生儿人表皮成纤维细胞建立的人iPS细胞集落的照片表示，其中O代表Oct3/4，S代表Sox2，K代表Klf4，L代表Lin28，N代表Nanog，M代表c-Myc，并且U代表L-Myc。因子的连接表示如“O-M-L”指出通过经由2A序列连接因子的翻译区制备的构建体。在每张照片下的数目指出非ES样集落数目/ES样集落数目。
图2是图1中所示的一些结果的图示。ES样集落数目由实心条指出，并且非ES样集落数目由框线条指出。在图2中，“6种因子”指出其中转移Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28、Nanog和c-Myc或L-Myc基因的情况；“ctrl”指出其中转移除前述6种基因中的Nanog外的5种基因的情况；“L-M”、“M-L”、“L-U”和“U-L”指出其中转移具有每种因子(L代表Lin28，M代表c-Myc，U代表L-Myc)在其中连接的构建体和Oct3/4、Sox2和Klf4的情况。
图3是通过将5种不同质粒pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hKSO、pCXLE-hMLN和pCX-SV40LT转移至成年人表皮成纤维细胞建立的iPS细胞集落的照片表示。左图显示在iPS细胞建立时的照片；右图显示在第3次传代(p3)时的照片。
图4是通过将4种不同质粒pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hKSO和pCXLE-hMLN转移至成年人表皮成纤维细胞建立的iPS细胞集落的照片表示。左图显示在iPS细胞建立时的照片；右图显示在第2次传代(p2)时的照片。
图5是通过将3种不同质粒pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL(左上图)，或3种不同质粒pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK和pCXLE-hMLN(右上图)，或3种不同质粒pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL(左下图)转移至成年人表皮成纤维细胞建立的iPS细胞集落的照片表示。在每个小图上的上列显示使用MEF作为饲养细胞获得的结果。在每个小图上的下列显示使用MSTO细胞作为饲养细胞获得的结果。在最右侧上在左肩上没有集落数目的照片是非ES样集落的照片。
图6是表2中所示的结果的图示。ES样集落数目由实心条指出，并且非ES样集落数目由框线条指出。从左侧起显示的是通过转移下述组合各自获得的结果：
(1)pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hMLN，
(2)pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL，
(3)pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL，
(4)pCXLE-GFP。
图7是通过将3种不同质粒pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK和pCXLE-hMLN(左上图)，或3种不同质粒pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL(左下图)，或3种不同质粒pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK和pCXLE-hMLN(右上图)，或3种不同质粒pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL(右下图)转移至衍生自6岁大的人皮肤的成纤维细胞建立的iPS细胞集落的照片表示。在每个小图上的上列显示使用MEF作为饲养细胞获得的结果。在每个小图上的下列显示使用MSTO细胞作为饲养细胞获得的结果。
图8是通过将3种不同质粒pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK和pCXLE-hMLN(左上图)，或3种不同质粒pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL(左下图)，或3种不同质粒pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK和pCXLE-hMLN(右上图)，或3种不同质粒pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL(右下图)转移至衍生自8个月大的人皮肤的成纤维细胞建立的iPS细胞集落的照片表示。在每个小图上的上列显示使用MEF作为饲养细胞获得的结果。在每个小图上的下列显示使用MSTO细胞作为饲养细胞获得的结果。
图9是表3中所示的结果的图示(使用TIG120)。ES样集落数目由实心条指出，并且非ES样集落数目由框线条指出。从左侧起显示的是通过转移下述组合各自获得的结果：
(1)pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hMLN，
(2)pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK、pCXLE-hMLN，
(3)pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL，
(4)pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL，
(5)pCXLE-GFP。
图10是表3中所示的结果的图示(使用TIG121)。ES样集落数目由实心条指出，并且非ES样集落数目由框线条指出。从左侧起显示的是与对于图9中的解释一样的(1)到(5)。
图11是表3中所示的结果的图示(使用TIG120)。从左侧起显示的是与对于图9中的解释一样的(1)到(5)。
图12显示通过基因组PCR就外源基因(Klf4、c-Myc、OriP)在基因组中的整合的存在或不存在的5种不同iPS细胞检查结果，其中“L”指出关于长DNA的结果，并且“S”指出关于短DNA的结果。由“347A1”指出的是关于在实施例2中建立的iPS集落的结果；“349A1”指出关于在实施例3中建立的iPS集落的结果；“341A5”指出关于通过将由Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28和Nanog组成的6种基因转移至胎儿人成纤维细胞建立的iPS集落的结果；“345A1”指出关于通过转移与用于“347A1”的那些相同的基因获得的另一个iPS集落的结果；并且“352A3”指出关于通过转移与用于“341A5”的那些相同的基因获得的另一个iPS集落的结果。HDF指出关于非转染的胎儿人成纤维细胞的基因组的结果，并且“retro”指出关于通过使用逆转录病毒载体将由Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc组成的4种基因转移至胎儿人成纤维细胞建立的iPS集落。在图12中，“endo”(框线箭头)代表内源基因，并且Tg(实心箭头)代表外源基因。
图13显示在转移后第6和14天时获得的，通过将pCX-EGFP、pCXE-EGFP和pCXLE-EGFP转移至HDF获得的细胞的荧光照片(GFP观察图像)。
图14是测定即使当使用质粒载体(缺乏EBNA-1和oriP的质粒载体)转移p53shRNA时，iPS细胞是否可以建立的检查结果的图示。ES样集落数目由实心条指出，并且非ES样集落数目由框线条指出。从左侧起显示的是通过转移下述组合各自获得的结果：
(1)pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hMLN，
(2)pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK、pCXLE-hMLN，
(3)pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hMLN、pSilencer-shp53，
(4)pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL，
(5)pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL，
(6)pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL、pSilencer-shp53，
(7)pCXLE-EGFP。
图15是通过将pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL转移至来自具有同HLA 4基因型的健康人的牙髓干细胞系DP74和DP94建立的iPS细胞集落的照片表示。
图16是计数通过将多种重编程基因转移至牙髓干细胞系DP74获得的ES样集落的结果的图示。ES样集落数目由实心条指出，并且非ES样集落数目由框线条指出。从左侧起显示的是通过转移下述组合各自获得的结果：
(1)pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hMLN，
(2)pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK、pCXLE-hMLN，
(3)pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL，
(4)pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL，
(5)pEP4-EO2S-ET2K、pEP4-EO2S-EN2K、pCEP4-M2L(图16中的Thomson’s混合物1)，
(6)pEP4-EO2S-ET2K、pEP4-EO2S-Ck2M-EN2L(图16中的Thomson’s混合物2)，
(7)pEP4-EO2S-ET2K、pEP4-EO2S-EN2L、pEP4-EO2S-EM2K(图16中的Thomson’s混合物3)，
(8)pCXLE-GFP。
图17是与图16相同的实验，但使用DP94系的结果的图示。
图18显示使用附加型载体转移的EGFP的表达量(荧光强度)的每周测量结果。上图：通过FACS分析的荧光强度的图表。横坐标轴指出荧光强度；纵坐标轴指出细胞数目。图表中的每个％值指出GFP阳性细胞的比例。下图：细胞的荧光照片(GFP阳性图像)。
图19是通过实时PCR就其具有的附加型载体的拷贝数检查建立iPS细胞的18个克隆的结果图示。纵坐标轴指出附加型载体的拷贝数/1x104细胞。“elepo 6d”代表在重编程基因转移后的第6天时的细胞，并且“起源”(“origin”)代表用于转移的HDF。
图20是通过定量PCR在建立的iPS细胞的9个克隆中表达的Oct3/4量的检查结果图示。框线条指出表达的外源和内源基因的量的总和(表达的总量)，并且实心条指出表达的外源基因的量。在图20中，“elepoD4”代表在转染后的第4天时的细胞，并且“KhES1”和“KhES3”代表人ES细胞。
图21是对Sox2、Klf4、L-Myc和Lin28进行的与图20一样的实验结果的图示。
图22显示通过对由表皮成纤维细胞(TIG和HDF)建立的人iPS细胞、起始TIG和HDF、和人ES细胞的DNA微阵列分析，基于每种基因表达的量中的差异的聚类分析结果。
图23显示进行的DNA微阵列分析结果的散布图，以测定基因表达模式在人ES细胞(KhES3)和HDF(左侧图表)，或人ES细胞(KhES3)和使用附加型载体建立的人iPS细胞(右侧图表)之间是否不同。
图24显示使用附加型载体建立的人iPS细胞的CGH阵列分析结果。数据显示为针对用于转染的TIG细胞(TIG120)的变异。
图25是显示通过培养iPS细胞获得的第一次传代时的细胞形态的照片表示，所述iPS细胞使用附加型载体伴随DP74系用作饲养细胞建立，使用ReproCELL培养基(右)。左图显示使用MSTO作为饲养细胞获得的照片。
图26是显示通过培养iPS细胞获得的第一次传代时的细胞形态的照片表示，所述iPS细胞使用附加型载体在无异物条件下(使用无异物培养基，并且不使用饲养细胞)建立。左图显示使用普通ReproCELL培养基获得的照片。
图27是显示通过培养iPS细胞获得的第一次传代时的细胞形态的照片表示，所述iPS细胞使用附加型载体在无异物条件下(使用无异物培养基，并且使用DP74系作为饲养细胞)建立。
图28显示在无异物条件下pCXLE-EGFP至DP74的转移结果。在左侧上显示的是在普通条件(对照)下的转移结果。上图：相差图像，下图：GFP观察图像。
图29是在表9中所示的6种不同条件下的细胞培养后，在无异物条件下转染后的第26天时出现的ES细胞样集落形态的照片表示。
图30显示附加型表达载体的结构。3种质粒用于Y4混合物(在这个图中，pCXLE-hOct4-shp53描述为pCXLE-hOct3/4-shp53)。重编程因子(OCT3/4、SOX2、KLF4、L-MYC、LIN28和用于p53的shRNA)以黑色显示。还显示了启动子(CAG)、WPRE、多聚腺苷酸化信号(pA)、EBNA-1、OriP和2个loxP位点。
图31显示在epi-iPSC克隆中保留的附加型载体的拷贝数。A：DP衍生的epi-iPS细胞的结果。B：成纤维细胞衍生的epi-iPS细胞的结果。括号中的数目指出每个克隆的传代数。还显示的是用于每个克隆的细胞数目。作为阳性对照，分析了逆转录病毒衍生的iPS克隆(253G-4)和在Y4混合物的电穿孔后6天的成纤维细胞(fibro-d6)。
图32显示通过RT-PCR分析的多能细胞标记基因的表达。A：DP衍生的epi-iPS细胞的结果。B：成纤维细胞衍生的epi-iPS细胞的结果。从用Y1(454B-1)、Y2(454C-2)、Y3(454D-1)和Y4(454E-2、451F-3、457C-1、453F-2、404C-2、409B-2、414C-2、418C-1、421C-1、426C-2、427D-4和428C-2)组合建立的epi-iPSC克隆中分离总RNA。还检查了逆转录病毒衍生的iPSC克隆(201B-7和253G-4)和hESC系(KhES-3和H9)。在标记OCT3/4和Sox2的泳道中，PCR引物仅扩增内源基因，而在Ret-Oct泳道中，PCR引物特异性扩增逆转录病毒Oct3/4转基因。G3PDH作为上样对照进行分析。作为阴性对照，从在Y4混合物的电穿孔后4天的人表皮成纤维细胞(HDF-elepo)中分离总RNA。
图33显示NANOG启动子区的DNA甲基化状态。空心和闭合圆圈分别指出未甲基化和甲基化的CpG。
图34显示衍生自epi-iPSC克隆的畸胎瘤。图34A：454E-2的结果。显示的是神经组织(A)、软骨(B)、肌肉(C)和肠样上皮(D)的苏木精和伊红染色。比例尺＝50μm。图34B：404C-2、409B-2、418C-1、421C-1、428C-2和454D-1的结果。显示的是神经组织、软骨和肠样上皮的苏木精和伊红染色。比例尺(右下角)＝50μm。
图35显示从epi-iPSC克隆(克隆454E-2)分化成多巴胺能神经元。图35A：显示的是关于Tuj1(绿色，E)、TH(红色，F)、和具有使用Hoechst 33342的核染色的合并图像(蓝色，G)的免疫染色图像。比例尺＝20μm。图35B：(A-C)用于巢蛋白(Nestin)(绿色)和Ki67(红色)的双重免疫染色，伴随DAPI核染色(蓝色)。高倍放大图像显示于(D)中。(E和F)关于Pax6(红色)和TH(绿色)的双重免疫染色。(G)关于TH(红色)和TuJ1(绿色)伴随DAPI的双重免疫染色。(H和I)关于TH(红色)和MAP2ab(绿色)的双重免疫染色。(J和K)关于TH(红色)和囊状单胺转运蛋白2(VMAT2，绿色)的双重免疫染色。比例尺：在(A-C、E-G)中100μm；在(D、H-K)中20μm。
图36显示来自人外周血单核细胞的iPS细胞的建立。图36a显示实验程序的概括。图36b是通过将3种不同质粒pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL转移至人外周血单核细胞建立的iPS细胞集落的照片表示。
发明详述
本发明提供了产生iPS细胞的方法，其包括使下述物质与体细胞接触：(a)Oct3/4或编码其的核酸、(b)Klf4或编码其的核酸、和(c)Sox2或编码其的核酸、以及(d1)L-Myc或编码其的核酸和/或(d2)p53的功能抑制剂。
(A)体细胞的来源
除哺乳动物起源(例如人、小鼠、猴、猪、大鼠等)的生殖细胞外的任何细胞可以用作用于iPS细胞生产的原材料。例子包括角质化上皮细胞(例如角质化表皮细胞)、粘膜上皮细胞(例如舌的浅层的上皮细胞)、外分泌腺上皮细胞(例如乳腺细胞)、激素分泌细胞(例如肾上腺髓质细胞)、用于代谢或贮存的细胞(例如肝细胞)、构成界面的内膜上皮细胞(例如I型肺泡细胞)、闭膜管的内膜上皮细胞(例如血管内皮细胞)、含具有转运能力的纤毛的细胞(例如气道上皮细胞)、用于细胞外基质分泌的细胞(例如成纤维细胞)、收缩细胞(例如平滑肌细胞)、血管和免疫系统的细胞(例如T淋巴细胞)、感觉相关细胞(例如杆状细胞)、自主神经系统神经元(例如胆碱能神经元)、感觉器官和外周神经元的支持细胞(例如卫星细胞)、中枢神经系统的神经细胞和神经胶质细胞(例如星形胶质细胞)、色素细胞(例如视网膜色素上皮细胞)、其祖细胞(组织祖细胞)等。对细胞分化的程度、细胞从其中收集的动物的年龄等没有限制；即使未分化的祖细胞(包括体干细胞)和最终分化的成熟细胞可以同样用作本发明中体细胞的来源。
未分化的祖细胞的例子包括组织干细胞(体干细胞)例如神经干细胞、造血干细胞、间质干细胞、脂肪衍生的基质(干)细胞和牙髓干细胞。造血和间质干细胞在骨髓、脐带血和胎盘中丰富含有。因为骨髓、脐带血和胎盘已保藏于公众和私人的许多血库中，并且用于治疗血液疾病例如白血病，所以此类保藏的骨髓、脐带血和胎盘还可以用作用于iPS细胞库的体细胞的来源。特别地，因为脐带血可以容易地从在分娩时获得的脐带血中收集，所以从脐带血中获得的造血和间质干细胞是用于iPS细胞库的体细胞的优选来源。牙髓干细胞也预期充当用于iPS细胞库的体细胞的来源，因为它们是可容易获得的，如从用于治疗牙周病等拔出的智齿和其他牙中分离且制备。
最终分化的成熟细胞的例子包括外周血单核细胞例如T细胞和B细胞。外周血的取样是临床测定中最低限度侵入性的和常规进行的。因为在临床测定后留下未使用的小量外周血样品通常被弃去，所以它们是用于iPS细胞库的体细胞的优选来源。特别地，因为T细胞相对容易在体外扩增，所以iPS细胞可以由即使小量外周血样品建立。来自外周血T细胞的iPS细胞的生成近期已由几个团体报道(Seki等人，Cell Stem Cell，7：11-14(2010)；Loh等人，Cell Stem Cell，7：15-19(2010)；Staerk等人，Cell Stem Cell，7：20-24(2010))。
哺乳动物个体作为体细胞的来源的选择并无具体限制；然而，当获得的iPS细胞待用于人中的再生医学时，从预防移植物排除的观点来看，优选收集来自患者或具有与患者那种相同或基本上相同的HLA类型的另一个人的体细胞。如本文使用的，“基本上相同的HLA类型”意指供体的HLA类型匹配患者的那种，其程度至已通过诱导衍生自供体的体细胞的iPS细胞分化获得的移植细胞可以移入的程度，此时它们伴随免疫抑制剂的使用等移植给患者。例如，它包括其中主要HLA(例如HLA-A、HLA-B和HLA-DR的3个主要基因座，进一步包括HLA-Cw的4个主要基因座)是等同的(下文会应用相同含义)的HLA类型等。当获得的iPS细胞不施用(移植)于人，但用作例如用于筛选用于评估患者的药物敏感性或不良反应的细胞来源时，同样希望从患者或具有与药物敏感性或不良反应关联的相同遗传多态性的另一个个人中收集体细胞。
在实施核重编程步骤前，从哺乳动物中分离的体细胞可以根据细胞的选择使用本身已知适合于其培养的培养基进行预培养。此类培养基的例子包括但不限于含有约5-20％胎牛血清(FCS)的最低必需培养基(MEM)、达尔贝科改良伊格尔(DMEM)培养基、RPMI1640培养基、199培养基、F12培养基等。当牙髓干细胞用作细胞时，例如优选使用用于间质干细胞的培养基，例如间质干细胞基础培养基(Lonza)。当转移试剂例如阳离子脂质体例如用于使体细胞与核重编程物质和p53的功能抑制剂(和另一种iPS细胞建立效率改进剂，如果需要的话)接触时，有时优选培养基已由无血清培养基替换，以便阻止转移效率减少。
为了获得适合于人临床应用的完全无异物人iPS细胞，更希望使用不含有衍生自非人动物的任何成分例如FCS的培养基。包含补充有适合于培养多种体细胞的人衍生成分(特别地，重组人蛋白质例如生长因子)、非必需氨基酸、维生素等的基础培养基的培养基是商购可得的；本领域技术人员能够根据体细胞的来源选择合适的无异物培养基。使用合适的无异物细胞解离溶液，将使用无异物培养基预培养的体细胞与培养器皿解离，并且回收，这之后使它们与核重编程物质和p53的功能抑制剂接触。
(B)核重编程物质
如本文使用的，“核重编程物质”可以是能够诱导来自体细胞的iPS细胞的一种或多种蛋白质因子或编码其的核酸(包括在载体中整合的形式)。在本发明中使用的核重编程物质由至少Oct3/4、Klf4和Sox2或编码其的核酸组成(Klf4和/或Sox2可以由已报道能够代替其功能的另一种因子替换)。当在组合中不使用p53的功能抑制剂时，组合L-Myc或编码其的核酸、和Lin28或Lin28b或编码其的核酸作为另外的核重编程物质。在本发明中使用的核重编程物质排除Nanog或编码其的核酸。具体地，在本发明中使用的核重编程物质由下述组合例示(此处，仅显示关于蛋白质因子的名称)：
(1)Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc(此处、Sox2可由Sox1、Sox3、Sox15、Sox17或Sox18替换；Klf4可由Klf1、Klf2或Klf5替换)
(2)Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、TERT、SV40大T抗原(下文SV40LT)
(3)Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、TERT、HPV16E6
(4)Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、TERT、HPV16E7
(5)Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、TERT、HPV16E6、HPV16E7
(6)Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、TERT、Bmil
(7)Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、Lin28
(8)Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、Lin28、SV40LT
(9)Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、Lin28、TERT、SV40LT
(10)Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、SV40LT
(11)Oct3/4、Esrrb、Sox2、L-Myc(Esrrb可由Esrrg替换)
(12)Oct3/4、Klf4、Sox2
(13)Oct3/4、Klf4、Sox2、TERT、SV40LT
(14)Oct3/4、Klf4、Sox2、TERT、HPV16E6
(15)Oct3/4、Klf4、Sox2、TERT、HPV16E7
(16)Oct3/4、Klf4、Sox2、TERT、HPV16E6、HPV16E7
(17)Oct3/4、Klf4、Sox2、TERT、Bmil
(18)Oct3/4、Klf4、Sox2、Lin28
(19)Oct3/4、Klf4、Sox2、Lin28、SV40LT
(20)Oct3/4、Klf4、Sox2、Lin28、TERT、SV40LT
(21)Oct3/4、Klf4、Sox2、SV40LT
(22)Oct3/4、Esrrb、Sox2(Esrrb可由Esrrg替换)
在上文组合中，可以使用Lin28b代替Lin28。当使用Esrrb或Esrrg[上文(11)和(22)]时，Klf4可以与之组合使用。
不落入上文(1)至(22)中但包含(1)至(22)中任一项的所有组成成分且进一步包含任选选择的其他物质的任何组合也可以包括在本发明的“核重编程物质”的范围中。如果经历核重编程的体细胞内源以足以引起核重编程的水平表达上文(1)至(22)中任一项的一种或多种组成成分，那么不含有这一种或多种组成成分的仅其余组成成分的组合也可以包括在本发明的“核重编程物质”的范围中。
在这些组合中，由Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28(Lin28b)和L-Myc组成的5种因子，和由Oct3/4、Sox2、Klf4和Lin28(Lin28b)组成的4种因子是优选的核重编程物质。还优选的是由上文5或4种因子和另外的SV40大T抗原组成的6或5种因子。
关于上述核重编程物质的小鼠和人cDNA序列的信息可参考WO2007/069666中提及的NCBI登记号获得(在该公开物中，Nanog描述为ECAT4。关于Lin28、Lin28b、Esrrb、Esrrg、L-Myc的小鼠和人cDNA序列的信息可以分别通过参考下述NCBI登记号获得)；本领域技术人员可容易地能够分离这些cDNA。
Figure BPA00001503215800171
用于用作核重编程物质的蛋白质因子可以通过下述方法进行制备：将获得的cDNA插入合适的表达载体内，将载体引入宿主细胞内，并且从培养的细胞或其条件化培养基中回收重组蛋白质因子。同时，当使用的核重编程物质是编码蛋白质因子的核酸时，将获得的cDNA插入病毒载体、质粒载体、附加型载体等内，以构建表达载体，并且对载体实施核重编程的步骤。
(c)将核重编程物质转移至体细胞的方法
将核重编程物质转移至体细胞可以使用本身已知用于蛋白质转移到细胞内的方法来达到，条件是该物质是蛋白质因子。此类方法包括例如使用蛋白质转移试剂的方法、使用蛋白质转移结构域(PTD)-或细胞穿透肽(CPP)-融合蛋白的方法、显微注射法等。蛋白质转移试剂是商购可得的，包括基于阳离子脂质的那些，例如BioPOTER ProteinDelivery Reagent(Gene Therapy Systems)、Pro-JectTM ProteinTransfection Reagent(PIERCE)和ProVectin(IMGENEX)；基于脂质的那些，例如Profect-1(Targeting Systems)；基于可透过膜的肽的那些，例如Penetrain Peptide(Q biogene)和Chariot Kit(Active Motif)，利用HVJ包膜(灭活的日本血凝病毒)的GenomONE(ISHIHARASANGYO KAISHA，LTD.)等。转移可以根据与这些试剂附着的方案来达到，通用程序如下文所述。将一种或多种核重编程物质在合适溶剂(例如缓冲溶液例如PBS或HEPES)中稀释，加入转移试剂，将混合物在室温孵育约5-15分钟，以形成复合物，在用无血清培养基更换培养基后将这种复合物加入细胞中，并且将细胞在37℃孵育1一数小时。其后，去除培养基且用含血清培养基替换。
开发的PTD包括使用蛋白质的跨细胞结构域的那些例如果蝇衍生的AntP、HIV衍生的TAT(Frankel，A.等人，Cell 55，1189-93(1988)或Green，M.&Loewenstein，P.M.Cell 55，1179-88(1988))、Penetratin(Derossi，D.等人，J.Biol.Chem.269，10444-50(1994))、Buforin II(Park，C.B.等人Proc.Natl Acad.Sci.USA 97，8245-50(2000))、Transportan(Pooga，M.等人FASEB J.12，67-77(1998))、MAP(模型两亲肽)(Oehlke，J.等人Biochim.Biophys.Acta.1414，127-39(1998))、K-FGF(Lin，Y.Z.等人J.Biol.Chem.270，14255-14258(1995))、Ku70(Sawada，M.等人Nature Cell Biol.5，352-7(2003))、Prion(Lundberg，P.等人Biochem.Biophys.Res.Commun.299，85-90(2002))、pVEC(Elmquist，A.等人Exp.Cell Res.269，237-44(2001))、Pep-1(Morris，M.C.等人Nature Biotechnol.19，1173-6(2001))、Pep-7(Gao，C.等人Bioorg.Med.Chem.10，4057-65(2002))、SynBl(Rousselle，C.等人Mol.Pharmacol.57，679-86(2000))、HN-I(Hong，F.D.&Clayman，G L.Cancer Res.60，6551-6(2000))和HSV-衍生VP22。衍生自PTD的CPP包括聚精氨酸，例如11R(CellStem Cell，4，381-384(2009))和9R(Cell Stem Cell，4，472-476(2009))。
制备掺入核重编程物质的cDNA和PTD或CPP序列的融合蛋白表达载体，并且使用该载体进行重组表达。回收融合蛋白且用于转移。转移可以以与上文相同的方式进行，除不加入蛋白质转移试剂外。
显微注射，将蛋白质溶液置于具有约1μm的尖端直径的玻璃针中，并且将溶液注射到细胞内的方法，确保蛋白质转移到细胞内。
蛋白质转移操作可以进行一次或多次任选选择的次数(例如一次或多次到10次或更少，或一次或多次到5次或更少等)。优选地，转移操作可以重复进行2次或更多(例如3次或4次)。用于重复转移操作的时间间隔是例如6-48小时，优选12-24小时。
然而，考虑到iPS细胞的建立效率，核重编程物质可以优选以编码蛋白质因子的核酸而不是像这样的因子的形式使用。核酸可以是DNA或RNA、或DNA/RNA嵌合体，并且可以是双链或单链的。优选地，核酸是双链DNA，特别是cDNA。
将核重编程物质的cDNA插入包含能够在宿主体细胞中起作用的启动子的合适表达载体内。有用的表达载体包括例如病毒载体例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和仙台病毒、用于在动物细胞中表达的质粒(例如pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)等。
待使用的载体类型可以根据待获得的iPS细胞的预期用途适当选择。有用的载体包括腺病毒载体、质粒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体、附加型载体等。
在表达载体中使用的启动子的例子包括EF1α启动子、CAG启动子、SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV(巨细胞病毒)启动子、RSV(劳斯肉瘤病毒)启动子、MoMuLV(莫洛尼小鼠白血病病毒)LTR、HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)启动子等，其中优先给予EF1α启动子、CAG启动子、MoMuLV LTR、CMV启动子、SRα启动子等。
需要时，除启动子外，表达载体可以含有增强子、多聚腺苷酸化信号、筛选标记基因、SV40复制起点等。筛选标记基因的例子包括二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等。
其为核重编程物质(重编程基因)的核酸可以分开整合到不同表达载体内，或2种或更多、优选2至3种不同基因可以整合到单一表达载体内。使用提供高转染效率的逆转录病毒或慢病毒载体时，优选使用前者，使用质粒、腺病毒或附加型载体等时，优选使用后者。此外，掺入2种或更多不同基因的表达载体和掺入单独一种基因的另一种表达载体可以组合使用。
在上文背景中，当多种重编程基因[例如2种或更多、优选2或3种不同基因，选自Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc、Lin28(Lin28b)和SV40LT]整合到一种表达载体中时，这些基因可以优选经由使得多顺反子表达成为可能的序列整合到表达载体内。通过使用使得多顺反子表达成为可能的序列，可以更有效地表达在一种表达载体中整合的多种基因。使得多顺反子表达成为可能的有用序列包括例如口蹄疫病毒的2A序列(SEQ ID NO：63；PLoS ONE 3，e2532，2008，Stem Cells 25，1707，2007)、IRES序列(美国专利号4,937,190)等，其中优先给予2A序列。当多种重编程基因作为多顺反子连接的插入一种表达载体内时，重编程基因的次序并无具体限制；例如，(i)Sox2和Klf4，(ii)L-Myc和Lin28(Lin28b)，(iii)Klf4，Sox2和Oct3/4可以以这个次序以从5’到3’的方向连接在一起。
具有重编程基因的表达载体可以根据载体的选择通过本身已知的技术引入细胞内。在病毒载体的情况下，例如，将含有核酸的质粒引入合适的包装细胞(例如Plat-E细胞)或互补细胞系(例如293细胞)内，回收培养上清液中产生的病毒载体，并且通过适合于病毒载体的方法将载体传染给细胞。例如，使用逆转录病毒载体的具体方法公开于WO2007/69666，Cell，126，663-676(2006)和Cell，131，861-872(2007)中。使用慢病毒载体的具体方法公开于Science，318，1917-1920(2007)中。当iPS细胞用作用于再生医学的细胞来源时，重编程基因的表达(再激活)潜在增加由衍生自iPS细胞的分化细胞再生的组织中的癌发生危险；因此，重编程基因优选是瞬时表达的，而不整合到细胞的染色体内。从这个观点来看，其很少整合到染色体内的腺病毒载体的使用是优选的。使用腺病毒载体的具体方法公开于Science，322，945-949(2008)中。因为腺伴随病毒载体在整合到染色体内的效率中也很低，并且就细胞毒性和炎症诱导性而言低于腺病毒载体，所以它可以作为另一种优选载体提及。因为仙台病毒能够稳定存在于染色体外，并且可以根据需要使用siRNA降解且去除，所以它也是优选利用的。关于仙台病毒载体，可以使用J.Biol.Chem.，282，27383-27391(2007)，Proc.Jpn.Acad.，Ser.B 85，348-362(2009)或JP-B-3602058中描述的那种。
当使用逆转录病毒载体或慢病毒载体时，即使转基因的沉默已发生，它仍可能变得再激活；因此，例如可以优选使用这样的方法，其中当变得不需要时，使用Cre-loxP系统切掉编码核重编程物质的核酸。即，具有预先在核酸的两端上排列的loxP序列，诱导iPS细胞，其后使用质粒载体或腺病毒载体允许Cre重组酶作用于细胞，从而可以切掉通过loxP序列夹心的区域。因为LTR U3区的增强子-启动子序列可能通过插入突变上调其附近的宿主基因，所以更优选使用通过缺失序列或用例如SV40的多聚腺苷酸化序列替换序列而制备的3′自灭活的(SIN)LTR，以避免loxP序列外侧的保留在基因组中而不被切掉的LTR对内源基因的表达调节。使用Cre-loxP系统和SIN LTR的具体方法公开于Chang等人，Stem Cells，27：1042-1049(2009)中。
同时，作为非病毒载体，使用脂转染法、脂质体法、电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、显微注射法、基因枪法等，可以将质粒载体转移到细胞内。使用质粒作为载体的具体方法在例如Science，322，949-953(2008)等中描述。
当使用质粒载体、腺病毒载体等时，转染可以进行一次或多次任选选择的次数(例如一次到10次，一次到5次等)。当2种或更多种表达载体引入体细胞内时，优选这些所有种类的表达载体同时引入体细胞内；然而，即使在这种情况下，转染也可以进行一次或多次任选选择的次数(例如一次到10次，一次到5次等)，优选地，转染可以重复进行2次或更多(例如3次或4次)。
当使用腺病毒或质粒时，转基因也可以变得整合到染色体内；因此，最终需要通过DNA印迹(Southern blot)或PCR证实不存在基因插入染色体内的情况。为此，如同上述Cre-loxP系统，使用其中转基因整合到染色体内其后去除基因的方法可能是有利的。在另一个优选实施方案方式中，可以使用其中转基因通过转座子整合到染色体内其后通过使用质粒载体或腺病毒载体使转座酶作用于细胞的方法，以便从染色体中完全消除转基因。作为优选转座子的例子，可以提及piggyBac，衍生自鳞翅目昆虫的转座子等。使用piggyBac转座子的具体方法公开于Kaji，K.等人，Nature，458：771-775(2009)，Woltjen等人，Nature，458：766-770(2009)中。
另一种优选的非整合型载体是附加型载体，其能够在染色体外自我复制。使用附加型载体的具体方法公开于Yu等人，Science，324，797-801(2009)中。在本发明的一个特别优选的实施方案中，可以使用具有以相同方向置于对于附加型载体复制必需的载体组成成分的5’和3’侧上的loxP序列的附加型载体。因为附加型载体能够在染色体外自我复制，所以它可以确保在宿主细胞中的稳定基因表达，即使它未整合到基因组中。然而，一旦iPS细胞建立，就希望载体被快速去除。通过使对于附加型载体复制必需的载体组成成分侧接在2个loxP序列之间，并且通过Cre重组酶的作用切掉载体组成成分，可以使得附加型载体丧失其自我复制潜力，从而载体可以被迫从iPS细胞中早期脱落。
在本发明中待使用的附加型载体的例子包括包含对于自我复制必需的衍生自EBV、SV40的序列等作为载体组分的载体。对于自我复制必需的载体组分通过复制起点和编码与复制起点结合以控制复制的蛋白质的基因具体例示；例子包括用于EBV的复制起点oriP和EBNA-1基因，和用于SV40的复制起点ori和SV40大T抗原基因。
附加型表达载体包含控制重编程基因转录的启动子。使用的启动子可以如上所述。如上所述，附加型表达载体可以根据需要进一步含有增强子、多聚腺苷酸化信号、可用于选择的标记基因等。可用于选择的标记基因的例子包括二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因等。
除噬菌体P1衍生的野生型loxP序列(SEQ ID NO：29)外，在本发明中有用的loxP序列包括任选选择的突变型loxP序列，当以相同方向置于侧接对于重编程基因复制必需的载体组分的位置时，能够通过重组缺失由loxP序列侧接的序列。此类突变型loxP序列的例子包括在5′重复中突变的lox71(SEQ ID NO：30)、在3′重复中突变的lox66(SEQID NO：31)、以及在间隔物部分中突变的lox2272和lox511。尽管置于载体组分的5’和3’侧上的2个loxP序列可以是等同或不等同的，但在间隔物部分中突变的2个突变型loxP序列必须是等同的(例如一对lox2272序列、一对lox511序列)。优先给予在5′重复中突变的突变型loxP序列(例如lox71)和在3′重复中突变的突变型loxP序列(例如lox66)的组合。在这种情况下，在染色体上保留的loxP序列具有由于重组在5′侧和3′侧所产生的重复中的双重突变，并且因此不太可能由Cre重组酶识别，从而减少由于不需要的重组引起染色体中的缺失突变的危险。当突变型loxP序列lox71和lox66组合使用时，各自可以置于前述载体组分的5′和3′的任何一侧上，但突变型loxP序列必须以这样的方向插入，从而使得突变位点将位于分别的loxP序列的外部末端。尽管本发明的优选附加型载体是即使无需通过Cre重组酶作用也从细胞中早期脱落的自我去除载体，但存在其中附加型载体花费更长时间从细胞中脱落的可能例外的情况。因此，优选可以设计loxP序列以备风险例如由于Cre重组酶处理产生的不需要的重组。
2个loxP序列各自以相同方向置于对于重编程基因复制必需的载体组成成分(即复制起点、或编码与复制起点结合以控制复制的蛋白质的基因序列)的5’和3’侧上。由loxP序列侧接的载体组成成分可以是复制起点或编码与复制起点结合以控制复制的蛋白质的基因序列，或两者。
为了增加RNA稳定性，附加型载体或质粒载体可以例如具有插入重编程基因编码区和多聚腺苷酸化信号之间的旱獭肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)序列。
附加型载体允许载体引入细胞内，使用例如脂转染法、脂质体法、电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、显微注射法、基因枪法等。具体地，例如可以使用Science，324：797-801(2009)中和其他地方描述的方法。
对于重编程基因复制必需的载体组分是否已从iPS细胞中去除可以通过进行DNA印迹分析或PCR分析得到证实，使用包含在载体组分中和/或在loxP序列附近的核苷酸序列的核酸作为探针或引物，以从iPS细胞中分离的附加体部分作为模板，并测定条带的存在或不存在或检测到的条带的长度。附加体部分可以通过本领域显而易见的方法进行制备；例如，可以使用Science，324：797-801(2009)中和其他地方描述的方法。
如下文实施例中所述，由本发明提供的含有loxP序列的某些附加型载体不仅显示出其中构成载体的外源核酸因子(包括重编程基因)不会即使瞬时整合到细胞的基因组中的任何附加型载体的必需效果，还具有其中当转移至体细胞时，无需用Cre重组酶处理，以附加体形式的载体从iPS细胞中早期脱落的出乎意料的效应。相应地，本发明还提供了在提供足以建立iPS细胞的重编程因子的表达水平后，从细胞中早期脱落的自我去除附加型载体。这种载体的特征在于它以50％或更多、优选60％或更多、更优选70％或更多的频率到第5次传代时从iPS细胞中脱落。可替代地，自我去除附加型载体的特征在于在转移后在1周内每1x104细胞的拷贝数与106细胞相似，而载体在细胞中不稳定以至在iPS细胞建立时(例如在载体转移后约4周)每1x104细胞的拷贝数减少至100或更少、优选50或更少、更优选30或更少的程度。
具体地，本发明的早期自我去除载体具有下述结构特征(i)到(iv)中的至少一个、优选2个或更多、更优选3个或更多、特别优选所有。
(i)2个loxP序列以相同方向置于对于附加型载体复制必需的载体组成成分的5’和3’侧上(例如EBNA-1基因和SV40大T抗原基因，优选EBNA-1基因)。
(ii)编码重编程因子的核酸在CAG启动子的控制下。
(iii)编码重编程因子的核酸在兔β-球蛋白多聚腺苷酸化信号的控制下。
(iv)WPRE序列存在于编码重编程因子的核酸和多聚腺苷酸化信号之间。
(D)p53的功能抑制剂
在本发明中，更优选除上述核重编程物质外，使p53的功能抑制剂与起始细胞接触。如本文提及的，“p53功能的抑制剂”可以是能够抑制(a)p53蛋白质的功能或(b)p53基因的表达的任何物质。即，不仅直接作用于p53蛋白质以抑制其功能的物质和直接作用于p53基因以抑制其表达的物质，而且作用于涉及p53信号转导的因子以导致p53蛋白质的功能或p53基因的表达抑制的物质，也包括在如本文提及的“p53功能的抑制剂”的范围中。优选地，p53的功能抑制剂是抑制p53基因的表达的物质，更优选编码针对p53的siRNA或shRNA的表达载体。
抑制p53蛋白质功能的物质的例子包括但不限于p53的化学抑制剂、p53的显性失活突变体或编码其的核酸、抗p53拮抗剂抗体或编码其的核酸、包含p53应答元件的共有序列的诱饵核酸、抑制p53途径的物质等。优选地，可以提及p53的化学抑制剂、p53的显性失活突变体或编码其的核酸、和p53途径抑制剂。
(D 1)p53的化学抑制剂
p53的化学抑制剂的例子包括但不限于由公开于WO 00/44364中的pifithrin(PFT)-α和-β、公开于Storm等人(Nat.Chem.Biol.2，474(2006))中的PFT-μ、及其类似物和盐(例如酸加成盐例如盐酸盐和氢溴化物等)等代表的p53抑制剂。在这些抑制剂中，PFT-α及其类似物[2-(2-亚氨基-4，5，6，7-四氢苯并噻唑-3-基)-1-对甲苯乙酮，HBr(产物名称：Pifithrin-α)和1-(4-硝基苯基)-2-(4，5，6，7-四氢-2-亚氨基-3(2H)-苯并噻唑)乙酮，HBr(产物名称：Pifithrin-α，p-硝基)]，PFT-β及其类似物[2-(4-甲苯基)咪唑并[2，1-b]-5，6，7，8-四氢苯并噻唑，HBr(产物名称：Pifithrin-α，环状)和2-(4-硝基苯基)咪唑并[2，1-b]-5，6，7，8-四氢苯并噻唑(产物名称：Pifithrin-α，p-硝基，环状)]，和PFT-μ[苯乙酰基烯基磺酰胺](产物名称：Pifithrin-μ)]是从Merck商购可得的。
p53的化学抑制剂与体细胞的接触可以通过下述方法进行：将抑制剂以合适浓度溶解于水性或非水性溶剂中，将抑制剂的溶液加入适合于培养从人或小鼠中分离的体细胞的培养基(例如补充有约5-20％胎牛血清的最低必需培养基(MEM)、达尔贝科改良伊格尔(DMEM)、RPMI 1640培养基、199培养基、F12培养基等)中，从而使得抑制剂浓度将落入完全抑制p53功能且不引起细胞毒性的范围中，并且将细胞培养给定时间。抑制剂浓度取决于使用的抑制剂种类而改变，并且适当地选择在约0.1nM-约100nM的范围上。接触的持续时间并无具体限制，只要它足以达到细胞的核重编程；通常，可以允许抑制剂共存在于培养基中，直至阳性集落出现。
p53基因称为肿瘤抑制基因；p53功能的永久抑制潜在增加癌发生的危险。p53的化学抑制剂是有用的，不仅是因为仅仅通过加入培养基中就可引入细胞内的优点，还因为在iPS细胞诱导后通过去除含有抑制剂的培养基，容易且快速地终止p53功能的抑制的能力。
(D2)p53的显性失活突变体
p53的显性失活突变体的选择并无具体限制，只要突变体能够竞争性针对在体细胞中内源表达的野生型p53蛋白质作用，以抑制其功能；例如，可以提及p53P275S，起因于位于小鼠p53的DNA结合区中的位置275(在人的情况下，位置278)上的脯氨酸至丝氨酸的点突变(deVries，A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99，2948-2953(2002))；p53DD，产生于在小鼠p53的位置14-301(在人p53中，对应于位置11-304)上的氨基酸缺失(Bowman，T.，Genes Develop.，10，826-835(1996))等。其他已知突变体包括例如p53S58A，产生于在小鼠p53的位置58(在人的情况下，位置61)上的丝氨酸至丙氨酸的点突变；p53C135Y，产生于在人p53的位置135(在小鼠的情况下，位置132)上的半胱氨酸至酪氨酸的点突变；p53A135V，产生于在小鼠p53的位置135(在人的情况下，位置138)上的丙氨酸至缬氨酸的点突变；p53R172H，产生于在位置172(在人的情况下，位置175)上的精氨酸至组氨酸的点突变；p53R270H，产生于在位置270(在人的情况下，位置273)上的精氨酸至组氨酸的点突变；p53D278N，产生于在小鼠p53的位置278(在人的情况下，位置281)上的天冬氨酸至天冬酰胺的点突变等；这些可以以相同方式使用。
p53的显性失活突变体可以通过例如下文描述的技术获得。首先，基于由SEQ ID NO：1或3所示的小鼠或人p53cDNA序列信息合成合适的寡核苷酸作为探针或引物，并且使用杂交法或(RT-)PCR法，从衍生自小鼠或人细胞或组织的mRNA、cDNA或cDNA文库克隆小鼠或人p53cDNA，并且亚克隆到合适质粒内。以突变待引入其内的位点的密码子(例如在p53P275S的情况下，cct，由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的核苷酸编号951-953表示)由编码另一个所需氨基酸的密码子(例如在p53P275S的情况下，tct)替换的形式，合成包含该位点的引物，并且使用这种引物进行反向PCR，以掺入p53cDNA的质粒作为模板，由此获得编码所需显性失活突变体的核酸。在缺失突变体如p53DD的情况下，可以设计在待缺失的位点外的引物，并且可以如上所述进行反向PCR。通过将编码显性失活突变体的上述获得的核酸引入宿主细胞内，并且从培养的细胞或其条件化培养基中回收重组蛋白质，可以获得所需显性失活突变体。
显性失活突变体与体细胞的接触可以通过与上述蛋白质核重编程物质一样的方式来达到。如上所述，p53功能的永久抑制潜在增加癌发生的危险。然而，因为p53的显性失活突变体经历通过蛋白酶的降解，并且在转染细胞中逐渐消失，并且相应地恢复在细胞中内源表达的p53的功能，所以突变蛋白质的使用在需要高安全的情况下可能是合适的，如在利用iPS细胞用于治疗用途中。
(D3)编码p53的显性失活突变体的核酸
在本发明的另一个优选实施方案方式中，p53功能的抑制剂是编码p53的显性失活突变体的核酸。核酸可以是DNA或RNA、或DNA/RNA嵌合体，且优选是DNA。核酸可以是双链或单链的。编码p53的显性失活突变体的cDNA可以通过上文关于突变蛋白质的制备描述的技术进行克隆。
与作为核重编程物质(重编程基因)的上述核酸一样，分离的cDNA可以插入合适的表达载体内并且转移至体细胞。
(D4)p53途径抑制剂
此处使用的术语p53途径的含义包括可以激活p53的所有上游信号级联和由激活的p53介导的所有下游信号级联。因此，p53途径抑制剂包括抑制上述信号转导途径中任何一个的所有物质，但在优选实施方案方式中，p53途径抑制剂是抑制p21的表达或功能(Myc抑制活性)的物质，所述p21的转录由p53激活；例如，可以提及siRNA、shRNA、反义核酸、针对p21的核酶等。抑制p21表达的这些核酸可以以与下文所述用于siRNA、shRNA、反义核酸、针对p53的核酶的方法一样的方式进行设计且合成，并且可以引入体细胞内。核酸可以以表达其的载体的形式提供，载体可以以与下文所述用于表达siRNA、shRNA、反义核酸、针对p53的核酶的载体的方法一样的方式进行构建，且引入体细胞内。
在另一个优选实施方案方式中，p53途径抑制剂是抑制ARF-MDM2-p53途径的物质，例如，作为ARF-MDM2-p53途径抑制剂，可以提及与p53直接结合以促进其核输出或泛素化的MDM2或编码其的核酸，抑制p19ARF或ATM(突变的运动失调性毛细血管扩张症)的表达或功能的物质，其抑制MDM2对p53的作用(例如针对这些因子的siRNA和shRNA)等。
(D5)其他物质
作为抑制p53蛋白质功能的其他物质的例子，可以提及抗p53拮抗剂抗体或编码其的核酸。抗p53拮抗剂抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。抗体的同种型并无具体限制，并且优选是IgG、IgM或IgA，特别优选IgG。除完整抗体分子外，抗体可以是例如片段例如Fab、Fab’或F(ab’)2，通过基因工程技术制备的缀合物分子，例如scFv、scFv-Fc、微型抗体或双价抗体，或由具有蛋白质稳定作用的分子例如聚乙二醇(PEG)修饰的衍生物。通过本身已知的抗体或抗血清生产方法，抗p53拮抗剂抗体可以使用p53或其部分肽作为抗原产生。作为已知抗p53拮抗剂抗体的例子，可以提及PAb1801(Oncogene Science Ab-2)和DO-1(Oncogene Science Ab-6)(Gire和Wynford-Thomas，Mol.Cell.Biol.，18，1611-1621(1998))等。编码抗p53拮抗剂抗体的核酸可以通过常规方法从杂交瘤中分离，所述杂交瘤产生抗p53单克隆抗体。获得的H链和L链基因可以连接在一起，以制备编码单链抗体的核酸。
作为抑制p53蛋白质的功能的另一种物质，可以提及抗p21拮抗剂抗体或编码其的核酸。抗p21拮抗剂抗体和编码其的核酸也可以与上述抗p53拮抗剂抗体和编码其的核酸一样制备。
抑制p53蛋白质的功能的另外一种物质是包含p53应答元件的共有序列的诱饵核酸(例如Pu-Pu-Pu-G-A/T-T/A-C-Py-Py-Py(Pu：嘌呤碱基，Py：嘧啶碱基)；SEQ ID NO：27)。此类核酸可以使用自动化DNA/RNA合成仪基于上述核苷酸序列信息合成。可替代地，此类诱饵核酸是商购可得的(例如p53转录因子诱饵(GeneDetect.com))。
用在p53的显性失活突变体或编码其的核酸的陈述中分别描述的方法，可以将抗p53拮抗剂抗体和抗p21拮抗剂抗体或编码抗体的核酸引入细胞内。上述诱饵核酸可以通过脂转染法等引入细胞内。
同时，作为抑制p53基因表达的物质的例子，可以提及针对p53的siRNA或shRNA、表达针对p53的siRNA或shRNA的载体、针对p53的反义核酸和针对p53的核酶等，并且针对p53的siRNA和shRNA和表达siRNA或shRNA的载体是优选的。
(D6)针对p53的siRNA和shRNA
针对p53的siRNA可以基于由SEQ ID NO：1或3所示的小鼠或人p53cDNA序列信息进行设计，并依照例如由Elbashir等人(Genes Dev.，15，188-200(2001))提出的原则。作为一般规则，关于siRNA的靶序列是AA+(N)19，但可以是AA+(N)21或NA+(N)21。有义链的5′末端无需是AA。尽管靶序列的位置并无具体限制，但希望靶序列选自除5’-UTR、从起始密码子起约50个碱基或3’-UTR外的区域。靶序列的GC含量也并无具体限制，但含量优选是约30一约50％；在GC分布中并非不规则且仅具有少数重复的序列是希望的。当在设计表达下文(b2)的siRNA或shRNA的载体中，polIII启动子用作启动子时，不应选择接连4个或更多T或A碱基的序列，以便阻止聚合酶转录停止。
基于上述规则选择的靶序列候选物就与mRNA中除靶外的连续16-17个碱基的序列的同源性进行检查，使用同源性检索软件程序例如BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，以便证实所选靶序列的特异性。对于其特异性已被证实的靶序列，由在AA(或NA)后的19-21个碱基具有TT或UU的3′末端突出端的有义链和具有与19-21个碱基互补的序列和TT或UU的3′末端突出端的反义链组成的双链RNA，设计为siRNA。此外，通过适当选择能够形成环结构(例如约8-25个碱基)的任选选择的接头序列，并且经由接头序列连接上述有义链和反义链，可以设计shRNA。
使用不花钱可在多个网站获得的检索软件程序可以检索siRNA和/或shRNA的序列。此类网站的例子包括但不限于siRNA Target Finder(http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html)和用于pSilencerTM Expression Vector的插入片段设计工具(http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html)，两者都由Ambion提供，和由RNAi Codex提供的GeneSeer(http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi)；并且相似检索在QIAGEN、Takara Bio、SiSearch、Dharmacon、Whitehead Institute、Invitrogen、Promega等的网站上是可能的。
下文所示的是针对小鼠p53设计的shRNA的序列，其使用在Ambion(SEQ ID NO：5-24)和RNAi Codex(SEQ ID NO：25和26)的网站上可获得的软件程序。有下划线的序列是在用切酶(dicer)切割后产生的dsRNA的有义链(5′侧)和反义链(3′侧)(不含有3′突出端“TT”)。小写字母指出错配或环。
[SEQ ID NO：5]
5’-TTTGACTGGATGACTGCCATGGttcaagagaCCATGGCAGTCAT CCAGTCTTTTTT-3’
[SEQ ID NO：6]
5’-TTTGATATCCTGCCATCACCTCttcaagagaGAGGTGATGGCAG GATATCTTTTTT-3’
[SEQ ID NO：7]
5’-TTTGGCCCAAGTGAAGCCCTCCttcaagagaGGAGGGCTTCAC TTGGGCCTTTTTT-3’
[SEQ ID NO：8]
5’-TTTGTGAAGCCCTCCGAGTGTCttcaagagaGACACTCGGAGG GCTTCACTTTTTT-3’
[SEQ ID NO：9]
5’-TTTGCCCTCCGAGTGTCAGGAGttcaagagaCTCCTGACACTCG GAGGGCTTTTTT-3’
[SEQ ID NO：10]
5’-TTTGTCTGTTATGTGCACGTACttcaagagaGTACGTGCACATAA CAGACTTTTTT-3’
[SEQ ID NO：11]
5’-TTTGTACTCTCCTCCCCTCAATttcaagagaATTGAGGGGAGGA GAGTACTTTTTT-3’
[SEQ ID NO：12]
5’-TTTGCTATTCTGCCAGCTGGCGttcaagagaCGCCAGCTGGCAG AATAGCTTTTTT-3’
[SEQ ID NO：13]
5’-TTTGACGTGCCCTGTGCAGTTGttcaagagaCAACTGCACAGG GCACGTCTTTTTT-3’
[SEQ ID NO：14]
5’-TTTGAAGTCACAGCACATGACGttcaagagaCGTCATGTGCTGT GACTTCTTTTTT-3’
[SEQ ID NO：15]
5’-TTTGTCACAGCACATGACGGAGttcaagagaCTCCGTCATGTGC TGTGACTTTTTT-3’
[SEQ ID NO：16]
5’-TTTGGAAATTTGTATCCCGAGTttcaagagaACTCGGGATACAA ATTTCCTTTTTT-3’
[SEQ ID NO：17]
5’-TTTGTACATGTGTAATAGCTCCttcaagagaGGAGCTATTACACA TGTACTTTTTT-3’
[SEQ ID NO：18]
5’-TTTGACTCCAGTGGGAACCTTCttcaagagaGAAGGTTCCCACT GGAGTCTTTTTT-3’
[SEQ ID NO：19]
5’-TTTGTCCTTTGCCCTGAACTGCttcaagagaGCAGTTCAGGGCA AAGGACTTTTTT-3’
[SEQ ID NO：20]
5’-TTTGATCCGCGGGCGTAAACGCttcaagagaGCGTTTACGCCCG CGGATCTTTTTT-3’
[SEQ ID NO：21]
5’-TTTGACCAAGAAGGGCCAGTCTttcaagagaAGACTGGCCCTT CTTGGTCTTTTTT-3’
[SEQ ID NO：22]
5’-TTTGAAAGTGGGGCCTGACTCAttcaagagaTGAGTCAGGCCC CACTTTCTTTTTT-3’
[SEQ ID NO：23]
5’-TTTGTTGGGGAATAGGTTGATAttcaagagaTATCAACCTATTCC CCAACTTTTTT-3’
[SEQ ID NO：24]
5’-TTTGATTCTATCTTGGGCCCTCttcaagagaGAGGGCCCAAGAT AGAATCTTTTTT-3’
[SEQ ID NO：25]
5’-TTTGCAuTACAgGTACgTGTGTAgtgtgctgtccTACACATGTACT TGTAGTGTTTTTT-3’
[SEQ ID NO：26]
5’-TTTGCAGTuTACTTuCCGCCgTAgtgtgctgtccTATGGCGGGAAG TAGACTGTTTTTT-3’
针对p53的siRNA可以通过下述方法进行制备，使用自动化DNA/RNA合成仪分开合成如上所述设计的有义链寡核苷酸和反义链寡核苷酸，和例如在合适的退火缓冲溶液中在约90-约95℃将寡核苷酸变性约1分钟，其后在约30-约70℃将其退火约1-约8小时。针对p53的shRNA可以通过下述方法进行制备：使用自动化DNA/RNA合成仪，合成如上所述设计的具有shRNA序列的寡核苷酸，且如上所述允许其自退火。
尽管构成siRNA和shRNA的核酸分子可以是天然存在的RNA，但分子可以包含多种化学修饰，以便增加稳定性(化学和/或针对酶)或比活性(对于mRNA的亲和力)。例如，为了阻止通过水解酶例如核酸酶的降解，构成siRNA或shRNA的每个核苷酸的磷酸残基(磷酸盐)可以由例如化学修饰的磷酸残基例如硫代磷酸酯(PS)、甲基磷酸酯或二硫代磷酸酯代替。在每个核苷酸的糖(核糖)的2′-位置上的羟基基团可以由-OR(R代表例如CH3(2′-O-Me)、CH2CH2OCH3(2′-O-MOE)、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等)替换。此外，碱基部分(嘧啶、嘌呤)可以是化学修饰的；例如，可以提及甲基或阳离子官能团引入嘧啶碱基的5-位置内、2-位置羰基由硫代羰基的代替等。
关于RNA的糖部分的构象，2个类型是占优势的：C2′-内(S型)和C3′-内(N型)；在单链RNA中，糖部分以两者的平衡出现，但当形成双链时，构象固定在N型。因此，还可以优选使用BNA(LNA)(Imanishi，T.等人，Chem.Commun.，1653-9，2002；Jepsen，J.S.等人，Oligonucleotides，14，130-46，2004)和ENA(Morita，K.等人，Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids，22，1619-21，2003)，其为RNA衍生物，其中糖部分的构象通过桥接2′氧和4′碳固定在N型，以便对靶RNA赋予强可结合性。
然而，因为用修饰类型的分子替换天然存在的RNA中的所有核糖核苷分子可以导致RNAi活性的丧失，所以引入修饰核苷必须在允许RISC复合物起作用的最低可能程度。
针对p53的siRNA还可以例如购自Ambion(例如Ambion目录#AM 16708，siRNA ID#69659、69753、69843、187424、187425、187426)，Santa Cruz(例如Santa Cruz目录#sc-29436，44219)等。
针对人p53的siRNA和shRNA还可以使用上述搜索软件程序之一进行设计且合成，通过输入由SEQ ID NO：3或Refseq.编号(NM 000546)所示的人p53cDNA的序列等作为查询，或还可以购自Ambion等。具体地，可以提及具有序列5’-GACTCCAGTGGTAATCTACTGctcgagCAGTAGATTACCACTGGAGTC-3’(SEQ ID NO：28；有下划线的部分指出关于p53的靶序列；大写字母指出形成dsRNA的部分)的针对人p53的shRNA，在Science，296，550-553(2002)中所述的针对p53的shRNA等。
与质粒DNA的情况一样，针对p53的siRNA或shRNA与体细胞的接触可以通过将核酸引入细胞内来达到，其使用脂质体法、聚胺法、电穿孔法、珠法等。使用阳离子脂质体的方法是最常见的并且提供高转移效率。除常见转染试剂例如Lipofectamine2000和Oligofectamine(Invitrogen)外，例如适合于引入siRNA的转移试剂，例如GeneEraserTM siRNA转移试剂(Stratagene)，也是商购可得的。
(D7)表达针对p53的siRNA或shRNA的载体
表达siRNA的载体可以串联类型和茎环(发夹)类型获得。前者是关于siRNA的有义链的表达盒和关于其反义链的表达盒串联连接的类型，每条链在细胞中表达且经历退火以形成双链siRNA(dsRNA)。同时，后者是关于shRNA的表达盒插入载体内的类型，shRNA在细胞中表达且经历通过切酶的加工以形成dsRNA。尽管polII启动子(例如CMV的立即早期启动子)可以用作启动子，但通常实践是使用polIII启动子，以便允许短RNA的准确转录。作为polIII启动子，可以提及小鼠和人U6-snRNA启动子、人H1-RNA酶P RNA启动子、人缬氨酸-tRNA启动子等。，使用连续4个或更多T残基的序列作为转录终止信号。
随后将因而构建的siRNA或shRNA表达盒插入质粒载体或病毒载体内。可以优选利用的此类载体与上文关于其为核重编程物质(重编程基因)的核酸提及的那些相同(病毒载体例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和仙台病毒；动物细胞表达质粒；附加型载体等)。如同重编程基因，载体可以根据获得的iPS细胞的预期用途适当选择。p53基因称为癌抑制基因，并且p53的永久功能抑制潜在增加癌发生的危险。因此，考虑到生成的iPS细胞的医学应用，希望针对p53的siRNA或shRNA可以设计为在细胞中瞬时表达。为此，更大优先给予不能自我复制的质粒载体等用作装载编码针对p53的siRNA或shRNA的核酸的载体。当与本发明的重编程因子组合时，即使以来自质粒的瞬时表达，针对p53的siRNA或shRNA也给出足够的iPS细胞建立效率。
可替代地，作为编码针对p53的shRNA的表达载体，还可以使用基于商购可得的质粒(例如从Addgene商购可得的pMKO.1-puro p53shRNA2：#10672等)等制备的，病毒载体(逆转录病毒等的)、质粒载体、附加型载体等。也可以根据需要利用上述Cre-loxP系统或piggyBac转座子系统。
表达针对p53的siRNA或shRNA的载体与体细胞的接触是通过将如上所述制备的质粒载体、附加型载体或病毒载体引入细胞内来达到的。这些转染可以通过与上述关于重编程基因相同的技术来达到。
(D8)其他物质
作为抑制p53基因的表达的其他物质，可以提及针对p53的反义核酸和核酶。
反义核酸可以是DNA或RNA，或DNA/RNA嵌合体。当反义核酸是DNA时，由靶RNA和反义DNA形成的RNA:DNA杂交物能够由内源RNA酶H识别，以引起靶RNA的选择性降解。因此，对于指导通过RNA酶H的降解的反义DNA的情况，靶序列可以不只是在p53mRNA中的序列，还可以是在p53基因的初级转录物的内含子区域中的序列。关于反义核酸的靶区域的长度并无具体限制，只要反义核酸的杂交导致翻译成p53蛋白质的抑制；靶区域可以是p53mRNA的完整序列或部分序列，并且可以最短为约15个碱基的序列，或最长为mRNA或初级转录物的完整序列。考虑合成的容易、抗原性、在细胞和其他组织中的可转移性，由约15-约40个碱基、特别是约18-约30个碱基组成的寡核苷酸是优选的。靶序列的位置包括但不限于5’-和3’-UTR、起始密码子的附近等。
狭义的核酶指具有酶活性以切割核酸的RNA，并且在本文中应理解为作为涵盖DNA的概念使用，只要它具有序列特异性核酸切割活性。最通用的核酶之一是在传染性RNA例如类病毒和病毒样体中发现的自剪接RNA，并且锤头型、发夹型等是已知的。锤头型显示出长度约40个碱基的酶活性，并且它可以通过使锤头结构部分(总共约10个碱基)邻近的两端的数个碱基的序列与mRNA的所需切割位点互补，从而特异性切割靶mRNA。
反义核酸或核酶可以使用自动化DNA/RNA合成仪进行合成。构成其的核苷酸分子还可以具有与上文所述siRNA一样的修饰，以便增加稳定性、比活性等。
可替代地，反义核酸或核酶还可以以编码其的核酸的形式使用，如在siRNA的情况下一样。
在体细胞核重编程的步骤中，p53功能的抑制剂必须以足以抑制p53功能的方式与体细胞接触。只要这个需求被满足，核重编程物质和p53功能的抑制剂就可以与体细胞同时接触，或任何一个可以预先接触。在实施方案的方式中，例如，当核重编程物质是编码蛋白质因子的核酸时，并且p53功能的抑制剂是化学抑制剂时，前者涉及从转染处理到蛋白质因子的大量表达的给定长度时滞，而后者能够快速抑制p53功能，从而在转染处理后细胞培养给定时间长度后，p53的化学抑制剂可以加入培养基中。在另一个实施方案方式中，例如，当核重编程物质和p53功能的抑制剂以病毒载体、质粒载体、附加型载体等的形式使用时，两者可以同时引入细胞内。
(E)iPS细胞建立效率改进剂
除p53功能的抑制剂外，通过使另一种公众已知的iPS细胞建立效率改进剂与体细胞接触，预期iPS细胞建立效率中的进一步增加。iPS细胞建立效率改进剂的例子包括但不限于组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂[例如丙戊酸(VPA)(Nat.Biotechnol.，26(7)：795-797(2008))，低分子抑制剂例如曲古菌素A(trichostatin A)、丁酸钠、MC 1293和M344，基于核酸的表达抑制剂例如针对HDAC的siRNA和shRNA(例如HDAC1 siRNA Smartpool
Figure BPA00001503215800351
(Millipore)，针对HDAC1的HuSH 29聚体shRNA构建体(OriGene)等)等]，G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂[例如低分子抑制剂例如BIX-01294(Cell Stem Cell，2：525-528(2008))、基于核酸的表达抑制剂例如针对G9a的siRNA和shRNA(例如G9a siRNA(人)(Santa Cruz Biotechnology)等)等]，L-钙通道激动剂(例如Bayk8644)(Cell Stem Cell，3，568-574(2008))，UTF1(Cell Stem Cell，3，475-479(2008))，细胞内信号转染的修饰剂[例如Wnt信号激活物(例如可溶性Wnt 3a)(Cell Stem Cell，3，132-135(2008))、TGF-β抑制剂、MEK抑制剂、2i/LIF(2i是分裂原活化蛋白质激酶信号和糖原合酶激酶-3的抑制剂，PloS Biology，6(10)，2237-2247(2008))]，其他天然或合成低分子化合物(例如5′-氮杂胞苷、thiazovivin、维生素C等)，和ES细胞特异性miRNA[例如，miR-302-367簇(Mol.Cell.Biol.doi：10.1128/MCB.00398-08，WO2009/075119)、miR-302(RNA(2008)14：1-10)、miR-291-3p、miR-294和miR-295(Nat.Biotechnol.27：459-461(2009))]。如上所述，基于核酸的表达抑制剂可以是具有编码siRNA或shRNA的DNA的表达载体的形式。
在核重编程物质的前述组成成分中，例如SV40大T也可以包括在iPS细胞建立效率改进剂的范围中，因为它们是对于体细胞的核重编程非必需的辅助因子。虽然核重编程的机制仍不明了，但对于核重编程必需因子外的辅助因子被视为核重编程物质还是iPS细胞建立效率改进剂并不重要。因此，因为体细胞核重编程过程视为起因于核重编程物质和iPS细胞建立效率改进剂与体细胞的接触的总体事件，所以看起来对本领域技术人员来说，区分两者不总是必需的。
这些其他iPS细胞建立效率改进剂与体细胞的接触可以按照上文就p53的功能抑制剂所述来达到，相对应于改进剂为(a)蛋白质因子、(b)编码蛋白质因子的核酸、或(c)低分子化合物的情况。
其他iPS细胞建立效率改进剂可以和核重编程物质一起与体细胞同时接触，并且任何一种可以预先接触，只要来自体细胞的iPS细胞建立的效率与不存在这种物质的情况下获得的效率比较得到显著改善；根据物质的性质，其可以以与上文关于p53的功能抑制剂描述的一样的时机与体细胞接触。
(F)通过培养条件改善建立效率
iPS细胞建立效率可以通过在体细胞的核重编程过程中在低氧条件下培养细胞得到进一步改善。如本文描述的，术语“低氧条件”意指在细胞培养时的环境氧浓度显著低于大气中。具体地，可以提及涉及比通常用于普通细胞培养的5-10％CO2/95-90％空气大气环境氧浓度更低的条件；例子包括涉及18％或更少的环境氧浓度的条件。优选地，环境氧浓度是15％或更少(例如14％或更少、13％或更少、12％或更少、11％或更少等)、10％或更少(例如9％或更少、8％或更少、7％或更少、6％或更少等)、或5％或更少(例如4％或更少、3％或更少、2％或更少等)。环境氧浓度优选是0.1％或更多(例如0.2％或更多、0.3％或更多、0.4％或更多等)、0.5％或更多(例如0.6％或更多、0.7％或更多、0.8％或更多、0.95％或更多等)、或1％或更多(例如1.1％或更多、1.2％或更多、1.3％或更多、1.4％或更多等)。
尽管可以使用在细胞环境中产生低氧状态的任何方法，但最容易的方法是在允许调整氧浓度的CO2温箱中培养细胞，并且这代表合适情况。允许调整氧浓度的CO2温箱从多个制造商商购可得(例如由Thermo scientific、Ikemoto Scientific Technology、Juji Field、Wakenyaku等制造的用于低氧培养的CO2温箱)。
在低氧条件下起始细胞培养的时间并无具体限制，只要与正常氧浓度比较(20％)，iPS细胞建立效率的改善未被阻止。尽管培养可以在体细胞与核重编程物质接触前、或与接触同时、或在接触后起始，但优选例如在低氧条件下的培养仅在体细胞与核重编程物质接触后，或在接触后的给定时间间隔[例如1-10(例如2、3、4、5、6、7、8或9)天]起始。
在低氧条件下细胞培养的持续时间并无具体限制，只要与正常氧浓度比较(20％)，iPS细胞建立效率的改善未被阻止；例子包括但不限于3天或更多、5天或更多、共7天或更多或10天或更多以及50天或更少、40天或更少、35天或更少或30天或更少的时期等。在低氧条件下培养的优选持续时间取决于环境氧浓度而改变；本领域技术人员可以根据使用的氧浓度适当调整培养的持续时间。在本发明的一个实施方案中，如果iPS细胞候选集落用药物抗性作为指示进行选择，那么优选在起始药物选择前由低氧条件恢复正常氧浓度。
此外，对于在低氧条件下的细胞培养的优选起始时间和培养的优选持续时间也取决于使用的核重编程物质的选择、在正常氧浓度下的iPS细胞建立效率等而改变。
在与核重编程物质和p53的功能抑制剂(以及需要时另一种iPS细胞建立效率改进剂)接触后，细胞可以例如在适合于培养ES细胞的条件下进行培养。在小鼠细胞的情况下，伴随白血病抑制因子(LIF)作为分化抑制因子加入普通培养基中进行培养。同时，在人细胞的情况下，希望加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和/或干细胞因子(SCF)代替LIF。通常，细胞在与作为饲养细胞的，用辐射或抗生素处理以终止细胞分裂的小鼠胚胎成纤维细胞的共存在下进行培养。通常用作饲养物的小鼠胚胎成纤维细胞包括STO细胞系(ATCCCRL-1503)等；为了iPS细胞的诱导，通常使用通过稳定整合新霉素抗性基因和LIF基因到STO细胞中而生成的SNL细胞(SNL76/7STO细胞；ECACC 07032801)[McMahon，A.P.&Bradley，A.Cell 62，1073-1085(1990)]等。然而，在本发明中，更优选使用小鼠胚胎原始成纤维细胞(MEF)，因为它的使用为人iPS细胞建立效率提供进一步改善。丝裂霉素C处理的MEF是从Millipore和ReproCELL商购可得的。与这些饲养细胞的共培养可以在核重编程物质接触前、接触时或接触后(例如1-10天后)起始。
本发明人首次成功提供了使用与非病毒载体组合的本发明的核重编程物质和p53的功能抑制剂生成人iPS细胞的方法，所述非病毒载体优选附加型载体，特别是早期自我去除类型，其中在从重编程因子和p53的功能抑制剂转移至体细胞到iPS细胞建立和维持的培养中不使用来自非人动物的成分(即在完全无异物条件下)。为了在无异物条件下诱导人iPS细胞，在与核重编程物质和p53的功能抑制剂(以及需要时另一种iPS细胞建立效率改进剂)接触后，起始细胞在不含FCS和来自非人动物的其他成分的培养基中进行培养。待作为分化抑制因子加入培养基中的有用物质(例如bFGF、SCF等)是纯化的人蛋白质的形式，优选重组蛋白质。任选选择的人体细胞可以用作饲养细胞；优选饲养细胞的例子包括人表皮成纤维细胞(HDF)、人牙髓干细胞等。还可以不使用饲养细胞诱导人iPS细胞。在这种情况下，商购可得的无异物包被试剂可以用于代替Matrigel和明胶包被细胞容器。
通过用药物抗性和报道分子的活性作为指示剂的方法，并且还通过基于形态的肉眼检查的方法，可以选择iPS细胞的候选集落。作为前者的例子，使用重组细胞选择对于药物抗性和/或报道分子活性阳性的集落，其中药物抗性基因和/或报道基因靶向在多能细胞中特异性高表达的基因的基因座(例如Fbx15、Nanog、Oct3/4等，优选Nanog或Oct3/4)。作为此类重组细胞的例子，可以提及将βgeo(其编码β-半乳糖苷酶和新霉素磷酸转移酶的融合蛋白)基因敲入Fbx15基因基因座内(Takahashi&Yamanaka，Cell，126，663-676(2006))的小鼠衍生的MEF，或由绿色荧光蛋白(GFP)基因和嘌呤霉素抗性基因整合到Nanog基因基因座中的转基因小鼠衍生的MEF(Okita等人，Nature，448，313-317(2007))等。同时，通过形态的肉眼检查用于选择候选集落的方法包括例如由Takahashi等人在Cell，131，861-872(2007)中描述的方法。尽管使用报道分子细胞的方法是方便和有效的，但从安全观点来看，当iPS细胞制备用于人治疗的目的时，希望通过肉眼检查集落选择。
如上所述，作为iPS细胞的所选集落的细胞的鉴定可以通过对于Nanog(或Oct3/4)报道分子(嘌呤霉素抗性、GFP阳性等)的阳性应答，以及通过可见ES细胞样集落的形成得到证实；然而，为了增加准确度，可以进行测试例如碱性磷酸酶染色，分析多种ES细胞特异性基因的表达，和将所选细胞移植至小鼠且证实畸胎瘤形成。
上述建立的iPS细胞可以用于多种目的。例如，通过利用对报道的ES细胞的分化诱导方法，可以诱导从iPS细胞分化成多种细胞(例如心肌细胞、血细胞、神经细胞、血管内皮细胞、胰岛素分泌细胞等)。因此，使用从患者或具有相同或基本上相同的HLA类型的另一个人中收集的体细胞诱导iPS细胞，将使得通过自体或同种异体移植的干细胞治疗成为可能，其中移植至患者的iPS细胞分化成所需细胞(即，患者的受累器官的细胞，对疾病具有疗效的细胞等)。此外，因为由iPS细胞分化的功能细胞(例如肝细胞)被认为比相应现有细胞系更好地反映功能细胞在体内的实际状态，所以它们还可以适当地用于对药物候选化合物的有效性和毒性的体外筛选等。
本发明在下文中借助于下述实施例进一步详细描述，然而，本发明绝不限于其。
实施例
实施例1
使用逆转录病毒建立人iPS细胞
基于pMXs质粒和Plat-E包装细胞[由在University of Tokyo的Dr.Toshio Kitamura提供；Morita，S.等人，Gene Ther.7，1063-1066(2000)]制备用于重编程的逆转录病毒。将多个构建体插入pMXs的多克隆位点内，以获得待用于重编程的逆转录病毒载体。通过经由口蹄疫病毒的2A序列连接人Oct3/4(在图1中O)、人Sox2(在图1中S)、人Klf4(在图1中K)、人c-Myc(在图1中M)、人Lin28(在图1中L)、人Nanog(在图1中N)和人L-Myc(在图1中U)和每种基因的翻译区[在图1中，关于分别基因(上文显示)的符号是带连字符的(例如O-M-L)]，制备插入的构建体。GFP用作阴性对照。
通过将上述逆转录病毒载体各自转移至Plat-E细胞制备用于重编程的每种逆转录病毒，所述Plat-E细胞已在前一天以0.6x106细胞/孔接种至6孔培养板(Falcon)。细胞在37℃在5％CO2的存在下使用DMEM/10％FCS[通过将10％胎牛血清加入DMEM(Nacalai Tesque)中制备的培养肉汤]进行培养。为了促进载体转移，将4.5μL FuGene6转染试剂(Roche)置于100μL Opti-MEM I Reduced-Serum Medium(Invitrogen)中，并且允许细胞在室温静置5分钟。随后，加入1.5μg每种表达载体，并且允许细胞在室温进一步静置15分钟，这之后将它们加入Plat-E培养肉汤中。在第2天时，将Plat-E上清液替换为新鲜供应的培养基。在第3天时，回收培养上清液并且通过0.45μm无菌滤器(Whatman)过滤，并且加入以4μg/mL的聚凝胺(Nacalai)，以获得病毒液体。
在实验中，在借助于慢病毒由小鼠Slc7a1转染后，使用由来自高加索新生儿的皮肤建立的成纤维细胞(Cell Applications)。将这种成纤维细胞培养且维持在37℃在5％CO2的存在下的100mm培养皿中，使用DMEM/10％FCS作为培养肉汤。在转移重编程因子前一天，去除培养基，并且通过加入5mL PBS洗涤细胞。在去除PBS后，加入0.25％Trypsin/1mM EDTA(Invitrogen)，并且反应在37℃进行约5分钟。在细胞升高后，加入DMEM/10％FCS以悬浮细胞，并且将1.3x105细胞接种至6孔培养板(Falcon)的一个孔。
第二天，将细胞与每种逆转录病毒混合且由每种逆转录病毒感染，所述逆转录病毒已使用Plat-E细胞产生。24小时后，将培养基替换为新鲜供应，以终止感染。在感染起始后第6天时，从板中去除培养基，并且通过加入1mL PBS洗涤细胞。在去除PBS后，加入0.25％Trypsin/1mM EDTA(Invitrogen)，并且反应在37℃进行约5分钟。在细胞升高后，加入DMEM/10％FCS以悬浮细胞，并且将5x105细胞接种至含有先前接种的饲养细胞的100mm皿。使用的饲养细胞是已用丝裂霉素C处理以终止细胞分裂的SNL细胞。第二天，将培养基替换为补充有4ng/mL bFGF(Wako)的灵长类动物ES细胞培养基(ReproCELL)；持续每2天更换这种培养基。在第35天时，计数人ES细胞样集落。集落照片和集落计数显示于图1中。集落计数的结果概括于图2中。在基因的所有组合中，用L-Myc代替c-Myc，关于人iPS集落(ES样集落)的建立效率高得多。无论使用c-Myc还是L-Myc，使用排除Nanog的5种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28和c-Myc或L-Myc；图2中的ctrl)的建立效率高于使用包括Nanog的6种基因(图2中的“6种因子”)。当L-Myc以L-Myc-Lin28的次序(图2中的U-L)连接使用时，与当使用L-Myc但不连接时获得的水平比较(分开转移的5种基因：图2中的“ctrl”)，建立效率不减少。
实施例2
使用附加型质粒建立人iPS细胞(1)
基于pCX-EGFP(由在Osaka University的Dr.Masaru Okabe提供；FEBS Letters，407，313-319，1997)制备用于重编程的质粒。首先，将旱獭肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)序列插入EGFP下游。通过将loxP序列插入pCEP4(Invitrogen)的EBNA-1的两端中，制备用于在细胞中复制这种载体的表达盒。将含有EBNA-1和oriP的这种表达盒整合到掺入WPRE的上述pCX-EGFP的BamHI位点内，并且将这命名为pCXLE-EGFP。用EcoRI处理这种pCXLE-EGFP，并且代替EGFP，插入多种构建体，以获得用于重编程的质粒。插入的5种构建体是：1)人Oct3/4，2)通过经由口蹄疫病毒的2A序列连接人Sox2和人Klf4的翻译区制备的构建体，3)通过经由口蹄疫病毒的2A序列连接人Klf4、人Sox2和人Oct3/4的翻译区制备的构建体，4)通过经由口蹄疫病毒的2A序列连接人c-Myc、人Lin28和Nanog的翻译区制备的构建体，和5)SV40大T抗原(每种构建体在CAG启动子和兔β-珠蛋白多聚A序列的控制下)，其分别命名为pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hKSO、pCXLE-hMLN和pCX-SV40LT(pCX-SV40LT是不具有WPRE序列、EBNA-1盒和loxP序列中的任何一个的质粒)。
在实验中，使用由来自36岁大的高加索女性的面部皮肤建立的成纤维细胞(Cell Applications，批次1388)。将这种成纤维细胞培养且维持在37℃在5％CO2的存在下的100mm培养皿中，使用DMEM/10％FCS[通过将10％胎牛血清加入DMEM(Nacalai Tesque)中制备的培养肉汤]。在质粒转移时，去除培养基，并且通过加入5mL PB S洗涤细胞。在去除PBS后，加入0.25％Trypsin/1mM EDTA(Invitrogen)，并且反应在37℃进行约5分钟。在细胞升高后，加入DMEM/10％FCS以悬浮细胞，并且在15mL离心管中回收6x105细胞。将悬液以800rpm离心5分钟，并且去除上清液。使用Microporator(AR BROWN)，将总共3μg质粒(0.5μg pCXLE-hOct4、1μg pCXLE-hSK、0.5μgpCXLE-hKSO、0.5μg pCXLE-hMLN、0.5μg pCX-SV40LT)转移至细胞。这种转移使用100μL芯片伴随在1650V持续10ms的3次脉冲发生。将转染的细胞转移至含有3mL DMEM/10％FCS的6孔培养板(Falcon)，并且在37℃在5％CO2的存在下培养6天。随后，去除培养基，并且通过加入2mL PBS洗涤细胞。在去除PBS后，加入0.25％Trypsin/1mM EDTA(Invitrogen)，并且反应在37℃进行约5分钟。在细胞升高后，加入DMEM/10％FCS以悬浮细胞，并且将2x105细胞接种至含有先前接种的饲养细胞的100mm皿。使用的饲养细胞是丝裂霉素C处理的MEF。第二天，将培养基替换为补充有4ng/mL bFGF(Wako)的灵长类动物ES细胞培养基(ReproCELL)；持续每2天更换这种培养基。在第26天时，1个人ES细胞样集落出现。在建立时的集落照片显示于图3中(左)。在第3次传代时的集落照片显示于图3中(右)。1个ES样集落可以由2x105细胞建立。
实施例3
使用附加型质粒建立人iPS细胞(2)
在实施例2中使用的除pCX-SV40LT外的4种不同质粒用于重编程：pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hKSO和pCXLE-hMLN。
在实验中，使用由来自36岁大的高加索女性的面部皮肤建立的成纤维细胞(Cell Applications，批次1388)。将这种成纤维细胞培养且维持在37℃在5％CO2的存在下的100mm培养皿中，使用DMEM/10％FCS[通过将10％胎牛血清加入DMEM(Nacalai Tesque)中制备的培养肉汤]。在质粒转移时，去除培养基，并且通过加入5mL PBS洗涤细胞。在去除PBS后，加入0.25％Trypsin/1mM EDTA(Invitrogen)，并且反应在37℃进行约5分钟。在细胞升高后，加入DMEM/10％FCS以悬浮细胞，并且在15mL离心管中回收6x105细胞。将悬液以800rpm离心5分钟，并且去除上清液。使用Microporator(AR BROWN)，将总共3μg质粒(1μg pCXLE-hOct4、1μg pCXLE-hSK、0.5μgpCXLE-hKSO、0.5μg pCXLE-hMLN)转移至细胞。这种转移使用100μL芯片伴随在1650V持续10ms的3次脉冲发生。将转染的细胞转移至含有3mL DMEM/10％FCS的6孔培养板(Falcon)，并且在37℃在5％CO2的存在下培养6天。随后，去除培养基，并且通过加入2mL PB S洗涤细胞。在去除PBS后，加入0.25％Trypsin/1mM EDTA(Invitrogen)，并且反应在37℃进行约5分钟。在细胞升高后，加入DMEM/10％FCS以悬浮细胞，并且将1x105细胞接种至含有先前接种的饲养细胞的100mm皿。使用的饲养细胞是丝裂霉素C处理的MEF或SNL76/7。第二天，将培养基替换为补充有4ng/mL bFGF(Wako)的灵长类动物ES细胞培养基(ReproCELL)；持续每2天更换这种培养基。当MEF用作饲养物时，1个人ES细胞样集落在第24天时出现。在建立时的集落照片显示于图4中(左)。在第2次传代时的集落照片显示于图4中(右)。1个ES样集落可以由1x105细胞建立。当SNL76/7用作饲养物时，无法建立iPS集落。
实施例4
使用附加型质粒建立人iPS细胞(3)
如实施例2和3中所示，当使用附加型质粒，将由Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28和Nanog组成的6种基因，或由相同6种和另外的SV40大T组成的7种基因转移至细胞时，仅约0-1个iPS细胞可以由1-2x105细胞建立。使用相同7种基因的此类低诱导效率也在Science，324，797-801(2009)中描述。此处，为了改善建立效率，使用在实施例1中的预备实验中给出有利结果的L-Myc(L-Myc-Lin28连接构建体)，然而不使用经判断为不需要的Nanog。此外，还使用编码针对人p53的shRNA的DNA[5’GACTCCAGTGGTAATCTACttcaagagaGTAGATTACCACTGGAGTC-3’(SEQ ID NO：32)：有下划线的部分是关于p53的靶序列；大写字母表示其中形成dsRNA的部分；下文简称为p53shRNA]。
除如实施例2中制备的pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK和pCXLE-hMLN外，制备且使用1)通过用EcoRI处理如实施例2中制备的pCXLE-EGFP，且掺入通过经由口蹄疫病毒的2A序列连接人L-Myc和人Lin28的翻译区制备的构建体，代替EGFP制备的质粒(pCXLE-hUL)，和2)掺入表达在pCXLE-hOct4的BamHI位点中插入的针对p53的shRNA(由U6启动子驱动)的质粒(pCXLE-hOct4-shp53)。pCXLE-EGFP用作对照。pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL的结构显示于图30中(在该图中，pCXLE-hOct4-shp53描述为pCXLE-hOct3/4-shp53)。
在实验中，在借助于慢病毒由小鼠Slc7a1转染后，使用由来自21岁大的日本妇女的皮肤建立的成纤维细胞(JCRB，TIG113)。将这种成纤维细胞培养且维持在37℃在5％CO2的存在下的100mm培养皿中，使用DMEM/10％FCS[通过将10％胎牛血清加入DMEM(NacalaiTesque)中制备的培养肉汤]。在质粒转移时，去除培养基，并且通过加入5mL PBS洗涤细胞。在去除PBS后，加入0.25％Trypsin/1mMEDTA(Invitrogen)，并且反应在37℃进行约5分钟。在细胞升高后，加入DMEM/10％FCS以悬浮细胞，并且在15mL离心管中回收6x105细胞。将悬液以800rpm离心5分钟，并且去除上清液。使用Microporator(AR BROWN)，将表2中所示的质粒(总共3μg质粒)转移至细胞。这种转移使用100μL芯片伴随在1650V持续10ms的3次脉冲发生。将转染的细胞转移至含有3mL DMEM/10％FCS的6孔培养板(Falcon)，并且在37℃在5％CO2的存在下培养7天。随后，去除培养基，并且通过加入2mL PBS洗涤细胞。在去除PBS后，加入0.25％Trypsin/1mM EDTA(Invitrogen)，并且反应在37℃进行约5分钟。在细胞升高后，加入DMEM/10％FCS以悬浮细胞，并且将1.5x105细胞接种至含有先前接种的饲养细胞的100mm皿。使用的饲养细胞是丝裂霉素C处理的MEF或SNL76/7。第二天，将培养基替换为补充有4ng/mL bFGF(Wako)的灵长类动物ES细胞培养基(ReproCELL)；持续每2天更换这种培养基。在第28天时，计数已出现的人ES细胞样集落。集落照片显示于图5中。集落计数的结果显示于表2和图6中(MEF用作饲养物)。
表2
375A-C：MEF饲养物；375D-E：MSTO饲养物
尽管无论使用哪种饲养物都可以建立iPS集落(ES样集落)，但使用MEF建立更多集落。当使用由Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc和Lin28组成的5种基因时，与使用常规6种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28和Nanog)比较，建立效率增加。当进一步加入p53shRNA时，建立效率急剧增加。
实施例5
使用附加型质粒建立人iPS细胞(4)
用于重编程的质粒与实施例4中的5种不同质粒pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hMLN、pCXLE-hUL和pCXLE-hOct4-shp53相同；pCXLE-EGFP用作对照。
在实验中，在借助于慢病毒由小鼠Slc7a1转染后，使用由来自6岁大的日本女性的皮肤建立的成纤维细胞(JCRB，TIG120)和由来自8个月大的日本男性的皮肤建立的成纤维细胞(JCRB，TIG121)。将这些成纤维细胞培养且维持在37℃在5％CO2的存在下的100mm培养皿中，使用DMEM/10％FCS[通过将10％胎牛血清加入DMEM(NacalaiTesque)中制备的培养肉汤]。在质粒转移时，去除培养基，并且通过加入5mL PBS洗涤细胞。在去除PBS后，加入0.25％Trypsin/1mMEDTA(Invitrogen)，并且反应在37℃进行约5分钟。在细胞升高后，加入DMEM/10％FCS以悬浮细胞，并且在15mL离心管中回收6x105细胞。将悬液以800rpm离心5分钟，并且去除上清液。使用Microporator(AR BROWN)，将表3中所示的质粒(总共3μg质粒)转移至细胞。这种转移使用100μL芯片伴随在1650V持续10ms的3次脉冲发生。将转染的细胞转移至含有3mL DMEM/10％FCS的6孔培养板(Falcon)，并且在37℃在5％CO2的存在下培养7天。随后，去除培养基，并且通过加入2mL PBS洗涤细胞。在去除PBS后，加入0.25％Trypsin/1mM EDTA(Invitrogen)，并且反应在37℃进行约5分钟。在细胞升高后，加入DMEM/10％FCS以悬浮细胞，并且将1x105细胞接种至含有先前接种的饲养细胞的100mm皿。使用的饲养细胞是丝裂霉素C处理的MEF或SNL76/7。第二天，将培养基替换为补充有4ng/mL bFGF(Wako)的灵长类动物ES细胞培养基(ReproCELL)；持续每2天更换这种培养基。在第28天时，计数已出现的人ES细胞样集落。集落照片显示于图7(使用TIG120)和图8(使用TIG121)中。集落计数的结果显示于表3，图9(使用TIG 120，MEF用作饲养物)和图10(使用TIG121，MEF用作饲养物)中。
表3
Figure BPA00001503215800461
与使用常规6种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28和Nanog)比较，使用另外的p53shRNA，建立效率增加。此外，与使用常规6种基因比较，当使用由Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc和Lin28组成的5种基因时，建立效率增加。当进一步加入p53shRNA时，建立效率仍急剧增加。
使用MEF作为饲养细胞获得的结果和使用SNL76/7(MSTO)获得的那些在图11中比较(使用TIG120)。尽管无论使用哪种饲养物都可以建立iPS集落(ES样集落)，但使用MEF建立更大数目的集落。
实施例6
在iPS集落中外源基因的存在或不存在的证实(1)
对通过使用附加型质粒转移重编程基因建立的5种不同iPS细胞就基因组中外源基因的整合的存在或不存在进行检查。
在6孔培养板(Falcon)中变得几乎铺满后，通过加入2mL PBS洗涤iPS细胞。在去除PBS后，加入400μL基因组回收缓冲液(50mMTris-HCl、20mM EDTA、100mM NaCl、1％SDS、50μg/mL蛋白酶K)以裂解细胞，并且在1.5mL管中回收细胞，这之后将细胞裂解物在55℃孵育过夜。将这与150μL PCI(苯酚、氯仿和异戊醇的25∶24∶1混合物)混合15分钟，并且以13200rpm离心10分钟。回收水层(上层)且与1mL乙醇混合。在另一个管中回收所得到的沉淀物，并且这用作长DNA。将除去沉淀物的其余液体以13200rpm离心15分钟。所得到的沉淀物用作短DNA。将每种DNA用70％乙醇洗涤且溶解于TE缓冲液中，以获得PCR模板。使用TaKaRa EX Taq(Takara Shuzo)进行PCR，其中50ng长DNA或250ng短DNA在每次反应中用作模板。下述引物组合使用。
Klf4的检测：hKlf4-S1016 ACC CAT CCT TCC TGC CCG ATC AGA(SEQ ID NO：33)
hKlf4-AS1170 ATC ACA AGT GTG GGT GGC GGT CCT(SEQ IDNO：34)
c-Myc的检测：hMyc-S547 GCC GCC GCC TCA GAG TGC ATCGAC(SEQ ID NO：35)
hMyc-AS947 CGA GTG GAG GGA GGC GCT GCG TAG(SEQ IDNO：36)
衍生自pCEP4的OriP的检测：pEP4-SF1 TTC CAC GAG GGT AGTGAA CC(SEQ ID NO：37)
pEP4-SR1 TCG GGG GTG TTA GAG ACA AC(SEQ ID NO：38)
在OriP检测时，还对通过加入200、20或2fg质粒制备的对照进行PCR，所述质粒已转移至起始成纤维细胞的基因组(50ng)(图12中的“+质粒”)。结果显示于图12中。在检查的任何iPS细胞中，在长DNA(在图12中的L)或短DNA(在图12中的S)中未检测到来自外源基因(Tg)和载体组成成分OriP的Klf4和c-Myc中的任何一个；估计转移的附加型质粒已从细胞中自发脱落。
实施例7
使用附加型质粒建立人iPS细胞(5)
以与实施例5一样的方式使用pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL，用由Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc和Lin28组成的5种基因，连同p53shRNA一起，转染作为体细胞来源的由来自以各种年龄的男性和女性日本和高加索受试者的皮肤建立的成纤维细胞(HDF)。MSTO或MEF充当饲养细胞。成纤维细胞以2种形式提供，一种具有小鼠Slc7a1掺入其中，并且另一种没有。计数在转染后第27-32天时出现的人ES细胞样集落。结果(n＝1-5)一起显示于表4中。
表4
Figure BPA00001503215800481
1F：女性，M：男性
2J：日本，C：高加索
在上表中，集落计数显示为每1x105HDF建立的集落的平均数目。如由表4显而易见的，发现iPS细胞可以不考虑细胞来源受试者的年龄、性别和种族而建立。还发现无论Slc7a1是否转移，都可以建立iPS细胞(未显示分开数据)。
实施例8
使用瞬时表达质粒转移p53shRNA
p53基因称为肿瘤抑制基因；p53长时间的功能抑制潜在增加癌发生的危险。此处，进行研究以测定iPS细胞是否可以与附加型载体一样建立，即使当p53shRNA借助于瞬时表达载体(缺乏EBNA-1和oriP的普通质粒载体：下文，质粒载体)进行表达时。
进行初步研究以测定在附加型载体和质粒载体之间在基因表达的消失程度中是否存在差异。在实验中，使用pCX-EGFP(由在OsakaUniversity的Dr.Masaru Okabe提供；FEBS Letters，407，313-319，1997)、如实施例2中制备的pCXLE-EGFP和pCXE-EGFP(通过去除来自pCXLE-EGFP的loxP序列制备的质粒)。在将每种质粒转移到HDF1419中后第6和14天时，检查GFP的表达。这种转移使用Microporator和100μL芯片伴随在1650V持续10ms的3次脉冲发生。结果显示于图13中。对于所有质粒，在第6天时观察到GFP荧光，但对于pCX-EGFP表达的量低于其他2种。在第14天时，仍观察到荧光，但对于pCX-EGFP表达的量相当大程度地低于其他2种。这些发现证实基因表达在质粒载体中比附加型载体中更早消失。
接下来，进行研究以测定iPS细胞是否可以建立，即使当使用质粒载体转移p53shRNA时。对于转移，使用下述质粒或附加型载体。
(a)pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK、pCXLE-hMLN
(b)pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hMLN、pSilencer-shp53
[pSilencer-shp53通过将p53shRNA插入pSilencerTM(Ambion)的U6启动子下游制备]
(c)pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL
(d)pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL、pSilencer-shp53
对于转移，使用每种载体的0.75μg[(b)和(d)]或1μg[(a)和(c)](总共3μg)。
使用由来自36岁大的高加索女性的皮肤的成纤维细胞(HDF 1388)作为体细胞，用MEF作为饲养细胞，以与实施例5一样的方式建立iPS细胞。这种转移使用Microporator和100μL芯片伴随在1650V持续10ms的3次脉冲发生。在转移后第27天时，计数已出现的人ES细胞样集落。结果显示于图14中。比较组合(a)和(b)(图14中的+M-L-N的Epi与Trans比较)、以及组合(c)和(d)(图14中的+U-L的Epi与Trans比较)，在使用用于转移p53shRNA的附加型载体和使用质粒载体之间建立的集落数目中不存在主要差异；证实即使使用质粒载体用于转移也可以良好建立iPS细胞。
实施例9
建立衍生自具有同-HLA(homo-HLA)基因型的健康人的牙髓干细胞的iPS细胞
来自具有关于4个基因基因座HLA-A、HLA-B、HLA-Cw和HLA-DRB 1的同-HLA基因型的健康人的牙髓干细胞(细胞系DP74和DP94)由在Gifu University的Drs.Takahiro Kunisada和Kenichi Tezuka提供。这些细胞系已如J.Dent.Res.、87(7)：676-681(2008)和WO2010/013359中所述建立。2种细胞系的前述4个HLA基因型及其等位基因频率[在日本人中在所有等位基因中具有4个HLA基因型的每种等位基因(单体型)的频率]显示于表5中。
表5
Figure BPA00001503215800501
使用用于重编程的5种不同质粒，以与实施例5一样的方式建立iPS细胞，所述质粒为：pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hMLN、pCXLE-hUL和pCXLE-hOct4-shp53。iPS细胞还通过转移Science、324：797-801(2009)(Thomson’s混合物)中所述的质粒建立。在每种情况下使用总共3μg载体；这种转移使用Microporator和100μL芯片伴随在1650V持续10ms的3次脉冲发生。MSTO用作饲养细胞。
通过将pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL转移至DP74和DP94建立的iPS细胞的照片显示于图15中。计数在转移后在第28天时出现的人ES细胞样集落。结果显示于图16和17中(每个数值图指出关于3次实验的平均值和标准差)。对于DP74系(图16)和DP94系(图17)，用由Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc和Lin28组成的5种基因，连同p53shRNA(pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL)一起的转移获得最高建立效率；如用HDF的获得良好结果。
实施例10
在iPS集落中外源基因的存在或不存在的证实(2)
在初步研究中，将pCXLE-EGFP转移至HDF，并且进行研究以测定EGFP的表达如何消失。从转移后第1到4周每周，通过FACS分析在1x104细胞中EGFP的表达量(荧光强度)。结果显示于图18中。EGFP的表达量和显示表达的细胞数目经过数周减少；在转染后4周，GFP阳性细胞已减少至低为2.4％。
随后，仅在通过pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL转移至HDF建立后，对18个不同iPS克隆就外源基因的存在或不存在进行检查。
提供含有5μL基因组回收缓冲液(补充有167μg/mL蛋白酶K的用于TaKaRa Ex Taq的缓冲液)的0.2mL管。在转染后第30天时，使每种iPS细胞的集落与皿物理解离，并且在这个管中回收。在回收后，将管在55℃孵育3小时，以获得细胞裂解物。在加入10μL H2O后，将裂解物在95℃加热3分钟，以使蛋白酶K失活。这如它作为用于实时PCR的模板使用。使用SYBR Premix EX Taq II(Takara Shuzo)进行PCR。我们设计了用于EBNA-1的PCR引物对，以计算附加型载体的拷贝数，和用于内源FBXO15基因座的另一个引物对，以估计细胞数目。
EBNA-1引物(用于检测附加型载体)
EBNA-183F ATC AGG GCC AAG ACA TAG AGA TG(SEQ IDNO：39)
EBNA-243R GCC AAT GCA ACT TGG ACG TT(SEQ ID NO：40)
Fbx15引物(用于检测内源等位基因)
hFbx15-2F GCC AGG AGG TCT TCG CTG TA(SEQ ID NO：41)
hFbx15-2R AAT GCA CGG CTA GGG TCAAA(SEQ ID NO：42)
虽然通过由扩增的Fbx15量计算的在反应混合物中的细胞计数校正扩增的EBNA-1量，但计算附加型载体的拷贝数/1x104细胞。结果显示于图19中。18个克隆的平均值极低，为20.3±13.7拷贝/1x104细胞，证实仅极小量的外源基因(附加型载体)在转染后30天保留。
接下来，进行相同实验，除细胞进行传代培养外。
我们制备新鲜细胞裂解液，这由1×Ex Taq缓冲液(Takara)和167μg/ml蛋白酶K组成。为了分析建立的iPS细胞，在用CTK处理去除饲养细胞后，用细胞刮棒收获在60-mm皿中培养的细胞。将细胞置于管内且离心，并且用200μl裂解液裂解细胞团块。在55℃孵育3小时随后为在95℃失活蛋白酶K后，裂解物用于定量PCR分析。我们使用pCXLE-hFbx15-cont2质粒用于标准扩增，所述质粒具有对于FBXO15和EBNA-1的扩增子。
DP衍生的epi-iPS细胞的结果显示于图31A中。在转染后6天，我们检测到大约200个附加型载体拷贝/细胞。相比之下，我们不能在测试的7个克隆中的5个中检测到任何EBNA-1DNA。在其余2个克隆中，我们分别检测到-0.001和2个拷贝(图31A)。后面的克隆可能具有质粒整合到染色体内。
成纤维细胞衍生的epi-iPS细胞的结果显示于图31B中。在几个克隆中(包括404C-2和409B-2)，我们不能检测到任何附加型载体。这些数据证实在大多数epi-iPSC克隆中，附加型载体自发丧失。
实施例11
在iPS集落中外源基因表达的存在或不存在的证实
在通过pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL转移至HDF建立后的第5至9次传代时，对9个不同iPS克隆就外源基因表达的存在或不存在进行检查。
从在6孔板的一个孔中的iPS细胞中提取总RNA；总RNA 1μg、引物dT(20)和逆转录酶Rever Tra Ace(TOYOBO)用于将mRNA逆转录为互补链DNA。反应产物的最终体积是20μL。加入这种逆转录物中的是60μL H2O。对于每种转基因进行定量PCR，用1μL反应产物(相当于12.5ng RNA)作为模板，并且用SYBR Green II作为指示剂，使用下表6中所示的引物组，一组用于测量表达的外源基因的量和表达的内源基因的量的总和(表达的总量)，并且另一组用于测量表达的外源基因的量。使用的PCR扩增条件如下：在95℃30秒的1个循环，随后为在94℃10秒、60℃10秒和72℃30秒的50个循环。
表6
hOCT3/4(总) hOct3/4-S944 #40-56 CCC CAG GGC CCC ATT TTG GTACC(SEQ ID NO：43)
hOct3/4-as #10-25 ACC TCAGTT TGAATG CAT GGG AGA GC(SEQ ID NO：44)
hOct3/4(Tg) hOCT4-1072F #74-74 CAT TCAAAC TGA GGT AAG GG(SEQ ID NO：45)
WPRE-70R #74-73 TAG CGT AAAAGG AGC AAC ATAG(SEQ ID NO：46)
hKLF4(总) hKlf4-S1016 #62-88 ACC CAT CCT TCC TGC CCGATC AGA(SEQ ID NO：47)
hKlf4-AS1048 #43-94 TTG GTAATG GAG CGG CGG GAC TTG(SEQ ID NO：48)
hKlf4(Tg) hKLF4-S1380 #66-24 oca cct ogc ctt aca cat gaa ga(SEQ ID NO：49)
WPRE-70R #74-73 TAG CGT AAAAGG AGC AAC ATA G(SEQ ID NO：50)
hSOX2(总) hSOX2-S875 #66-23 ttc aca tgt ccc agc act acc aga(SEQ ID NO：51)
HsSox2-AS #31-72 TCACAT GTG TGA GAG GGG CAG TGT GC(SEQ ID NO：52)
hSox2(Tg) hSOX2-S875(66-23) #66-23 ttc aca tgt ccc agc act acc aga(SEO ID NO：53)
FMDV-2A-R2 #74-72 TTT GTTTGACAG GAG CGACAAT(SE0 ID NO：54)
hL-MYC(总) hMYCL1-S1027 #71-59 GCG AAC CCAAGA CCC AGG CCT GCT CC(SE0 ID NO：55)
hMYCL1-AS1145 #71-60 CAG GGG GTC TGC TCG CAC CGT GAT G(SEQ ID NO：56)
hLMyc(Tg) hLMyc-1005F #74-76 GGC TGA GAA GAG GAT GGC TAC(SEQ ID NO：57)
FMDV-2A-R2 #74-72 TTT GTT TGA CAG GAG CGACAAT(SEQ ID NO：58)
hLin28(总) hLin28 S502 #49-64 AGCCATATGGTAGCCTCATGTCCGC(SE0 ID NO：59)
hLIN28-AS #47-6 TCAATT CTG TGC CTC CGG GAG CAG GGT AGG(SEQ ID NO：60)
hLin28(Tg) hLin28 S502 #49-64 AGCCATATGGTAGCCTCATGTCCGC(SEQ ID NO：61)
WPRE-70R #74-73 TAG CGT AAA AGG AGC AAC ATAG(SEQ ID NO：62)
接下来，已用于转染的pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL各自制备为106个拷贝/μL溶液，并且将这种溶液系列稀释10倍。用每种起始溶液和系列稀释作为模板，以相同方式进行定量PCR。对于每种重编程基因，对于用于测量表达的总量的引物组和用于测量表达的外源基因的量的引物组各自生成标准曲线。使用这种标准曲线转换关于每种iPS细胞的定量PCR结果，并且每种基因的拷贝数/12.5ng总RNA计算为表达的总量和表达的外源基因的量。在纵坐标轴上的这个拷贝数的对数图显示于图20(Oct3/4)和图21(Sox2、Klf4、L-Myc、Lin28)(灰色区域指出在检测限度下的值)中。观察到大量克隆包括409B-2和421C-1，其中表达水平在检查的所有外源基因的检测限度下。显示选择这些细胞允许利用更安全的iPS细胞。
实施例12
人Epi-iPS细胞的表征
1)微阵列分析和CGH阵列分析
为了测定基因表达模式在通过将pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL转移至表皮成纤维细胞(TIG和HDF)建立的人iPS细胞、人ES细胞以及用于转移的TIG和HDF中是否不同，如Cell，131，861-872(2007)中所述进行DNA微阵列分析。多种细胞之间的关联系数显示于表7中。
Figure BPA00001503215800551
基于在多种基因中表达的量中的差异的聚类分析结果显示于图22中。散点图分析的结果显示于图23中。使用附加型载体建立的iPS细胞显示出类似于ES细胞那种的表达模式，并且因此证明是类似于ES细胞的iPS细胞。
CGH阵列分析的结果显示于图24中。与用于转移的TIG细胞的比较显示无主要异常。通过在某些细胞上的G带染色的核型分析揭示无异常发现。
在上文描述的实验中，使用下述阵列和扫描仪：
●用于人GE的阵列：G4112F Whole Human Genome MicroarrayKit，4x44K(Agilent)
●用于人CGH的阵列：G4426B#14950Human Genome CGHMicroarray Kit 4x44K(Agilent)
●扫描仪：DNA微阵列扫描仪，型号G2539A
2)RT-PCR分析
我们检查了在epi-iPS细胞中多能干细胞标记例如OCT3/4、SOX2、NANOG和ESG1的表达。DP衍生的epi-iPS细胞的结果显示于图32A中，并且成纤维细胞衍生的epi-iPS细胞的结果显示于图32B中。RT-PCR分析揭示epi-iPSC克隆以与hESC和逆转录病毒衍生的iPSC克隆可比较的水平表达这些基因。
3)亚硫酸氢盐测序
在去除饲养细胞后从iPS细胞中提取基因组DNA，并且如前所述(K.Takahashi等人，Cell 131，861(2007年11月30日))进行分析。
在NANOG的启动子区中CpG位点的DNA甲基化水平在亲本HDF和DP细胞中较高，但在epi-iPS和ES细胞中较低(图33)。
4)畸胎瘤形成
我们检查了epi-iPSC在体内的分化潜力。用CTK溶液收集细胞且离心。将细胞团块重悬浮于DMEM/F12中。将来自铺满的60-mm皿的一半细胞注射到SCID小鼠(CREA，日本)的睾丸内。注射后从8到12周，解剖肿瘤，并且用溶于PBS中的4％多聚甲醛固定。将石蜡包埋的组织切片且用苏木精与伊红染色。结果显示于图34中。组织学检查证实这些肿瘤是畸胎瘤且含有所有3个胚层的组织，包括神经上皮、软骨、肌肉和肠样上皮(图34A，B)。
5)体外分化
使用与通过SMAD拮抗剂和活化素/结节抑制剂的双重SMAD抑制组合的类胚体样聚集体(SFEB)的无血清培养法(M.Eiraku等人，Cell Stem Cell 3，519(2008))，进行体外介导的分化成多巴胺能神经元。
对于多巴胺能神经元的诱导，如下制备分化培养基：DMEM/F12补充有5％Knockout Serum Replacement(KSR；Invitrogen)、2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、和0.1mM 2-巯基乙醇。使用96孔低细胞粘着板(LIPIDURE-COAT PLATE A-U96、NOF Corporation)，将iPS细胞在Accumax(Invitrogen)中解离成单个细胞，并且在补充有10μM Y-27632、2μM dorsomorphin、和10μm SB431542(Sigma)的分化培养基中以9000细胞/150μl/孔的密度快速再聚集。在培养5天后，用100ng/ml FGF-8和20ng/ml Wnt1刺激细胞聚集体。从第8天起，将200ng/ml SHH呈递给培养基。在第12天时，收集聚集的细胞且转移至在具有200ng/ml SHH的NB培养基(含有B27补充物的Neurobasal培养基；Invitrogen)中的60mm聚鸟氨酸/层粘连蛋白包被的皿。其后，在第15天时，将培养基换成补充有1ng/ml FGF-20和12.5ng/ml bFGF的NB培养基。细胞在第22天时进行收获，且以2×105/孔的密度接种到8孔腔板上，其在NB培养基中，所述NB培养基补充有2ng/mlGDNF、20ng/ml BDNF、400μM dbcAMP和200μM抗坏血酸。在第29天时固定分化的细胞用于免疫染色分析。我们使用巢蛋白(Chemicon)、Ki67(Novocastra)、Pax6(Covance)、βIII-微管蛋白(Covance Research Products)、酪氨酸羟化酶(Chemicon)、MAP2ab(Sigma)和VAMT-2(PelFreeze)的一级抗体。适当时使用与Alexa488、Alexa594或Cy5缀合的二级抗体。为了显现核，将200ng/mL 4’，6’-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)加入最终洗涤中。
结果显示于图35中。大多数细胞表达未成熟的神经标记巢蛋白(图35B-A)。某些细胞仍是增殖性的，并且对于Ki67是阳性的(图35B-B，C，D)。未成熟神经细胞的簇对于Pax6是阳性的，而在用诱导因子例如SHH和FGF8处理后，更成熟的细胞簇表达多巴胺能神经元的标记，酪氨酸羟化酶(TH)(图35B-E，35B-F)。TH阳性细胞还与神经标记Tuj1和MAP2ab、和多巴胺转运蛋白VMAT2一起共定位(图35A-E，F，G，35B-G，H，I，J，K)。因此，epi-iPSC具有分化成多巴胺能神经元的潜力。还对通过使用Y3混合物(pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL)建立的epi-iPSC实施类似分析(RT-PCR、拷贝数分析、核型和畸胎瘤形成)。因此，epi-iPSC证实为与通过使用Y4混合物(pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL)建立的epi-iPSC是可比较的。各自的epi-iPSC克隆分析列表显示于表8中。
表8.Epi-iPS克隆列表
Figure BPA00001503215800581
ND，我们在我们的不同方案(N＝1)中无法检测到RPE分化。
实施例13
在无异物(Xeno-free)条件下(在不存在异源成分的情况下)iPS细胞的建立和培养
在再生医学领域中，在利用使用附加型载体建立的iPS细胞中，关键在于iPS细胞在无异物条件下的建立和维持。因此，如下所述进行研究。
1)使用牙髓干细胞系作为饲养细胞
已知即使当将已用于转染的人表皮成纤维细胞(HDF)用作饲养细胞时，也可以建立且维持人iPS细胞[Takahashi等人，PLoSone，第4卷，第12期，e8067(2009)]。这在考虑临床应用中是相当重要的，因为自体饲养细胞的使用使得在无异物条件下iPS细胞的维持成为可能。因此，进行研究以测定牙髓干细胞系DP74是否可以充当饲养细胞。使用的iPS细胞是通过将pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL转移至HDF建立的人iPS细胞。使用的培养肉汤是通过将bFGF(Wako)以4ng/mL加入普通灵长类动物ES细胞培养基(ReproCELL)制备的培养基(下文ReproCELL培养基)。在1次传代后细胞的照片显示于图25中。ES样形态维持至与使用MSTO作为饲养细胞比较的等价程度。
2)在无异物条件下iPS细胞的维持(1)
进行研究以测定iPS细胞是否可以在完全无异物条件下维持，使用无异物培养基TeSR2(Stemcell Technologies)和无异物板包被试剂CELLstart(GIBCO)(不使用饲养细胞)。使用的iPS细胞是通过将pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL转移至HDF建立的人iPS细胞。在1次传代后细胞的照片显示于图26中。当使用ReproCELL培养基时，细胞开始改变其形态，而当使用TeSR2时，细胞维持未分化的形态。
3)在无异物条件下iPS细胞的维持(2)
进行研究以测定iPS细胞是否可以使用无异物培养基TeSR2(Stemcell Technologies)和KSR-XF[补充有15％KnockOut SRXenoFree(Invitrogen)、2mM GlutaMAX-I(Invitrogen)、0.1mM非必需培养基(Invitrogen)、0.1mM 2-巯基乙醇(Invitrogen)和8ng/mL bFGF(Wako)的KnockOut DMEM(Invitrogen)]进行维持，用DP74系作为饲养细胞。使用的iPS细胞是通过将pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL转移至HDF建立的人iPS细胞。在1次传代后细胞的照片显示于图27中。无论使用何种无异物培养基，ES样形态得到维持。
实施例14
在无异物条件下的转染
进行研究以测定无异物条件是否不仅在iPS细胞建立后，还在iPS细胞建立前(即在重编程基因转移至体细胞时)发挥目的作用。
在初步研究中，使用Microporator将pCXLE-EGFP转移至DP74。使用的无异物培养基是StemPro MSC-SFM(Invitrogen)。
在37℃在5％CO2的存在下在CELLstart包被的100mm培养皿中培养且维持DP74，使用StemPro MSC-SFM(Invitrogen)作为培养肉汤。在pCXLE-EGFP转移时，去除培养基，并且通过加入5mL PBS洗涤细胞。在去除PBS后，加入无异物细胞解离液TripLE select(Invitrogen)，并且反应在37℃进行约5分钟。在细胞升高后，加入StemPro MSC-SFM以悬浮细胞，并且在15mL离心管中回收细胞。将悬液以800rpm离心5分钟，并且去除上清液。在细胞再次悬浮于StemPro MSC-SFM中后，在1.5mL管中回收6x105细胞。将悬液以800rpm离心5分钟，并且去除上清液。使用Microporator将pCXLE-EGFP(3μg)转移至细胞。这种转移使用100μL芯片伴随在1850V持续20ms的1次脉冲，或伴随在1200V持续30ms的2次脉冲发生。将转染的细胞转移至含有3mL StemPro MSC SFM的CELLstart包被的6孔培养板(Falcon)，并且在37℃在5％CO2的存在下培养7天。结果显示于图28中。当使用无异物培养基(StemPro MSC-SFM)时，转移效率在1850V、20ms、1次脉冲的条件下很低。然而，当条件变成1200V、30ms、2次脉冲时，细胞存活率和转移效率增加。因此，后一种条件用于随后的转染。
3种不同质粒pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL用于重编程。在实验中，使用牙髓干细胞系DP74。在37℃在5％CO2的存在下在CELLstart包被的100mm培养皿中培养且维持DP74系，使用StemPro MSC-SFM作为培养肉汤。在质粒转移时，去除培养基，并且通过加入5mL PBS洗涤细胞。在去除PBS后，加入TripLE select(Invitrogen)，并且反应在37℃进行约5分钟。在细胞升高后，加入StemPro MSC-SFM以悬浮细胞，并且在15mL离心管中回收细胞。将悬液以800rpm离心5分钟，并且去除上清液。在细胞再次悬浮于StemPro MSC-SFM中后，在1.5mL管中回收6x105细胞。将悬液以800rpm离心5分钟，并且去除上清液。使用Microporator将3种不同质粒(各1μg，总共3μg)转移至细胞。这种转移使用100μL芯片伴随在1200V共30ms的2次脉冲发生。将转染的细胞转移至含有3mLStemPro MSC SFM的CELLstart包被的6孔培养板(Falcon)，并且在37℃在5％CO2的存在下培养7天。随后去除培养基，并且通过加入2mLPBS洗涤细胞。在去除PBS后，加入TripLE select(Invitrogen)，并且反应在37℃进行约5分钟。在细胞升高后，加入StemPro MSC-SFM以悬浮细胞，并且在15mL离心管中回收细胞。将悬液以800rpm离心5分钟，并且去除上清液。在细胞再次悬浮于StemPro MSC-SFM中后，在表9中所示的多种条件下将1x105细胞接种至100mm皿。第二天，将培养基替换为表9中所示的培养基；持续每2天更换这种培养基。在转移后第26天时出现的人ES细胞样集落的照片显示于图29中(左)。
表9
  编号     培养基   饲养细胞
  1     ReproCELL培养基   MSTO
  2     TeSR2   MSTO
  3     KSR-XF   MSTO
  4     TeSR2   DP74细胞(自我饲养物，CELLstart)
  5     KSR-XF   DP74细胞(自我饲养物，CELLstart)
  6     TeSR2   无饲养细胞(用CELLstart包被)
无论使用何种培养基和饲养细胞，都可以建立iPS集落。具体地，关于表9中编号4-6的结果(所有在无异物条件下获得)证实使用附加型载体在无病毒条件下且从转染时开始在完全无异物条件下，由牙髓干细胞可以建立且维持iPS细胞。
实施例15
来自人外周血单核细胞的iPS细胞建立
根据制造商的说明书，用Nucleofector(Lonza)与人T细胞试剂盒，将3微克表达质粒(1微克pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL)电穿孔到新鲜分离的外周单核细胞(5.0x106)内。我们使用程序V-24的条件。6小时后，用细胞因子(IL-6、sIL-6R、SCF、TPO、Flit3/4-配体和IL-2)和抗CD3/CD28抗体刺激转染的血细胞。在2天后，将细胞接种到用MEF饲养物覆盖的6孔板上。随后在如图36a中图示的接种后，将培养基从补充有IL-6、sIL-6R、SCF、TPO、Flit3/4-配体和IL-2的X-vivo 10逐步换成hES培养基。集落在第29天时进行拍照(图36b)。我们可以建立具有扁平hESC样形态的人iPS集落。
虽然本发明已着重于优选实施方案进行描述，但对于本领域技术人员显而易见的是优选实施方案可以进行修饰。本发明预期本发明可以通过除本说明书中详细描述的那些外的方法体现。相应地，本发明涵盖在附加“权利要求”的要旨和范围中涵盖的所有修饰。
此外，在本文引用的所有出版物包括专利和专利申请中公开的内容在此整体引入作为参考，至它们已在本文中公开的程度。
本申请基于美国临时专利申请号61/232,402和61/307,306，其内容在此引入作为参考。
Figure IPA00001503215300041
Figure IPA00001503215300051
Figure IPA00001503215300061
Figure IPA00001503215300071
Figure IPA00001503215300081
Figure IPA00001503215300091
Figure IPA00001503215300101
Figure IPA00001503215300121
Figure IPA00001503215300131
Figure IPA00001503215300141
Figure IPA00001503215300151
Figure IPA00001503215300161
Figure IPA00001503215300171
Figure IPA00001503215300181
Figure IPA00001503215300201
Figure IPA00001503215300211

Claims (23)

1.一种产生iPS细胞的方法，其包括使下述物质与体细胞接触：(a)Oct3/4或编码其的核酸、(b)Klf4或编码其的核酸、和(c)Sox2或编码其的核酸、以及(d1)L-Myc或编码其的核酸和/或(d2)p53的功能抑制剂。
2.根据权利要求1的方法，其进一步包括使(e)Lin28或Lin28b或编码其的核酸与所述体细胞接触。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述p53的功能抑制剂是选自针对p53的siRNA和shRNA和编码其的DNA的核酸。
4.根据权利要求2或3的方法，其包括将下述物质转移至体细胞：(a)编码Oct3/4的核酸、(b)编码Klf4的核酸、(c)编码Sox2的核酸、(d1)编码L-Myc的核酸和/或(d2)编码针对p53的shRNA的核酸、以及(e)编码Lin28或Lin28b的核酸。
5.根据权利要求4的方法，其中选自前述(a)、(b)、(c)、(d1)和(e)的至少一种核酸以附加型载体的形式转移。
6.根据权利要求4或5的方法，其中(d2)所述编码针对p53的shRNA的核酸以在细胞中不能自我复制的质粒载体的形式转移。
7.根据权利要求5或6的方法，其中所述附加型载体是以50％或更多的频率到第5次传代时从iPS细胞中脱落的自我去除载体。
8.根据权利要求5-7中任一项的方法，其中所述附加型载体具有以相同方向置于对于所述核酸复制必需的载体组成成分的5’和3’侧上的loxP序列。
9.根据权利要求8的方法，其不包括用Cre重组酶处理所述细胞的过程。
10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述体细胞是人细胞。
11.根据权利要求10的方法，其包括在从前述因子(a)、(b)、(c)、以及(d1)和/或(d2)或另外的(e)与所述体细胞接触到iPS细胞建立的期间过程中不存在来自非人动物的成分的情况下培养细胞。
12.根据权利要求11的方法，其中人细胞用作饲养细胞，或其中不使用饲养细胞。
13.根据权利要求12的方法，其中所述饲养细胞衍生自与所述体细胞相同的个体。
14.一种iPS细胞诱导促进剂，其包含(a)编码Oct3/4的核酸、(b)编码Klf4的核酸、(c)编码Sox2的核酸、(d1)编码L-Myc的核酸和/或(d2)编码针对p53的shRNA的核酸、以及(e)编码Lin28或Lin28b的核酸。
15.根据权利要求14的试剂，其中选自前述(a)、(b)、(c)、(d1)和(e)的至少一种核酸是以附加型载体的形式。
16.根据权利要求14或15的试剂，其中(d2)所述编码针对p53的shRNA的核酸是以在细胞中不能自我复制的质粒载体的形式。
17.根据权利要求15或16的试剂，其中所述附加型载体是以50％或更多的频率到第5次传代时从iPS细胞中脱落的自我去除载体。
18.根据权利要求15-17中任一项的试剂，其中所述附加型载体具有以相同方向置于对于前述核酸各自的复制必需的载体组成成分的5’和3’侧上的loxP序列。
19.一种无需经历核酸在基因组中的整合已丧失前述核酸的iPS细胞，其通过根据权利要求5-9中任一项的方法获得。
20.根据权利要求19的iPS细胞，其为人iPS细胞。
21.一种不含来自非人动物的任何污染成分的人iPS细胞，其通过根据权利要求11-13中任一项的方法获得。
22.根据权利要求19-21中任一项的iPS细胞在产生体细胞中的用途。
23.根据权利要求19-21中任一项的iPS细胞，其中所述iPS细胞在产生体细胞中充当细胞来源。
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