JP2021175401A - 人工多能性幹細胞の作製方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】臨床利用に適した安全な人工多能性幹細胞の効率的な作製方法を提供する。【解決手段】本開示によれば、体細胞を用意することと、体細胞に初期化因子ＲＮＡを含むセンダイウイルスを導入することと、を含む、人工多能性幹細胞の作製方法が提供される。また、本開示によれば、体細胞を用意することと、体細胞にＲＮＡトランスフェクション試薬を用いて初期化因子ＲＮＡを導入することと、ゲル培地中で体細胞を初期化することと、を含む、人工多能性幹細胞の作製方法が提供される。【選択図】図１

Description

本発明は、細胞技術に関し、人工多能性幹細胞の作製方法に関する。
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞とは、二つの特徴的な能力を有する細胞である。一つは、体を構成するあらゆる細胞へと変化することができる能力である。もう一つは、半永久的な増殖能を有することである。ｉＰＳ細胞はこの二つの能力を有するため、自己の体細胞からｉＰＳ細胞を作製し、目的の体細胞へ変化させることで、拒絶反応のない移植治療へと応用することができる。そのためｉＰＳ細胞は、再生医療の有力な技術になると考えられている。
ｉＰＳ細胞の誕生から現在までに、数多くのその作製方法が確立された。代表的なｉＰＳ細胞の作製方法としては、レトロウイルス／レンチウイルスを用いた方法、及びエピソーマルベクターを用いた方法が挙げられる。
レトロウイルス／レンチウイルスを用いた方法について説明する。体細胞をレトロウイルスやレンチウイルスに感染させて、初期化因子をコードしている遺伝子を細胞内に導入することができる。さらに、レトロウイルスやレンチウイルスは、体細胞のゲノムに初期化因子を挿入することができ、初期化因子の細胞内での安定的な発現を誘導する。
しかし、レトロウイルス／レンチウイルスを用いた方法には、以下の問題点がある。まず、体細胞のゲノムへの初期化因子の挿入は、既存の遺伝子やプロモーターを傷つけるため、細胞の癌化の原因になり得る。また、ゲノム上に挿入された初期化因子は、ｉＰＳ細胞を体細胞に変化させた後に再度活性化するおそれがある。そのため、ｉＰＳ細胞由来の移植用細胞には癌化のリスクがある。実際、マウスモデルにおいては、導入された初期化因子の再活性化が体細胞で見られ、癌化することが確認されている（例えば、非特許文献１参照。）。
エピソーマルベクターは環状ＤＮＡであり、核内で自己増幅する。エピソーマルベクターは、原理的にはゲノムに組み込まれないと考えられてきたが、最近の研究では、エピソーマルで作成されたｉＰＳ細胞のゲノム上に、エピソーマルベクターの断片が散在して挿入されることが報告されている。そのため、リプログラミング遺伝子が細胞内に残存しうるという問題がある。例えばｃ−ＭＹＣやＫＬＦ４が細胞内に残存すると、癌化の原因になる。リプログラミング遺伝子が細胞内に残存しているか否かを検査するには膨大な費用が必要である。移植細胞プール中の全ての細胞にエピソーマルプラスミドのゲノムへの挿入がなく、残存がないことを示すことは不可能である。
レトロウイルス／レンチウイルスを用いた方法、及びエピソーマルベクターを用いた方法には、上述した問題があるため、ＲＮＡを用いたｉＰＳ細胞の作製方法が提案されている（例えば、非特許文献２参照。）。
Nature 448, 313-317 Nature Biotechnol 26(3): 313-315, 2008.
初期化因子ＲＮＡを効率的に体細胞に導入する方法が求められている。本発明は、臨床利用に適した安全な人工多能性幹細胞の効率的な作製方法を提供することを目的の一つとする。
本発明の態様によれば、体細胞を用意することと、体細胞に初期化因子ＲＮＡを含むセンダイウイルスを導入することと、を含む、人工多能性幹細胞の作製方法が提供される。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、ゲル培地で浮遊培養されている体細胞に初期化因子ＲＮＡを含むセンダイウイルスを導入してもよい。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、接着培養されている体細胞に初期化因子ＲＮＡを含むセンダイウイルスを導入してもよい。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法が、ゲル培地中で体細胞を初期化することをさらに含んでいてもよい。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、体細胞が繊維芽細胞であってもよい。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、体細胞が血液細胞であってもよい。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法が、赤血球分離剤を用いて、体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含んでいてもよい。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、フィルターを用いて、体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含んでいてもよい。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、免疫磁気ビーズを用いて、体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含んでいてもよい。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、初期化因子ＲＮＡが、Ｍ3Ｏ又はＯＣＴ３／４のｍＲＮＡ、ＳＯＸ２のｍＲＮＡ、ＫＬＦ４のｍＲＮＡ、及びｃ−ＭＹＣのｍＲＮＡを含んでいてもよい。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、ゲル培地が攪拌されなくともよい。ゲル培地が、成長因子を含まなくともよい。ゲル培地が、成長因子を４０質量％以下の濃度で含んでいてもよい。ゲル培地が、ｂＦＧＦを含まなくともよい。
また、本発明の態様によれば、体細胞を用意することと、体細胞にＲＮＡトランスフェクション試薬を用いて初期化因子ＲＮＡを導入することと、ゲル培地中で体細胞を初期化することと、を含む、人工多能性幹細胞の作製方法が提供される。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、体細胞が繊維芽細胞であってもよい。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、体細胞が血液細胞であってもよい。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法が、赤血球分離剤を用いて、体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含んでいてもよい。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、フィルターを用いて、体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含んでいてもよい。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、免疫磁気ビーズを用いて、体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含んでいてもよい。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、初期化因子ＲＮＡが、Ｍ3Ｏ又はＯＣＴ３／４のｍＲＮＡ、ＳＯＸ２のｍＲＮＡ、ＫＬＦ４のｍＲＮＡ、及びｃ−ＭＹＣのｍＲＮＡを含んでいてもよい。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、ゲル培地が攪拌されなくもよい。ゲル培地が、成長因子を含まなくともよい。ゲル培地が、成長因子を４０質量％以下の濃度で含んでいてもよい。ゲル培地が、ｂＦＧＦを含まなくともよい。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、初期化因子ＲＮＡの導入を複数回行ってもよい。
本発明によれば、臨床利用に適した安全な人工多能性幹細胞の効率的な作製方法を提供可能である。
第１実施形態の実施例１の結果を示す蛍光顕微鏡の写真と、フローサイトメーターによるドットプロットである。 第１実施形態の実施例１の結果を示す蛍光顕微鏡の写真と、フローサイトメーターによるドットプロットである。 第１実施形態の実施例３に係るｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 第１実施形態の実施例３に係る免疫染色された細胞の写真である。 第１実施形態の実施例４に係る免疫染色された細胞の写真である。 第１実施形態の実施例５に係る免疫染色された細胞の写真である。 第１実施形態の実施例６に係る免疫染色された細胞の写真である。 第１実施形態の実施例７から９の結果を示すフローサイトメーターによるドットプロットである。 第１実施形態の実施例１０、１１に係るｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 第１実施形態の実施例１０に係る免疫染色された細胞の写真であるである。 第１実施形態の実施例１１に係る免疫染色された細胞の写真であるである。 第１実施形態の実施例１２に係る１０ｍＬ血液当たりの平均単核球細胞数を示すグラフである。 第１実施形態の実施例１２の結果を示すフローサイトメーターによるドットプロットである。 第１実施形態の実施例１３の結果を示す蛍光顕微鏡の写真である。 第１実施形態の実施例１３の結果を示すフローサイトメーターによるドットプロットである。 第１実施形態の実施例１４に係るｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 第２実施形態の実施例で用いた初期化因子ｍＲＮＡのマスターミックスの成分を示す表である。 第２実施形態の実施例で用いたキットの内容物を示す表である。 第２実施形態の実施例に係るｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 第２実施形態の参考例に係る蛍光顕微鏡写真である。 第２実施形態の参考例に係る蛍光活性化フローサイトメーターによる分析結果を示すグラフである。
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお以下の示す実施形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
（第１実施形態）
第１実施形態に係る人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の作製方法は、体細胞を用意することと、体細胞に初期化因子ＲＮＡを含むセンダイウイルスを導入することと、を含む。
体細胞の例としては、繊維芽細胞、血液細胞、歯髄幹細胞、ケラチノサイト、毛乳頭細胞、口腔上皮細胞、及び体性幹前駆細胞等が挙げられる。
血液細胞は、血液から分離される。血液は、例えば末梢血及び臍帯血であるが、これらに限定されない。血液は、成年から採取されてもよいし、未成年から採取されてもよい。採血の際には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヘパリン、及び生物学的製剤基準血液保存液Ａ液（ＡＣＤ−Ａ）液等の抗凝固剤を用いる。
血液細胞は、例えば、単核球細胞（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、好中球、好酸球、好塩基球、及びリンパ球等の有核細胞であり、赤血球、顆粒球、及び血小板を含まない。血液細胞は、例えば血管内皮前駆細胞、血液幹・前駆細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞であってもよい。Ｔ細胞は、例えばαβＴ細胞である。
単核球細胞は、血液細胞の分離用媒体、及び遠心分離装置等を用いて、血液から分離される。血液細胞の分離用媒体としてＦｉｃｏｌｌ（ＧＥヘルスケア）を使用する場合の、単核球細胞の分離方法は、以下のとおりである。
低温では単核球細胞の分離精度が悪くなる傾向にあるため、遠心機を４℃から４２℃好ましくは１８℃に設定する。成年又は未成年のヒトから１０μＬから５０ｍＬの血液を採血し、血液が固まらないように血液にＥＤＴＡを含むキレート剤を加えて優しく混ぜる。また、ヒトリンパ球分離用の媒体（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ、ＧＥヘルスケアジャパン）を５ｍＬずつ２本の１５ｍＬチューブに分注する。５ｍＬの血液に対して５ｍＬのＰＢＳを加えて希釈し、チューブ中のヒトリンパ球分離用の媒体の上に５ｍＬずつ重層する。この時、界面を乱さないように、希釈血液をチューブの管壁を伝わらせてゆっくりと媒体上に加える。
チューブ中の溶液を、１０×ｇから１０００×ｇ、好ましくは４００×ｇで、４℃から４２℃好ましくは１８℃で５分から２時間、好ましくは３０分間遠心する。遠心後、チューブ中に白く濁った中間層が現れる。この白く濁った中間層は、単核球細胞を含んでいる。チューブ中の白く濁った中間層をピペットマンでゆっくりと回収し、新しい１５ｍＬチューブに移す。この際、下層は吸い取らないようにする。白く濁った中間層は、１本のチューブより１ｍＬ程度回収できる。２本分の中間層をまとめて１本のチューブに移す。
回収した単核球細胞に対し、１ｍＬから４８ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、溶液をさらに１０×ｇから１０００×ｇ、好ましくは２００×ｇ、４℃から４２℃、好ましくは１８℃で１分から６０分、好ましくは１０分間遠心する。その後、アスピレータを用いて溶液の上清を吸引して除去し、１ｍＬから１２ｍＬ、好ましくは３ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ−ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を加えて懸濁し、単核球細胞懸濁液を得る。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。
採血管としてバキュテイナ（登録商標、ＢＤ）を使用する場合の、単核球細胞の分離方法は、以下のとおりである。
低温では単核球細胞の分離精度が悪くなる傾向にあるため、遠心機を４℃から４２℃、好ましくは１８℃に設定する。成年又は未成年のヒトから、採血管（バキュテイナ（登録商標）、ＢＤ）を用いて８ｍＬ採血し、転倒混和して抗凝固剤と混和する。その後、バランスを調整し、溶液を４℃から４２℃、好ましくは１８℃、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは１５００×ｇから１８００×ｇでスイングロータで１分から６０分、好ましくは２０分間遠心する。遠心後、血漿層である上層を取り除き、ピペッティングして単核球層とゲルに張り付いている血球を懸濁して懸濁液を得る。得られた懸濁液を、別の１５ｍＬチューブに移す。
１５ｍＬチューブの懸濁液に１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、懸濁液を４℃から４２℃、好ましくは１８℃、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは２００×ｇで１分から６０分、好ましくは５分間遠心する。遠心後、上清をアスピレータで除去する。また、溶血剤（ＰｈａｒｍＬｙｓｅ（登録商標）、１０倍濃度、ＢＤ）を滅菌水で１倍濃度に希釈する。１５ｍＬチューブ中のペレットをタッピングでほぐし、１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１ｍＬの溶血剤を加える。その後、室温で遮光し、１分間から６０分間、好ましくは１分間溶液を静置する。
次に、１５ｍＬチューブに１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、４℃から４２℃、好ましくは室温で、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは２００×ｇで１分から６０分、５分間遠心する。遠心後、上清をアスピレータで除去し、１ｍＬから１５ｍＬ、好ましくは３ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ−ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を加えて懸濁し、単核球細胞懸濁液を得る。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。
血液から単核球細胞を分離する方法は、上記の方法に限られず、例えば、透析膜を使用して、血液から単核球を分離してもよい。また、全血単核球濃縮用ピュアセルセレクトシステム（登録商標、ＰＡＬＬ）、血球細胞除去用浄化器（セルソーバＥ、登録商標、旭化成）、及び血小板製剤用白血球除去フィルター（セパセルＰＬ、登録商標、ＰＬＸ−５Ｂ−ＳＣＤ、旭化成）等のフィルターも使用可能である。
単核球細胞は、赤血球を重力沈降又は遠心分離することにより有核細胞を分離することが可能な赤血球分離剤を用いて分離されてもよい。赤血球分離剤の例としては、ＨｅｔａＳｅｐ（登録商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＨＥＳ４０（ＮＩＰＲＯ）が挙げられる。
また、単核球細胞としては、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ社から販売されているＣＴＬ−ＵＰ１や、Ｓａｎｇｕｉｎｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＰＢＭＣ−００１等を使用してもよい。
あるいは、血液細胞としては、セルバンカー１、ステムセルバンカー ＧＭＰグレード、及びステムセルバンカー ＤＭＳＯフリー ＧＭＰグレード（ゼノアック）等の細胞凍結保存液を用いて凍結保存された血液細胞を解凍して用いてもよい。
単核球細胞を解凍する際には、まず、１５ｍＬチューブに１ｍＬから１５ｍＬ、好ましくは８ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ−ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を入れておき、凍結した単核球細胞の入ったチューブを４℃から４２℃、好ましくは３７℃の温浴槽にいれて、単核球細胞を溶かし始める。その後、少し氷が残っている状態で、単核球細胞の入ったチューブを温浴槽から引きあげ、単核球細胞を既知組成無血清造血細胞培地の入ったチューブに移す。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。
血液細胞は、細胞表面マーカーに基づいて分離されてもよい。血液幹・前駆細胞は、ＣＤ３４が陽性である。Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８のいずれかが陽性である。Ｂ細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０のいずれかが陽性である。血液幹・前駆細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞は、例えば、自動磁気細胞分離装置及び免疫磁気ビーズを用いて、血液細胞から分離される。あるいは、予め分離された単核球細胞を用意してもよい。ただし、細胞表面マーカーに基づいて分離されていない血液細胞を用いてもよい。
ＣＤ３４陽性細胞は、幹・前駆細胞であり、リプログラミングされやすい傾向にある。また、ＣＤ３陽性細胞であるＴ細胞を用いてｉＰＳ細胞を作製すると、Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞はＴＣＲリコンビネーションの型を保持しているので、Ｔ細胞に効率的に分化誘導できる傾向にある。
ＣＤ３４陽性細胞の分離方法は、以下のとおりである。
１０ｍＬの無血清培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００、ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、１０μＬのＩＬ−６（１００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＳＣＦ（３００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＴＰＯ（３００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＦＬＴ３リガンド（３００μｇ／ｍＬ）、及び１０μＬのＩＬ−３（１０μｇ／ｍＬ）を加えて血球培地（血液幹・前駆細胞培地）を調製する。
６ウェルプレートの１ウェルに１ｍＬから６ｍＬ、好ましくは２ｍＬの血球培地を入れる。また、培地の蒸発を防ぐために、他の５ウェルのそれぞれに１ｍＬから６ｍＬ、２ｍＬのＰＢＳを入れる。その後、６ウェルプレートを４℃から４２℃、好ましくは３７℃のインキュベーターに入れて温める。
２０ｍＬのＰＢＳに対し、１０μＬから１ｍＬ、好ましくは８０μＬのＥＤＴＡ（５００ｍｍｏｌ／Ｌ）及び１０μＬから１ｍＬ、好ましくは２００μＬのＦＢＳを加えたカラムバッファを用意する。１×１０4から１×１０9個、好ましくは２×１０7個の単核球細胞を含有する単核球細胞懸濁液を１５ｍＬチューブに分注し、単核球細胞懸濁液を、４℃から４２℃、好ましくは４℃、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは３００×ｇで１０分間遠心する。遠心後、上清を除き、単核球細胞を１００μＬから１ｍＬ、好ましくは３００μＬのカラムバッファで懸濁する。
１５ｍＬチューブ中の単核球細胞懸濁液に、１０μＬから１ｍＬ、好ましくは１００μＬのＦｃＲブロッキング試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及び１０μＬから１ｍＬ、好ましくは１００μＬのＣＤ３４マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を加える。ＦｃＲブロッキング試薬は、マイクロビーズ標識の特異性を高めるために用いられる。その後、単核球細胞懸濁液を混和して、４℃から４２℃、好ましくは４℃で１分から２時間、好ましくは３０分間静置する。
次に、１５ｍＬチューブ中の単核球細胞懸濁液に１ｍＬから１５ｍＬ、好ましくは１０ｍＬのカラムバッファを加えて希釈し、４℃から４２℃、好ましくは４℃、１００×ｇから１０００×ｇ、好ましくは３００×ｇで１分から２時間、好ましくは１０分間遠心する。遠心後、１５ｍＬチューブ中の上清をアスピレータで除き、１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは５００μＬのカラムバッファを加えて再懸濁する。
自動磁気細胞分離装置用のカラム（ＭＳカラム、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を自動磁気細胞分離装置（ＭｉｎｉＭＡＣＳ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に取り付け、カラムに１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは５００μＬのカラムバッファを入れて洗浄する。次に、単核球細胞をカラムに入れる。さらに、カラムに１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは５００μＬのカラムバッファを入れて、カラムを１回から１０回、好ましくは３回洗浄する。その後、カラムを自動磁気細胞分離装置から外し、１５ｍＬチューブに入れる。次に、カラムに１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは１０００μＬのカラムバッファを入れ、速やかにシリンジを押してＣＤ３４陽性細胞を１５ｍＬチューブに流出させる。
１０μＬのＣＤ３４陽性細胞懸濁液をトリパンブルーで染めて、細胞数を血球計算版でカウントする。また、１５ｍＬチューブ中のＣＤ３４陽性細胞懸濁液を、４℃から４２℃、好ましくは４℃、１００×ｇから１０００×ｇ、好ましくは３００×ｇで１分から２時間、好ましくは１０分間遠心する。遠心後、上清をアスピレータで除く。さらに、温めておいた血球培地でＣＤ３４陽性細胞を再懸濁し、ＣＤ３４陽性細胞を培養プレートにまく。その後、４℃から４２℃、好ましくは３７℃、１％から２０％、好ましくは５％ＣＯ2でＣＤ３４陽性細胞を６日間培養する。この間、培地交換はしなくてもよい。
ＣＤ３４以外のマーカーで細胞を単離する方法は、ＣＤ３４陽性細胞を単離する方法と同様である。
接着培養されている体細胞に、初期化因子ＲＮＡを含むセンダイウイルスを導入する。あるいは、ゲル培地で浮遊培養されている体細胞に、初期化因子ＲＮＡを含むセンダイウイルスを導入する。
初期化因子ＲＮＡを導入される体細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、あるいはＬａｍｉｎｉｎ５１１（ｉＭａｔｒｉｘ−５１１、ｎｉｐｐｉ）等の基底膜マトリックスを用いて、フィーダーフリーで培養する。
初期化因子ＲＮＡを導入される体細胞が培養される培地としては、例えば、Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ(ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ)等のヒトＥＳ／ｉＰＳ培地等の幹細胞培地を使用可能である。
ただし、幹細胞培地は、これに限定されず、種々の幹細胞培地が使用可能である。例えばＰｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｒｅｐｒｏｓｔｅｍ、ＲｅｐｒｏＦＦ、ＲｅｐｒｏＦＦ２、ＲｅｐｒｏＸＦ（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）、ｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ２、ＴｅＳＲＥ８、ＲｅｐｒｏＴｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＥＳ／ｉＰＳ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｒｃｋ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ （登録商標）ＸＦ／ＦＦ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ ｉＰＳ ａｎｄ ＥＳ Ｃｅｌｌｓ、Ｐｌｕｒｉｔｏｎ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）、Ｓｔｅｍｆｉｔ ＡＫ０２Ｎ、Ｓｔｅｍｆｉｔ ＡＫ０３（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）、ＥＳＣ−Ｓｕｒｅ（登録商標）ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｆｅｅｄｅｒ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｈＥＳＣ／ｉＰＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ ＳｔｅｍＣｅｌｌ）、Ｌ７（登録商標）ｈＰＳＣ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ （ＬＯＮＺＡ）、及びＰｌｕｒｉＱ（ＭＴＩ−ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ）等を利用してもよい。幹細胞培地は、例えば、ディッシュ、ウェル、又はチューブ等に入れられる。
ゲル培地は、例えば、幹細胞培地にジェランガムを終濃度が０．００１質量％から０．５質量％、０．００５質量％から０．１質量％、あるいは０．０１質量％から０．０５質量％となるよう添加することにより調製される。
ゲル培地は、ジェランガム、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の高分子化合物を含んでいてもよい。また、ゲル培地は、メチルセルロースを含んでいてもよい。メチルセルロースを含むことにより、細胞同士の凝集がより抑制される。
あるいは、ゲル培地は、poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA)、poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA）、Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)、amine terminated、carboxylic acid terminated、maleimide terminated、N-hydroxysuccinimide (NHS) ester terminated、triethoxysilane terminated、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate)、及びN-Isopropylacrylamideから選択される少なくの温度感受性ゲルを含んでいてもよい。
ゲル培地は、例えば、ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）等の成長因子を含まない。あるいは、ゲル培地は、ｂＦＧＦ等の成長因子を、４００μｇ／Ｌ以下、４０μｇ／Ｌ以下、あるいは１０μｇ／Ｌ以下の低濃度で含む。
また、ゲル培地は、ＴＧＦ−βを含まないか、ＴＧＦ−βを６００ｎｇ／Ｌ以下、３００ｎｇ／Ｌ以下、あるいは１００ｎｇ／Ｌ以下の低濃度で含む。
ゲル培地は、撹拌されなくともよい。また、ゲル培地は、フィーダー細胞を含まなくともよい。
ゲル培地は、カドヘリン、ラミニン、フィブロネクチン、及びビトロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種の物質を含んでいてもよい。
体細胞に導入される初期化因子ＲＮＡは、例えば、ＯＣＴ３／４のｍＲＮＡ、ＳＯＸ２のｍＲＮＡ、ＫＬＦ４のｍＲＮＡ、及びｃ−ＭＹＣのｍＲＮＡを含む。初期化因子ＲＮＡとして、ＯＣＴ３／４を改良したＭ3Ｏを使用してもよい。また、初期化因子ＲＮＡは、ＬＩＮ２８Ａ、ＦＯＸＨ１、ＬＩＮ２８Ｂ、ＧＬＩＳ１、ｐ５３−ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ、ｐ５３−Ｐ２７５Ｓ、Ｌ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ＤＰＰＡ５、ＺＩＣ３、ＢＣＬ−２、Ｅ−ＲＡＳ、ＴＰＴ１、ＳＡＬＬ２、ＮＡＣ１、ＤＡＸ１、ＴＥＲＴ、ＺＮＦ２０６、ＦＯＸＤ３、ＲＥＸ１、ＵＴＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、ＥＳＲＲＢ、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＴＢＸ３、ＭＢＤ３ｓｈ、ＴＨ２Ａ、ＴＨ２Ｂ、及びＰ５３ＤＤからなる群から選択される少なくとも一つの因子のｍＲＮＡをさらに含んでいてもよい。これらのｍＲＮＡは、ＴｒｉＬｉｎｋから入手可能である。なお、ここでは遺伝子記号はヒトで記載しているが、大文字・小文字表記によって、種を制限することを意図するものではない。例えば、全て大文字表記していても、マウス又はラットの遺伝子を含むことを排除するものではない。ただし、実施例においては、実際に使用した生物種に則って、遺伝子記号を表記している。
ｍＲＮＡは、プソイドウリジン（Ψ）、５−メチルウリジン（５ｍｅＵ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍｅ１Ψ）、５−メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、５−ヒドロキシメチルウリジン（５ｈｍＵ）、５−フォーミルウリジン（５ｆＵ）、５−カルボキシメチルエステルウリジン（５ｃａｍＵ）、チエノグアノシン（ｔｈＧ）、Ｎ４−メチルシチジン（ｍｅ４Ｃ）、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５−メチオキシチジン（５ｍｏＣ）、５−ヒドロキシメチルシチジン（５ｈｍＣ）、５−ヒドロキシシチジン（５ｈｏＣ）、５−フォルムシチジン（５ｆＣ）、５−カルボキシシチジン（５ｃａＣ）、Ｎ６−メチル−２−アミノアデノシン（ｍ６ＤＡＰ）、ジアミノプリン（ＤＡＰ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’−Ｏ−メチルウリジン（Ｕｍまたはｍ２’−ＯＵ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、及びＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）からなる群から選択される少なくとも１つで修飾されていてもよい。
ｍＲＮＡは、ポリアデニル化されていてもよい。
ｍＲＮＡは、インビトロで転写される（ＩＶＴ）ＲＮＡのポリアデニル化によって調製されてもよい。ｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）末端をコードするＤＮＡテンプレートを用いることによって、ＩＶＴの間にポリアデニル化されてもよい。ｍＲＮＡがキャッピングされてもよい。細胞における発現の効率性を最大化するために、大部分のｍＲＮＡ分子がキャップを含有することが好ましい。ｍＲＮＡは５’ｃａｐ［ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ］構造を有していてもよい。当該配列はｍＲＮＡを安定化させ、転写を促進させる配列である。５’ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅをもつｍＲＮＡからは、脱リン酸化処理により５’ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅを取り除いてもよい。ｍＲＮＡはＡｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）として［３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ］を有していてもよい。ＡＲＣＡは転写開始点より前に挿入される配列であり、転写されるｍＲＮＡの効率は二倍となる。ｍＲＮＡはＰｏｌｙＡテールを有していてもよい。
また、ｍＲＮＡは、自己増殖能を持つリプリケイティブＲＮＡであってもよい。リプリケイティブＲＮＡとは、自己増殖能を持つＲＮＡであり、通常のＲＮＡと異なり、ＲＮＡの複製に必要なタンパク質を発現させる能力を併せ持っている。リプリケイティブＲＮＡはアルファウイルスの一種であるベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）ウイルス由来である。リプリケイティブＲＮＡを細胞にトランスフェクションすると、リプログラミング因子を作り続けるＲＮＡを細胞に発現させることができるため、初期化因子ＲＮＡを細胞に複数回導入することを省くことが可能となる。
リプリケイティブＲＮＡの配列は、アルファウイルスレプリコンＲＮＡ、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、エバーグレーズ（Ｅｖｅｒｇｌａｄｅｓ）ウイルス、ムカンボ（Ｍｕｃａｍｂｏ）ウイルス、ピクスナ（Ｐｉｘｕｎａ）ウイルス、及び西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥ）からなる群から選択されるアルファウイルスから得られる配列を含んでいてよい。
また、リプリケイティブＲＮＡは、シンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルス、セムリキ森林（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ）ウイルス、ミデルブルグ（Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ）ウイルス、チクングニア（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）ウイルス、オニョンニョン（Ｏ’ｎｙｏｎｇ−ｎｙｏｎｇ）ウイルス、ロスリバー（Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒ）ウイルス、バーマフォレスト（Ｂａｒｍａｈ Ｆｏｒｅｓｔ）ウイルス、ゲタ（Ｇｅｔａｈ）ウイルス、サギヤマ（Ｓａｇｉｙａｍａ）ウイルス、ベバル（Ｂｅｂａｒｕ）ウイルス、マヤロ（Ｍａｙａｒｏ）ウイルス、ウナ（Ｕｎａ）ウイルス、アウラ（Ａｕｒａ）ウイルス、ワタロア（Ｗｈａｔａｒｏａ）ウイルス、ババンキ（Ｂａｂａｎｋｉ）ウイルス、Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈウイルス、ハイランドＪ（Ｈｉｇｈｌａｎｄｓ Ｊ）ウイルス、フォートモーガン（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス、ヌドゥム（Ｎｄｕｍｕ）ウイルス、及びバギークリーク（Ｂｕｇｇｙ Ｃｒｅｅｋ）ウイルスからなる群から選択されるアルファウイルスから得られる配列を含んでいてよい。
リプリケイティブＲＮＡは、例えば、５’から３’に向かって、（ＶＥＥ ＲＮＡレプリカーゼ）−（プロモーター）−（ＲＦ１）−（自己切断型ペプチド）−（ＲＦ２）−（自己切断型ペプチド）−（ＲＦ３）−（ＩＲＥＳもしくはコアプロモーター）−（ＲＦ４）−（ＩＲＥＳもしくは任意のプロモーター）−（任意に選択可能なマーカー）−（ＶＥＥ ３’ＵＴＲ及びポリＡテール）−（任意に選択可能なマーカー）−プロモーターを含んでいる。上記のＲＦ１−４は、多能性細胞への体細胞の脱分化を誘導する因子である。上記のＲＦ２−３、ＲＦ３−４、ＲＦ４は任意である。上記のＲＦ１−４は、ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ−２、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＧＬＩＳ１、ＦＯＸＨ１、ｐ５３−ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ、ｐ５３−Ｐ２７５Ｓ、Ｌ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ＤＰＰＡ５、ＺＩＣ３、ＢＣＬ−２、Ｅ−ＲＡＳ、ＴＰＴ１、ＳＡＬＬ２、ＮＡＣ１、ＤＡＸ１、ＴＥＲＴ、ＺＮＦ２０６、ＦＯＸＤ３、ＲＥＸ１、ＵＴＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、ＥＳＲＲＢ、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＴＢＸ３、ＭＢＤ３ｓｈ、ＴＨ２Ａ、及びＴＨ２Ｂからなる群から選択されてもよい。
初期化因子ＲＮＡは、センダイウイルスを用いて体細胞に導入される。初期化因子ＲＮＡを搭載したセンダイウイルスとしては、ＣｙｔｏＴｕｎｅ（登録商標、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が使用可能である。センダイウイルスの力価（タイター）の指標としては、感染多重度（ＭＯＩ）が挙げられる。センダイウイルスのＭＯＩは、例えば、０．１から１００．０、あるいは１．０から５０．０である。
センダイウイルスを用いて、体細胞へ初期化因子ＲＮＡの導入を行った後、ゲル培地ではない液体培地あるいはゲル培地中で、体細胞を初期化させる。
体細胞が人工多能性幹細胞に誘導（リプログラミング）されたか否かは、例えば、細胞の形態から確認することができる。あるいは、体細胞が人工多能性幹細胞に誘導されたか否かは、サイトフローメータで、未分化であることを示す細胞表面マーカーであるＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−１、及びＳＳＥＡ５から選択される少なくとも一つの表面マーカーが陽性であるか否かを分析することにより行う。ＴＲＡ−１−６０は、ｉＰＳ／ＥＳ細胞に特異的な抗原であり、体細胞では検出されない。ｉＰＳ細胞はＴＲＡ−１−６０陽性画分からのみできることから、ＴＲＡ−１−６０陽性細胞はｉＰＳ細胞の種と考えられる。
以上説明した第１実施形態に係る人工多能性幹細胞の作製方法によれば、初期化因子ＲＮＡを発現させることができるＲＮＡを体細胞に効率的に導入して、初期化因子ＲＮＡを発現させ、人工多能性幹細胞を作製することが可能である。
（第１実施形態の実施例１）
ゲル培地ではない液体培地である、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含む２ｍＬのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に懸濁した１×１０5個の繊維芽細胞（ＨＤＦ２４４３又はＨＤＦ２８０２、Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｃ．）を、ウェルディッシュの各ウェルに播種し、ウェルディッシュを３７℃のＣＯ2インキュベーター中に静置して、繊維芽細胞を接着培養した。２４時間後、蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現させることのできるセンダイウイルス（ＣｙｔｏＴｕｎｅ、登録商標、ＥｍＧＦＰ Ｓｅｎｄａｉ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を、感染多重度（ＭＯＩ）が３．０となるよう液体培地に添加した。２４時間後、蛍光顕微鏡を利用して、図１（ＨＤＦ２４４３）及び図２（ＨＤＦ２８０２）に示すように、繊維芽細胞の蛍光強度を観察した。また、フローサイトメーターを利用して蛍光強度を測定した。その結果、繊維芽細胞がセンダイウイルスに感染していることが確認された。
（第１実施形態の実施例２）
１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）にジェランガム（日産化学）が０．０２質量％になるよう添加した２ｍＬのゲル培地に懸濁した１×１０5個の繊維芽細胞（ＨＤＦ２４４３又はＨＤＦ２８０２）をチューブに播種し、チューブを３７℃のＣＯ2インキュベーター中に静置して、繊維芽細胞を浮遊培養した。２４時間後、蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現させることのできるセンダイウイルス（ＣｙｔｏＴｕｎｅ、登録商標、ＥｍＧＦＰ Ｓｅｎｄａｉ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を、ＭＯＩが３．０となるようゲル培地に添加した。２４時間後、蛍光顕微鏡を利用して、図１（ＨＤＦ２４４３）及び図２（ＨＤＦ２８０２）に示すように、繊維芽細胞の蛍光強度を観察した。また、フローサイトメーターを利用して蛍光強度を測定した。その結果、繊維芽細胞がセンダイウイルスに感染していることが確認された。
また、第１実施形態の実施例１、２の結果から、液体培地中で接着培養したときより、ゲル培地中で浮遊培養したときのほうが、蛍光タンパク質ＥＧＦＰが多く発現していた。これは、液体培地中で接着培養したときより、ゲル培地中で浮遊培養したときのほうが、センダイウイルスを細胞に効率的に導入できたことを示している。
（第１実施形態の実施例３）
ｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ）を４ｎｇ／ｍＬ含有しているｈＥＳ培地（Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ、リプロセル）にジェランガム（日産化学）が０．０２質量％になるよう添加した２ｍＬのゲル培地に懸濁した１×１０5個の繊維芽細胞（ＨＤＦ１４１９、Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｃ．）をチューブに播種し、チューブを３７℃のＣＯ2インキュベーター中に静置し、繊維芽細胞を浮遊培養した。２４時間後、初期化因子ＯＳＫＭ（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ）を発現させることのできるセンダイウイルス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をゲル培地に添加した。センダイウイルスは、ｈＫＯＳ（ＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２）のＭＯＩが５．０、ｃ−ＭＹＣのＭＯＩが５．０、及びｈＫＬＦのＭＯＩが５．０となるようゲル培地に添加した。
以降、３７℃のＣＯ2インキュベーター中にチューブを静置した。２３日間、細胞を培養し続けた。その間、４８時間毎に、５００μＬのｂＦＧＦ含有ゲル培地をチューブに加えた。
その結果、ｂＦＧＦ含有ゲル培地中において、ｉＰＳ細胞のクランプの形成が認められた。また、ｂＦＧＦ含有ゲル培地で作製されたｉＰＳ細胞をフィーダー上にまきなおし、コロニーの形態を確認したところ、図３に示すように、未分化なｉＰＳ細胞コロニーの形態であった。さらに、細胞を多能性幹細胞のマーカーであるＯＣＴ３／４に対する抗体で免疫染色したところ、図４に示すように、細胞は、ＯＣＴ３／４陽性を示した。
（第１実施形態の実施例４）
センダイウイルスを、ｈＫＯＳ（ＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２）のＭＯＩが２．５、ｃ−ＭＹＣのＭＯＩが２．５、及びｈＫＬＦのＭＯＩが２．５となるようゲル培地に添加した以外は、第１実施形態の実施例３と同様にして、繊維芽細胞（ＨＤＦ１４１９、Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｃ．）を初期化した。
その結果、ｂＦＧＦ含有ゲル培地中において、ｉＰＳ細胞のクランプの形成が認められた。また、ｂＦＧＦ含有ゲル培地で作製されたｉＰＳ細胞をフィーダー上にまきなおし、コロニーの形態を確認したところ、図３に示すように、未分化なｉＰＳ細胞コロニーの形態であった。さらに、細胞を多能性幹細胞のマーカーであるＯＣＴ３／４に対する抗体で免疫染色したところ、図５に示すように、細胞は、ＯＣＴ３／４陽性を示した。
（第１実施形態の実施例５）
ｂＦＧＦを含有しないゲル培地を用いた以外は、第１実施形態の実施例３と同様にして、繊維芽細胞（ＨＤＦ１４１９、Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｃ．）を初期化した。
その結果、ｂＦＧＦ非含有ゲル培地中において、ｉＰＳ細胞のクランプの形成が認められた。また、ｂＦＧＦ非含有ゲル培地で作製されたｉＰＳ細胞をフィーダー上にまきなおし、コロニーの形態を確認したところ、図３に示すように、未分化なｉＰＳ細胞コロニーの形態であった。さらに、細胞を多能性幹細胞のマーカーであるＯＣＴ３／４に対する抗体で免疫染色したところ、図６に示すように、細胞は、ＯＣＴ３／４陽性を示した。
（第１実施形態の実施例６）
繊維芽細胞（ＨＤＦ２８０２、Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｃ．）を用いた以外は、第１実施形態の実施例５と同様にして、繊維芽細胞（ＨＤＦ２８０２、Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｃ．）を初期化した。
その結果、ｂＦＧＦ非含有ゲル培地中において、ｉＰＳ細胞のクランプの形成が認められた。また、ｂＦＧＦ非含有ゲル培地で作製されたｉＰＳ細胞をフィーダー上にまきなおし、コロニーの形態を確認したところ、図３に示すように、未分化なｉＰＳ細胞コロニーの形態であった。さらに、細胞を多能性幹細胞のマーカーであるＯＣＴ３／４に対する抗体で免疫染色したところ、図７に示すように、細胞は、ＯＣＴ３／４陽性を示した。
第１実施形態の実施例３から６の結果は、複数種類の繊維芽細胞から、ｂＦＧＦ含有ゲル培地及びｂＦＧＦ非含有ゲル培地を用いて、センダイウイルスによってｉＰＳ細胞を誘導できたことを示している。
（第１実施形態の実施例７）
ゲル培地ではない液体培地である、７５０μＬのＳｔｅｍｓｐａｎＡＣＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に懸濁した５×１０4個の血液細胞（単核球細胞、スタンフォード大学血液センター）をウェルディッシュの各ウェルに播種し、ウェルディッシュを３７℃のＣＯ2インキュベーター中に静置して、血液細胞を培養した。なお、ＳｔｅｍｓｐａｎＡＣＦには、成長因子として、２０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３、１０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ６、１０ｎｇ／ｍＬのＧＣＳＦ、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３を添加した。ＳｔｅｍｓｐａｎＡＣＦを使用する以下の実施例においても、同様である。
２４時間後、蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現させることのできるセンダイウイルス（ＣｙｔｏＴｕｎｅ、登録商標、ＥｍＧＦＰ Ｓｅｎｄａｉ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を、ＭＯＩが３．０となるよう液体培地に添加した。２４時間後、蛍光顕微鏡を利用して、血液細胞の蛍光強度を観察した。また、図８に示すように、フローサイトメーターを利用して蛍光強度を測定した。その結果、血液細胞がセンダイウイルスに感染していることが確認された。
（第１実施形態の実施例８）
ＳｔｅｍｓｐａｎＡＣＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に脱アシル化ジェランガム（日産化学）が０．０２質量％になるよう添加した７５０μＬのゲル培地に懸濁した５×１０4個の血液細胞（単核球細胞、スタンフォード大学血液センター）をチューブに播種し、チューブを３７℃のＣＯ2インキュベーター中に静置して、血液細胞を培養した。
２４時間後、蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現させることのできるセンダイウイルス（ＣｙｔｏＴｕｎｅ、登録商標、ＥｍＧＦＰ Ｓｅｎｄａｉ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を、ＭＯＩが３．０又は３０．０となるようゲル培地に添加した。２４時間後、蛍光顕微鏡を利用して、血液細胞の蛍光強度を観察した。また、図８に示すように、フローサイトメーターを利用して蛍光強度を測定した。その結果、血液細胞がセンダイウイルスに感染していることが確認された。また、ＭＯＩが高いほうが、細胞にセンダイウイルスを効率的に導入できることが確認された。
（第１実施形態の実施例９）
ＳｔｅｍｓｐａｎＡＣＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にジェランガム（日産化学）が０．０２質量％になるよう添加した１００μＬのゲル培地に懸濁した５×１０4個の血液細胞（単核球細胞、スタンフォード大学血液センター）をチューブに播種し、チューブを３７℃のＣＯ2インキュベーター中に静置して、血液細胞を浮遊培養した。
２４時間後、蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現させることのできるセンダイウイルス（ＣｙｔｏＴｕｎｅ、登録商標、ＥｍＧＦＰ Ｓｅｎｄａｉ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を、ＭＯＩが３０．０となるようゲル培地に添加した。２４時間後、蛍光顕微鏡を利用して、血液細胞の蛍光強度を観察した。また、図８に示すように、フローサイトメーターを利用して蛍光強度を測定した。その結果、血液細胞がセンダイウイルスに感染していることが確認された。
（第１実施形態の実施例１０）
７５０μＬのＳｔｅｍｓｐａｎＡＣＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に懸濁した１×１０6個の血液細胞（単核球細胞、スタンフォード大学血液センター）をウェルディッシュの各ウェルに播種し、ウェルディッシュを３７℃のＣＯ2インキュベーター中に静置して、血液細胞を接着培養した。３日後、７５０μＬのＳｔｅｍｓｐａｎＡＣＦを各ウェルに添加し、３７℃のＣＯ2インキュベーター中に静置して、引き続き血液細胞を培養した。
さらに３日後、各ウェル中の血液細胞を回収し、遠心分離機を利用して２８０ｇで血液細胞を遠心し、ｂＦＧＦを含有していないｈＥＳ培地（Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ、リプロセル）にジェランガムが０．０２質量％となるよう添加したゲル培地２ｍＬに血液細胞を懸濁し、血液細胞が懸濁されたゲル培地をチューブに入れた。
初期化因子ＯＳＫＭ（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ）を発現させることのできるセンダイウイルス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をゲル培地に添加した。センダイウイルスは、ｈＫＯＳ（ＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２）のＭＯＩが１０．０、ｃ−ＭＹＣのＭＯＩが１０．０、及びｈＫＬＦのＭＯＩが１０．０となるようゲル培地に添加した。
以降、３７℃のＣＯ2インキュベーター中にチューブを静置した。３０日間、細胞を培養し続けた。その間、４８時間毎に、５００μＬのｂＦＧＦ非含有ゲル培地をチューブに加えた。
その結果、ｂＦＧＦ非含有ゲル培地中において、ｉＰＳ細胞のクランプの形成が認められた。また、ｂＦＧＦ非含有ゲル培地で作製されたｉＰＳ細胞をフィーダー上にまきなおし、コロニーの形態を確認したところ、図９に示すように、未分化なｉＰＳ細胞コロニーの形態であった。さらに、細胞を多能性幹細胞のマーカーであるＯＣＴ３／４に対する抗体で免疫染色したところ、図１０に示すように、細胞は、ＯＣＴ３／４陽性を示した。
（第１実施形態の実施例１１）
センダイウイルスを、ｈＫＯＳ（ＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２）のＭＯＩが５．０、ｃ−ＭＹＣのＭＯＩが５．０、及びｈＫＬＦのＭＯＩが２．５となるようゲル培地に添加した以外は、第１実施形態の実施例１０と同様にして、血液細胞（単核球細胞、スタンフォード大学血液センター）を初期化した。
その結果、ｂＦＧＦ非含有ゲル培地中において、ｉＰＳ細胞のクランプの形成が認められた。また、ｂＦＧＦ非含有ゲル培地で作製されたｉＰＳ細胞をフィーダー上にまきなおし、コロニーの形態を確認したところ、図９に示すように、未分化なｉＰＳ細胞コロニーの形態であった。さらに、細胞を多能性幹細胞のマーカーであるＯＣＴ３／４に対する抗体で免疫染色したところ、図１１に示すように、細胞は、ＯＣＴ３／４陽性を示した。
（第１実施形態の実施例１２）
８ｍＬの全血に対して２ｍＬのＨｅｔａＳｅｐ（登録商標、ステムセルテクノロジーズ）又はＨＥＳ４０（ＮＩＰＲＯ）を添加し、３７℃のＣＯ2インキュベーターで３０分から１時間インキュベートし、赤血球を沈降させた。その後、血漿成分をチューブに移し、単核球細胞数を計測した。結果を図１２に示す。Ｆｉｃｏｌｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた場合と同等以上に、単核球細胞を分離できた。
分離された単核球細胞をＣＤ３コンジュゲート抗体で免疫染色をし、ＦＡＣＳでＴ細胞画分の濃縮率を確認した。結果を図１３に示す。赤血球分離剤を用いて、単核球細胞を効率的に分離できることが示された。
（第１実施形態の実施例１３）
ゲル培地ではない液体培地である、７５０μＬのＳｔｅｍｓｐａｎＡＣＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、第１実施形態の実施例１２で分離した５×１０4個の単核球細胞を懸濁させた。当該懸濁液をウェルディッシュの各ウェルに播種し、ウェルディッシュを３７℃のＣＯ2インキュベーター中に静置して、単核球細胞を培養した。
２４時間後、蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現させることのできるセンダイウイルス（ＣｙｔｏＴｕｎｅ、登録商標、ＥｍＧＦＰ Ｓｅｎｄａｉ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を、ＭＯＩが３．０となるよう液体培地に添加した。２４時間後、蛍光顕微鏡を利用して、図１４に示すように、細胞の蛍光強度を観察した。また、図１５に示すように、フローサイトメーターを利用して蛍光強度を測定した。その結果、単核球細胞がセンダイウイルスに感染していることが確認された。
（第１実施形態の実施例１４）
ゲル培地ではない液体培地である、７５０μＬのＳｔｅｍｓｐａｎＡＣＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、第１実施形態の実施例１２で分離した１×１０6個の単核球細胞を懸濁させた。当該懸濁液をウェルディッシュの各ウェルに播種し、ウェルディッシュを３７℃のＣＯ2インキュベーター中に静置して、単核球細胞を培養した。３日後、７５０μＬのＳｔｅｍｓｐａｎＡＣＦを各ウェルに添加し、３７℃のＣＯ2インキュベーター中に静置した。
さらに３日後、各ウェル中の細胞を回収し、遠心分離機を用いて、２８０ｇで単核球細胞を単離した。単離した単核球細胞をゲル培地ではない液体培地であるｈＥＳ細胞培地（Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ、リプロセル）、又はｂＦＧＦ非含有ＳｔｅｍｓｐａｎＡＣＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に懸濁し、当該懸濁液をウェルディッシュの各ウェルに入れた。
初期化因子ＯＳＫＭ（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ）を発現させることのできるセンダイウイルス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培地に添加した。センダイウイルスは、ｈＫＯＳ（ＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２）のＭＯＩが１０．０、ｃ−ＭＹＣのＭＯＩが１０．０、及びｈＫＬＦのＭＯＩが１０．０となるよう培地に添加した。
単核球細胞をセンダイウイルスに感染させた２日後、ｂＦＧＦを含有ｈＥＳ細胞培地（Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ、リプロセル）をウェルに加え、さらに２日後、細胞をフィーダー細胞上に播種した。その後、１９日間、フィーダー細胞上で細胞を培養したところ、図１６に示すように、未分化なｉＰＳ細胞コロニーの形成が確認された。したがって、Ｆｉｃｏｌｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて単離された単核球細胞と同様に、ＨｅｔａＳｅｐ（登録商標、ステムセルテクノロジーズ）を用いて単離された単核球細胞、及びＨＥＳ４０（ＮＩＰＲＯ）を用いて単離された単核球細胞から、ｉＰＳ細胞を誘導できることが確認された。
（第２実施形態）
第２実施形態に係る人工多能性幹細胞の作製方法は、体細胞を用意することと、体細胞にＲＮＡトランスフェクション試薬を用いて初期化因子ＲＮＡを導入することと、ゲル培地中で体細胞を初期化することと、を含む。
体細胞の例としては、繊維芽細胞、血液細胞、歯髄幹細胞、ケラチノサイト、毛乳頭細胞、口腔上皮細胞、及び体性幹前駆細胞が挙げられる。
血液細胞の詳細は、第１実施形態で説明したとおりである。初期化因子ＲＮＡの詳細も、第１実施形態で説明したとおりである。
初期化因子ＲＮＡを導入される体細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、あるいはＬａｍｉｎｉｎ５１１（ｉＭａｔｒｉｘ−５１１、ｎｉｐｐｉ）等の基底膜マトリックスを用いて、フィーダーフリーで培養する。
初期化因子ＲＮＡを導入される体細胞が培養される培地としては、例えば、ＰｌｕｒｉＱ（ＭＴＩ−ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ）、及びＰｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ(ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ)等のヒトＥＳ／ｉＰＳ培地等の幹細胞培地を使用可能である。
ただし、幹細胞培地は、これに限定されず、種々の幹細胞培地が使用可能である。例えばＰｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｒｅｐｒｏｓｔｅｍ、ＲｅｐｒｏＦＦ、ＲｅｐｒｏＦＦ２、ＲｅｐｒｏＸＦ（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）、ｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ２、ＴｅＳＲＥ８、ＲｅｐｒｏＴｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＥＳ／ｉＰＳ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｒｃｋ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ （登録商標）ＸＦ／ＦＦ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ ｉＰＳ ａｎｄ ＥＳ Ｃｅｌｌｓ、Ｐｌｕｒｉｔｏｎ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）、Ｓｔｅｍｆｉｔ ＡＫ０２Ｎ、Ｓｔｅｍｆｉｔ ＡＫ０３（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）、ＥＳＣ−Ｓｕｒｅ（登録商標）ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｆｅｅｄｅｒ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｈＥＳＣ／ｉＰＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ ＳｔｅｍＣｅｌｌ）、及びＬ７（登録商標）ｈＰＳＣ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ （ＬＯＮＺＡ）等を利用してもよい。幹細胞培地は、例えば、ディッシュ、ウェル、又はチューブ等に入れられる。
初期化因子ＲＮＡは、ＲＮＡトランスフェクション試薬を用いて体細胞に導入される。ＲＮＡトランスフェクション試薬としては、リポフェクタミン メッセンジャーマックス（登録商標）が使用可能である。
あるいは、ＲＮＡトランスフェクション試薬としては、例えば、ｍＲＮＡ−Ｉｎ（登録商標、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， Ｉｎｃ．）が用いられる。さらに、ＲＮＡトランスフェクション試薬としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）２０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）３０００、ＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｓｔｅｍｆｅｃｔ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍｆｅｃｔ）、ＮｅｘｔＦｅｃｔ（登録商標）ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏｏＳｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ−１００２）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ ＣＤ３４ ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ−１００３）、及びＲｅｐｒｏＲＮＡ（登録商標）トランスフェクション試薬（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等のリポフェクション試薬を利用してもよい。
体細胞への初期化因子ＲＮＡの導入は、複数回行ってもよい。体細胞への初期化因子ＲＮＡの導入は、例えば、２日に１回、あるいは１日に１回、５日間以上１５日間以内、７日間以上１３日間以内、あるいは１０日間繰り返して行う。ただし、ｍＲＮＡがリプリケイティブＲＮＡである場合、体細胞への初期化因子ＲＮＡの導入は１回でもよい。
体細胞への初期化因子ＲＮＡの導入を行った後、体細胞をゲル培地に入れ、体細胞を初期化させる。
ゲル培地は、例えば、幹細胞培地にジェランガムを終濃度が０．００１質量％から０．５質量％、０．００５質量％から０．１質量％、あるいは０．０１質量％から０．０５質量％となるよう添加することにより調製される。
ゲル培地は、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の高分子化合物を含んでいてもよい。また、ゲル培地は、メチルセルロースを含んでいてもよい。メチルセルロースを含むことにより、細胞同士の凝集がより抑制される。
あるいは、ゲル培地は、poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA)、poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA）、Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)、amine terminated、carboxylic acid terminated、maleimide terminated、N-hydroxysuccinimide (NHS) ester terminated、triethoxysilane terminated、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate)、及びN-Isopropylacrylamideから選択される少なくの温度感受性ゲルを含んでいてもよい。
ゲル培地は、例えば、ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）等の成長因子を含まない。あるいは、ゲル培地は、ｂＦＧＦ等の成長因子を、４００μｇ／Ｌ以下、４０μｇ／Ｌ以下、あるいは１０μｇ／Ｌ以下の低濃度で含む。
また、ゲル培地は、ＴＧＦ−βを含まないか、ＴＧＦ−βを６００ｎｇ／Ｌ以下、３００ｎｇ／Ｌ以下、あるいは１００ｎｇ／Ｌ以下の低濃度で含む。
ゲル培地は、撹拌されなくともよい。また、ゲル培地は、フィーダー細胞を含まなくともよい。
ゲル培地は、カドヘリン、ラミニン、フィブロネクチン、及びビトロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種の物質を含んでいてもよい。
体細胞が人工多能性幹細胞に誘導（リプログラミング）されたか否かは、第１実施形態で説明した方法により確認することができる。
以上説明した第２実施形態に係る人工多能性幹細胞の作製方法によれば、初期化因子を発現させることができるＲＮＡを体細胞に効率的に導入して、ゲル培地中で体細胞を効率的に初期化して、人工多能性幹細胞を作製することが可能である。
（第２実施形態の実施例）
ウェルプレートの各ウェルに、１．５ｍＬのＰＢＳに対し、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１（ｎｉｐｐｉ）を０．５μｇ／ｃｍ2となるように希釈した基底膜マトリックスの希釈液を入れた。その後、ウェルプレートを３７℃のインキュベーターに１時間以上入れた。次に、ウェルプレートの各ウェルから基底膜マトリックスの希釈液を取り除き、ウェルプレートの各ウェルに１０％ＦＢＳ培地に懸濁した繊維芽細胞を約１×１０5個播種し、繊維芽細胞を接着培養した。
図１７に示す初期化因子ｍＲＮＡのマスターミックスを用意した。また、ウェルプレートの各ウェル中の培地を２ｍＬのＰｌｕｒｉＱ（登録商標、ＭＴＩ−ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ）に交換した。さらに、図１８に示す内容物をいれたチューブＡとチューブＢを用意した。次に、チューブＡとチューブＢの内容物を混合し、ＲＮＡトランスフェクション試薬であるｍＲＮＡ−Ｉｎ（登録商標、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， Ｉｎｃ．）と、ｍＲＮＡマスターミックスと、の混合物を作製し、１０分間静置した。その後、ＲＮＡ−ＩｎとｍＲＮＡマスターミックスの混合物を各ウェルに加え、ウェルプレートを揺らして、培地中にＲＮＡ−ＩｎとｍＲＮＡマスターミックスの混合物を拡散させた。次に、繊維芽細胞を３７℃、５％ＣＯ2で一晩インキュベートして初期化因子ＲＮＡを細胞にトランスフェクトとした。
翌日以降、９日間連続で、上記と同様に、初期化因子ＲＮＡを細胞にトランスフェクトとした。したがって、合計１０回、初期化因子ＲＮＡを細胞にトランスフェクトとした。
初期化因子ＲＮＡを細胞に１０回トランスフェクトした後、各ウェルから培地を取り除き、細胞をＰＢＳで洗浄した。次に、３００μＬの細胞剥離液（ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ、登録商標、ライフテクノロジーズ）を各ウェルに加え、ウェルプレートを３７℃インキュベーターに１０分間置いた。その後、各ウェルに７００μＬのＰｌｕｒｉＱを加え、ピペッティングにより細胞塊をシングルセルに解離して、細胞懸濁液を作製した。
ヒトＥＳ培地（Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ、リプロセル）に０．０２質量％の濃度でポリマーＦＰ００１を配合して、ゲル培地を作製した。ゲル培地には、ｂＦＧＦを含めなかった。ＦＰ００１は、ジェランガムを主体とする培地用添加剤である。次に、細胞懸濁液を１５ｍＬチューブに移し、５分間１０００ｒｐｍで遠心した。さらに、１５ｍＬチューブから上清を取り除き、２ｍＬのゲル培地に細胞を再懸濁した。その後、１日おきに、１ｍＬのゲル培地を１５ｍＬチューブに加えた。細胞をゲル培地に移行させて１０日後、ゲル培地で作製されたｉＰＳ細胞をフィーダー上にまきなおし、コロニーの形態を確認したところ、図１９に示すように、未分化なｉＰＳ細胞コロニーの形態であった。
（第２実施形態の参考例）
ヒト血液細胞は健康な成人男性から入手した。また、修飾化ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ社）、非接着ディッシュ、１５ｍＬチューブ、５０ｍＬチューブ、フィコール、サイトフローメータ（ＢＤ）、ＣＤ３４に対する抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＣＤ３に対する抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＭＡＣＳ（登録商標）バッファ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、Ｔ細胞培地、低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）、ｓｉＲＮＡ導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｃｅ）、及びＴＲＡ−１−６０に対する抗体（ＢＤ）を用意した。
Ｔ細胞（ＣＤ３陽性細胞）培地は、以下Ａ培地とＢ培地の混合液であった。Ａ培地は、１５ｍＬのＸ ｖｉｖｏ−１０（Ｌｏｎｚａ社、０４−７４３Ｑ）及びＩＬ−２（１０ｕｇ／ｍＬ）の混合液であった。Ｂ培地は１．５ｍＬチューブにＸ ｖｉｖｏ−１０及びＤｙｎａｂｅａｄｓＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社， １１１−３１Ｄ）５０μＬを混合し、５秒間ボルテックス後、スピンダウンし、ＤｙｎａＭａｇ−２（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に静置し、一分静置後、上清を取り除いたものであった。
また、１０ｍＬの無血清培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００、ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、１０μＬのＩＬ−６（１００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＳＣＦ（３００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＴＰＯ（３００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＦＬＴ３リガンド（３００μｇ／ｍＬ）、及び１０μＬのＩＬ−３（１０μｇ／ｍＬ）を加えて血球培地（血液幹・前駆細胞培地）を調製した。
また、それぞれ濃度が１００ｎｇ／μＬのＯＣＴ３／４のｍＲＮＡ含有液、ＳＯＸ２のｍＲＮＡ含有液、ＫＬＦ４のｍＲＮＡ含有液、ｃ−ＭＹＣのｍＲＮＡ含有液、ＬＩＮ２８ＡのｍＲＮＡ含有液、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のｍＲＮＡ含有液を用意した。次に、３８５μＬのＯＣＴ３／４のｍＲＮＡ含有液、１１９μＬのＳＯＸ２のｍＲＮＡ含有液、１５６μＬのＫＬＦ４のｍＲＮＡ含有液、１４８μＬのｃ−ＭＹＣのｍＲＮＡ含有液、８３μＬのＬＩＮ２８ＡのｍＲＮＡ含有液、及び１１０μＬのＧＦＰのｍＲＮＡ含有液を混合し、初期化因子混合液を得た。得られた初期化因子混合液を５０μＬずつ容量１．５ｍＬのＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅのチューブ（エッペンドルフチューブ（登録商標）、エッペンドルフ）に分注し、−８０℃の冷凍庫に保存した。
遠心機を１８℃に設定した。５ｍＬから５０ｍＬの血液を採血し、血液にＥＤＴＡを加えて優しく混ぜた。また、ヒトリンパ球分離用の媒体（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ、ＧＥヘルスケアジャパン）を５ｍＬずつ２本の１５ｍＬチューブに分注した。５ｍＬのＰＢＳを血液に加えて希釈し、チューブ中のヒトリンパ球分離用の媒体の上に５ｍＬずつ重層した。この時、界面を乱さないように、希釈血液をチューブの管壁を伝わらせてゆっくりと媒体上に加えた。
チューブ中の溶液を、４００×ｇ、１８℃で３０分間遠心した。この際、加速、減速ともゆっくり行った。遠心後、チューブ中に白く濁った中間層が現れた。この白く濁った中間層は、単核球細胞を含んでいる。チューブ中の白く濁った中間層をピペットマンでゆっくりと回収し、新しい１５ｍＬチューブに移した。この際、下層は吸い取らないようにした。白く濁った中間層は、１本のチューブより１ｍＬ程度回収できた。２本分の中間層をまとめて１本のチューブに移した。
回収した単核球細胞に対し、１２ｍＬのＰＢＳを加えて、溶液をさらに２００×ｇ、１８℃で１０分間遠心した。その後、アスピレータを用いて溶液の上清を吸引して除去し、３ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ−ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を加えて懸濁し、単核球細胞懸濁液を得た。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントした。
１×１０7個の単核球細胞と、ＣＤ３４抗体又はＣＤ３抗体と、を、４℃の溶液１００μＬ中で１５分反応させた。反応後、溶液に５ｍＬのＭＡＣＳ（登録商標）バッファ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を加え、２７０ｇで遠心した。遠心後、上清を除去し、１ｍＬのＭＡＣＳバッファを添加した。その後、自動磁気細胞分離装置（ａｕｔｏＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の分離プログラムを利用して、単核球細胞のうち、ＣＤ３４陽性細胞又はＣＤ３陽性細胞を分離した。
分離した５×１０6個の単核球細胞を１ｍＬのＴ細胞培地、又は血液幹・前駆細胞培地に懸濁し、１２ウェルプレートに播種し、培養した。培養条件は、ＣＯ2濃度が５％、酸素濃度が１９％、及び温度が３７℃であった。
１００μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）と２５μＬの初期化因子混合液を混合し、第１の混合液とした。また、１１２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）と１２．５μＬのｓｉＲＮＡ導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｃｅ）を混合し、第２の混合液とした。その後、第１の混合液と、第２の混合液と、を混合し、１５分室温で静置してリポフェクション反応液とした。
得られたリポフェクション反応液のうち６０μＬを単核球細胞を培養している１２ウェルプレートに穏やかに添加し、引き続き、３７℃で１８時間、単核球細胞をフィーダーフリーで培養した。培養条件は、ＣＯ2濃度が５％、酸素濃度が１９％、及び温度が３７℃であった。リポフェクション反応液を添加した時の単核球細胞の密度は３×１０6であった。１８時間後、単核球細胞を１５ｍＬチューブに回収し、３００ｇで遠心し、上清を除去した。その後、１．２５ｍのＣＤ３４用血球培地を１５ｍＬチューブに添加して、単核球細胞懸濁液を同じ１２ウェルプレートに戻し、一晩３７度で単核球細胞をフィーダーフリーで培養した。培養条件は、ＣＯ2濃度が５％、及び酸素濃度が１９％であった。上記工程を２日に１回、７日間繰り返した。
リポフェクションを開始してから７日目に、リポフェクションを合計４回した細胞の密度は、３×１０6であった。細胞の一部を１２ウェルプレートから取り出し、蛍光顕微鏡でＧＦＰの発現を確認したところ、図２０に示すように、ＧＦＰの発現が確認された。これにより、単核球細胞にｍＲＮＡがトランスフェクションし、トランスフェクトされたｍＲＮＡからタンパク質が合成されていることが確認された。
（ＴＲＡ−１−６０の発現の確認）
リポフェクションを開始してから７日目に、細胞の一部を１２ウェルプレートから取り出し、取り出した細胞を初期化され始めた細胞で特異的に発現する表面抗原であるＴＲＡ−１−６０対する抗体であって、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）蛍光色素で標識された抗体で染色した。その後、蛍光活性化セルソータ（ＦＡＣＳ（登録商標）、ＢＤ）で、ＴＲＡ−１−６０陽性細胞の割合を確認することによって、細胞においてリプログラミングが開始され、ｉＰＳ細胞遺伝子が発現し、ｉＰＳ細胞ができてくる事を確認した。
図２１に示すように、自家蛍光の強度をｘ軸に、蛍光標識抗ＴＲＡ−１−６０抗体の蛍光強度をｙ軸にとったドットプロットを作成した。遺伝子を導入しなかったネガティブコントロールでは、ＴＲＡ−１−６０陽性細胞は検出されなかった。これに対し、実験１，２及び３において、ＴＲＡ−１−６０陽性細胞が検出された。なお、実験１では、マーカーによる分離をしていない単核球全体から誘導した結果であり、実験２は、ＣＤ３陽性で分離した細胞から誘導した結果であり、実験３は、ＣＤ３４陽性で分離した細胞から誘導した結果である。したがって、初期化因子ＲＮＡのリポフェクションを用いて、血液由来の細胞に初期化因子を導入し、ｉＰＳ細胞を誘導できることが示された。

Claims (26)

  1. 体細胞を用意することと、
    前記体細胞に初期化因子ＲＮＡを含むセンダイウイルスを導入することと、
    を含む、人工多能性幹細胞の作製方法。
  2. ゲル培地で浮遊培養されている前記体細胞に前記初期化因子ＲＮＡを含むセンダイウイルスを導入する、請求項１に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  3. 接着培養されている前記体細胞に前記初期化因子ＲＮＡを含むセンダイウイルスを導入する、請求項１に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  4. ゲル培地中で前記体細胞を初期化することをさらに含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  5. 前記体細胞が繊維芽細胞である、請求項１から４のいずれか１項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  6. 前記体細胞が血液細胞である、請求項１から４のいずれか１項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  7. 赤血球分離剤を用いて、前記体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含む、請求項６に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  8. フィルターを用いて、前記体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含む、請求項６に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  9. 免疫磁気ビーズを用いて、前記体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含む、請求項６に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  10. 前記初期化因子ＲＮＡが、Ｍ3Ｏ又はＯＣＴ３／４のｍＲＮＡ、ＳＯＸ２のｍＲＮＡ、ＫＬＦ４のｍＲＮＡ、及びｃ−ＭＹＣのｍＲＮＡを含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  11. 前記ゲル培地が攪拌されない、請求項２又は４に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  12. 前記ゲル培地が、成長因子を含まない、請求項２又は４に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  13. 前記ゲル培地が、成長因子を４０質量％以下の濃度で含む、請求項２又は４に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  14. 前記ゲル培地が、ｂＦＧＦを含まない、請求項２又は４に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  15. 体細胞を用意することと、
    前記体細胞にＲＮＡトランスフェクション試薬を用いて初期化因子ＲＮＡを導入することと、
    ゲル培地中で前記体細胞を初期化することと、
    を含む、人工多能性幹細胞の作製方法。
  16. 前記体細胞が繊維芽細胞である、請求項１５に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  17. 前記体細胞が血液細胞である、請求項１５に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  18. 赤血球分離剤を用いて、前記体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含む、請求項１７に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  19. フィルターを用いて、前記体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含む、請求項１７に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  20. 免疫磁気ビーズを用いて、前記体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含む、請求項１７に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  21. 前記初期化因子ＲＮＡが、Ｍ3Ｏ又はＯＣＴ３／４のｍＲＮＡ、ＳＯＸ２のｍＲＮＡ、ＫＬＦ４のｍＲＮＡ、及びｃ−ＭＹＣのｍＲＮＡを含む、請求項１５から２０のいずれか１項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  22. 前記ゲル培地が攪拌されない、請求項１５から２１のいずれか１項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  23. 前記ゲル培地が、成長因子を含まない、請求項１５から２２のいずれか１項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  24. 前記ゲル培地が、成長因子を４０質量％以下の濃度で含む、請求項１５から２３のいずれか１項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  25. 前記ゲル培地が、ｂＦＧＦを含まない、請求項１５から２４のいずれか１項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  26. 前記初期化因子ＲＮＡの導入を複数回行う、請求項１５から２５のいずれか１項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
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