JP6854879B2 - 巨核球と血小板とを分離する方法および巨核球と血小板とを分離するための器具 - Google Patents
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Description
[1] 少なくとも巨核球を含む培養液を、VLA−4インテグリンおよびVLA−5インテグリンの少なくとも一方を介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させる接触工程、
上記接触工程の前および/または後において巨核球を培養して血小板を産生させる培養工程、および
上記接触工程および上記培養工程後の培養液を回収する回収工程を含む、
巨核球と血小板とを分離する方法。
[2] 巨核球を培養して血小板を産生させ、得られた巨核球および血小板を含む培養液を、VLA−4インテグリンおよびVLA−5インテグリンの少なくとも一方のインテグリンを介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させ、基材と接触させた培養液を回収する、[1]に記載の方法。
[3] 巨核球を含む培養液を、VLA−4インテグリンおよびVLA−5インテグリンの少なくとも一方のインテグリンを介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させ、基材と接触させた巨核球を培養して血小板を産生させ、その後に培養液を回収する、[1]に記載の方法。
[4] VLA−4インテグリンおよびVLA−5インテグリンの少なくとも一方のインテグリンを介して巨核球と接着する生体親和性高分子が、フィブロネクチン、フィブロネクチンのRGD配列であるGRGDSもしくはCS−1配列であるEILDVを有するペプチド、またはVCAM−1と表記されるVascular Cell Adhesion Molecule−1もしくはVCAM−1のQIDSPL配列を有するペプチドである、[1]から[3]の何れか一に記載の方法。
[5] 上記の接触工程、培養工程および回収工程を2回以上反復する、[1]から[4]の何れか一に記載の方法。
[6] VLA−4インテグリンおよびVLA−5インテグリンの少なくとも一方を介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材を含む、巨核球と血小板とを分離するための器具。
本発明による巨核球と血小板とを分離する方法は、
少なくとも巨核球を含む培養液を、VLA−4インテグリンおよびVLA−5インテグリンの少なくとも一方を介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させる接触工程、
上記接触工程の前および/または後において巨核球を培養して血小板を産生させる培養工程、および
上記接触工程および上記培養工程後の培養液を回収する回収工程を含む。
巨核球は造血幹細胞に由来する細胞であり、巨核球系前駆細胞、巨核芽球細胞、および前巨核球を経て形成される多形核を有する細胞である。巨核球は、骨髄の中に存在し直径35〜160μmの骨髄中で最大の造血系細胞である。巨核球は、血小板を産出する。1個の巨核球から数千個の血小板が産出される。なお、巨核球の細胞質が分解して血小板になった後、巨核球は細胞質を失い裸核となり、裸核はマクロファージにより分解される。本発明で言う巨核球とは、成熟した巨核球のほか、巨核球系前駆細胞、巨核芽球細胞、前巨核球等を含んでいてもよい。
造血前駆細胞としては、骨髄由来、臍帯血由来、動員(G−CSF)末梢血、ES細胞由来中肺葉系細胞または末梢血由来細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの造血前駆細胞としては、例えば、CD34陽性のもの(例えばCD34+細胞、CD133+細胞、SP細胞、CD34+CD38−細胞、c−kit+細胞あるいはCD3−、CD4−、CD8−およびCD34+細胞のもの)が挙げられる(国際公開WO2004/110139)。
間葉系細胞としては、例えば、間葉系幹細胞および脂肪前駆細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
通常の方法では巨核球への分化能を有さない細胞としては、例えば、繊維芽細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
通常の方法では巨核球への分化能を有さない細胞にダイレクトリプログラミング技術を用いることで巨核球および血小板を産生する方法としては、巨核球への誘導遺伝子を発現するように遺伝子導入するか、または、特定の核酸、タンパク質もしくは低分子化合物等を培養液中に添加することで、通常の方法では巨核球への分化能を有さない細胞を巨核球に分化することで巨核球へと分化させることができる。
接触工程は、少なくとも巨核球を含む培養液を、VLA−4インテグリンおよびVLA−5インテグリンの少なくとも一方を介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させる工程である。
フィブロネクチンのRGD配列(GRGDS:配列番号1)またはCS−1配列(EILDV:配列番号2)(フィブロネクチンのVLA−4インテグリンまたはVLA−5インテグリン接着ドメイン)を有するペプチド;
VCAM−1(Vascular Cell Adhesion Molecule−1);
VCAM−1のQIDSPL配列(配列番号3)(VCAM−1のVLA−4インテグリンまたはVLA−5インテグリン接着ドメイン)を有するペプチド;
MadCAM−1(Mucosal adressin cell adhesion molecule−1);
TSP(Thrombospondin);
OPN(Osteopontin);
ADAM(a disintegrin and mettalloprotease);ICAM−4(intercellular adhesion molecule−1);
COMP(cartilage oligomeric matrix)、および
L1(CD171)
遺伝子組み換えタンパク質または遺伝子組み換えペプチドは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばEP1014176A2号公報、米国特許第6992172号公報、国際公開WO2004/85473号、国際公開WO2008/103041号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所望のアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、遺伝子組み換えタンパク質または遺伝子組み換えペプチドが産生されるので、産生された遺伝子組み換えタンパク質または遺伝子組み換えペプチドを培養物から回収することにより、遺伝子組み換えタンパク質または遺伝子組み換えペプチドを得ることができる。
本発明においては、上記の接触工程の前および/または後において、巨核球を培養して血小板を産生させる培養工程を行う。即ち、本発明においては、巨核球と血小板の分離は、巨核球を培養して、あらかじめ血小板を産生させた後に、巨核球と血小板の混合液に対して適用することもできる。あるいは、巨核球を、VLA−4インテグリンおよびVLA−5インテグリンの少なくとも一方のインテグリンを介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させ、巨核球と該基材が接着した状態で、巨核球に血小板を産生させながら適用することもできる。
(態様1)巨核球を培養して血小板を産生させ、得られた巨核球および血小板を含む培養液を、VLA−4インテグリンおよびVLA−5インテグリンの少なくとも一方のインテグリンを介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させ、基材と接触させた培養液を回収する。
(態様2)巨核球を含む培養液を、VLA−4インテグリンおよびVLA−5インテグリンの少なくとも一方のインテグリンを介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させ、基材と接触させた巨核球を培養して血小板を産生させ、その後に培養液を回収する。
(態様3)巨核球を培養して血小板を産生させ、得られた巨核球および血小板を含む培養液を、VLA−4インテグリンおよびVLA−5インテグリンの少なくとも一方のインテグリンを介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させ、基材と接触させた巨核球をさらに培養して血小板を産生させ、その後に培養液を回収する。
血小板は、巨核球よりもVLA−4インテグリンおよびVLA−5インテグリンの少なくとも一方のインテグリンを介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材への接着性が低いため、基材と接触させた培養液を回収する工程によって、血小板を効率的に回収することができる。
本発明によれば、VLA−4インテグリンおよびVLA−5インテグリンの少なくとも一方を介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材を含む、巨核球と血小板とを分離するための器具が提供される。VLA−4インテグリンおよびVLA−5インテグリンの少なくとも一方を介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材としては、本明細書中で上記したものを使用することができる。本発明の上記器具を用いて巨核球と血小板とを分離する方法も、本明細書中に上記した通りである。
下記略号は以下の意味を示す。
FBS:ウシ胎児血清
DPBS:ダルベッコのリン酸緩衝食塩水(Dulbecco’s Phosphate−Buffered Saline)
PE:フィコエリシン(Phycoerythrin)
7−AAD:7−アミノ−7−アクチノマイシンD
(1)基材へのコーティング
フィブロネクチン溶液(fibronectin、ヒト血漿由来、和光純薬工業社製)をDPBS(Thermo Fisher Scientific社製)で50μg/mlに希釈し、コーティング溶液とした。コーティング溶液を、プラズマ処理済ポリスチレン製6ウエルプレート(Tissue Culture−Treated、 Corning社製)に1ml添加した。上記プレートを37℃、1時間インキュベートした後、DPBSで1回洗浄し、フィブロネクチン被覆基材を得た。
ヒト巨核球および血小板を調製するための分化誘導培地として、Stemspan megakaryocyte expansion supplement(Stemcell technologies社製)、Penicillin−Streptomycin Solution(×100)(和光純薬工業社製)を添加したStemspan SFEM II(Stemcell technologies社製)を使用した。上記の分化誘導培地を使用して、BM−CD34+Stem/Progenitor Cells(Allcell社)を低接着ポリスチレン製6ウエルプレート(Ultra−Low Attachment Surface、Corning社製)上で14日培養した。培養中の浮遊細胞を15mLチューブ(Corning社製)に回収し、1700×g、室温で5分遠心した。上清を捨て1%FBS(Thermo Fisher Scientific社製)入りのDPBS(100μl)で懸濁した。PerCP−Cy5.5(登録商標)標識抗CD41a抗体(日本ベクトンディッキンソン社製)10μl、PE標識抗CD42b抗体(日本ベクトンディッキンソン社製)10μlを加え、遮光で30分反応した。1%FBS入りのDPBS(1mL)を加えて、1700×g、室温で5分遠心し、上清を捨てた。7−AADを加えた1%FBS入りのDPBS(100μl)で懸濁し、遮光で15分反応した後に、1%FBS入りのDPBS(300μl)を加えて、フローサイトメトリー(BD(ベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー)社製、FACS Aria)により測定した。巨核球系細胞株であるMEG−01(ATCC(American Type Culture Collection)から購入)をコントロールとして、FSC(前方散乱光: forward scatter)、SSC(側方散乱光 :side scatter)ゲートから巨核球分画および血小板分画を決定した。各抗体のアイソタイプコントロール抗体で染色したサンプルとの比較から、CD41a陽性およびCD42b陽性細胞の存在を確認し、BM−CD34+ Stem/Progenitor Cellsからの巨核球分化および巨核球からの血小板産生を確認した。
上記(2)の方法で得たヒト巨核球および血小板の培養液を40μmセルストレーナー(Falcon社製)へ通した後に、上記(1)で作製したフィブロネクチン被覆基材に培養液を1ウエル当たり2ml添加し、37℃で1時間接触させた。1時間経過した後に、クエン酸−デキストロース溶液(ACD)(sigma−aldrich社製)が入った15ml遠心分離用コニカルチューブ(Falcon社製)に培養液上清を全回収した。また、DPBSで2回洗浄し、洗浄液をコニカルチューブに回収することで、フィブロネクチン被覆基材に吸着していない浮遊細胞を回収した。
回収液を15mLチューブに回収し、1700×g、室温で10分遠心した。上清を捨て1%FBS入りのDPBS(100μl)で懸濁した。PerCP−Cy5.5(登録商標)標識抗CD41a抗体10μlを加え、遮光で30分反応した。1%FBS入りのDPBS(1mL)を加えて、1700×g、室温で10分遠心し、上清を捨てた。核染色剤であるHoechst33342(同仁化学研究所社製)を加えた1%FBS入りのDPBS(100μL)で懸濁し、遮光環境で15分反応した。1%FBS入りのDPBS(300μL)を加え、BD Trucount tubes(日本ベクトンディッキンソン社製)を用いてフローサイトメトリー(FACS Aria)により測定した。巨核球系細胞株であるMEG−01をコントロールとして、FSC、SSCゲートから巨核球分画および血小板分画を決定した。血小板分画におけるCD41陽性細胞、核染色陰性細胞を血小板とし、巨核球分画におけるCD41陽性細胞、核染色陽性細胞を巨核球とすることで、回収液中の血小板数および巨核球数を算出した。以下の式から得た血小板回収率および巨核球回収率を表1に示す。
(基材接触後に得た回収液中の血小板数/元の液中の血小板数)×100
(基材接触後に得た回収液中の巨核球数/元の液中の巨核球数)×100
指標値=血小板回収率(%)/巨核球回収率(%)
分離性能B:10.0≧指標値>5.0
分離性能C: 5.0≧指標値>2.5
分離性能D: 2.5≧指標値
フィブロネクチン(rfibronectin、ヒト、組み換え体、R&D社製)をDPBSで50μg/mlに希釈してコーティング溶液としたこと(実施例2)、並びにVCAM−1(ヒト、組み換え体、和光純薬工業社製)をDPBSで5μg/mlに希釈し、コーティング溶液としたこと(実施例3)以外は、実施例1と同様の操作を実施した。結果を表1に示す。
比較例として、fibrinogen(ヒト血漿由来、和光純薬工業社製、比較例1)、collagen I(ラット尾由来、Corning社製、比較例2)、collagen IV(ヒト胎盤由来、Sigma−aldrich社製、比較例3)、Laminin(ヒト臍帯由来、Sigma−aldrich社製、比較例4)、vwf(von Willebranf Factor、ヒト血漿由来、Haematologic Technologies社製、比較例5)をそれぞれコーティング溶液とし、実験に用いた。また、比較例6として、コーティング溶液の代わりにDPBSを用いた。その他は実施例1と同様の操作を実施した。結果を表1に示す。
実施例1でフィブロネクチン被覆基材に1時間接触した後の浮遊細胞培養液を、別のフィブロネクチン被覆基材に1時間接触させる工程を複数回繰り返した。その他は実施例1と同様の操作を実施した。結果を表2に示す。
Claims (3)
- 巨核球を培養して血小板を産生させる培養工程、
培養工程で得られた巨核球と血小板とを含む培養液を、VLA−4インテグリンおよびVLA−5インテグリンの少なくとも一方を介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させる接触工程、および
前記培養工程および前記接触工程後の培養液を回収する回収工程を含む、
巨核球と血小板とを分離する方法。 - 前記培養工程において、巨核球を3時間以上培養する、請求項1に記載の方法。
- 前記回収工程において、前記培養工程および前記接触工程後の培養液を、血小板回収率(%)/巨核球回収率(%)>5.0で回収する、請求項1又は2に記載の方法。
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