CN117736974A - Dapt在维持扩展多潜能干细胞多能性及提高其增殖能力中的应用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了DAPT在维持扩展多潜能干细胞多能性及提高其增殖能力中的应用。本发明首次发现DAPT能够有效维持扩展多潜能干细胞多能性并提高其增殖能力，解决了EPSC增殖过程中多能性逐渐丢失的问题，本发明可以实现EPSC的体外培养扩增、维持其多能性并提高其增殖能力，为EPSC的体外大量扩增奠定了基础，可作为细胞治疗技术的种子细胞，广泛应用于治疗各种疾病，临床应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及DAPT在维持扩展多潜能干细胞多能性及提高其增殖能力中的应用。
背景技术
如何建立高质量的多能干细胞一直是干细胞研究的核心问题。EPSC(Expanded(orextended)pluripotent stem cell，扩展多潜能干细胞)是2017年邓宏魁研究组建立的一类具有全能性功能特征的多能干细胞，同时具有胚内和胚外组织的发育潜能(Yang etal.,2017)。
iPSC细胞只能发育分化形成外中内三胚层组织和细胞，而EPSC可以分化形成胚胎外组织相对于iPSC具有更强的分化潜能(Yasuda，2018)。此外EPSC相比于iPSC还具有分化形成的功能细胞更接近体细胞(Chen，2020)、体外进行基因编辑效率更高(Xiang，2019)和传代过程中基因组更稳定等优势(Liu，2021)(Zheng，2021)。EPSC已成功分化为很多细胞类型，包括体细胞和滋养层细胞，这尤其有助于再生医学的研究例如疾病建模、疗法筛选、毒性测试、遗传疾病研究和生殖生物学研究，EPSC已经成为多能干细胞研发重要细胞平台。
目前EPSC的制备和扩增方法主要是采用邓宏魁教授的方法，具体方法如文章Chemically Defined and Xeno-free Culture Condition for Human ExtendedPluripotent Stem Cells中所报道，EPSC培养基主要由LIF、CHIR99021、(S)-(+)-Dimethindene maleate、Minocycline hydrochloride、Y-27632等小分子化合物组成。华中科技大学研究发现在前述EPSC培养基基础上加入GSK126有助于iPSC向EPSC的转化和EPSC体外全能性的维持。上述方法诱导以及扩增培养得到的EPSC，其多能性基因Klf17和Dppa3的表达相比于iPSC显著增加，而对EPSC全能性(或多能性)维持起关键作用的Oct4基因的表达量并没有升高。因此，本领域亟需一种能够在不影响EPSC体外增殖和分化效率的情况下仍然能够保证EPSC全能性的新型体外扩增剂。
DAPT(GSI-IX)是一种γ-secretase抑制剂，有研究表明其能够通过抑制γ-分泌酶底物Notch的活性进而影响细胞信号传导和细胞分化，但是未见其与EPSC相关的报道，也未见其能够作为EPSC体外扩增剂的相关报道，更未见其在维持EPSC多能性及提高EPSC增殖效率中的应用的相关报道。本发明首次发现DAPT能够有效维持EPSC多能性并提高其增殖效率。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明的第一方面提供了DAPT在维持扩展多潜能干细胞多能性和/或提高扩展多潜能干细胞增殖能力中的应用。
进一步，所述DAPT的浓度为3-10μM。
更进一步，所述DAPT的浓度为10μM。
在本发明中，所述DAPT是一种人工合成的γ-分泌酶抑制剂，名称：(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-L-2-苯基甘氨酸叔丁酯，CAS编号：208255-80-5，分子式：
C23H26F2N2O4，分子量：432.47。体外实验DAPT对总Aβ和Aβ42的IC50值分别是115nM和200nM。DAPT具有神经保护活性，能够促进神经干细胞的增殖分化。
术语“扩展多潜能干细胞(Expanded Potential Stem Cells，EPSC)”，也称潜能性扩展干细胞、扩展多能干细胞、扩展性多能干细胞等，具有“幼稚”或基态的特性，并且具有分化为胚外细胞系(卵黄囊中的滋养细胞和胚外内胚层)以及源自胚泡内部细胞群的固有胚胎细胞的巨大潜力。EPSC不仅能发育成任何类型的细胞，且发育潜力超过胚胎干细胞(ESC)和诱导多能干细胞(iPSC)。EPSC可用于研究和研发，例如疾病建模、治疗筛选、毒性试验、遗传疾病研究和生殖生物学研究。EPSC可用于体外产生功能细胞，目前EPSC已成功分化为胰腺细胞、神经元、T细胞等多种细胞类型。EPSC可采用文献中报道的方法制备，例如，采用专利US10745670B2中的方法制备。EPSC和iPSC的细胞表面标志物类似，因此EPSC鉴定也使用iPSC多能性基因，例如，ESRG、OCT4、SOX2、NANOG、LIN28A、POU5F1。
在具体实施方案中，本发明所述的EPSC采用如下方法制备得到：使用DMEM/F12培养基稀释matrigel至终浓度为0.5％，包被细胞培养板，CO2恒温培养箱中放置2h以上。包被体积：对于6孔板，每个孔加入2mL稀释后的matrigel，对于T25瓶，加入5mL稀释后的matrigel，CO2恒温培养箱中放置2h以上。事先在室温条件下温育E8培养基，在含Y-27632的E8完全培养基中复苏iPSC，按500万细胞/10-15mL的量准备培养基。24h后，更换培养基为EPSC培养基，每天换液培养，待汇合度达到70％-80％时，按1：4进行传代，使用0.5mM EDTA消化细胞，细胞传入新的孔或T25瓶中。传代10次后，得到所述EPSC。
在具体实施方案中，所述EPSC培养基中各组分的含量如下：46.625％ DMEM/F-12培养基、46.625％ Neurobasal、1％ GlutaMAX、1％ NEAA、0.1mMβ-Mercaptoehanol、3％KSR、0.50％ B-27、0.25％ N-2、1％ ITS-X、100μg/mL L-AA-pi、2μM(S)-(+)-Dimethindenemaleate、10ng/mL LIF、40ng/mL Activin A、2μM Minocycline hydrochloride、10μMTrolox、1μM CHIR99021、5μM Y-27632、2μM XAV939、1μM GSK126。
术语“诱导多能干细胞(iPSC)”指通过人工诱导某些基因的表达从某些成体细胞(如成纤维细胞)获得的具有全能性或多能性的干细胞。在本领域已知的一些方法中，可通过将某些干细胞相关基因转染到非多能细胞如成体成纤维细胞来获得iPSC。转染可以通过使用病毒如逆转录病毒或慢病毒的病毒转导来实现。在一些方法中，转染基因可包括转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，尽管同时转染其他基因有可能提高诱导效率。在另一些方法中，可利用慢病毒系统采用Oct4、Sox2、Nanog和Lin28基因转化体细胞。在iPSC中诱导表达的基因包括但不限于Oct-3/4；Sox基因家族的某些成员(例如Soxl、Sox2、Sox3和Sox15)；Klf家族的某些成员(例如Klfl、Klf2、Klf4和Klf5)、Myc家族的某些成员(例如C-myc、L-myc和N-myc)、Nanog、Lin28、Tert、Fbx15、ERas、ECAT15-1、ECAT15-2、Tcl1、β-Catenin、ECAT1、Esg1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Fth117、Sal14、Rex1、UTF1、Stella、Stat3、Grb2、Prdm14、Nr5a1、Nr5a2或E-cadherin，或其任何组合。目前已经可以从市场上购得用于制备iPSC的各种试剂，如重编程载体、表达盒、培养基等，甚至商业化的iPSC。
术语“多能性”，即干性，是指干细胞维持未分化状态的一种能力，以及能够无限创造出与自身相似细胞的自我更新能力的统称。干细胞在不断的自我更新的同时，还保持了向一种或多种细胞分化的潜在能力，以及接受外加诱导进行分化的能力。干细胞的多能性可以通过形态学观察，也可以通过检测细胞的多能性基因(多能性标志物)来检测。
术语“增殖”是指细胞群体数量的增加，能够以与生长相同的含义来使用。术语“扩增”应理解为具有其在本领域中的通常含义，即细胞在体外增殖的过程。在具体实施方案中，EPSC经历增殖或扩增后未分化成特定细胞并具有与原细胞相同的性质，即经过增殖或扩增的EPSC仍保持其分化成各种类型细胞的能力。
在一些实施方案中，本发明通过实验验证首次发现在体外扩增EPSC的培养基中添加DAPT能够有效维持EPSC多能性并提高其增殖能力。在具体实施方案中，本发明所述的DAPT的使用浓度需要大于3μM，只要能够产生有效维持EPSC多能性并提高其增殖能力这一效果的DAPT的使用浓度均在本发明的保护范围内，所述DAPT的浓度优选为10μM。
本发明的第二方面提供了一种用于维持扩展多潜能干细胞多能性和/或提高扩展多潜能干细胞增殖能力的组合物。
进一步，所述组合物包含本发明第一方面所述的DAPT。
术语“组合物”涵盖并公开任何包含各自列举的物质(或由其组成或基本上由其组成)的物理实体，组合物的物理形式不受限制。例如，术语“组合物”涵盖并公开了一种粉末，其中所述列举的物质各自以粉末形式存在。在一个实施方案中，术语“组合物”还涵盖并公开了一种液体溶液，其中所述列举的物质各自以可溶性形式存在。在一个实施方案中，术语“组合物”还涵盖并公开了一种乳液，其中存在列举的物质。在一个实施方案中，术语“组合物”还涵盖并公开了一种悬浮液，其中存在列举的物质。在一个实施方案中，术语“组合物”还涵盖并公开了混合物，其中如上定义的试剂呈一种形式。
本发明的第三方面提供了一种用于维持扩展多潜能干细胞多能性和/或提高扩展多潜能干细胞增殖能力的培养基。
进一步，所述培养基包含本发明第一方面所述的DAPT。
进一步，所述培养基中还包含DMEM/F-12培养基、Neurobasal、GlutaMAX、NEAA、β-Mercaptoehanol、KSR、B-27、N-2、ITS-X、L-AA-pi、(S)-(+)-Dimethindene maleate、LIF、Activin A、Minocycline hydrochloride、Trolox、CHIR99021、Y-27632、XAV939、GSK126。
更进一步，所述培养基中各组分的含量分别为：46.625％ DMEM/F-12培养基、46.625％ Neurobasal、1％ GlutaMAX、1％ NEAA、0.1mMβ-Mercaptoehanol、3％ KSR、0.50％ B-27、0.25％ N-2、1％ ITS-X、100μg/mL L-AA-pi、2μM(S)-(+)-Dimethindenemaleate、10ng/mL LIF、40ng/mL Activin A、2μM Minocycline hydrochloride、10μMTrolox、1μM CHIR99021、5μM Y-27632、2μM XAV939、1μM GSK126。
在一些实施方案中，本发明所列举的数值范围或具体数值(例如，培养基中各组分的含量范围或具体含量)仅用于解释本发明所取得的技术效果，而不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员可在本发明所列举的数值范围或具体数值的基础上进行多种调整或修改，只要能够达到预期的维持EPSC多能性和/或提高EPSC增殖能力这一效果，这样经调整或修改后的数据范围或具体数值同样包含在本发明的保护范围内。
本发明的第四方面提供了一种维持扩展多潜能干细胞多能性和/或提高扩展多潜能干细胞增殖能力的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：采用本发明第三方面所述的培养基对扩展多潜能干细胞进行培养。
本发明的第五方面提供了本发明第一方面所述的DAPT、本发明第二方面所述的组合物和/或本发明第三方面所述的培养基在扩增扩展多潜能干细胞中的应用。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：
本发明首次发现DAPT能够有效维持扩展多潜能干细胞(EPSC)多能性并提高其体外增殖能力，解决了现有技术中存在的无法在体外长期扩增培养过程中维持EPSC多能性的这一技术问题，申请人的这一研究成果可以实现EPSC的体外长期培养扩增、维持其多能性并增强其增殖能力，为EPSC的体外大量扩增奠定了基础，可作为细胞治疗技术的种子细胞，广泛应用于治疗各种疾病，临床应用前景广阔。
附图说明
图1为不同浓度DAPT对EPSC多能性基因表达的qPCR检测结果图。
图2为添加DAPT后EPSC的AP染色结果，其中，A图：EPSC克隆形成照片和数量统计图，B图：不同放大倍数下的AP染色图。
图3为DAPT对EPSC增殖速率影响的结果图，其中，A图：不同放大倍数下细胞数量的电子显微镜观察图，B图：细胞数量随时间的变化曲线。
图4为DAPT对EPSC形成畸胎瘤的分析结果图，其中，A图：畸胎瘤数量结果图，B图：畸胎瘤重量统计图。
图5为DAPT对高代数EPSC制备嵌合体效率的影响结果图，其中，A图：嵌合体荧光显微镜观察图，B图：各组嵌合体形成数量统计图。
图6为DAPT对EPSC分化潜能的影响结果图，其中，A图：使用TSC诱导培养基培养EPSC 6天后的细胞形态图，B图：使用TSC诱导培养基培养EPSC 6天后细胞TSC标志基因的qPCR检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，具体实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
本发明各实施例中所使用到的部分试剂信息见下表1。
表1试剂信息
| 试剂 | 生产公司 | 货号 |
| DMEM/F-12 | Thermo | 11330-032 |
| Neurobasal | Thermo | 212103-049 |
| GlutaMAX | Thermo | 35050-061 |
| NEAA | Thermo | 11140-050 |
| β-Mercaptoehanol | Thermo | 21985-023 |
| KSR | Thermo | 10828028 |
| N-2 | Thermo | 12587-010 |
| B-27 | Thermo | 17502-048 |
| ITS-X | Thermo | 51500056 |
| L-AA-pi | Sigma | A8960 |
| (S)-(+)-Dimethindene maleate | Tocris | 1425 |
| LIF | Peprotech | 300-05 |
| Activin A | Stemcell | 78001.1 |
| Minocycline hydrochloride | MCE | HY-17412 |
| Trolox | Merck | 648471 |
| CHIR99021 | Selleck | S1263 |
| Y-27632 | Abcam | ab120129 |
| XAV939 | Selleck | S1180 |
| GSK126 | Selleck | S7061 |
| DAPT | Abcam | ab120633 |
| IMDM | Thermo | 12440-053 |
| L-AA | Sigma | W210901 |
| BMP4 | Abcam | ab92855 |
| A8301 | Abcam | ab142092 |
实施例1由诱导多能干细胞(iPSC)分化制备扩展多潜能干细胞(EPSC)
本发明以iPSC为起始细胞，诱导分化EPSC，具体制备过程如下：
使用DMEM/F12培养基稀释matrigel至终浓度为0.5％，包被细胞培养板，CO2恒温培养箱中放置2h以上。包被体积：对于6孔板，每个孔加入2mL稀释后的matrigel，对于T25瓶，加入5mL稀释后的matrigel，CO2恒温培养箱中放置2h以上。事先在室温条件下温育E8培养基，在含Y-27632的E8完全培养基中复苏iPSC，按500万细胞/10-15mL的量准备培养基。24h后，更换培养基为EPSC培养基，每天换液培养，待汇合度达到70％-80％时，按1：4进行传代，使用0.5mM EDTA消化细胞，细胞传入新的孔或T25瓶中。传代至P10代，即认定iPSC向EPSC的转化彻底完成，
转化完成后，继续按1：5比例传代，后续所有实验均使用传至P10代以上的细胞。EPSC培养基组分见表2：
表2EPSC培养基组成
| 组分 | 使用浓度 |
| DMEM/F-12 | 46.625％ |
| Neurobasal | 46.625％ |
| GlutaMAX | 1％ |
| NEAA | 1％ |
| β-Mercaptoehanol | 0.1mM |
| KSR | 3％ |
| B-27 | 0.25％ |
| N-2 | 0.50％ |
| ITS-X | 1％ |
| L-AA-pi | 100μg/mL |
| (S)-(+)-Dimethindene maleate | 2μM |
| LIF | 10ng/mL |
| Activin A | 40ng/mL |
| Minocycline hydrochloride | 2μM |
| Trolox | 10μM |
| CHIR99021 | 1μM |
| Y-27632 | 5μM |
| XAV939 | 2μM |
| GSK126 | 1μM |
实施例2DAPT对EPSC多能性基因表达的影响
现有技术中EPSC的维持培养也是采用实施例1中的EPSC培养基，本实施例为了考察DAPT对EPSC多能性的影响，在EPSC培养基的基础上添加不同浓度的DAPT，检测EPSC多能性基因表达量的变化情况。具体操作如下：
取实施例1中制备的P11代EPSC进行复苏，具体复苏步骤为：将保存有P11代EPSC的冻存管放入37℃温水中晃荡至冻存液完全融化，吸取冻存液至15ml离心管中加入等体积比的EPSC培养基混匀；1100rpm/min离心5min，吸弃上清液；使用EPSC培养基重悬细胞。
取适量DAPT粉末加入DMSO溶解形成终浓度为10mM/L的DAPT浓缩液。
将复苏后的EPSC按照5万个细胞/cm2的密度接种于matrigel胶包被的6孔板。DAPT粉末使用DMSO溶解至终浓度10mM。之后将接种细胞分为对照组(Control)、DAPT 1μM组、DAPT 3μM组、DAPT 10μM组，分别加入2ml EPSC培养基、2ml EPSC培养基+0.2μL DAPT浓缩液(DAPT浓度为1μM/L)、2ml EPSC培养基+0.6μL DAPT浓缩液(DAPT浓度为3μM/L)、2ml EPSC培养基+2μL DAPT浓缩液(DAPT浓度为10μM/L)。于37℃、5％CO2培养箱中培养72小时后，收取细胞提取mRNA，通过qPCR检测多能性基因Nanog、Dppa3、Sox2、Oct4、Dux4、Klf4和Klf17的表达情况。
结果如图1所示，DAPT浓度为1μM/L和3μM/L时对EPSC多能性基因Nanog、Dppa3、Sox2、Oct4、Dux4、Klf4和Klf17的表达都没有显著影响。DAPT浓度为10μM/L时对多能性基因Nanog、Dppa3、Sox2、Dux4、Klf4和Klf17的表达没有显著影响，但显著促进了Oct4基因的表达，Oct4位于细胞全能性调控网络的顶端，被认为是重编程中不可缺少的核心转录因子，是维持干细胞多能性最重要的因子。因此，可认为10μM DAPT对EPSC体外多能性的维持有显著的积极作用。
实施例3DAPT对EPSC体外多能性维持能力的影响
本实施例使用碱性磷酸酶(AP)染色液试剂盒(碧云天公司，货号：C3206)检测加入DAPT是否有利于EPSC保持未分化状态。碱性磷酸酶是一种水解酶，在碱性条件下，催化磷酸酯键，从而将底物分子(如核酸、蛋白、生物碱)上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基。多能干细胞高水平表达碱性磷酸酶，当使用AP染色液试剂盒对固定的多能干细胞染色时，未分化细胞呈红色或紫色、多聚集起来呈克隆状，而分化的细胞呈无色、分散存在。因此，通过AP染色后细胞的颜色和克隆状态来评价DAPT是否有助于EPSC在体外的多能性维持。
具体操作方法如下：取实施例1中制备的P11代EPSC进行复苏，具体复苏步骤为：将保存有P11代EPSC的冻存管放入37℃温水中晃荡至冻存液完全融化，吸取冻存液至15ml离心管中加入等体积比的EPSC培养基混匀；1100rpm/min离心5min，吸弃上清液；使用EPSC培养基重悬细胞。
取适量DAPT粉末加入DMSO溶解形成终浓度为10mM/L的DAPT浓缩液。
将复苏后的EPSC按照1000个细胞/cm2的细胞密度接种于matrigel胶包被的12孔板。之后将接种细胞分为DAPT-组(对照组)和DAPT+组，分别加入2ml EPSC培养基、2ml EPSC培养基+2μL DAPT浓缩液(DAPT浓度为10μM/L),于37℃、5％ CO2培养箱中培养6天后用4％的PFA溶液固定细胞，使用AP染色液试剂盒进行检测。
结果如图2所示，DAPT+组的AP染色阳性克隆数量明显多于DAPT-组，三次重复实验后对结果进行统计分析，克隆形成数量有统计学差异(图2A)；对AP染色结果在显微镜下观察，DAPT+组细胞均成紫色且呈克隆状生长，散在的分化细胞数量明显少于DAPT-组(图2B)。表明在EPSC培养基的基础上添加10μM DAPT有助于维持EPSC的未分化状态，DAPT可作为潜在的EPSC多能性维持添加剂。
实施例4DAPT对EPSC细胞增殖的影响
本实施例考察DAPT对EPSC增殖速率的影响，具体方法如下，取实施例1中制备的P11代进行复苏，具体复苏步骤为：将保存有P11代EPSC的冻存管放入37℃温水中晃荡至冻存液完全融化，吸取冻存液至15ml离心管中加入等体积比的EPSC培养基混匀；1100rpm/min离心5min，吸弃上清液；使用EPSC培养基重悬细胞。
将复苏后的EPSC按照3万个细胞/cm2的细胞密度接种于matrigel胶包被的6孔板。将接种细胞分为DAPT-组(对照组)和DAPT+组，每个组接种6个孔，分别加入2ml EPSC培养基、2ml EPSC培养基+2μL DAPT浓缩液(DAPT浓度为10μM/L)于37℃、5％ CO2培养箱中培养5天。接种后每过一天消化一个孔，采用血球计数板进行细胞计数，连续计数5天。接种3天后于电子显微镜下观察两组的细胞数量，接种5天后制作细胞增殖曲线。
结果如图3所示，在接种三天后观察可见DPAT+组细胞数量明显多于DAPT-组(图3A)，对不同接种时间细胞数量统计可见DAPT+组的细胞增殖速率明显快于DAPT-组(图3B)。
实施例5DAPT对EPSC形成畸胎瘤的影响
一些科学家认为畸胎瘤分析是验证人IPS多能性的最佳检测法，是确定新细胞系多能性的必要手段。有研究表明将一定数量的hPSC注射入免疫缺损的小鼠体内，注射后4-12周，多能细胞将生成可检测的畸胎瘤。畸胎瘤包含代表三个胚层的组织，并且可通过组织学检验分析，确认来自于各细胞谱系的多细胞的存在。EPSC与IPS和ESC相比具有更高的全能性和发育潜力，目前一般适用于IPS多能性检测的方法也适用于EPSC，因此本实施例通过畸胎瘤分析来考察DAPT对EPSC多能性维持的作用。
取实施例1中制备的P11代EPSC进行复苏，具体复苏步骤为：将保存有P11代EPSC的冻存管放入37℃温水中晃荡至冻存液完全融化，吸取冻存液至15ml离心管中加入等体积比的EPSC培养基混匀；1100rpm/min离心5min，吸弃上清液；使用EPSC培养基重悬细胞。
然后将EPSC细胞分为DAPT-组和DAPT+组，分别添加2ml EPSC培养基、2ml EPSC培养基+2μL DAPT浓缩液(DAPT浓度为10μM/L)培养20天(即细胞从P11传代至P16)。之后，将8只NSG雄性小鼠也分为DAPT-组和DAPT+组，于每只小鼠大腿内侧皮下注射100万个EPSC细胞，继续饲养三周后处死小鼠，取畸胎瘤组织，统计其重量信息。
结果如图4所示，接种DAPT-组EPSC和DAPT+组EPSC的小鼠均形成了畸胎瘤，但是畸胎瘤重量统计结果显示接种DAPT+组EPSC的小鼠体内形成的畸胎瘤重量显著高于接种DAPT-组EPSC的小鼠。表明EPSC经过DAPT处理后其多能性能够维持更长时间。
实施例6DAPT对高代数EPSC制备嵌合体效率的影响
本实施例通过实施例1制备的P11代细胞制备嵌合体的效率来评估DAPT对高代数EPSC保持全能性或多能性的影响。
本实施例采用稳定表达GFP的慢病毒转染EPSC，获取稳定表达GFP的EPSC细胞系。具体转染方式为：采用表达质粒表达GFP，包装质粒为pMD2.G，VSVG和REV的第三代慢病毒系统，获取慢病毒后按25000病毒：1个EPSC细胞的比例加入慢病毒，同时加入10μg/mLPolybrene(翌圣生物40804ES76)，24小时后更换病毒感染液。感染结束后分选GFP阳性细胞继续培养用于后续实验。
随后将GFP阳性的EPSC细胞分为DAPT-组和DAPT+组，分别添加2ml EPSC培养基、2ml EPSC培养基+2μL DAPT浓缩液(DAPT浓度为10μM/L)培养20天(即细胞从P11传代至P16)。选取10个B6小鼠的8细胞期胚胎，分为iPSC组、DAPT-组和DAPT+组，每个组别的胚胎中分别原核注射iPSC细胞、DAPT-组EPSC细胞和DAPT+组EPSC细胞，每个胚胎注射10个细胞。两天后胚胎发育到囊胚期，形成内细胞团(ICM)和滋养层细胞(TE)结构，荧光显微镜观察胚胎中存在GFP阳性细胞则判定为嵌合胚胎。
三个组的嵌合胚胎形成情况和数量统计结果如图5所示，iPSC组10个胚胎中有7个在ICM中有嵌合细胞，3个胚胎没有形成嵌合细胞。DAPT-组有2个胚胎在ICM和TE中都存在嵌合细胞、2个胚胎仅在TE中存在嵌合、4个胚胎仅在ICM中存在嵌合、2个胚胎中没有嵌合。DAPT+组10个胚胎中均形成嵌合胚胎，其中4个胚胎在ICM和TE中均形成嵌合，6个胚胎在ICM中存在嵌合。表明DAPT能够极大地提高EPSC制备嵌合体的效率，进一步证明了DAPT能够使高代数的EPSC依然具有全能性。
实施例7DAPT对ESPC分化潜能的影响
本实施例检测了DAPT对EPSC向滋养层干细胞(TSC)分化的能力，取实施例1中制备的P11代EPSC使用0.5mM EDTA进行消化，按照5万个细胞/cm2的细胞密度接种于matrigel胶包被的6孔板。将EPSC细胞分为DAPT-组和DAPT+组，分别添加EPSC培养基、EPSC培养基+10μMDAPT培养一天。接种后第二天更换TSC诱导培养基(培养基配方见表3)，计为D1。接种后每天换液，第六天收取细胞，电子显微镜下观察细胞形态，提取mRNA后qPCR检测TSC标志基因KRT7、HLAG、GATA3、CGβ、TFAP2C的表达情况。
表3TSC诱导培养基配方
| 组分 | 使用浓度 |
| IMDM | 93％ |
| GlutaMAX | 1％ |
| NEAA | 1％ |
| β-Mercaptoehanol | 0.1mM |
| KSR | 5％ |
| L-AA | 50μg/mL |
| BMP4 | 20ng/mL |
| A8301 | 2μM |
电子显微镜观察结果如图6A所示，DAPT-组和DAPT+组在更换TSC培养基后EPSC细胞的增殖和细胞形态没有明显差异。qPCR检测结果如图6B所示，两个组的EPSC所有的TSC标志基因表达没有表达差异，表明DAPT处理不会EPSC的全能分化潜能。
Claims (9)
1.DAPT在维持扩展多潜能干细胞多能性和/或提高扩展多潜能干细胞增殖能力中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述DAPT的浓度为3-10μM。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述DAPT的浓度为10μM。
4.一种用于维持扩展多潜能干细胞多能性和/或提高扩展多潜能干细胞增殖能力的组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1-3中任一项所述的
DAPT。
5.一种用于维持扩展多潜能干细胞多能性和/或提高扩展多潜能干细胞增殖能力的培养基，其特征在于，所述培养基包含权利要求1-3中任一项所述的DAPT。
6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述培养基中还包含DMEM/F-12培养基、Neurobasal、GlutaMAX、NEAA、β-Mercaptoehanol、KSR、B-27、N-2、ITS-X、L-AA-pi、(S)-(+)-Dimethindene maleate、LIF、Activin A、Minocycline hydrochloride、Trolox、CHIR99021、Y-27632、XAV939、GSK126。
7.根据权利要求6所述的培养基，其特征在于，所述培养基中各组分的含量分别为：46.625％DMEM/F-12培养基、46.625％Neurobasal、1％GlutaMAX、1％NEAA、0.1mMβ-Mercaptoehanol、3％KSR、0.50％B-27、0.25％N-2、1％ITS-X、100μg/mL L-AA-pi、2μM(S)-(+)-Dimethindene maleate、10ng/mL LIF、40ng/mL Activin A、2μMMinocyclinehydrochloride、10μM Trolox、1μM CHIR99021、5μM Y-27632、2μM XAV939、1μM GSK126。
8.一种维持扩展多潜能干细胞多能性和/或提高扩展多潜能干细胞增殖能力的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：采用权利要求5-7中任一项所述的培养基对扩展多潜能干细胞进行培养。
9.权利要求1-3任一项所述的DAPT、权利要求4所述的组合物和/或权利要求5-7中任一项所述的培养基在扩增扩展多潜能干细胞中的应用。
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