CN116355837A - 一种epsc悬浮培养和分化神经干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种EPSC悬浮培养和分化神经干细胞的方法。为解决贴壁培养EPSC成本高、耗费人力成本高的技术问题，本发明首先提出了悬浮培养EPSC的方法。同时，通过本发明所提供的悬浮培养方法，可以更快速的使EPSC分化，具体地，本发明提供了使用EPSC培养基悬浮培养EPSC的方法，所述EPSC培养基中包含DMEM/F‑12、Neurobasal、L‑谷氨酰胺或其代替物、NEAA、β‑Mercaptoehanol、血清替代物、B‑27、N‑2、ITS‑X、L‑AA‑pi、(S)‑(+)‑Dimethindene maleate、LIF、Activin A、Minocycline hydrochloride、Trolox、CHIR99021、Y‑27632、XAV939、GSK126。

Description

一种EPSC悬浮培养和分化神经干细胞的方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种EPSC悬浮培养和分化神经干细胞的方法。
背景技术
如何建立高质量的多能干细胞一直是干细胞研究的核心问题。EPSC(Expanded(orextended)pluripotent stem cell，扩展潜能干细胞)是2017年邓宏魁研究组建立的一类具有全能性功能特征的多能干细胞，同时具有胚内和胚外组织的发育潜能(Yang et al.,2017)。
iPSC细胞只能发育分化形成外中内三胚层组织和细胞，而EPSC可以分化形成胚胎外组织相对于iPSC具有更强的分化潜能(Yasuda，2018)。此外EPSC相比于iPSC还具有分化形成的功能细胞更接近体细胞(Chen，2020)、体外进行基因编辑效率更高(Xiang，2019)和传代过程中基因组更稳定等优势(Liu，2021)(Zheng，2021)。EPSC已成功分化为很多细胞类型，包括体细胞和滋养层细胞，这尤其有助于再生医学的研究例如疾病建模、疗法筛选、毒性测试、遗传疾病研究和生殖生物学研究，EPSC已经成为多能干细胞研发重要细胞平台。
目前EPSC的培养方式有两种，一种是在feeder cell(滋养层细胞)存在的条件总培养(Yang，2017)，一种是在无滋养层细胞的条件下培养(Liu，2021；Zheng，2021)。两种培养方案都是使用贴壁的方式培养完成，贴壁培养条件下培养皿表面需要laminin521或Matrigel胶做预处理。贴壁培养成本较高，且需要人力较高。
同时，由EPSC诱导分化神经干细胞的传统方法均为使用IPS培养基贴壁培养EPSC先分化为IPSC后再进行后续分化，由EPSC分化为IPSC的过程需要大约3天，IPSC分化为神经干细胞(NSC)大约需要6-8天。诱导过程复杂，花费时间长。
发明内容
为解决贴壁培养EPSC成本高、耗费人力成本高的技术问题，本发明首先提出了悬浮培养EPSC的方法。同时，通过本发明所提供的悬浮培养方法，可以更快速的使EPSC分化，具体地，通过本发明方法诱导EPSC直接分化成NSC只需要3天，大大的缩短分化过程。
具体地，本发明提供了以下技术方案：
一方面，本发明提供了一种EPSC培养基，所述EPSC培养基中包含DME M/F-12、Neurobasal、L-谷氨酰胺或其代替物、NEAA(非必需氨基酸溶液，No n-Essential AminoAcids)、β-Mercaptoehanol(β-巯基乙醇，β-ME，BME)、血清替代物、B-27、N-2、ITS-X(Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine，胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺溶液)、L-AA-pi(L-抗坏血酸)、(S)-(+)-Dimethinde ne maleate、LIF、Activin A、Minocyclinehydrochloride、Trolox、CHIR99021、Y-27632、XAV939、GSK126。
优选地，所述EPSC培养基中包含46.625％的DMEM/F-12、46.625％的Neu robasal、1％的L-谷氨酰胺或其代替物、1％的NEAA、0.1mM的β-Mercaptoehanol、3％的血清替代物、0.25％的B-27、0.50％的N-2、1％的ITS-X、100μg/mL的L-AA-pi、2μM的(S)-(+)-Dimethindene maleate、10ng/mL的LIF、40ng/mL的Activin A、2μM的Minocyclinehydrochloride、10μM的Trolox、1μM的CHIR99021、5μM的Y-27632、2μM的XAV939、1μM的GSK126。
另一方面，本发明提供了一种N2B27培养基，所述N2B27培养基中包含AdvancedDMEM/F12、Neurobasal、L-谷氨酰胺或其代替物、B-27、N-2、β-Merc aptoehanol。
优选地，所述N2B27培养基中包含48.75％的Advanced DMEM/F12、48.75％的Neurobasal、1％的L-谷氨酰胺或其代替物、1％的B-27、0.50％的N-2、0.05mM的β-Mercaptoehanol。
另一方面，本发明提供了一种神经诱导培养基，所述神经诱导培养基中包含Advanced DMEM/F12、Neurobasal、L-谷氨酰胺或其代替物、B-27、N-2、β-Mercaptoehanol、LDN193189、SB431542、CHIR99021。
优选地，所述神经诱导培养基中包含48.75％的Advanced DMEM/F12、48.75％的Neurobasal、1％的L-谷氨酰胺或其代替物、1％的B-27、0.50％的N-2、0.05mM的β-Mercaptoehanol、100nM的LDN193189、10μM的SB431542、3μM的CHIR99021。
或者，所述神经诱导培养基也可以描述为向前述N2B27培养基添加了LDN 193189、SB431542、CHIR99021而配置成的培养基。
如本发明以上培养基中所使用的试剂，所述DMEM/F-12、Advanced DME M/F12、Neurobasal是基础培养基，术语“基础培养基”是指能够支持细胞生长的任何培养基，通常包含无机盐、维生素、葡萄糖、缓冲体系和必需氨基酸。本领域技术人员根据细胞培养状态、培养环境、培养设备，可对其成分做出合适的调节。所述B-27、N-2是成分确定的无血清添加剂，本领域技术人员根据其成分可自行配制，也可以使用商品化的成品。
最优选地，本发明所述L-谷氨酰胺或其代替物选用GlutaMAX；
优选地，所述血清替代物包括KSR(KnockOutTM血清替代物)、MSC无血清添加剂、Ultroser G；最优选地，本发明所述血清替代物选用KSR。
如本发明所述“非必需氨基酸”选自甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸及其组合。
如本发明所使用的，以上培养基中涉及的其他成分ITS-X(Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine，胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺溶液)、L-AA-pi(L-抗坏血酸)、(S)-(+)-Dimethindene maleate、LIF、Activin A、Minocycline hydrochl oride、Trolox、CHIR99021、Y-27632、XAV939、GSK126、LDN193189、SB431542、CHIR99021都是成分明确的试剂，本领域技术人员根据本发明提供的具体配方即可配制出本发明所述培养基，实验本发明所要实现的技术目的。
培养EPSC
另一方面，本发明提供了一种悬浮培养EPSC的方法，所述方法包括使用前述EPSC培养基培养EPSC。
优选地，所述方法的培养环境是5％ CO2饱和湿度、37℃。
在一种具体的实施例中，所述细胞培养是对细胞进行静置培养，或者，对细胞进行低速搅拌。
如本发明具体实施例，本发明在2ml的培养体系中对细胞进行静置培养，或者在125ml反应器中对细胞进行低速搅拌培养。
具体地，本发明所述培养需使用低吸附培养器皿进行培养。培养体系大于50ml时，需对细胞进行低速搅拌，所述低速包括5rpm/min、10rpm/min、20rpm/min、30rpm/min、40rpm/min、50rpm/min、60rpm/min、70rpm/min、80rpm/min、90rpm/min、100rpm/min。
更具体地，如本发明具体实施例所使用的转速是60rpm/min。
优选地，所述方法培养得到的细胞有活性，且具有自我更新能力。
优选地，所述方法中细胞的初始密度是5万/ml。
另一方面，本发明提供了前述EPSC培养基在诱导EPSC生成、培养EPSC中的应用。
诱导EPSC分化为神经干细胞(neural stem cell)
另一方面，本发明提供了一种诱导EPSC分化为神经干细胞(neural stemcell)的方法，所述方法包括使用N2B27培养基培养细胞和使用神经诱导培养基培养EPSC。
优选地，所述使用N2B27培养基培养细胞的时长是1天、2天、3天、4天、5天、6天或更多。
优选地，优选地，所述使用N2B27培养基培养细胞的时长是1天(24小时)。
优选地，所述使用神经诱导培养基培养细胞的时长是1天、2天、3天、4天、5天、6天或更多。
优选地，所述方法的培养环境是5％ CO2饱和湿度、37℃。
在一种具体的实施例中，所述细胞培养是对细胞进行静置培养，或者，对细胞进行持续的低速搅拌。
如本发明具体实施例，本发明在2ml的培养体系中对细胞进行静置培养，或者在125ml反应器中对细胞进行低速搅拌培养。
具体地，本发明所述培养需使用低吸附培养器皿进行培养。培养体系大于50ml时，需对细胞进行低速搅拌，所述低速包括5rpm/min、10rpm/min、20rpm/min、30rpm/min、40rpm/min、50rpm/min、60rpm/min、70rpm/min、80rpm/min、90rpm/min、100rpm/min。
更具体地，如本发明具体实施例所使用的转速是60rpm/min。
另一方面，本发明提供了以上方法制备得到的神经干细胞及其在制备细胞治疗产品中的应用。
具体地，以上方法培养至第3(1+2)天时，细胞就呈Sox2和Pax6阳性，且以上方法培养到第2(1+1)天之后，Nestin阳性细胞比例占90％以上。
优选地，所述诱导EPSC分化为神经干细胞的方法是诱导出高表达KLF4、OCT4、DPPA3、KLF17、SOX2或NANOG中任意一种或多种标志基因的神经干细胞。
另一方面，本发明提供了一种诱导EPSC分化为神经干细胞的培养基组合，所述培养基组合是N2B27培养基和神经诱导培养基的组合。
优选地，所述神经干细胞是高表达KLF4、OCT4、DPPA3、KLF17、SOX2或NANOG中任意一种或多种标志基因的神经干细胞。
另一方面，本发明提供了前述诱导EPSC分化为神经干细胞的培养基组合在诱导EPSC分化为神经干细胞(neural stem cell)中的应用。
优选地，所述神经干细胞是高表达KLF4、OCT4、DPPA3、KLF17、SOX2或NANOG中任意一种或多种标志基因的神经干细胞。
制备神经干细胞(neural stem cell)
另一方面，本发明提供了一种制备神经干细胞(neural stem cell)的方法，所述方法包括使用前述EPSC培养基培养EPSC的步骤，所述方法还包括使用N2B27培养基和神经诱导培养基诱导EPSC分化为神经干细胞(neural stem cell)的步骤。
优选地，所述神经干细胞是高表达KLF4、OCT4、DPPA3、KLF17、SOX2或NANOG中任意一种或多种标志基因的神经干细胞。
优选地，所述方法的培养环境是5％ CO2饱和湿度、37℃。
在一种具体的实施例中，所述细胞培养是对细胞进行静置培养，或者，对细胞进行持续的低速搅拌。
如本发明具体实施例，本发明在2ml的培养体系中对细胞进行静置培养，或者在125ml反应器中对细胞进行低速搅拌培养。
具体地，本发明所述培养需使用低吸附培养器皿进行培养。培养体系大于50ml时，需对细胞进行低速搅拌，所述低速包括5rpm/min、10rpm/min、20rpm/min、30rpm/min、40rpm/min、50rpm/min、60rpm/min、70rpm/min、80rpm/min、90rpm/min、100rpm/min。
更具体地，如本发明具体实施例所使用的转速是60rpm/min。
另一方面，本发明提供了一种制备神经干细胞的培养基组合，所述培养基组合是EPSC培养基、2B27培养基和神经诱导培养基的组合。
另一方面，本发明提供了前述制备神经干细胞的培养基组合在制备神经干细胞中的应用。
另一方面，本发明提供了以上方法制备得到的神经干细胞及其在制备细胞治疗产品中的应用。
优选地，本发明所述神经干细胞是高表达KLF4、OCT4、DPPA3、KLF17、SOX2或NANOG中任意一种或多种标志基因的神经干细胞。
优选地，本发明所述的一种悬浮培养EPSC的方法、诱导EPSC分化为神经干细胞(neural stem cell)的方法和制备神经干细胞(neural stem cell)的方法都是悬浮培养的方法，包括静置培养或对细胞进行低速搅拌。
术语定义
除非另有定义，本发明所使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本发明描述的那些相似或等效的任何方法和材料，但是描述了优选的方法和材料。出于本发明的目的，以下术语定义如下。
如本文中所使用的，术语“悬浮培养”是一种细胞悬浮培养于液体培养基中的培养方式，具体指的是一种在受到不断搅动或摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞团的组织培养系统，是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。
本领域技术人员应当熟知悬浮培养技术的培养设备是多种多样的，包括但不限于诸如培养箱和/或用于保持细胞恒定运动的装置，例如旋转平台、振荡器、摇袋生物反应器、一次性生物反应器、一次性XDR生物反应器、细胞培养袋、PBS系列细胞培养箱、细胞培养袋、一次性摇瓶等等。
如本发明所使用，属于“低吸附培养器皿”可以包括聚苯乙烯材质的细胞培养器皿、聚碳酸酯材质的细胞培养器皿、聚甲基丙烯酸甲酯材质的细胞培养器皿、COC树脂材质的细胞培养器皿、环烯烃聚合物材质的细胞培养器皿等低吸附表面的细胞培养器皿。所述“低吸附培养器皿”无需经过层粘连蛋白521(Laminin521)、Matrigel、玻连蛋白(Vitronectin)等基质胶处理，从而不会使被培养的细胞贴壁。
如本发明具体实施例对大于50ml的细胞进行培养时使用的是华龛125ml反应器，所述华龛125ml反应器可以低速搅拌细胞，也即使细胞相对于培养设备旋转(运动)，所述低速包5rpm/min、10rpm/min、20rpm/min、30rpm/min、40rpm/min、50rpm/min、60rpm/min、70rpm/min、80rpm/min、90rpm/min、100rpm/min。最优选地，所述低速搅拌是指60rpm/min。
一般来说，本发明的细胞培养基组合物可以一天更新一次，本领域技术人员根据悬浮培养的具体需要和环境可以决定更换培养基的频率。例如，每约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时更换培养基。在另外的实施方案中，也可以较不经常地更换培养基，诸如但不限于每1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或每2天或更多天，或者以上两者间的任一时间范围。
本发明所述培养EPSC包括对EPSC进行传代。如本文所用的，细胞培养语境中的术语“传代”的用法与其在本领域的用法相同。也就是说，细胞培养传代是从之前培养收集细胞，并随后将较小数目的收集的(收获的)细胞转移至新细胞培养容器(器皿)中。本领域技术人员应当熟知细胞培养传代的过程和方法。
在某些实施方案中，本发明所述EPSC(Expanded pluripotent stem cell，Extended pluripotent stem cell，扩展多能干细胞)可以是从干细胞或体细胞产生的。
在某些实施方案中，所述干细胞包括胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ESC)、单倍体胚胎干细胞(Haploid Embryonic Stem Cells，haESCs)、诱导多能干细胞(Inducedpluripotent stem cell，iPSC)、或成体干细胞(somatic stemcell，如骨髓、脂肪、神经或皮肤中提取的干细胞)。
在某些实施方案中，所述体细胞包括人体各种细胞，例如肌细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞等。或者，所述EPSC是自公共细胞资源库取得或是购买的商品化产品。
在优选的实施方案中，本发明所述EPSC可以是按照Chemically Defined andXeno-free Culture Condition for Human Extended Pluripotent Stem Cells文章中所报道的方法有多功能诱导干细胞(ips)诱导而产生的细胞；可以经过多次传代，例如传代10次。
在某些实施方案中，本发明所述EPSC是具有全能性功能特征的多能干细胞，具有极强的分化潜能，使用本发明培养方法所得到的EPSC也可以经诱导成不同的目标细胞后应用于各种医疗或科研途径。
有益效果：
1、本研究发现EPSC可以悬浮培养，在不影响EPSC细胞的条件下降低了培养成本、提高了细胞培养效率。
2、本研究发现EPSC可以直接分化成NSC，时间只需要3天，大大的缩短分化过程。
3、本发明所提供的技术方案都基于悬浮培养，所使用的培养器皿无需经过Matrigel等基质处理，节省了人力物力。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
附图说明
图1是细胞活率检测的结果图。
图2是细胞形态和碱性磷酸染色检测的结果图，A是悬浮培养后光镜下的细胞形态，B是贴壁培养后光镜下的细胞形态，C是悬浮培养后碱性磷酸染色检测的结果图，D是贴壁培养后碱性磷酸染色检测的结果图。
图3是培养过程中EPSC细胞数目的统计图。
图4是在贴壁培养或悬浮培养得到的EPSC之间对比多能性基因表达量的检测结果图。
图5是悬浮培养方式下，诱导EPSC分化出Nestin阳性细胞比例的检测结果图。
图6是悬浮培养方式下，诱导EPSC分化第x天时标志基因Sox2和Pax6表达量的检测结果图。
图7是EPSC诱导分化出的神经干细胞相对于EPSC标志基因表达量变化的检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1、EPSC的悬浮培养方法及验证
培养方法
表1、EPSC培养基配方
组分 产品信息 使用浓度
DMEM/F-12 thermo 11330-032 46.625％
Neurobasal thermo 212103-049 46.625％
GlutaMAX thermo 35050-061 1％
NEAA thermo 11140-050 1％
β-Mercaptoehanol thermo 21985-023 0.1mM
KSR thermo 10828028 3％
B-27 thermo 12587-010 0.25％
N-2 thermo 17502-048 0.50％
ITS-X thermo 51500056 1％
L-AA-pi sigma A8960 100μg/mL
(S)-(+)-Dimethindene maleate Tocris 1425 2μM
LIF Peprotech 300-05 10ng/mL
Activin A stemcell 78001.1 40ng/mL
Minocycline hydrochloride MCE HY-17412 2μM
Trolox Merck-648471 10μM
CHIR99021 selleck S1263 1μM
Y-27632 abcam ab120129 5μM
XAV939 selleck S1180 2μM
GSK126 selleck S7061 1μM
本发明使用的EPSC是将多功能诱导干细胞(ips)按邓宏魁教授的方法诱导而来的，具体方法如文章Chemically Defined and Xeno-free Culture Condition for HumanExtended Pluripotent Stem Cells中所报道。
培养方式：
使用EDTA消化液将贴壁的EPSC消化为小细胞团块，用二倍体积的DMEM/F12终止消化，使用移液器吹打细胞至小的细胞团块。转移细胞团块至离心管，1050rpm/min离心5min离心弃上清，使用上述EPSC培养基重悬细胞，细胞密度大约为5万/ml(此密度等同于贴壁培养状态下6孔板中加2ml细胞悬液的数量)。
小体积培养体系(<50ml)：使用低吸附6孔板加入总计2ml细胞悬液静置培养，培养环境5％ CO2饱和湿度、37℃。
大体积培养体系(>50ml)：使用华龛125ml反应器，加入120ml EPSC完全培养基，培养环境5％ CO2饱和湿度、37℃，60rpm/min转速下培养。
两种培养状态下的EPSC的检测结果无统计学显著差异。
悬浮细胞传代方法：吸取悬浮的细胞团块至15ml离心管，轻轻反复吹打细胞团块至小团块，1050rpm/min离心5min离心弃上清，EPSC培养基重悬细胞接种至培养体系中。
1、细胞活率的检测
悬浮培养72小时后，使用活/死细胞染色试剂盒(Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒：碧云天生物C2015)对EPSC悬浮的细胞团块进行染色，绿色为活细胞，红色为死细胞。可见团块状的EPSC是活细胞，而分散的单细胞为死细胞(图1)。
2、细胞形态和碱性磷酸染色检测
悬浮培养碱性磷酸酶染色是衡量多能干细胞自我更新的主要指标。悬浮培养72小时后，对悬浮培养的EPSC观察了光镜下的形态(图2A)，悬浮培养的EPSC贴壁24小时后，再观察细胞状态(图2B)，并使用碱性磷酸酶染色试剂盒进行对悬浮培养和悬浮后贴壁的EPSC进行染色(碱性磷酸酶染色试剂盒：碧云天生物C3206)。如图2CD所示，我们发现悬浮培养的EPSC碱性磷酸酶染色呈阳性反应，表明悬浮培养的EPSC具有自我更新的能力。
3、细胞增殖
对不同时间点的EPSC细胞数目做了统计，如图3所示，悬浮EPSC3天后是原有细胞数目的三倍，细胞增殖明显。
4、悬浮EPSC和贴壁培养EPSC多能性基因表达的对比
表3、检测引物
基因 上游引物 下游引物
Klf4 CGGACATCAACGACGTGAG GACGCCTTCAGCACGAACT
Klf17 GCTGCCCAGGATAACGAGAAC ATCTCTGCGCTGTGAGGAAAG
Oct4 GTGTTCAGCCAAAAGACCATCT GGCCTGCATGAGGGTTTCT
Dppa3 TAGCGAATCTGTTTCCCCTCT CTGCTGTAAAGCCACTCATCTT
Sox2 TCCCGTATGAAAGCATCGTGG CCCATTTGGGTAGATCAGGTAAC
Sox2 GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG
Nanog TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG
Dux4 CTGGTCTTCTACGTGGAAATGAA CGTGGGAGTCTTGAGTGTGC
GAPDH TGACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG GCGTCAAAGGTGGAGGAGTGGGT
Nanog TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG
为确定EPSC的多能性，细胞传代后72小时，我们对比了相同培养时间的贴壁EPSC和悬浮EPSC的多能性基因的表达变化，检测引物如表2所示。
如图4所示悬浮培养(灰色柱形图)的KLF4，OCT4，DPPA3，KLF17，SOX2和NANOG基因的表达均高于贴壁培养的EPSC(黑框柱图)。
以上的数据表明，悬浮培养的EPSC细胞的细胞活率较高，细胞增殖较快同时具有干细胞干性和多能性。
实施例2、诱导EPSC分化神经干细胞的方法及验证
诱导方法
表3、N2B27培养基配方
组分 产品信息 使用浓度
Advanced DMEM/F12 thermo 12634-101 48.75％
Neurobasal thermo 212103-049 48.75％
GlutaMAX thermo 35050-061 1％
B-27 thermo 12587-010 1％
N-2 thermo 17502-048 0.50％
β-Mercaptoehanol thermo 21985-023 0.05mM
表4、神经诱导培养基
组分 产品信息 使用浓度
Advanced DMEM/F12 thermo 12634-101 48.75％
Neurobasal thermo 212103-049 48.75％
GlutaMAX thermo 35050-061 1％
B-27 thermo 12587-010 1％
N-2 thermo 17502-048 0.50％
β-Mercaptoehanol thermo 21985-023 0.05mM
LDN193189 selleck S2618 100nM
SB431542 selleck S1067 10μM
CHIR99021 selleck S1263 3μM
将实施例1中悬浮培养的EPSC细胞，使用N2B27培养基培养24小时，之后更换神经诱导培养基(含有LDN193189，SB431542和CHIR99021的N2B27培养基)进行培养。
培养方式大规模培养体系(大于50ml)同具体实施例1，2ml培养体系或大规模培养体系(大于50ml)培养状态下的EPSC向NSC分化的检测结果无统计学显著差异。
1、Nestin的表达情况检测
为确定神经干细胞(neural stem cell)的分化比例，通过流式检测分化细胞中Nestin的表达。D1+1时Nestin的表达就达到97％，而后到第6天(D1+5)Nestin阳性细胞群均在90％以上。
结果如图5所示，图中：
D1+1是指，使用N2B27培养基培养1天+使用神经诱导培养基培养1天。
D1+2是指，使用N2B27培养基培养1天+使用神经诱导培养基培养2天。
D1+3是指，使用N2B27培养基培养1天+使用神经诱导培养基培养3天。
D1+4是指，使用N2B27培养基培养1天+使用神经诱导培养基培养4天。
D1+5是指，使用N2B27培养基培养1天+使用神经诱导培养基培养5天。
在D1+2时，本发明还检测了标志基因Sox2和Pax6，检测结果显示分化细胞均成阳性，结果如图6所示。
2、诱导分化出的神经干细胞与EPSC的多能性对比
本发明对比了分化出的神经干细胞和EPSC的标志基因表达。
如图7所示，在D1+2时，神经干细胞nestin，pax6和sox2均比EPSC细胞表达升高，而Oct4和Nanog表达较EPSC下降明显，表明EPSC向NSC分化中多能性丢失。

Claims (10)

1.一种EPSC培养基或其在诱导EPSC生成、培养EPSC中的应用，所述EPSC培养基中包含DMEM/F-12、Neurobasal、L-谷氨酰胺或其代替物、NEAA、β-Mercaptoehanol、血清替代物、B-27、N-2、ITS-X、L-AA-pi、(S)-(+)-Dimethindene maleate、LIF、Activin A、Minocyclinehydrochloride、Trolox、CHIR99021、Y-27632、XAV939、GSK126；
优选地，所述EPSC培养基中包含46.625％的DMEM/F-12、46.625％的Neurobasal、1％的L-谷氨酰胺或其代替物、1％的NEAA、0.1mM的β-Mercaptoehanol、3％的血清替代物、0.25％的B-27、0.50％的N-2、1％的ITS-X、100μg/mL的L-AA-pi、2μM的(S)-(+)-Dimethindenemaleate、10ng/mL的LIF、40ng/mL的Activin A、2μM的Minocycline hydrochloride、10μM的Trolox、1μM的CHIR99021、5μM的Y-27632、2μM的XAV939、1μM的GSK126；
优选地，所述L-谷氨酰胺或其代替物是GlutaMAX；
优选地，所述血清替代物包括KSR、MSC无血清添加剂、Ultroser G；
最优选地，所述血清替代物是KSR。
2.一种N2B27培养基，所述N2B27培养基中包含Advanced DMEM/F12、Neurobasal、L-谷氨酰胺或其代替物、B-27、N-2、β-Mercaptoehanol；
优选地，所述N2B27培养基中包含48.75％的Advanced DMEM/F12、48.75％的Neurobasal、1％的L-谷氨酰胺或其代替物、1％的B-27、0.50％的N-2、0.05mM的β-Mercaptoehanol；
优选地，所述L-谷氨酰胺或其代替物是GlutaMAX；
优选地，所述血清替代物包括KSR、MSC无血清添加剂、Ultroser G；
最优选地，所述血清替代物是KSR。
3.一种神经诱导培养基，所述神经诱导培养基中包含Advanced DMEM/F12、Neurobasal、L-谷氨酰胺或其代替物、B-27、N-2、β-Mercaptoehanol、LDN193189、SB431542、CHIR99021；
优选地，所述神经诱导培养基中包含48.75％的Advanced DMEM/F12、48.75％的Neurobasal、1％的L-谷氨酰胺或其代替物、1％的B-27、0.50％的N-2、0.05mM的β-Mercaptoehanol、100nM的LDN193189、10μM的SB431542、3μM的CHIR99021；
优选地，所述L-谷氨酰胺或其代替物是GlutaMAX；
优选地，所述血清替代物包括KSR、MSC无血清添加剂、Ultroser G；
最优选地，所述血清替代物是KSR。
4.一种培养基组合物，所述培养基组合物包括权利要求1所述EPSC培养基、权利要求2所述N2B27培养基和权利要求3所述神经诱导培养基中的至少两种。
5.权利要求1-3任一所述培养基或权利要求4所述培养基组合物在制备神经干细胞中的应用。
6.一种悬浮培养EPSC的方法，所述方法包括使用权利要求1所述EPSC培养基培养EPSC；
优选地，所述方法的培养环境是5％CO2饱和湿度、37℃；
优选地，所述细胞培养是对细胞进行静置培养，或者，对细胞进行低速搅拌；
优选地，所述低速是60rpm/min。
7.一种诱导EPSC分化为神经干细胞的悬浮培养方法，所述悬浮培养方法包括使用权利要求2所述N2B27培养基和权利要求3所述神经诱导培养基培养EPSC；
优选地，所述使用N2B27培养基培养细胞的时长是1天、2天、3天、4天、5天、6天或更多；
优选地，所述使用神经诱导培养基培养细胞的时长是1天、2天、3天、4天、5天、6天或更多；
优选地，所述悬浮培养方法的培养环境是5％CO2饱和湿度、37℃；
优选地，所述细胞培养是对细胞进行静置培养，或者，对细胞进行低速搅拌；
优选地，所述低速是60rpm/min。
8.一种制备神经干细胞的悬浮培养方法，所述悬浮培养方法包括使用权利要求1所述EPSC培养基培养EPSC的步骤，所述方法还包括使用权利要求2所述N2B27培养基和权利要求3所述神经诱导培养基诱导EPSC分化为神经干细胞的步骤；
优选地，所述悬浮培养方法的培养环境是5％CO2饱和湿度、37℃；
优选地，所述细胞培养是对细胞进行静置培养，或者，对细胞进行低速搅拌；
优选地，所述低速是60rpm/min。
9.如权利要求6-8任一所述方法，所述EPSC的来源是干细胞或体细胞；
优选地，所述干细胞包括胚胎干细胞、单倍体胚胎干细胞、诱导多能干细胞或成体干细胞；
优选地，所述体细胞包括肌细胞、软骨细胞、内皮细胞或上皮细胞。
10.权利要求7或8所述方法制备得到的神经干细胞或其在制备细胞治疗产品中的应用；
优选地，所述神经干细胞是高表达KLF4、OCT4、DPPA3、KLF17、SOX2或NANOG中任意一种或多种标志基因的神经干细胞。
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