JP2024511108A - 人工多能性幹細胞を取得するための方法 - Google Patents

Abstract

造血系列の細胞から人工多能性幹細胞を取得する方法が本明細書において提供される。

Description

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、これによりその全体が参照によって組み込まれる配列表を含有する。２０２２年３月２３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０２５４５０＿ＷＯ０１４＿ＳＬ．ｔｘｔという名称で、６２，９６９バイトのサイズである。

細胞療法は、様々な疾患および状態の処置に対する大きな期待を提供する。細胞療法では、遺伝子障害、がん、神経障害、心臓障害、または眼関連の問題を含む多数の医学的状態から生じたと考えられる欠損または損傷組織または細胞を交換または修復するために、自己または同種細胞が患者に移植される。多能性幹細胞は細胞療法にとりわけ有用であり、これには、体細胞から生成された多能性幹細胞が含まれる。Ｋ．ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＳ．Ｙａｍａｎａｋａの重大な研究は、４つの初期化転写因子、すなわちＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、およびｃ－Ｍｙｃを発現するレトロウイルスベクターを形質導入したマウス線維芽細胞からの多能性幹細胞の誘導を実証した（Cell (2006) 126:663-76）。しかしながら、レトロウイルスベクターは宿主ゲノムに挿入変異を引き起こすおそれがあり、したがって臨床現場において使用される理想的なベクターではない。

したがって、初期化因子を体細胞に導入するためのＲＮＡベースの手法が試みられている。そのような手法の１つは、アルファウイルスベースのウイルスＲＮＡレプリコンを利用する。トガウイルス（Togaviridae）科における３０を超えるウイルスの属を構成するアルファウイルスは、脂質エンベロープを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスである。新世界アルファウイルスとしては、東部、西部、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（それぞれ、ＥＥＥＶ、ＷＥＥＶ、およびＶＥＥＶ）が挙げられ、北および南アメリカにおいて発見されている。旧世界アルファウイルスとしては、チクングニア（ＣＨＩＫ）、シンドビス、ロスリバー、およびオニョンニョンウイルスが挙げられる。

アルファウイルスは、およそ１４ｋｂの長さのプラス鎖一本鎖ＲＮＡゲノムを含有する。宿主細胞への侵入後、アルファウイルス粒子は、分解を受け、細胞の細胞質にゲノムＲＮＡを放出する。ウイルスゲノムの翻訳により非構造ポリタンパク質Ｐ１２３４が生じ、これは、その後プロテアーゼによって切断されて、非構造タンパク質（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４）を生成する。非構造タンパク質はＲＮＡ複製および転写に関与する。サブゲノムＲＮＡ－２６Ｓ ＲＮＡ－もまた、転写によりウイルスゲノムから産生される。２６Ｓ ＲＮＡの翻訳により構造ポリタンパク質が産生され、これは切断されて構造タンパク質（例えば、ＶＥＥＶの場合、Ｃ、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、およびＥ１）を生成する。構造タンパク質は、出芽およびウイルスカプシド形成に関与する。例えば、Shin et al., PNAS (2012) 109(41):16534-9、Jose et al., Future Microbiol. (2009) 4:837-56、Hardy and Strauss, J Virol. (1989) 63(11):4653-64、Melancon and Garoff, J Virol. (1987) 61(5):1301-9、およびStrauss et al., Virology (1984) 133(1):92-110)、およびGlanville et al., PNAS (1976) 73(9):3059-63)を参照されたい。

アルファウイルスレプリコンは、複製のためにＤＮＡ中間体を必要とせず、したがって、レトロウイルスベクターを含む他のいくつかの一般的に使用されるウイルスベクターに対するより安全な代替手段を提供する（Yoshioka et al., Cell Stem Cell. (2013) 13(2):246-54、Yoshioka and Dowdy, PLOS ONE (2017) 12:e0182018）。アルファウイルス、特にＶＥＥは、体細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に初期化する場合における、外因性転写因子をコードする遺伝子を運ぶためのベクターとして探索されている。しかしながら、この手法は、線維芽細胞および血管内皮細胞（ＢＯＥＣ：blood outgrowth endothelial cell）でのみ試みられている。いずれの細胞型も臨床的に特に魅力的ではない。自己線維芽細胞は患者の皮膚穿刺から取得されるが、これは侵襲性かつ有痛性である。ＢＯＥＣは、末梢血から得られるが、希少な細胞であり、樹立のために労力と時間のかかるプロセスを必要とする。

組込みを伴わない別の初期化手法は、エピソームＤＮＡプラスミドベクターを利用する。Ｗｅｎらは、この手法を使用して末梢血単核細胞をｉＰＳＣに初期化した（Stem Cell Rep. (2016) 6:873-84）。しかし、この手法は、複数のベクターを介して導入された様々な初期化因子のレベルの注意深い較正を必要とする。

センダイウイルスベクターもまた、初期化因子をコードする遺伝子を運ぶために使用されている。センダイベクターはマイナス鎖パラミクソウイルスであり、このベクターはビリオンにパッケージングされなければならない。この手法はより複雑である。これはパッケージング細胞株を必要とし、外来性物質をベクター産物に導入するおそれがある。

したがって、末梢血細胞からｉＰＳＣを取得する効率的かつ安全な手法が必要とされている。

本開示は、造血系列の開始細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の集団を取得する方法を提供する。方法は、開始細胞に、ＢＣＬ－ｘＬ、ならびにＯＣＴファミリータンパク質、ＫＬＦファミリータンパク質、ＭＹＣファミリータンパク質、ＳＯＸファミリータンパク質、ＬＩＮ２８タンパク質、ＮＡＮＯＧタンパク質、およびｐ５３ドミナントネガティブタンパク質から選択される１つまたは複数の追加の初期化因子をコードするアルファウイルスＲＮＡ発現構築物を導入することと、開始細胞を培養して、ＢＣＬ－ｘＬおよび１つまたは複数の追加の初期化因子の発現を可能にし、それによって開始細胞およびその後代を誘導してｉＰＳＣに初期化することとを含む。

一態様では、本開示は、ＢＣＬ－ｘＬ、ならびにＯｃｔファミリータンパク質、ＫＬＦファミリータンパク質、Ｍｙｃファミリータンパク質、ＳＯＸファミリータンパク質、ＬＩＮ２８タンパク質、ＮＡＮＯＧタンパク質、およびｐ５３ドミナントネガティブタンパク質から選択される１つまたは複数の追加の初期化因子をコードするアルファウイルスＲＮＡ発現構築物がトランスフェクトされている造血系列の開始細胞から取得される、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の集団を提供する。

開始細胞は、例えば、ヒト起源の造血幹細胞、赤血球前駆細胞（erythroid progenitor cell）、リンパ球前駆細胞（lymphoid progenitor cell）、末梢血単核細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、マクロファージ、単球、好中球、好酸球、または樹状細胞であり得る。一部の実施形態では、開始細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエリスロポエチン（ＥＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびＩＬ－３の存在下で、任意選択で５～１０または６～７日間培養することによって取得された赤血球前駆細胞である。さらなる実施形態では、ＰＢＭＣは、０．５～５ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ、５０～２００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および１～１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３の存在下で培養される。

一部の実施形態では、ＲＮＡ発現構築物は電気穿孔により開始細胞に導入される。さらなる実施形態では、開始細胞は電気穿孔の前にＢ１８Ｒタンパク質と共に培養される。

別の態様では、本開示は、ＢＣＬ－ｘＬ、ならびにＯＣＴファミリータンパク質、ＫＬＦファミリータンパク質、ＭＹＣファミリータンパク質、ＳＯＸファミリータンパク質、ＬＩＮ２８タンパク質、ＮＡＮＯＧタンパク質、およびｐ５３ドミナントネガティブタンパク質から選択される１つまたは複数の追加の初期化因子をコードするアルファウイルスＲＮＡ発現構築物を提供する。

本明細書におけるアルファウイルスＲＮＡ発現構築物のコード配列を含むＤＮＡベクター、および本明細書におけるアルファウイルスＲＮＡ発現構築物またはＤＮＡベクターを含む宿主細胞（例えばヒト細胞）もまた提供される。

一部の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡ発現構築物は、自己複製構築物であり、当該構築物を自己複製型にするのに十分な１つまたは複数の非構造タンパク質の遺伝子（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４遺伝子）を含む。さらなる実施形態では、アルファウイルスＲＮＡ発現構築物は、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）ＲＮＡ発現構築物であり、ＶＥＥＶ ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、ＶＥＥＶ ＲＮＡ発現構築物は、野生型ＶＥＥＶゲノムの対応する領域からの１つまたは複数の（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上の）変異を含有する。

一部の実施形態では、ＯＣＴファミリータンパク質はＯＣＴ４（例えばヒトＯＣＴ４）であり、ＫＬＦファミリータンパク質はＫＬＦ４（例えばヒトＫＬＦ４）であり、ＳＯＸファミリータンパク質はＳＯＸ２（例えばヒトＳＯＸ２）であり、ＬＩＮ２８タンパク質はＬＩＮ２８Ｂ（例えばヒトＬＩＮ２８Ｂ）であり、および／またはＭＹＣファミリータンパク質はｃ－ＭＹＣ（例えばヒトｃ－ＭＹＣ）である。

特定の実施形態では、配列番号１もしくはそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＢＣＬ－ｘＬタンパク質、配列番号３もしくはそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＯＣＴ４タンパク質、配列番号５もしくはそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＫＬＦ４タンパク質、配列番号７もしくはそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＳＯＸ２タンパク質、および／または配列番号９もしくはそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むｃ－ＭＹＣタンパク質。

一部の実施形態では、ＢＣＬ－ｘＬおよび１つまたは複数の追加の初期化因子のコード配列は、２Ａペプチドまたは内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）のコード配列によって分離されている。一部の実施形態では、ＢＣＬ－ｘＬおよび１つまたは複数の追加の初期化因子のコード配列は、共通のプロモーター（例えば２６Ｓプロモーター）の転写制御下にある。

一部の実施形態では、本明細書におけるアルファウイルスＲＮＡ発現構築物は、ＯＣＴファミリータンパク質、ＳＯＸファミリータンパク質、ＢＣＬ－ｘＬ、およびＭＹＣファミリータンパク質、ならびに任意選択でＫＬＦファミリータンパク質の発現を導く。

別の態様では、本開示は、本明細書において取得されたｉＰＳＣを分化促進剤の存在下で培養することを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化細胞を取得する方法を提供する。ｉＰＳＣから分化したことによって取得される分化細胞もまた提供される。一部の実施形態では、本明細書において取得される分化細胞は、任意選択で、Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞、抑制性Ｔ細胞、骨髄細胞、樹状細胞、および免疫抑制性マクロファージから選択されるヒト免疫細胞；任意選択で、ドーパミン作動性ニューロン、ミクログリア細胞、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、皮質ニューロン、脊髄もしくは動眼ニューロン、腸管ニューロン、プラコード由来細胞、シュワン細胞、および三叉神経もしくは感覚ニューロンから選択される、ヒト神経系における細胞；任意選択で、心筋細胞、内皮細胞、および結節細胞から選択される、ヒト心血管系における細胞；任意選択で、肝細胞、胆管細胞、および膵ベータ細胞から選択される、ヒト代謝系における細胞、または任意選択で、網膜色素上皮細胞、光受容錐体細胞（photoreceptor cone cell）、光受容桿体細胞（photoreceptor rod cell）、双極細胞、神経節細胞から選択される、ヒト視覚系における細胞、免疫細胞、神経細胞、心血管細胞、もしくは代謝系における細胞である。特定の実施形態では、分化細胞は外胚葉系列の細胞（例えばニューロン）である。他の特定の実施形態では、分化細胞は中胚葉系列の細胞（例えば心筋細胞）である。

本開示はまた、本明細書において取得される分化細胞と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。本開示はまた、処置を必要とする患者を処置する方法であって、医薬組成物を患者に投与することを含む、方法；処置を必要とする患者を処置するための医薬の製造のための分化細胞の使用；および処置を必要とする患者を処置することにおける使用のための分化細胞または医薬組成物を提供する。

本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明に明らかである。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態および態様を示しているが、例示としてのみ与えられており、限定ではないことが理解されるべきである。本発明の範囲内での様々な変更および修正は、当業者には詳細な説明から明らかとなるだろう。

７つの例示的なＶＥＥＶ ＲＮＡ初期化構築物（ＯＫＳ－ｉＢＭ、ＯＫＳ－ｉＧＭ、ＯＫＳ－ｉＧ、ＯＳＢ、ＯＳ－ｉＢ、ＯＳ－ｉＭ、およびＯＳ－ｉＢＭ）を示す概略図である。ｎｓＰ１～４：非構造タンパク質のコード配列。ＯＣＴ４：オクタマー結合転写因子４のコード配列。ＫＬＦ４：クルッペル様因子４のコード配列。ＳＯＸ２：ＳＲＹボックス転写因子２のコード配列。ＢＣＬ－ｘＬ：Ｂ細胞リンパ腫－巨大。ＧＬＩＳ１：Ｇｌｉｓファミリージンクフィンガー１のコード配列。ＩＲＥＳ：内部リボソーム進入部位。アスタリスクを有する灰色のバー：２Ａペプチドのコード配列。ＡＡＡ：ポリＡ配列。 ４つのＶＥＥ－ＥＰ－ｉＰＳＣ株であるＶＥＥ－ＥＰ－ｉＰＳＣ－１、－２、－３および－４それぞれにおける多能性関連マーカーの発現を示すフローサイトメトリーグラフである。ＶＥＥ－ＥＰ－ｉＰＳＣ－１、－２、－３および－４は、赤血球前駆（ＥＰ）細胞に、それぞれＯＫＳ－ｉＢＭ、ＯＫＳ－ｉＧＭ、ＯＫＳ－ｉＧ、およびエピソーム対照を電気穿孔により導入することによって生成した。ＥＢＮＡ ＯｒｉＰエピソーム対照は、初期化因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８、およびｐ５３ドミナントネガティブを含有した（Ｅｐｉ５（商標）エピソームｉＰＳＣ初期化キット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Okita et al., Nat Meth. (2011) 8:409-12）。フローサイトメトリーは、継代８の培養細胞において実施した。 図２－１と同じ。 図２－１と同じ。 図２－１と同じ。 図２－１と同じ。 図２－１と同じ。 図２－１と同じ。 図２－１と同じ。 図２－１と同じ。 図２－１と同じ。 図２－１と同じ。 図２－１と同じ。 ４つのＶＥＥ－ＥＰ－ｉＰＳＣ株を、初めに神経外胚葉系列を誘導し、次いで前駆体をニューロンの運命に成熟させることによって、１６日間分化させたことを示す棒グラフである。ＴＨ^＋ＦＯＸＡ２^＋ドーパミンニューロンをフローサイトメトリーによって定量した。ＴＨ：チロシンヒドロキシラーゼ。ＦＯＸＡ２：フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２。 ４つのＶＥＥ－ＥＰ－ｉＰＳＣ株を、ＷＮＴシグナル伝達の段階特異的調節により、心臓系列の方向に７日間分化させたことを示す棒グラフである。心筋細胞を、フローサイトメトリーによって心筋トロポニン（ｃＴＮＴ）について定量した。 ＥＰのＶＥＥ ＲＮＡ初期化の効率を示す図である。ＥＰに、図１に示した初期化構築物を電気穿孔により導入した。上の図２に関する記述のエピソーム対照を使用した。図５Ａは、ＴＲＡ－１－６０染色の全ウェル画像を示す写真のパネルである。図５Ｂは、ＴＲＡ－１－６０^＋コロニーを定量するグラフである。 野生型ＶＥＥＶ ＲＮＡゲノム配列のヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す図である（ただし、配列におけるＴは、ＲＮＡではＵである）。 図６－１と同じ。 図６－１と同じ。 図６－１と同じ。 組換えＶＥＥＶ ＲＮＡ発現ベクターのヌクレオチド配列（配列番号１５）を示す図である（ただし、配列におけるＴは、ＲＮＡではＵである）。この配列は、野生型配列に対する６つの変異（Ｃ３５２Ｇ、Ａ１５６４Ｇ、Ｃ１５６７Ａ、Ｔ１５７０Ｃ、Ｃ１６４７Ａ、およびＣ３９１７Ｔ）を含有する。クローニング部位はアスタリスクによって示される。 図６－５と同じ。 図６－５と同じ。 図６－５と同じ。

本開示は、血液由来細胞（例えば赤血球前駆体（erythroid progenitor））を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に初期化するための改良された方法を記載する。これらの方法は、初期化因子ＢＣＬ－ｘＬ、ならびに１つまたは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つ全ての）追加の初期化因子（例えば、ＯＣＴファミリーメンバー、ＫＬＦファミリーメンバー、ＳＯＸファミリーメンバー、ＭＹＣタンパク質、ＮＡＮＯＧタンパク質、ＧＬＩＳファミリーメンバー、ＬＩＮ２８タンパク質、およびｐ５３ドミナントネガティブ）をコードするアルファウイルス（例えばＶＥＥＶ）ＲＮＡ発現ベクター（すなわち、または発現構築物）の使用を伴う。アルファウイルスＲＮＡ発現構築物は、本明細書に記載される改良された方法を介して血液細胞に導入することができる。トランスフェクトされた細胞は、３週間未満で回収可能なｉＰＳＣとなる。

末梢血は、体細胞のｉＰＳＣへの初期化のための容易に利用可能な細胞源である。したがって、本方法は、ｉＰＳＣを生成する効率を大きく向上させる。宿主細胞に組み込まないＲＮＡベースの発現ベクターの使用のために、本方法によって取得されるｉＰＳＣは、レトロウイルスベクターを使用する従来の方法によって取得されるものよりも安全な臨床プロファイルを有する。

Ｉ．初期化因子を発現させるためのアルファウイルスＲＮＡ構築物
本開示のアルファウイルスＲＮＡ発現構築物は、自己複製型ＲＮＡレプリコンである。自己複製型ＲＮＡレプリコンまたは構築物とは、宿主細胞において自身の複製を導き得るような、非構造タンパク質遺伝子を発現するＲＮＡ分子を指す。これは、５’および３’アルファウイルス複製認識配列、ＲＮＡ複製および転写に不可欠であるアルファウイルス非構造タンパク質（例えば、ＶＥＥ ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４）のコード配列、ならびにポリアデニル化シグナル配列を含み得る。これは、初期化因子をコードする配列などの異種ＲＮＡ配列の発現を導くための１つまたは複数のエレメント（例えば、ＩＲＥＳ配列、コアまたはミニプロモーターなど）をさらに含有してもよい。

一部の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡ構築物は、（ｉ）複製に必要なＶＥＥＶ非構造タンパク質の遺伝子、（ｉｉ）５’および３’ウイルス複製認識配列、（ｉｉｉ）目的の初期化因子を発現するための発現カセット、例えばポリシストロン発現カセット、ならびに（ｉｖ）ポリアデニル化尾部を含むＶＥＥＶ ＲＮＡレプリコンである。Yoshioka 2013および2017, supraならびに国際公開第２０１３／１７７１３３号パンフレット、ならびに米国特許第１０，７９３，８３３号明細書、同第１０，３７０，６４６号明細書、および同第９，８６２，９３０号明細書もまた参照されたい。レプリコンは、ＶＥＥＶ構造タンパク質遺伝子を欠いていてもよい。自己複製型ＶＥＥ ＲＮＡ構築物は、限定された回数の細胞分裂の間、トランスフェクトされた細胞内で複製することができる。分解によるＲＮＡ構築物減少のタイミングは、Ｂ１８Ｒの培養培地からの除外によってさらに調節することができる。

例示的なＶＥＥＶ ＲＮＡ構築物は、ＢＣＬ－ｘＬおよび他の初期化因子を発現する。初期化因子とは、体細胞において過剰発現した場合に、細胞を分化状態から多能性状態に移行するように誘導するタンパク質である。本明細書において使用される初期化因子は、ヒトタンパク質または所望の生物学的効果を保持するその修飾型であり得る。

Ａ．ＢＣＬ－ｘＬ
ヒトＢＣＬ－ｘＬは、ＢＣＬ２Ｌ１遺伝子によってコードされる。例示的なヒトＢＣＬ－ｘＬアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ０７８１７に見出すことができ、以下のアミノ酸配列を有する。

このタンパク質の機能的アナログ、すなわち、同じかまたは実質的に同じ生物学的機能を有する（例えば、タンパク質の転写因子機能の７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上）を保持する）分子は、本開示によってＢＣＬ－ｘＬタンパク質として包含される。例えば、機能的アナログは、例えば上記タンパク質の一部を追加のアミノ酸残基と共にもしくはそれを伴わずに含有する、および／または上記タンパク質に対する変異を含有する、上記タンパク質のアイソフォームまたはバリアントであり得る。一部の実施形態では、機能的アナログは、配列番号１に対して少なくとも９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有する。２つのアミノ酸配列の（または２つの核酸配列の）同一性パーセントは、例えばＢＬＡＳＴ（登録商標）によって、初期パラメータを使用して（米国立医学図書館の米国立生物工学情報センターのウェブサイトにおいて利用可能）、取得することができる。一部の実施形態では、比較目的でアラインメントされる参照配列の長さは、その参照配列の少なくとも３０％、（例えば、少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、または９０％である。

ある特定の実施形態では、本明細書における構築物によって発現されるＢＣＬ－ｘＬタンパク質は以下の配列を有し、ここで、四角で囲まれた残基は、プロセシング後の２Ａ自己切断ペプチド由来のレムナントである（異なる自己切断ペプチドは、異なるレムナントを残すか、またはレムナントを残さない場合がある）。

Ｂ．ＯＣＴファミリーメンバー
例示的なＶＥＥＶ構築物は、Ｏｃｔファミリータンパク質（例えば、ＯＣＴ１、ＯＣＴ２、ＯＣＴ４、ＯＣＴ６、ＯＣＴ７、ＯＣＴ８、ＯＣＴ９、およびＯＣＴ１１）のコード配列を含み得る。例えば、米国特許第８，２７８，１０４号明細書および国際公開第２０１３／１７７１３３号パンフレットを参照されたい。ヒトＯＣＴ４は、ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子によってコードされる。例示的なヒトＯＣＴ４アミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ０１８６０に見出すことができ、以下のアミノ酸配列を有する。

このタンパク質の機能的アナログ、すなわち、同じかまたは実質的に同じ生物学的機能を有する（例えば、タンパク質の転写因子機能の７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上を保持する）分子は、本開示によってＯＣＴ４タンパク質として包含される。例えば、機能的アナログは、例えば上記タンパク質の一部を追加のアミノ酸残基と共にもしくはそれを伴わずに含有する、および／または上記タンパク質に対する変異を含有する、上記タンパク質のアイソフォームまたはバリアントであり得る。一部の実施形態では、機能的アナログは、配列番号３に対して少なくとも９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有する。

ある特定の実施形態では、本明細書における構築物によって発現されるＯＣＴ４タンパク質は以下の配列を有し、ここで、四角で囲まれた残基は、プロセシング後の２Ａ自己切断ペプチド由来のレムナントである（異なる自己切断ペプチドは、異なるレムナントを残すか、またはレムナントを残さない場合がある）。

Ｃ．ＫＬＦファミリーメンバー
例示的なＶＥＥＶ構築物は、ＫＬＦファミリータンパク質（例えば、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ３、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ＫＬＦ６、ＫＬＦ７、ＫＬＦ８、ＫＬＦ９、ＫＬＦ１０、ＫＬＦ１１、ＫＬＦ１２、ＫＬＦ１３、ＫＬＦ１４、ＫＬＦ１５、ＫＬＦ１６、およびＫＬＦ１７）のコード配列を含み得る。例えば、米国特許第８，２７８，１０４号明細書および国際公開第２０１３／１７７１３３号パンフレットを参照されたい。ヒトＫＬＦ４は、ＫＬＦ４遺伝子によってコードされる。例示的なヒトＫＬＦ４アミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｏ４３４７４に見出すことができ、以下のアミノ酸配列を有する。

このタンパク質の機能的アナログ、すなわち、同じかまたは実質的に同じ生物学的機能を有する（例えば、タンパク質の転写因子機能の７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上を保持する）分子は、本開示によってＫＬＦ４タンパク質として包含される。例えば、機能的アナログは、例えば上記タンパク質の一部を追加のアミノ酸残基と共にもしくはそれを伴わずに含有する、および／または上記タンパク質に対する変異を含有する、上記タンパク質のアイソフォームまたはバリアントであり得る。一部の実施形態では、機能的アナログは、配列番号５に対して少なくとも９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＥＳＳＲＢがＫＬＦタンパク質の代わりに使用され得る。一部の実施形態では、ＫＬＦ４タンパク質は、配列番号５のアイソフォームであり、以下に示す配列番号６のアミノ酸残基２～４７１を含む。

ある特定の実施形態では、本明細書における構築物によって発現されるＫＬＦ４タンパク質は以下の配列を有し、ここで、四角で囲まれた残基は、プロセシング後の２Ａ自己切断ペプチド由来のレムナントである（異なる自己切断ペプチドは、異なるレムナントを残すか、またはレムナントを残さない場合がある）。

Ｄ．ＳＯＸファミリーメンバー
例示的なＶＥＥＶ構築物は、ＳＯＸファミリータンパク質（例えば、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＳＯＸ４、ＳＯＸ５、ＳＯＸ６、ＳＯＸ７、ＳＯＸ８、ＳＯＸ９、ＳＸＯ１０、ＳＯＸ１１、ＳＯＸ１２、ＳＯＸ１３、ＳＯＸ１４、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ２１、およびＳＯＸ３０）のコード配列を含み得る。例えば、米国特許第８，２７８，１０４号明細書および国際公開第２０１３／１７７１３３号パンフレットを参照されたい。ヒトＳＯＸ２は、ＳＯＸ２遺伝子によってコードされる。例示的なヒトＳＯＸ２アミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ４８４３１に見出すことができ、以下のアミノ酸配列を有する。

このタンパク質の機能的アナログ、すなわち、同じかまたは実質的に同じ生物学的機能を有する（例えば、タンパク質の転写因子機能の７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上を保持する）分子は、本開示によってＳＯＸ２タンパク質として包含される。例えば、機能的アナログは、例えば上記タンパク質の一部を追加のアミノ酸残基と共にもしくはそれを伴わずに含有する、および／または上記タンパク質に対する変異を含有する、上記タンパク質のアイソフォームまたはバリアントであり得る。一部の実施形態では、機能的アナログは、配列番号７に対して少なくとも９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有する。

ある特定の実施形態では、本明細書における構築物によって発現されるＳＯＸ２タンパク質は以下の配列を有し、ここで、四角で囲まれた残基は、プロセシング後の２Ａ自己切断ペプチド由来のレムナントである（異なる自己切断ペプチドは、異なるレムナントを残すか、またはレムナントを残さない場合がある）。

Ｅ．ＭＹＣファミリーメンバー
例示的なＶＥＥＶ構築物は、ＭＹＣファミリータンパク質（例えば、ｃ－ＭＹＣ、ｎ－ＭＹＣ、およびｌ－ＭＹＣ）のコード配列を含み得る。例えば、米国特許第８，２７８，１０４号明細書を参照されたい。ヒトｃ－ＭＹＣは、ＭＹＣ遺伝子によってコードされる。例示的なヒトｃ－ＭＹＣアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１１０６に見出すことができ、以下のアミノ酸配列を有する。

このタンパク質の機能的アナログ、すなわち、同じかまたは実質的に同じ生物学的機能を有する（例えば、タンパク質の転写因子機能の７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上を保持する）分子は、本開示によってｃ－ＭＹＣタンパク質として包含される。例えば、機能的アナログは、例えば上記タンパク質の一部を追加のアミノ酸残基と共にもしくはそれを伴わずに含有する、および／または上記タンパク質に対する変異を含有する、上記タンパク質のアイソフォームまたはバリアントであり得る。一部の実施形態では、機能的アナログは、配列番号９に対して少なくとも９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、低下した形質転換活性を有するＭＹＣバリアントがｃ－ＭＹＣの代わりに使用され得る。例えば、米国特許第９，００５，９６７号明細書を参照されたい。

ある特定の実施形態では、本明細書における構築物によって発現されるｃ－ＭＹＣタンパク質は以下の配列を有し、ここで、四角で囲まれた残基は、プロセシング後の２Ａ自己切断ペプチド由来のレムナントである（異なる自己切断ペプチドは、異なるレムナントを残すか、またはレムナントを残さない場合がある）。

Ｆ．ＧＬＩＳファミリーメンバー
例示的なＶＥＥＶ構築物は、ＧＬＩＳファミリータンパク質（例えば、ＧＬＩＳ１、ＧＬＩＳ２、およびＧＬＩＳ３）のコード配列を含み得る。例えば、米国特許第８，９５１，８０１号明細書を参照されたい。ヒトＧＬＩＳ１は、ＧＬＩＳ１遺伝子によってコードされる。例示的なヒトＧＬＩＳ１アミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ８ＮＢＦ１に見出すことができ、以下のアミノ酸配列を有する。

このタンパク質の機能的アナログ、すなわち、同じかまたは実質的に同じ生物学的機能を有する（例えば、タンパク質の転写因子機能の７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上を保持する）分子は、本開示によってＧＬＩＳ１タンパク質として包含される。例えば、機能的アナログは、例えば上記タンパク質の一部を追加のアミノ酸残基と共にもしくはそれを伴わずに含有する、および／または上記タンパク質に対する変異を含有する、上記タンパク質のアイソフォームまたはバリアントであり得る。一部の実施形態では、機能的アナログは、配列番号１１に対して少なくとも９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有する。

Ｇ．ＮＡＮＯＧ
本ＶＥＥＶ構築物は、ＮＡＮＯＧのコード配列を含み得る。例えば、米国特許第９，５０６，０３９号明細書を参照されたい。ヒトＮＡＮＯＧは、ＮＡＮＯＧ遺伝子によってコードされる。例示的なヒトＮＡＮＯＧアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９Ｈ９Ｓ０に見出すことができ、以下のアミノ酸配列を有する。

この配列の機能的アナログ、すなわち、上記タンパク質の同じかまたは実質的に同じ生物学的機能を有する（例えば、タンパク質の転写因子機能の７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上を保持する）分子は、本開示によってＮＡＮＯＧタンパク質として包含される。例えば、機能的アナログは、例えば上記タンパク質の一部を追加のアミノ酸残基と共にもしくはそれを伴わずに含有する、および／または上記タンパク質に対する変異を含有する、上記タンパク質のアイソフォームまたはバリアントであり得る。一部の実施形態では、機能的アナログは、配列番号１２に対して少なくとも９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有する。

Ｈ．ＬＩＮ２８タンパク質
本ＶＥＥＶ構築物は、ＬＩＮ２８タンパク質（例えば、ＬＩＮ２８ＡまたはＬＩＮ２８Ｂ）のコード配列を含み得る。例えば、米国特許第９，５０６，０３９号明細書を参照されたい。ヒトＬＩＮ２８Ｂは、ＬＩＮ２８Ｂ遺伝子によってコードされる。例示的なヒトＬＩＮ２８Ｂアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ１Ｂ０ＧＶＤ３に見出すことができ、以下のアミノ酸配列を有する。

この配列の機能的アナログ、すなわち、上記タンパク質の同じかまたは実質的に同じ生物学的機能を有する（例えば、タンパク質の転写因子機能の７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上を保持する）分子は、本開示によってＬＩＮ２８Ｂタンパク質として包含される。例えば、機能的アナログは、例えば上記タンパク質の一部を追加のアミノ酸残基と共にもしくはそれを伴わずに含有する、および／または上記タンパク質に対する変異を含有する、上記タンパク質のアイソフォームまたはバリアントであり得る。一部の実施形態では、機能的アナログは、配列番号１３に対して少なくとも９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有する。

本明細書に記載される初期化因子の例示的な機能的アナログは、例えば、その開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれるYang et al., Asian J Andrology (2015) 17:394-402に記載されている。

Ｉ．ＲＮＡ発現構築物
一部の実施形態では、初期化因子のコード配列は、それぞれが自身のプロモーター（例えば２６Ｓプロモーター）と他の転写調節エレメントとを有する１つまたは複数の発現カセットに組み入れられていてもよい。

一部の実施形態では、初期化因子のコード配列は、共通のプロモーター（例えば、２６ＳまたはＳＰ６プロモーター）から転写されるように、ポリシストロン発現カセットにインフレームで配置されていてもよい。これらのコード配列は、ポリシストロンカセットからのｍＲＮＡ転写物の翻訳が別個のタンパク質をもたらすように、翻訳スキップ配列（すなわち、自己切断ペプチドのインフレームコード配列）によって分離されていてもよい。自己切断ペプチドは、翻訳中にリボソームスキップを引き起こす。自己切断ペプチドの例は、１８～２２アミノ酸の典型的な長さを有するウイルス由来ペプチドの２Ａペプチドである。２Ａペプチドには、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、およびＰＱＲ（Lo et al., Cell Reports (2015) 13:2634-2644）が含まれる。例として、Ｐ２Ａは１９アミノ酸のペプチドであり、切断後、Ｐ２Ａ由来の数個のアミノ酸残基が上流の遺伝子に残り、プロリンが第２の遺伝子の先頭に残される。初期化因子のコード配列はまた、ｍＲＮＡにおいて、代わりに内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離されていてもよい。ＩＲＥＳもまた、共通のＲＮＡ転写物から別個のポリペプチドの翻訳を可能にする。プロセシングされたポリペプチドに残される２Ａ残基は、ポリペプチドの機能性に影響を及ぼさない。

例として、アルファウイルスＲＮＡ構築物は、５’から３’に向かって、［アルファウイルス５’ＵＴＲ］－［アルファウイルスＲＮＡレプリカーゼの遺伝子］－［プロモーター］－［初期化因子１コード配列］－［２Ａペプチドコード配列］－［初期化因子２コード配列］－［２Ａペプチドコード配列］－［初期化因子３コード配列］－［ＩＲＥＳまたはコアプロモーター］－［初期化因子４コード配列］－［２Ａペプチドコード配列］－［初期化因子５］－［任意選択の選択マーカー］－［アルファウイルス３’ＵＴＲおよびポリＡ尾部］を含み得る。ポリＡ尾部の長さは可変であってもよく（例えば、１０～２００個超のアデノシン）、初期化因子の順序は、ＲＮＡ構築物の初期化機能に影響を及ぼすことなく変化させることができる。ポリシストロン初期化因子発現カセットのプロモーターは、例えば、２６Ｓ内部プロモーターであり得る。一部の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡ構築物はＶＥＥＶ ＲＮＡ構築物であり、そのレプリカーゼの遺伝子はＶＥＥＶ ＲＮＡレプリカーゼ１、２、３、および４である。

一部の実施形態では、アルファウイルス（例えばＶＥＥＶ）ＲＮＡ構築物は、任意選択で、５’から３’に向かって、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４のコード配列と、初期化因子の組合せ、例えば（ｉ）ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＢＣＬ－ｘＬ、およびｃ－Ｍｙｃ、（ｉｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＢＣＬ－ｘＬ、およびｃ－ＭＹＣ、または（ｉｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＢＣＬ－ｘＬを発現するためのポリシストロン発現カセットとを含む、図１に示すような構造を有し得る。ポリシストロン発現カセットにおいて、発現カセットは２６Ｓプロモーターの転写制御下にあってもよい、および／または初期化因子のコード配列は、ＩＲＥＳ配列もしくは自己切断２Ａペプチドのコード配列によって分離されていてもよい（ＩＲＥＳの位置の非限定的な例を図１に示す）。

アルファウイルス（例えばＶＥＥＶ）ＲＮＡ構築物は、ＤＮＡ鋳型（例えばＤＮＡプラスミド構築物）から作製され得る。例として、ＲＮＡ構築物は、ＳＰ６（またはＴ７）ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写キットを使用することによってＤＮＡ鋳型から転写され得る。

ＶＥＥＶのいかなる株も、本ＲＮＡ構築物に骨格を提供するために使用することができる。例えば、ＶＥＥＶのＴＣ－８３株が使用されてもよい。この株は、ｎｓＰ２にＰ７７３Ｓ変異を含有し、その結果、形質導入された細胞に対して低下した細胞変性効果を有する。１つまたは複数のｎｓタンパク質における他のまたは追加の変異が、ＲＮＡ複製および発現を向上させるため、ならびに／またはＲＮＡゲノムに対する免疫応答を減弱させるために導入されてもよい。例えば、ＶＥＥＶ ＲＮＡ発現構築物は、図６Ｂに示す変異のうちの１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、もしくは６つ全て）を含むことができる。さらに、ＶＥＥＶの代わりに、他のアルファウイルスもまた、初期化自己複製型ＲＮＡ構築物に骨格を提供するために使用することができる。ＲＮＡ構築物が基づき得る他のアルファウイルスの非限定的な例は、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（Everglades virus）、ムカンボウイルス（Mucambo virus）、ピクスナウイルス（Pixuna virus）および西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ミデルブルフウイルス（Middelburg virus）、チクングニアウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、バーマ森林ウイルス、ゲタウイルス、サギヤマウイルス、ベバルウイルス（Bebaru virus）、マヤロウイルス、ウナウイルス（Una virus）、アウラウイルス（Aura virus）、ワタロアウイルス（Whataroa virus）、ババンキウイルス（Babanki virus）、キジルアガシュウイルス（Kyzylagach virus）、ハイランドＪウイルス（Highlands J virus）、フォートモーガンウイルス（Fort Morgan virus）、ンドゥムウイルス（Ndumu virus）およびバギークリークウイルス（Buggy Creek virus）である。ＲＮＡ構築物は、２つ以上のアルファウイルスからの配列を含有してもよい。

ＩＩ．ＲＮＡ構築物を使用した造血系列の細胞からのｉＰＳＣの生成
本方法は血液細胞を、人工多能性幹細胞になるように効率的に初期化（または「脱分化」と称される）する。

本明細書で使用する場合、「多能性の」または「多能性」という用語は、細胞の、自己複製して、３つの胚葉：内胚葉、中胚葉、または外胚葉のいずれかの細胞に分化する能力を指す。「多能性幹細胞」または「ＰＳＣ」には、例えば、胚盤胞の内部細胞塊から得られるかまたは体細胞核移植によって得られる胚性幹細胞、および非多能性細胞から得られるｉＰＳＣが含まれる。

「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」という用語は、成体体細胞、部分分化細胞または最終分化細胞などの非多能性細胞、例えば、線維芽細胞、造血系列の細胞、筋細胞、ニューロン、表皮細胞などに１つまたは複数の初期化因子を導入するかまたは接触させることによって、それらの細胞から人工的に調製される多能性幹細胞の種類を指す。

ＰＳＣ誘導の開始細胞集団は、細胞療法を必要とする患者または健康なドナーの血液（例えば末梢血）から取得することができる。末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）は、従来の方法によって単離することができ、次いで、細胞のサブセット、例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、ナチュラルキラー細胞、好中球、好酸球、樹状細胞、ならびに様々な造血前駆細胞、例えば、赤血球前駆体、リンパ球前駆体（lymphoid progenitor）、および骨髄前駆体を取得するためにさらに分画および／または濃縮することができる。

一部の実施形態では、赤血球前駆細胞について濃縮された細胞集団を取得するために、ＰＭＢＣは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＩＬ－３が補充された基礎培地（例えば、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ ＩＩ培地、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において一定の期間（例えば、３～１０日間、例えば６、７、または８日間）培養される。培養培地には、例えば、０．５～５（例えば、１、２、３、または４）ＩＵ／ｍＬのＥＰＯ、５０～２００（例えば、７５、１００、１２５、１５０、または１７５）ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および１～１０（例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９）ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３が補充され得る。赤血球前駆体増殖を促進する他の因子、例えば、組換えヒトインスリン、鉄飽和ヒトトランスフェリン、硝酸鉄、ヒドロコルチゾンもまた使用され得る。例えば、Neildez-Nguyen et al., Nat Biotechnol. (2002) 20:467-72、およびFilippone et al., PLoS One (2010) 5(3):e9496を参照されたい。赤血球前駆体はさらに、例えば、ＣＤ７１およびＣＤ３６などの赤血球前駆体マーカーに結合する試薬（例えば抗体）を使用する蛍光または磁気活性化細胞選別によって細胞培養から単離することができる。

一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、１ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ、約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および約５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３の存在下で培養される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、１ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ、約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３の存在下で培養される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、１ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ、約１５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および約５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３の存在下で培養される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、１ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ、約１５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３の存在下で培養される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、１ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ、約２００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および約５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３の存在下で培養される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、１ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ、約２００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３の存在下で培養される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、３ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ、約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および約５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３の存在下で培養される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、３ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ、約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３の存在下で培養される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、３ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ、約１５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および約５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３の存在下で培養される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、３ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ、約１５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３の存在下で培養される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、３ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ、約２００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および約５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３の存在下で培養される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、３ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ、約２００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３の存在下で培養される。これらの実施形態では、培養は、６、７、または８日間行われ得る。

血液細胞の他のサブセットもまた、細胞培養を介した分画および／または濃縮によって取得することができる。血液細胞の特定のサブセットに関するマーカーは周知であり、例えば、Ｔリンパ球に関してはＣＤ３であり、Ｂ細胞に関してはＣＤ１９およびＣＤ２０である。

本ＲＮＡ構築物は、マイクロインジェクション、電気穿孔、バイオリスティック微粒子送達（biolistic particle delivery）、リポフェクション、カチオン性ポリマー、およびリン酸カルシウム沈殿を含むいくつかの技法によって体細胞集団に導入することができる。一部の実施形態では、本ＲＮＡ構築物は電気穿孔により体細胞（例えば、造血前駆細胞およびリンパ球）に導入される。アルファウイルスのベクターとしての使用は、インターフェロン（ＩＦＮ）による自然免疫応答によって阻害され得ることが公知であるが、細胞の抗ウイルス応答を阻害し、それによって細胞において所望のレプリコン活性を可能にするために、Ｂ１８ＲまたはＢ１９ＲなどのＩ型ＩＦＮ阻害薬が使用されてもよい。一部の実施形態では、アルファウイルス（例えばＶＥＥＶ）送達およびその後の複製を容易にするために、ならびに／またはトランスフェクトされた細胞における細胞のインターフェロン応答を抑制するために、細胞は、電気穿孔の前にＢ１８Ｒタンパク質を用いて処理されてもよい。電気穿孔された細胞は、Ｂ１８Ｒの存在下で２～３週間培養されてもよく、その間にｉＰＳＣが発生し、回収可能となる。ｉＰＳＣは、ＴＲＡ－１－６０、ＮＡＮＯＧ、ＳＳＥＡ３、およびＳＳＥＡ４などのマーカーによって検出され得る。一部の実施形態では、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）などの培養培地は、電気穿孔後の細胞の生存を促進するために、電気穿孔細胞懸濁緩衝液として使用され得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ構築物は、アルファウイルスビリオンにパッケージングされてもよく、ビリオンは、初期化される細胞に形質導入するために使用される。

ｉＰＳＣを維持する方法は当技術分野で周知であり、そのような方法の多くは、胚性幹細胞を維持する方法と類似している。例えば、Thomson et al., Science (1998) 282(5391):1145-7、Hovatta et al., Human Reprod. (2003) 18(7):1404-09、Ludwig et al., Nature Methods (2006) 3:637-46、Kennedy et al., Blood (2007) 109:2679-87、Chen et al., Nature Methods (2011) 8:424-9、およびWang et al., Stem Cell Res. (2013) 11(3):1103-16を参照されたい。ｉＰＳＣはまた、使用前に凍結保存されていてもよい。

ＩＩＩ．ｉＰＳＣの標的細胞型への分化
ｉＰＳＣは、多くの異なる疾患を有する患者において、再生医療のために送達され得る多数の特定の細胞型の潜在的な生成における出発点である。ｉＰＳＣの文脈において、分化とは、ｉＰＳＣから開始される細胞特異的プロトコルを使用した系列特化のプロセスである。本方法によって取得されるｉＰＳＣは、内胚葉、外胚葉および中胚葉系列における細胞を含む、細胞療法のための目的の細胞型に分化することができる。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、目的の細胞型への分化の前に、初めに（例えば、患者に欠損している機能性タンパク質を産生するように、治療タンパク質を産生するように、自殺スイッチを含むように、または免疫検出を逃れ、それによって同種適用を支持するように）遺伝子操作されていてもよい。ｉＰＳＣの様々な系列の細胞への分化およびその増殖を誘導するための方法は当技術分野で周知である。分化細胞型の非限定的な例を以下に記載する。

Ａ．免疫細胞
任意選択で遺伝子改変されているｉＰＳＣは、リンパ球様細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞）、骨髄細胞（例えば、顆粒球、単球／マクロファージ、および組織常在性マクロファージ、例えばミクログリア）、および樹状細胞（例えば、骨髄系樹状細胞および形質細胞様樹状細胞）などの免疫細胞に分化してもよい。一部の実施形態では、遺伝子改変された細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞またはＣＡＲ Ｔ細胞である。遺伝子改変された免疫細胞はまた、ＨＬＡ－ＧまたはＨＬＡ－Ｅなどの免疫調節性導入遺伝子を発現してもよい。

例えば、ＰＳＣの樹状細胞への分化を誘導するための方法は、Slukvin et al., J Imm. (2006) 176:2924-32、Su et al., Clin Cancer Res. (2008) 14(19):6207-17、およびTseng et al., Regen Med. (2009) 4(4):513-26に記載されている。ＰＳＣを造血前駆細胞、骨髄系列の細胞、およびＴリンパ球に誘導するための方法は、例えば、Kennedy et al., Cell Rep. (2012) 2:1722-35に記載されている。ＰＳＣをマクロファージに誘導するための方法は、van Wilgenburg et al., PLoS One (2013) 8(8):e71098に記載されている。

免疫抑制性免疫細胞（例えば、制御性Ｔ細胞および免疫抑制性マクロファージ）などの免疫細胞は、関節リウマチ、多発性硬化症、慢性リンパ性甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、慢性潰瘍性大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、グッドパスチャー症候群、全身性エリテマトーデス、全身性血管炎、強皮症、自己免疫性溶血性貧血、および自己免疫性甲状腺疾患を含むがこれらに限定されない自己免疫疾患を有する患者に移植することができる。免疫細胞ベースの療法はまた、線維症などの移植に関連する症状の処置を含む、移植時の移植片拒絶を処置することに使用されてもよい。

Ｂ．神経細胞
任意選択で遺伝子改変されているｉＰＳＣは、どの特定のニューロンの亜型かを問わないニューロンおよびニューロン前駆体細胞（例えば、ドーパミン作動性ニューロン、腸管ニューロン、介在ニューロン、および皮質ニューロン）；どの特定のグリア亜型かを問わないグリア細胞およびグリア前駆体細胞（例えば、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、単能性（dedicated）オリゴデンドロサイト前駆体細胞、およびアストロサイトとオリゴデンドロサイトとを生じ得る両能性（bipotent）グリア前駆体）；ならびにミクログリアおよびミクログリア前駆体細胞を含むがこれらに限定されない神経細胞に分化してもよい。脊髄または動眼ニューロン、腸管ニューロン、プラコード由来細胞、シュワン細胞、および三叉神経または感覚ニューロンもまた企図される。

神経細胞は、神経変性疾患を有する患者を含むがこれに限定されない患者に移植することができる。神経変性疾患の例は、とりわけ、パーキンソン病、アルツハイマー病、認知症、てんかん、レビー小体症候群、ハンチントン病、脊髄性筋委縮症、フリードライヒ運動失調症、筋萎縮性側索硬化症、バッテン病、および多系列萎縮症、白質ジストロフィー、横断性脊髄炎、視神経脊髄炎、リソソーム蓄積障害（例えば、ハーラー症候群、ファブリー病、ゴーシェ病、スライ症候群、ＧＭ１およびＧＭ２ガングリオシドーシス、ハンター症候群、ニーマン・ピック病、サンフィリポ症候群）、タウオパチーである。

これらの疾患の多くにおいて、ｉＰＳＣは初めに、二重ＳＭＡＤ阻害を介して初期神経細胞運命を採用するように導かれ得る（Chambers et al., Nat Biotechnol. (2009) 27(3):275-80）。初期神経細胞は前部の特徴を採用するため、追加のシグナルの非存在は、前部／前脳皮質細胞をもたらし得る。尾側化シグナルを遮断して、それが行われなかった場合にはより後部の特徴を有する培養を生成し得るパラクリンシグナルを予防することができる（例えば、ＸＡＶ９３９はＷＮＴを遮断することができ、ＳＵ５４０２はＦＧＦシグナルを遮断することができる）。背側皮質ニューロンはＳＨＨ活性化を遮断することによって作製することができる一方、腹側皮質ニューロンはＳＨＨ活性化を介して作製することができる。セロトニン作動性ニューロンまたは脊髄運動ニューロンなどのより尾側の細胞型は、ＦＧＦおよび／またはＷＮＴシグナルの添加を介して培養を尾側化することによって作製することができる。一部の細胞型では、培養を後部化するためにレチノイン酸（別の尾側化剤）が添加されてもよい。グリア細胞型の産生は、概して、初期神経細胞と同じパターン化に従った後に、ＦＧＦ２および／またはＥＧＦ含有培地における長期培養を行ってもよい。ＰＮＳ細胞型は、時宜を得たＷＮＴシグナルを分化プロセスの初期に伴うことを除いては同じ一般原則に従ってもよい。

神経細胞は、当該損傷組織に配置されたカニューレを介して患者に導入することができる。細胞調製物は、支持培地に入れられ、調製物を正確に送達することができるシリンジまたはピペット様装置に充填され得る。次いで、通例、送達を的確に標的とする定位固定法を使用して、カニューレが患者の神経系に配置され得る。次いで、細胞は、適合性の速度で組織に排出され得る。

Ｃ．心血管細胞
任意選択で遺伝子改変されているｉＰＳＣは、特定の心筋細胞亜型を含む心筋細胞（例えば、心室または心房）、心臓線維芽細胞、心臓平滑筋細胞、心外膜細胞、心内膜細胞、心内皮細胞、プルキンエ線維、ならびに結節およびペースメーカー細胞などの心血管系における細胞に分化してもよい。例えば、Kattman et al., Cell Stem Cell (2011) 8(2):228-40、Lian et al., PNAS (2012) 109:e1848-57、Lee et al., Cell Stem Cell (2017) 21:179-94に示されているように、ならびに国際公開第２０１６／１３１１３７号パンフレット、国際公開第２０１８／０９８５９７号パンフレット、および米国特許第９，４５３，２０１号明細書に示されているように、ｉＰＳＣを心筋細胞に分化させるための方法は多数存在する。当技術分野における任意の好適な方法が、ＰＳＣ由来心筋細胞を取得するために、本明細書における方法と共に使用することができる。

一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、１つまたは複数の心臓分化培地においてインキュベートされる。例えば、培地は、様々な濃度の骨形成タンパク質（ＢＭＰ、例えばＢＭＰ４）およびアクチビン（例えばアクチビンＡ）を含有し得る。所望の心筋細胞分化を達成するために必要な最適濃度を決定するために、分化因子濃度の滴定が実施されてもよい。

一部の実施形態では、分化心筋細胞は、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）および／またはミオシン軽鎖２ｖ（ＭＬＣ２ｖ）のうちの１つまたは複数を発現する。一部の実施形態では、未熟心筋細胞は、トロポニンＴ、心筋トロポニンＩ、アルファアクチニンおよび／またはベータミオシン重鎖のうちの１つまたは複数を発現する。

Ｄ．代謝系における細胞
任意選択で遺伝子改変されているｉＰＳＣは、ヒト代謝系に関与する細胞に分化してもよい。例えば、細胞は、胃腸系の細胞（例えば、肝細胞、胆管細胞、および膵ベータ細胞）、造血系の細胞、および中枢神経系の細胞（例えば、下垂体ホルモン放出細胞）であり得る。例として、下垂体ホルモン放出細胞を生成するために、ｉＰＳＣをＢＭＰ４およびＳＢ４３１５４２（アクチビンシグナル伝達を遮断する）と共に培養し、その後ＳＨＨ／ＦＧＦ８およびＦＧＦ１０を添加し；次いで、細胞を、ＳＨＨ／ＦＧＦ８およびＦＧＦ１０のみに長期間供した後、ＦＧＦ８またはＢＭＰ（またはその両方）に供して、細胞を特定のホルモン放出胞になるように誘導する。例えば、Zimmer et al., Stem Cell Reports (2016) 6:858-72を参照されたい。

Ｅ．視覚系における細胞
任意選択で遺伝子改変されているｉＰＳＣは、視覚系における細胞に分化してもよい。例えば、細胞は、網膜前駆細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）前駆細胞、ＲＰＥ細胞、神経網膜前駆細胞、光受容前駆細胞、光受容細胞、双極細胞、水平細胞、神経節細胞、アクマリン細胞、ミュラーグリア細胞、錐体細胞、または桿体細胞であり得る。ｉＰＳＣをＲＰＥ細胞に分化させる方法は、例えば、国際公開第２０１７／０４４４８３号パンフレットに記載されている。ＲＰＥ細胞を単離するための方法は、例えば、国際公開第２０１７／０４４４８８号パンフレットに記載されている。ｉＰＳＣを神経網膜前駆細胞に分化させるための方法は、国際公開第２０１９／２０４８１７号パンフレットに記載されている。網膜前駆細胞およびＲＰＥ細胞を同定および単離するための方法は、例えば、国際公開第２０１１／０２８５２４号パンフレットに記載されている。

ＩＶ．医薬組成物および使用
本明細書に記載されるｉＰＳＣ由来細胞は、細胞と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物において提供することができる。薬学的に許容される担体は、任意選択でいかなる動物由来成分も含有しない細胞培養培地であり得る。保存および輸送のために、細胞は、－７０℃未満（例えば、ドライアイス上または液体窒素中）で凍結保存されてもよい。使用前、細胞は、解凍され、目的の細胞型を支持する滅菌細胞培地に希釈され得る。

細胞は、患者に全身投与（例えば、静脈内注射または注入を介して）されても、局所投与（例えば、局所組織、例えば、心臓、脳、および損傷組織部位への直接注射を介して）されてもよい。冠動脈内投与、心筋内投与、経心内膜投与、または頭蓋内投与を含むがこれらに限定されない、細胞を患者の組織または臓器に投与するための様々な方法は、当技術分野で公知である。

治療有効数のｉＰＳＣ由来細胞が患者に投与される。本明細書で使用する場合、「治療有効」という用語は、疾患、障害、および／または状態に罹患しているかまたは罹患しやすいヒト対象に投与される場合に、疾患、障害、および／または状態の症状の発症または進行を処置、予防、および／または遅延するのに十分な、細胞の数または医薬組成物の量を指す。当業者であれば、治療有効量が、典型的には少なくとも１単位用量を含む投与計画を介して投与されることを理解するだろう。

本明細書に別段の定義がない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。例示的な方法および材料は以下に記載されるが、本明細書に記載されるものと類似しているかまたは同等の方法および材料もまた、本開示の実施または試験において使用することができる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先する。概して、本明細書に記載される、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子学、分析化学、合成有機化学、医薬品および創薬化学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、ならびにそれらの技法は、当技術分野で周知かつ一般的に使用されているものである。酵素反応および精製技法は、当技術分野で一般的に遂行されているように、または本明細書に記載されるように、製造業者の仕様書に従って実施される。さらに、文脈上別段の要件がない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。本明細書および実施形態全体にわたって、「有する（have）」および「含む（comprise）」という単語、または「有する（has）」、「有すること（having）」、「含む（comprises）」もしくは「含むこと（comprising）」などの活用形は、記載された整数または整数群を含むが、任意の他の整数も整数群も除外されないことを意味すると理解されるだろう。本明細書において言及した全ての刊行物および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。いくつかの文献が本明細書に引用されているが、この引用は、これらの文献のいずれかが当技術分野における通常の一般的知識の一部を形成していることを承認するものではない。

本発明をより良好に理解できるように、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、例示のみを目的としており、いかなる点においても本発明の範囲を限定していると解釈されるべきではない。

[実施例１]
ＶＥＥＶ設計およびＲＮＡ合成
この実施例は、ポリシストロンＶＥＥＶ ＲＮＡ構築物の設計およびそれらの合成を記載する。以下の研究において使用した構築物は、Yoshioka, 2013, supraに記載されているＶＥＥＶ ＲＮＡ骨格配列をベースとした。その骨格配列は、ＶＥＥＶの４つの非構造タンパク質をコードする。サブゲノム配列を改変して、様々な組合せの初期化核因子を発現させた（図１）。ＲＮＡ構築物ＯＫＳ－ｉＢＭは、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＢＣＬ－ｘＬ、およびｃ－ＭＹＣをコードする。ＲＮＡ構築物ＯＫＳ－ｉＧＭは、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＧＬＩＳ１、およびｃ－ＭＹＣをコードする。ＲＮＡ構築物ＯＫＳ－ｉＧは、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、およびＧＬＩＳ１をコードする。ＲＮＡ構築物ＯＳＢは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＢＣＬ－ｘＬをコードする。ＲＮＡ構築物ＯＳ－ｉＢは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＢＣＬ－ｘＬをコードする。ＲＮＡ構築物ＯＳ－ｉＭは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびｃ－ＭＹＣをコードする。ＲＮＡ構築物ＯＳ－ｉＢＭは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＢＣＬ－ｘＬおよびｃ－ＭＹＣをコードする。名称に「ｉ」を含む構築物は、ＳＯＸ２コード配列の直ぐ下流にＩＲＥＳ配列を含有する。様々な初期化因子のコード配列は、全ての初期化因子が同じプロモーターから発現されるように、自己切断２Ａペプチドのコード配列またはＩＲＥＳによって分離されている（Wen et al., Stem Cell Rep. (2016) 6:873-84、Su et al., PLoS ONE (2013) 8:e64496）。

ＶＥＥＶ ＲＮＡ構築物は、そのそれぞれのＤＮＡプラスミド鋳型から酵素的に合成した。ＲＮＡ合成を最適化するために、ＡＧキャップアナログ技術（ＣｌｅａｎＣａｐ、Ｔｒｉｌｉｎｋ）を使用して５’キャップ付加ＲＮＡを生成した。

組換えＶＥＥＶ構築物の骨格配列を図６Ｂ（配列番号１５）に示し、ここで、発現カセットの挿入部位は配列においてアスタリスクによって示される。

[実施例２]
赤血球前駆体のｉＰＳＣへの初期化
この実施例は、赤血球前駆細胞をｉＰＳＣに初期化するための例示的なプロトコルを記載する。赤血球前駆体（ＥＰ）について濃縮された細胞集団を取得するために、ヒトドナー由来のＰＢＭＣを解凍し、次いで、約３ＩＵ／ｍＬのＥＰＯ、約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および約５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を補充した培地（「ＥＰ培地」）において５～１０日（例えば６日）間培養した。これらの成長因子はＥＰ増殖を支持する。例えば、Wang et al., Clin Hemorheol Microcirc.(2007) 37(4):291-9を参照されたい。あるいは、ＰＢＭＣは、Wen et al. (Stem Cell Reports (2016) 6:873-84)に記載されているように、例えば、１００ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、３００－０７）、１０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン－３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＡＦ－２００－０３）、２Ｕ／ｍｌのエリスロポエチン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１００－６４）、２０ｎｇ／ｍｌのインスリン成長因子１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１００－１１）、１ｍＭのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ、Ｄ４９０２）、および０．２ｍＭの１－チオグリセロール（Ｓｉｇｍａ、Ｍ６１４５）を補充したＳｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）ＩＩ造血幹細胞発現培地（Ｓｉｇｍａ、Ｓ０１９２）を含む培養培地において培養してもよい。

より具体的には、解凍したＰＢＭＣをＥＰ培地に播種して、組織培養処理プレートにおいて２～３×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度を達成した。播種から一晩（例えば、１６～２４時間）経過後、培地の約４分の１～４分の３を交換した。２日目に、細胞を新規容器（超低付着、非組織培養処理）に移し、毎日２５～７５％培地交換を実施した。５日目に、追加のＥＰ培地を添加することによって細胞を２倍に希釈した。６（または７）日目に、培養培地の２分の１を交換し、ＥＰ細胞の試料を、フローサイトメトリーによってＣＤ７１およびＣＤ３６の二重陽性について評価した。

次いで、ＣＤ７１^＋ＣＤ３６^＋ＥＰ細胞をインターフェロン抑制因子（例えば、組換えＢ１８Ｒタンパク質）と共に２０分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、ＤＰＢＳを用いて洗浄し、次いで約２×１０^７細胞／ｍＬでＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に再懸濁した。各１２０μＬの電気穿孔反応のために、４μｇのＶＥＥＶ初期化ＲＮＡを、冷却した１．５ｍＬマイクロチューブに移した。次いで、細胞を電気穿孔し、Ｂ１８Ｒ補充ＥＰ培地にプレーティングし、２日間流加した。プレートは、ビトロネクチンまたはラミニンなどの基質でコーティングされていた。トランスフェクション後３～６日目に、細胞を、Ｂ１８Ｒ補充Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ７またはＲｅｐｒｏＴｅＳＲ（商標）培地を用いて流加した。トランスフェクション後７日目から、培養は完全培地交換を毎日受けた。ｉＰＳＣのコロニーは、トランスフェクション後１０日目あたりから発生し、１５～２０日目の間に採取できる状態になった。採取したコロニーを、Ｂ１８Ｒの非存在下で増殖させ、次いで凍結保存した（本明細書ではＶＥＥ－ＥＰ－ｉＰＳＣと称される）。

図２Ａ～Ｃに示すように、３つのＶＥＥＶ ＲＮＡ構築物を用いて生成したＶＥＥ－ＥＰ－ｉＰＳＣは、未分化多能性細胞と関連する核（ＮＡＮＯＧ）および表面マーカー（ＴＲＡ－１－６０、ＳＳＥＡ－３およびＳＳＥＡ－４）を発現した。これらの細胞は、正常な核型もまた有した。

ＶＥＥ－ＥＰ－ｉＰＳＣを次世代配列決定によって特性解析して、５００超のがん関連遺伝子における遺伝子バリアントの獲得を評価した。ＶＥＥ－ＥＰ－ｉＰＳＣ株における５００超の遺伝子の遺伝子配列をドナーＰＢＭＣの開始集団と比較した際、配列において差は観察されなかった。これらのデータは、初期化の間に遺伝子バリアントが獲得されなかったことを実証する。

全てのＶＥＥ－ＥＰ－ｉＰＳＣ細胞株は、外胚葉を表すＴＨ^＋ドーパミン作動性ニューロンに分化する能力を実証した（図３）。ＶＥＥ－ＥＰ－ｉＰＳＣのドーパミン作動性ニューロンの方向への分化を導くために、本発明者らは初めに、０日目～７日目にＴＧＦ－βおよびＢＭＰシグナル伝達を遮断することによってｉＰＳＣを神経外胚葉系列の方向に誘導した。本発明者らは同時に、０日目～７日目に組換えＣ２５ＩＩ ＳＨＨタンパク質を介して細胞を底板運命にパターン化し、０日目～１２日目にＷＮＴアゴニスト低分子ＣＨＩＲ－９９０２１を使用して細胞の中脳アイデンティティを微調整した。これらのステップの後、１０～１６日目に神経栄養因子および１２日目～１６日目に低分子γ－セクレターゼ阻害薬ＤＡＰＴを使用して、前駆体をニューロンの運命に成熟させた。１６日目の分化細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで５日間成熟させ、ＴＨ^＋ＦＯＸＡ２^＋ドーパミンニューロンをフローサイトメトリーによって定量した。

全てのＶＥＥ－ＥＰ－ｉＰＳＣ細胞株は、中胚葉分化を表す心筋トロポニン（ｃＴＮＴ）陽性心筋細胞に分化することもできた（図４）。ＶＥＥ－ＥＰ－ｉＰＳＣ株を、ＷＮＴアゴニストＣＨＩＲ－９９０２１およびＷＮＴアンタゴニストｅｎｄｏ－ＩＷＲ１の使用を介したＷＮＴシグナル伝達の段階特異的調節により、心臓系列の方向に分化させた。心筋細胞を、フローサイトメトリーによって心筋トロポニン（ｃＴＮＴ）染色について定量した。

転写因子の種々の組合せを含有するＶＥＥＶ ＲＮＡ構築物の初期化効率を決定するために、赤血球前駆体をＰＢＭＣから増殖させ、初期化ＲＮＡ構築物を電気穿孔により導入した。ＴＲＡ－１－６０陽性コロニーを、電気穿孔の１７日後（ＯＫＳ－ｉＢＭおよびエピソーム構築物の場合）または２５日後（ＯＫＳ－ｉＧＭおよびＯＫＳ－ｉＧ構築物の場合）に定量した。初期化の効率は、ＰＳＣマーカーＴＲＡ－１－６０を発現している細胞ベースのコロニーの数として決定した（図５Ａ）。ＶＥＥＶ ＲＮＡに媒介されたＥＰ初期化の効率は、ＶＥＥＶ構築物にＢＣＬ－ｘＬコード配列を含めた場合、有意に上昇した（図５Ｂ）。ＢＣＬ－ｘＬコード配列を含有したＶＥＥＶ ＯＫＳ－ｉＢＭ構築物は、従来の初期化因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８、およびｐ５３ドミナントネガティブを含有するエピソームベース対照よりも４倍高いＥＰ初期化効率を実証した（図５Ｂ－ｉＢＭ／Ｅｐｉ５）。ＯＳ－ｉＢＭ構築物はまた、活性であり、ｉＰＳＣコロニーを形成した（データは示していない）。

Su et al. (2013, supra)は、第５の初期化因子としてＢＣＬ－ｘＬを含めた場合（エピソームＯＳ＋ＭＫ＋Ｂの組合せ）、ＯＳ＋ＭＫ（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣおよびＫＬＦ４）の組合せと比較しておよそ８倍の初期化効率の上昇を観察した。しかしながら、Yoshioka and Dowdy (2017, supra)が、初期化因子の組合せを評価した際、ＧＬＩＳ１の包含（ＶＥＥ－ＯＫＳ－ｉＧＭ）は、４因子の組合せ（ＶＥＥ－ＯＫＳ－ｉＭ）と比較して、初期化効率をおよそ２０倍高めた。したがって、ＧＬＩＳ１をＢＣＬ－ｘＬに置き換えること（ＶＥＥ－ＯＫＳ－ｉＢＭ）が赤血球前駆体の初期化効率をさらに８倍上昇させたことは予期せぬことであった（図５Ｂ－ｉＢＭ／ｉＧＭ）。この驚くべきかつ劇的な初期化効率の上昇は、低効率の赤血球初期化を堅牢な手法に変貌させる。より堅牢な効率は、異なる血液試料の間で一貫した初期化を可能にし、臨床使用のためのＥＰ初期化の実行可能性に極めて重要である。

[実施例３]
Ｔ細胞のｉＰＳＣへの初期化
この実施例は、Ｔリンパ球をｉＰＳＣに初期化するためのプロトコルを記載する。精製されたＣＤ３^＋Ｔ細胞（汎Ｔ細胞）を、２名の独立したドナー由来の末梢血（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）の陰性免疫選択および免疫表現型同定によって取得した。両方のドナー由来の汎Ｔ細胞を解凍し、ＣＴＳ（商標）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）および１００ＩＵ／ｍＬのＩＬを補充したＴ細胞完全培地に維持した。電気穿孔の前に、汎Ｔ細胞を、０．２μｇ／ｍＬの組換えＢ１８Ｒタンパク質を用いて３０分間処理し、冷リン酸緩衝生理食塩水を用いて洗浄し、再懸濁した）。

細胞を、電気穿孔し、プレーティングし、超低接着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において、０．２μｇ／ｍＬのＢ１８Ｒ、ＣＴＳ（商標）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、および１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した上記Ｔ細胞培地中で２４時間インキュベートした。次に、細胞を、ＬＮ５２１でコーティングした組織培養プレートに再びプレートティングし、０．２μｇ／ｍＬのＢ１８Ｒを新たに補充した。電気穿孔後３～６日目の間に、初期化培養を、０．２μｇ／ｍＬのＢ１８Ｒを毎日補充したＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ０３培地（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）を用いて流加した。トランスフェクション後７日目から、培養は、Ｂ１８Ｒ補充ＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ０３培地を用いる完全培地交換を毎日受けた。ｉＰＳＣのコロニーは、トランスフェクション後１０日目あたりから発生し、１５～２０日目の間に採取できる状態になった。採取したコロニーを、Ｂ１８Ｒの非存在下でＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ０３培地を用いて増殖させ、次いで凍結保存した（本明細書ではＶＥＥ－Ｔ－ｉＰＳＣと称される）。

結論として、本発明者らは、赤血球前駆体に加えてＣＤ３^＋Ｔ細胞も、ＶＥＥ－ＯＫＳ－ｉＢＭ ＲＮＡを用いる電気穿孔によって初期化することができることを実証した。２つの異なるドナーＴ細胞ロットを初期化してｉＰＳＣ株を樹立し、初期化効率は、２つのドナー間で平均して０．００５％であった。これは、トランスフェクトされた細胞１００万個当たり５０のコロニーをもたらし得る、十分な細胞株誘導率である。

配列のリスト
本開示の例示的な配列を以下の表に提供する（ＳＥＱ：配列番号）。

Claims (30)

1. 造血系列の開始細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の集団を取得する方法であって、
   前記開始細胞に、ＢＣＬ－ｘＬ、ならびにＯＣＴファミリータンパク質、ＫＬＦファミリータンパク質、ＭＹＣファミリータンパク質、ＳＯＸファミリータンパク質、ＬＩＮ２８タンパク質、ＮＡＮＯＧタンパク質、およびｐ５３ドミナントネガティブタンパク質から選択される１つまたは複数の追加の初期化因子をコードするアルファウイルスＲＮＡ発現構築物を導入することと、
   前記開始細胞を培養して、ＢＣＬ－ｘＬおよび前記１つまたは複数の追加の初期化因子の発現を可能にし、それによって前記開始細胞およびその後代を誘導してｉＰＳＣに初期化することと
   を含む、方法。
2. 前記開始細胞が、ヒト起源の造血幹細胞、赤血球前駆細胞、リンパ球前駆細胞、末梢血単核細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、マクロファージ、単球、好中球、好酸球、または樹状細胞である、請求項１に記載の方法。
3. 前記開始細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエリスロポエチン、幹細胞因子、およびＩＬ－３の存在下で、任意選択で５～１０または６～７日間培養することによって取得された赤血球前駆細胞である、請求項２に記載の方法。
4. 前記ＰＢＭＣが、０．５～５ＩＵ／ｍｌのエリスロポエチン、５０～２００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子、および１～１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３の存在下で培養される、請求項３に記載の方法。
5. 前記ＲＮＡ発現構築物が電気穿孔により前記開始細胞に導入される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
6. 電気穿孔の前に前記開始細胞をＢ１８Ｒタンパク質と接触させることを含む、請求項５に記載の方法。
7. 請求項１から６のいずれか一項に記載の方法から取得される、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の集団。
8. ＢＣＬ－ｘＬ、ならびにＯｃｔファミリータンパク質、ＫＬＦファミリータンパク質、Ｍｙｃファミリータンパク質、ＳＯＸファミリータンパク質、ＬＩＮ２８タンパク質、ＮＡＮＯＧタンパク質、およびｐ５３ドミナントネガティブタンパク質から選択される１つまたは複数の追加の初期化因子をコードするアルファウイルスＲＮＡ発現構築物がトランスフェクトされている造血系列の開始細胞から取得される、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の集団。
9. 前記開始細胞が、ヒト起源の造血幹細胞、赤血球前駆細胞、リンパ球前駆細胞、末梢血単核細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、マクロファージ、単球、好中球、好酸球、または樹状細胞である、請求項８に記載のｉＰＳＣ。
10. 前記開始細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＥＰＯ、ＳＣＦ、およびＩＬ－３の存在下で、任意選択で５～１０または６～７日間培養することによって取得された赤血球前駆細胞である、請求項９に記載のｉＰＳＣ。
11. ＢＣＬ－ｘＬ、ならびにＯＣＴファミリータンパク質、ＫＬＦファミリータンパク質、ＭＹＣファミリータンパク質、ＳＯＸファミリータンパク質、ＬＩＮ２８タンパク質、ＮＡＮＯＧタンパク質、およびｐ５３ドミナントネガティブタンパク質から選択される１つまたは複数の追加の初期化因子をコードするアルファウイルスＲＮＡ発現構築物。
12. 請求項１１に記載のアルファウイルスＲＮＡ発現構築物のコード配列を含むＤＮＡベクター。
13. 請求項１１に記載のアルファウイルスＲＮＡ発現構築物または請求項１２に記載のＤＮＡベクターを含む宿主細胞であって、任意選択でヒト細胞である、宿主細胞。
14. 前記アルファウイルスＲＮＡ発現構築物が、自己複製構築物であり、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４遺伝子を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法、請求項７から１０のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ、請求項１１に記載のアルファウイルスＲＮＡ発現構築物、請求項１２に記載のＤＮＡベクター、または請求項１３に記載の宿主細胞。
15. 前記アルファウイルスＲＮＡ発現構築物が、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）ＲＮＡ発現構築物であり、ＶＥＥＶ ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４遺伝子を含み、
    任意選択で、前記ＶＥＥＶ ＲＮＡ発現構築物が、野生型ＶＥＥＶゲノムの対応する領域からの１つまたは複数の、任意選択で２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上の変異を含有する、
    前述の請求項のいずれか一項に記載の方法、ｉＰＳＣ、アルファウイルスＲＮＡ発現構築物、ＤＮＡベクター、または宿主細胞。
16. 前記ＯＣＴファミリータンパク質がＯＣＴ４、任意選択でヒトＯＣＴ４である、
    前記ＫＬＦファミリータンパク質がＫＬＦ４、任意選択でヒトＫＬＦ４である、
    前記ＳＯＸファミリータンパク質がＳＯＸ２、任意選択でヒトＳＯＸ２である、
    前記ＬＩＮ２８タンパク質がＬＩＮ２８Ｂ、任意選択でヒトＬＩＮ２８Ｂである、および／または
    前記ＭＹＣファミリータンパク質がｃ－ＭＹＣ、任意選択でヒトｃ－ＭＹＣである、
    前述の請求項のいずれか一項に記載の方法、ｉＰＳＣ、アルファウイルスＲＮＡ発現構築物、ＤＮＡベクター、または宿主細胞。
17. 前記アルファウイルスＲＮＡ発現構築物が、
    配列番号１もしくはそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＢＣＬ－ｘＬタンパク質、
    配列番号３もしくはそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＯＣＴ４タンパク質、
    配列番号５もしくはそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＫＬＦ４タンパク質、
    配列番号７もしくはそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＳＯＸ２タンパク質、および／または
    配列番号９もしくはそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むｃ－ＭＹＣタンパク質、
    の発現を導く、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法、ｉＰＳＣ、アルファウイルスＲＮＡ発現構築物、ＤＮＡベクター、または宿主細胞。
18. 前記アルファウイルスＲＮＡ発現構築物が、ＯＣＴファミリータンパク質、ＳＯＸファミリータンパク質、ＢＣＬ－ｘＬ、およびＭＹＣファミリータンパク質、ならびに任意選択でＫＬＦファミリータンパク質の発現を導く、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法、ｉＰＳＣ、アルファウイルスＲＮＡ発現構築物、ＤＮＡベクター、または宿主細胞。
19. ＢＣＬ－ｘＬおよび前記１つまたは複数の追加の初期化因子のコード配列が、２Ａペプチドまたは内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）のコード配列によって分離されている、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法、ｉＰＳＣ、アルファウイルスＲＮＡ発現構築物、ＤＮＡベクター、または宿主細胞。
20. ＢＣＬ－ｘＬおよび前記１つまたは複数の追加の初期化因子のコード配列が、共通のプロモーター、任意選択で２６Ｓプロモーターの転写制御下にある、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法、ｉＰＳＣ、アルファウイルスＲＮＡ発現構築物、ＤＮＡベクター、または宿主細胞。
21. 請求項７から１０および１４から２０のいずれか一項に記載のｉＰＳＣを分化促進剤の存在下で培養することを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化細胞を取得する方法。
22. 請求項２１に記載の方法によって取得される分化細胞。
23. 請求項７から１０および１４から２０のいずれか一項に記載のｉＰＳＣを分化させることから取得される分化細胞。
24. 前記分化細胞が、
    任意選択で、Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞、抑制性Ｔ細胞、骨髄細胞、樹状細胞、および免疫抑制性マクロファージから選択されるヒト免疫細胞、
    任意選択で、ドーパミン作動性ニューロン、ミクログリア細胞、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、皮質ニューロン、脊髄もしくは動眼ニューロン、腸管ニューロン、プラコード由来細胞、シュワン細胞、および三叉神経もしくは感覚ニューロンから選択される、ヒト神経系における細胞、
    任意選択で、心筋細胞、内皮細胞、および結節細胞から選択される、ヒト心血管系における細胞、
    任意選択で、肝細胞、胆管細胞、および膵ベータ細胞から選択される、ヒト代謝系における細胞、または
    任意選択で、網膜色素上皮細胞、光受容錐体細胞、光受容桿体細胞、双極細胞、もしくは神経節細胞から選択される、ヒト視覚系における細胞
    である、請求項２１に記載の方法、または請求項２２もしくは２３に記載の分化細胞。
25. 前記分化細胞が外胚葉系列の細胞であり、任意選択で、前記分化細胞がニューロンである、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の方法または細胞。
26. 前記分化細胞が中胚葉系列の細胞であり、任意選択で、前記分化細胞が心筋細胞である、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の方法または細胞。
27. 請求項２２から２６のいずれか一項に記載の分化細胞と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
28. 処置を必要とする患者を処置する方法であって、請求項２２から２６のいずれか一項に記載の分化細胞または請求項２７に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む、方法。
29. 処置を必要とする患者を処置するための医薬の製造のための、請求項２２から２６のいずれか一項に記載の分化細胞の使用。
30. 処置を必要とする患者を処置することにおける使用のための、請求項２２から２６のいずれか一項に記載の分化細胞または請求項２７に記載の医薬組成物。
    

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