JP6396893B2 - 合成自己複製RNAによるヒトiPS細胞の作製 - Google Patents
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Description
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形"a"、"an"、および"the"は、文脈から明らかにそうでないと指定されない限り、複数の指示対象を含んでいる。したがって、たとえば、「細胞(単数)」への言及は、複数のそうした細胞を含んでおり、「薬剤(単数)」に対する言及は、当業者に知られている1つもしくは複数の薬剤への言及を含んでいるが、他も同様である。
(実施例)
表2:RF-RNAレプリコンのqRT-PCRによる検出
表3:VEE-RF RNAレプリコンによるiPS細胞作製
本発明は以下の実施形態を包含する。
[1] アルファウイルス由来の少なくとも1つの非構造的レプリカーゼドメイン、ならびに、体細胞で発現されたときに多能性幹細胞の生成を誘導するための因子をコードする、少なくとも1つの非アルファウイルス性異種配列を含んでなる、アルファウイルスレプリコンRNA。
[2] レプリコンが、東部ウマ脳炎ウイルス(EEE)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEE)、エバーグレーズ(Everglades)ウイルス、ムカンボ(Mucambo)ウイルス、ピクスナ(Pixuna)ウイルス、および西部ウマ脳炎ウイルス(WEE)からなる群から選択されるアルファウイルスから得られる配列を含む、1に記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[3] レプリコンが、シンドビス(Sindbis)ウイルス、セムリキ森林(Semliki Forest)ウイルス、ミデルブルグ(Middelburg)ウイルス、チクングニア(Chikungunya)ウイルス、オニョンニョン(O'nyong-nyong)ウイルス、ロスリバー(Ross River)ウイルス、バーマフォレスト(Barmah Forest)ウイルス、ゲタ(Getah)ウイルス、サギヤマ(Sagiyama)ウイルス、ベバル(Bebaru)ウイルス、マヤロ(Mayaro)ウイルス、ウナ(Una)ウイルス、アウラ(Aura)ウイルス、ワタロア(Whataroa)ウイルス、ババンキ(Babanki)ウイルス、Kyzylagachウイルス、ハイランドJ(Highlands J)ウイルス、フォートモーガン(Fort Morgan)ウイルス、ヌドゥム(Ndumu)ウイルス、およびバギークリーク(Buggy Creek)ウイルスからなる群から選択されるアルファウイルスから得られる配列を含む、1に記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[4] 少なくとも1つの非アルファウイルス性異種配列が、少なくとも2、3、4、または5つの非アルファウイルス性異種配列を含んでなる、1に記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[5] 非アルファウイルス性異種配列が、KLFポリペプチド、SOX-2ポリペプチド、OCT-3/4ポリペプチド、c-MYCもしくはn-MYCもしくはL-MYCポリペプチド、GLIS1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、およびそれらの任意の組み合わせをコードするポリヌクレオチドから選択される、1〜4のいずれか1つに記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[6] KLFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号8の配列に対して少なくとも95%の同一性を有するKLFポリペプチドをコードする、5に記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[7] KLFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号8の配列を有するKLFポリペプチドをコードする、5に記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[8] KLFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号7に記載の配列を含んでなり、この配列の"T"が"U"となっている、5に記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[9] SOX-2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号6の配列に対して少なくとも95%の同一性を有するSOX-2ポリペプチドをコードする、5に記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[10] SOX-2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号6の配列を有するSOX-2ポリペプチドをコードする、5に記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[11] SOX-2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号5に記載の配列を含んでなり、この配列の"T"が"U"となっている、5に記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[12] OCT-4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号4の配列に対して少なくとも95%の同一性を有するOCT-4ポリペプチドをコードする、5に記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[13] OCT-4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号4の配列を有するOCT-4ポリペプチドをコードする、5に記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[14] OCT-4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号3に記載の配列を含んでなり、この配列の"T"が"U"となっている、5に記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[15] c-MYCポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号10の配列に対して少なくとも95%の同一性を有するc-MYCポリペプチドをコードする、5に記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[16] c-MYCポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号10の配列を有するc-MYCポリペプチドをコードする、5に記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[17] c-MYCポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号9に記載の配列を含んでなり、この配列の"T"が"U"となっている、5に記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[18] GLIS1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号34の配列に対して少なくとも95%の同一性を有するGLIS1ポリペプチドをコードする、5に記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[19] GLIS1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号34の配列を有するGLIS1ポリペプチドをコードする、5に記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[20] GLIS1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号33に記載の配列を含んでなり、この配列の"T"が"U"となっている、5に記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[21] NANOGポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号2の配列に対して少なくとも95%の同一性を有するNANOGポリペプチドをコードする、5に記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[22] NANOGポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号2の配列を有するNANOGポリペプチドをコードする、5に記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[23] NANOGポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号1に記載の配列を含んでなり、この配列の"T"が"U"となっている、5に記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[24] レプリコンが、5'から3'に向かって、(VEE RNAレプリカーゼ)-(プロモーター)-(RF 1 )-(自己切断型ペプチド)-(RF 2 )-(自己切断型ペプチド)-(RF 3 )-(IRESもしくはコアプロモーター)-(RF 4 )-(IRESもしくは任意のプロモーター)-(任意選択可能なマーカー)-(VEE 3’UTRおよびポリAテール)-(任意に選択可能なマーカー)-プロモーターを含んでなり;上記のRF 1-4 は、多能性細胞への体細胞の脱分化を誘導する因子であって、上記のRF 2-3 は任意であり、RF 3-4 は任意であり、またはRF 4 は任意であり;上記のRF 1-4 が、Oct-4、Klf4、Sox-2、c-Myc、Nanog、およびGlis1からなる群から選択される、1に記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[25] レプリコンが、その配列の"T"が”U"で置き換えられた、おおよそ1位からおおよそ7561位までの、配列番号29、30、31、または32に対して90%、95%、98%、99%、または100%同一の配列を含んでなり、それに1つもしくは複数のRFが続き、それに3'UTRおよびポリAテールが続いているが、この1つもしくは複数のRFが、Oct-3/4、Sox-2、Klf4、c-Myc、Nanog、およびGlis1からなる群から選択され;2つ以上のRFが存在する場合には、そのコード配列は配列内リボソーム進入部位(IRES)または小型プロモーターで隔てられていてもよい、1〜24のいずれか1つに記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[26] レプリコンが、"T"が”U"となっている、配列番号29、30、31、または32からなる群から選択される配列に対して、少なくとも95%、98%、99%、または100%同一である配列を含んでなる、25に記載のアルファウイルスレプリコンRNA。
[27] 1〜26のいずれか1つに記載のレプリコンで形質転換されたヒト細胞を含んでなる組成物。
[28] B18R馴化培地を追加して含んでなる、27に記載の組成物。
[29] ヒト細胞が体細胞である、27に記載の組成物。
[30] ヒト細胞が線維芽細胞である、29に記載の組成物。
[31] 幹細胞を作製する方法であって、27に記載の組成物を少なくとも30日間、レプリコンのコード配列が発現される条件下で培養すること、ならびに幹細胞を単離することを含む、前記方法。
[32] 幹細胞を作製する方法であって、1〜26のいずれか1つに記載のレプリコンで体細胞を形質転換すること、レプリコンの発現を促進する条件下で体細胞を培養すること、ならびに幹細胞を単離することを含む、前記方法。
[33] 前記培養が、B18Rで馴化された培地中で細胞を培養することを含む、31または32に記載の方法。
[34] B18R馴化培地が、B18R mRNAの初代ヒト線維芽細胞へのトランスフェクションによって作製される、33に記載の方法。
[35] 幹細胞がレトロウイルスDNAもしくはRNAを含まない、31または33に記載の方法から得られる、単離された幹細胞。
[36] (i) KLF4、(ii) OCT4、(iii) SOX2、(iv) c-MYCまたはn-MYCまたはL-MYC、(v) GLIS1、および(vi) NANOGからなる群から選択される、少なくとも4つの脱分化因子をコードするポリヌクレオチドを含んでなる異所性自己複製RNAレプリコンと、ヒト体細胞を接触させること;
脱分化因子が発現されるように体細胞を培養すること;
幹細胞の形態および/または幹細胞マーカーを示す細胞を選択すること;ならびに
その細胞を人工幹細胞集団が得られるように継代培養すること;
を含む方法。
[37] 細胞が、腫瘍拒絶抗原1-60および/または1-81の発現を検出することによって選択される、36に記載の方法。
[38] ヒト幹細胞を作製するためのベクター系であって:
KLF4、OCT4、SOX2、c-MYCもしくはn-MYCもしくはL-MYC、GLIS1、NANOG、またはそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される脱分化因子をコードする、1つもしくは複数のポリヌクレオチドを含有する、少なくとも1つの自己複製RNAレプリコンを含んでなる、前記ベクター系。
[39] レプリコンが、
(a)Oct4、Sox2、Klf4、およびc-Myc、または
(b)Oct4、Sox2、Klf4、およびGlis1
を含有する、38に記載のベクター系。
[40] 少なくとも1つの自己複製RNAベクターがアルファウイルスに由来する、38に記載のベクター系。
[41] アルファウイルスがVEEである、40に記載のベクター系。
[42] 1つもしくは複数の脱分化ポリヌクレオチド配列を含有する異所性RNAレプリコンを含んでなる、単離されたヒト体細胞。
[43] 異所性RNAレプリコン中の脱分化ポリヌクレオチドを発現させる培養条件で、体細胞が脱分化する、42に記載のヒト体細胞。
[44] 43に記載の細胞を含んでなる、細胞集団。
[45] 35に記載の方法によって得られる、細胞集団。
[46] 細胞または方法が、異所性RNAレプリコンの分解を阻害する培地中で細胞を培養することを含んでいる、44もしくは45に記載の細胞集団、または35もしくは36に記載の方法。
Claims (32)
- アルファウイルス由来の複数の非構造的レプリカーゼドメイン、ならびに、体細胞で発現されたときに多能性幹細胞の生成を誘導するためのリプログラミング因子(RF)をコードする、少なくとも4つの異種ポリヌクレオチド配列を含んでなる、RNAレプリコン、ここで前記RNAレプリコンは、5'から3'に向かって、(前記アルファウイルス由来の複数の非構造的レプリカーゼドメイン)-(プロモーター)-(RF1)-(自己切断型ペプチド)-(RF2)-(自己切断型ペプチド)-(RF3)-(IRES)-(RF4)-(IRESもしくは任意のプロモーター)-(任意選択可能なマーカー)-(アルファウイルス3’UTRおよびポリAテール)-(任意に選択可能なマーカー)-プロモーターを含んでなり;上記のRF1-4は、多能性細胞への体細胞の脱分化を誘導するリプログラミング因子(RF)をコードする異種ポリヌクレオチド配列であって;上記のRF1-4は、Oct-3、Oct-4、Klf、Sox-2、c-Myc、n-Myc、L-Myc、Nanog、およびGlis1からなる群から選択されるRFをコードするポリヌクレオチドである、RNAレプリコン。
- RNAレプリコンが、東部ウマ脳炎ウイルス(EEE)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEE)、エバーグレーズ(Everglades)ウイルス、ムカンボ(Mucambo)ウイルス、ピクスナ(Pixuna)ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス(WEE)、シンドビス(Sindbis)ウイルス、セムリキ森林(Semliki Forest)ウイルス、ミデルブルグ(Middelburg)ウイルス、チクングニア(Chikungunya)ウイルス、オニョンニョン(O'nyong-nyong)ウイルス、ロスリバー(Ross River)ウイルス、バーマフォレスト(Barmah Forest)ウイルス、ゲタ(Getah)ウイルス、サギヤマ(Sagiyama)ウイルス、ベバル(Bebaru)ウイルス、マヤロ(Mayaro)ウイルス、ウナ(Una)ウイルス、アウラ(Aura)ウイルス、ワタロア(Whataroa)ウイルス、ババンキ(Babanki)ウイルス、Kyzylagachウイルス、ハイランドJ(Highlands J)ウイルス、フォートモーガン(Fort Morgan)ウイルス、ヌドゥム(Ndumu)ウイルス、およびバギークリーク(Buggy Creek)ウイルスからなる群から選択されるアルファウイルスから得られる配列を含む、請求項1に記載のRNAレプリコン。
- KLFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号8の配列に対して少なくとも95%の同一性を有するKLFポリペプチドをコードする、請求項1に記載のRNAレプリコン。
- KLFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号8の配列を有するKLFポリペプチドをコードする、請求項1に記載のRNAレプリコン。
- KLFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号7に記載の配列を含んでなり、かつ、該配列中のチミジン残基はウラシル残基で置き換えられている、請求項1に記載のRNAレプリコン。
- SOX-2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号6の配列に対して少なくとも95%の同一性を有するSOX-2ポリペプチドをコードする、請求項1に記載のRNAレプリコン。
- SOX-2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号6の配列を有するSOX-2ポリペプチドをコードする、請求項1に記載のRNAレプリコン。
- SOX-2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号5に記載の配列を含んでなり、かつ、該配列中のチミジン残基はウラシル残基で置き換えられている、請求項1に記載のRNAレプリコン。
- OCT-4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号4の配列に対して少なくとも95%の同一性を有するOCT-4ポリペプチドをコードする、請求項1に記載のRNAレプリコン。
- OCT-4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号4の配列を有するOCT-4ポリペプチドをコードする、請求項1に記載のRNAレプリコン。
- OCT-4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号3に記載の配列を含んでなり、かつ、該配列中のチミジン残基はウラシル残基で置き換えられている、請求項1に記載のRNAレプリコン。
- c-MYCポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号10の配列に対して少なくとも95%の同一性を有するc-MYCポリペプチドをコードする、請求項1に記載のRNAレプリコン。
- c-MYCポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号10の配列を有するc-MYCポリペプチドをコードする、請求項1に記載のRNAレプリコン。
- c-MYCポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号9に記載の配列を含んでなり、かつ、該配列中のチミジン残基はウラシル残基で置き換えられている、請求項1に記載のRNAレプリコン。
- GLIS1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号34の配列に対して少なくとも95%の同一性を有するGLIS1ポリペプチドをコードする、請求項1に記載のRNAレプリコン。
- GLIS1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号34の配列を有するGLIS1ポリペプチドをコードする、請求項1に記載のRNAレプリコン。
- GLIS1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号33に記載の配列を含んでなり、かつ、該配列中のチミジン残基はウラシル残基で置き換えられている、請求項1に記載のRNAレプリコン。
- NANOGポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号2の配列に対して少なくとも95%の同一性を有するNANOGポリペプチドをコードする、請求項1に記載のRNAレプリコン。
- NANOGポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号2の配列を有するNANOGポリペプチドをコードする、請求項1に記載のRNAレプリコン。
- NANOGポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号1に記載の配列を含んでなり、かつ、該配列中のチミジン残基はウラシル残基で置き換えられている、請求項1に記載のRNAレプリコン。
- RNAレプリコンが、5'から3'に向かって、(VEE RNAレプリカーゼ)-(プロモーター)-(RF1)-(自己切断型ペプチド)-(RF2)-(自己切断型ペプチド)-(RF3)-(IRES)-(RF4)-(IRES)-(任意選択可能なマーカー)-(VEE 3’UTRおよびポリAテール)-(任意に選択可能なマーカー)-プロモーターを含んでなり;上記のRF1-4は、多能性細胞への体細胞の脱分化を誘導する因子であって、上記のRF1-4が、Oct-4、Klf4、Sox-2、c-Myc、Nanog、およびGlis1からなる群から選択される、請求項1に記載のRNAレプリコン。
- RNAレプリコンが、配列番号29、30、31、または32の、1位から7561位までに対して95%同一の配列を含んでなり、かつ、該配列中のチミジン残基はウラシル残基で置き換えられている、請求項1または21に記載のRNAレプリコン。
- RNAレプリコンが、配列番号29、30、31、および32からなる群から選択される配列に対して、100%同一である配列を含んでなり、かつ、該配列中のチミジン残基はウラシル残基で置き換えられている、請求項22に記載のRNAレプリコン。
- 幹細胞を作製する生体外での方法であって、請求項1〜23のいずれか1つに記載のRNAレプリコンで体細胞を生体外で形質転換すること、前記RNAレプリコンの発現を促進する条件下で体細胞を生体外で培養すること、ならびに幹細胞を単離することを含む、前記生体外での方法。
- 前記培養が、B18Rを添加した培地中で細胞を培養することを含む、請求項24に記載の生体外での方法。
- B18Rを添加された培地が、B18R mRNAの初代ヒト線維芽細胞へのトランスフェクションによって作製されるものである、請求項25に記載の生体外での方法。
- 請求項1または21に記載のRNAレプリコンと、ヒト体細胞を生体外で接触させること;
脱分化因子が発現されるように体細胞を生体外で培養すること;
幹細胞の形態および/または幹細胞マーカーを示す細胞を選択すること;ならびに
その細胞を人工幹細胞集団が得られるように生体外で継代培養すること;
を含む、ヒト体細胞から人工幹細胞集団を製造し取得する生体外での製造方法。 - 細胞が、腫瘍拒絶抗原1-60および/または1-81の発現を検出することによって選択される、請求項27に記載の生体外での製造方法。
- 請求項1に記載のRNAレプリコンを含んでなる、単離されたヒト体細胞。
- 前記RNAレプリコン中の脱分化ポリヌクレオチドを発現させる培養条件で培養されたときに、前記体細胞が脱分化する、請求項29に記載のヒト体細胞。
- 請求項30に記載の細胞を含んでなる、細胞集団。
- 前記細胞が、前記RNAレプリコンの分解を阻害する培地中で継代培養される、請求項27もしくは28に記載の方法。
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