CN104508131A

CN104508131A - 通过合成的自我复制的RNA形成人iPS细胞

Info

Publication number: CN104508131A
Application number: CN201380038648.1A
Authority: CN
Inventors: 史蒂文·F·道迪; 吉岡直寿
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2012-05-21
Filing date: 2013-05-21
Publication date: 2015-04-08
Anticipated expiration: 2033-05-21
Also published as: JP6396893B2; US10370646B2; ES2698527T3; PT2852671T; EP2852671B1; AU2013266496A1; US9862930B2; EP2852671A4; HUE041853T2; AU2013266496B2; DK2852671T3; US20150159143A1; IL235628B; PL2852671T3; SG11201407595UA; EP2852671A2; WO2013177133A2; US20210108179A1; WO2013177133A3; IL272917A

Abstract

本公开文本提供了用于获得诱导性干细胞的方法和组合物，及其制备和使用方法。

Description

通过合成的自我复制的RNA形成人iPS细胞

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年5月21日提交的美国临时申请序列号61/649,876和2013年3月15日提交的61/798,229号的优先权，在此通过引用将它们每一个全文并入。

发明领域

提供了用于从成纤维细胞产生和繁殖干细胞的方法和组合物。本公开文本涉及诱导性多能干细胞(iPS)的产生及其使用方法。

发明背景

干细胞为再生器官、修复组织、制备或递送生物因子和治疗疾病或病症的潜在来源。

发明概述

患者来源的诱导性多能干细胞的产生对于在治疗上使用干细胞是重要的。iPS细胞的产生要求几个多能性转录因子或重组因子(RF)的表达，包括Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、Glis1(和潜在地Nanog与Lin28)。然而，由于担心在iPS细胞产生期间载体DNA(病毒和裸DNA)整合到基因组中，排除了这些方法随后应用在患者中。

本公开文本描述了通过使用来自修饰的甲病毒(例如委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒)的合成的自我复制的RNA来异位表达RF以产生诱导性多能干细胞(iPS)的方法。在一实施方案中，设计甲病毒表达四种RF，使其具有超过mRNA转染方法的下列优势：1)利用能够用于有限数量的细胞分裂的自我复制的单一RNA种类，因此减少了转染量；2)能够在一个、两个、三个、四个或更多个RF开放阅读框(ORF)处编码；以及3)在多次细胞分裂过程中以高阈值水平稳定表达所有RF基因。通过使用甲病毒的自我复制骨架(已移除结构基因)表达RF只需要3-4次转染(甚至只要1或2次)到原代成纤维细胞就可以产生iPS细胞。甲病毒RF-RNA转录本的产生利用SP6(或T7)体外转录试剂盒，不要求特别的条件，因此进一步地简化了方法用于广泛用途。通过随时间在相同的细胞中以稳定高水平表达四种RF，连同用于有效数量的多次细胞传代的甲病毒-RF RNA的复制，甲病毒-RF RNA方法解决了与通过持续大于14天每天重复用四个单独的RF mRNA每天转染来尝试产生iPS细胞有关的主要的无效率问题。甲病毒-RF RNA为不利用DNA中间物的异位方法，因此没有机会发生基于DNA载体的iPS细胞方法可能发生的整合突变。而且，可以通过从培养基撤回B18R来调节通过降解来丢失RNA复制子的时机。使用这一方法，OCT4/KLF4/SOX2/c-MYC与OCT4/KLF4/SOX2/GLIS1甲病毒-RFRNA方案从两个独立的亲代人成纤维细胞群中产生了大于100个独立的iPS细胞克隆。另外，可以改造方法以表达可选的RF组合和/或向RF-RNA骨架插入额外的RF ORF，用于从特定的细胞类型提纯iPS细胞产生或在驱动分化转化中使用。

本公开文本提供了甲病毒复制子RNA，其包含至少一个来自甲病毒的非结构性复制酶域和至少一个编码因子的非甲病毒的异源性序列，所述因子用于当在体细胞中表达时诱导多能干细胞的产生。在一实施方案中，复制子包含获自甲病毒的序列，所述甲病毒选自东方马脑炎病毒(EEE)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、埃弗格赖德病毒、穆坎博病毒、皮春纳病毒和西方马脑炎病毒(WEE)。在另一实施方案中，复制子包含获自甲病毒的序列，所述甲病毒选自辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒、米德尔堡病毒、基孔肯雅病毒、阿尼昂尼昂病毒、罗斯河病毒、巴马森林病毒、盖他病毒、鹭山病毒、贝巴鲁病毒、马雅罗病毒、乌纳病毒、奥拉病毒、瓦塔罗阿病毒、巴班肯病毒、Kyz病毒(Kyzylagach virus)、高地J病毒、摩根堡病毒、恩杜姆病毒、博吉河病毒。还在另一实施方案中，至少一个非甲病毒的异源性序列包含至少2、3、4或5个非甲病毒的异源性序列。还在另一实施方案中，在上文任何的非甲病毒的异源性序列选自编码KLF多肽、SOX-2多肽、OCT-3/4多肽、c-MYC或n-MYC或L-MYC多肽、GLIS1多肽、NANOG多肽和其任何组合的多核苷酸。在另一实施方案中，编码KLF多肽的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO:8序列至少95％同一性的KLF多肽。在另一实施方案中，编码KLF多肽的多核苷酸编码具有SEQ ID NO:8序列的KLF多肽。还在另一实施方案中，编码KLF多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:7所示序列，其中“T”为“U”。在另一实施方案中，编码SOX-2多肽的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO:6序列至少95％同一性的SOX-2多肽。在另一实施方案中，编码SOX-2多肽的多核苷酸编码具有SEQ ID NO:6序列的SOX-2多肽。还在另一实施方案中，编码SOX-2多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:5所示序列，其中“T”为“U”。在另一实施方案中，编码OCT-4多肽的多核苷酸编码具有与SEQ IDNO:4序列至少95％同一性的OCT-4多肽。在另一实施方案中，编码OCT-4多肽的多核苷酸编码具有SEQ ID NO:4序列的OCT-4多肽。还在另一实施方案中，编码OCT-4多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:3所示序列，其中“T”为“U”。在另一实施方案中，编码c-MYC多肽的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO:10序列至少95％同一性的c-MYC多肽。在另一实施方案中，编码c-MYC多肽的多核苷酸编码具有SEQ IDNO:10序列的c-MYC多肽。还在另一实施方案中，编码c-MYC多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:9所示序列，其中“T”为“U”。在另一实施方案中，编码GLIS1多肽的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO:34序列至少95％同一性的GLIS1多肽。在另一实施方案中，编码GLIS1多肽的多核苷酸编码具有SEQ ID NO:34序列的GLIS1多肽。还在另一实施方案中，编码GLIS1多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:33所示序列，其中“T”为“U”。在另一实施方案中，编码NANOG多肽的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO:2序列至少95％同一性的NANOG多肽。在另一实施方案中，编码NANOG多肽的多核苷酸编码具有SEQ ID NO:2序列的NANOG多肽。还在另一实施方案中，编码NANOG多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:1所示序列，其中“T”为“U”。在一实施方案中，在上文任何的复制子从5’到3’包含：(VEE RNA复制酶)-(启动子)-(RF₁)-(自切割肽)-(RF₂)-(自切割肽)-(RF₃)-(IRES或核心启动子)-(RF₄)-(IRES或任选的启动子)-(任选的选择性标记物)-(VEE 3’UTR和聚腺苷酸尾)-(任选的选择性标记物)-启动子；其中RF_1-4为诱导体细胞去分化为多能细胞的因子，其中RF_2-3为任选的、RF_3-4为任选的、或RF₄为任选的；其中RF_1-4选自Oct-4、Klf4、Sox-2、c-Myc、Nanog和Glis1。在另一实施方案中，复制子包含与SEQ ID NO:29、30、31或32从大约位置1到大约位置756190％、95％、98％、99％或100％同一的序列，其中序列的“T”被“U”取代，接着是一个或多个RF，再接着是3’UTR和聚腺苷酸尾，其中一个或多个RF选自Oct-3/4、Sox-2、Klf4、c-Myc、Nanog和Glis1；其中当存在多个RF时，编码序列可被内部核糖体进入位点(IRES)或小启动子所分隔。在另一实施方案中，复制子括与选自SEQ ID NO:29、30、31或32的序列至少95％、98％、99％或100％同一的序列，其中“T”为“U”。

本公开文本也提供了组合物，其包含被如以上任何实施方案和本文进一步所述的实施方案中所述的复制子转化的人细胞。在一实施方案中，组合物还包含B18R条件培养基。在另一实施方案中，人细胞为体细胞。在另一实施方案中，人细胞为成纤维细胞。

本公开文本也提供了制备干细胞的方法，其包括在表达复制子的编码序列的条件下培养以上和本文他处所述的组合物至少30天，和分离干细胞。

本公开文本也提供了制备干细胞的方法，其包括用本公开文本的复制子转化体细胞，在促进复制子表达的条件下培养体细胞，和分离干细胞。在一实施方案中，培养包括在B18R条件培养基中培养细胞。在另一实施方案中，通过将B18R mRNA转染到原代人成纤维细胞来产生B18R条件培养基。

本公开文本也提供了通过本文所述的方法所获得的分离的干细胞，其中干细胞没有逆转录病毒的DNA或RNA。

本公开文本也提供了方法，其包括：使人体细胞与异位的自我复制的RNA复制子接触，所述复制子包含编码至少四个选自以下的去分化因子的多核苷酸：(i)KLF4、(ii)OCT4、(iii)SOX2、(iv)c-MYC或n-MYC或L-MYC、(v)GLIS1和(vi)NANOG；培养体细胞以表达去分化因子；选择呈现干细胞形态和/或干细胞标志物的细胞；和继代培养细胞以获得诱导性干细胞群。在一实施方案中，通过检测肿瘤排斥抗原1-60和/或1-81的表达选择细胞。

本公开文本也提供了用于产生人干细胞的载体系统，其包含至少一个自我复制的RNA复制子，所述复制子包含一个或多个编码选自以下的去分化因子的多核苷酸：KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、GLIS1和NANOG或其任何组合。在一实施方案中，复制子包含(a)Oct4、Sox2、Klf4与c-Myc，或(b)Oct4、Sox2、Klf4和Glis1。在另一实施方案中，至少一个自我复制的RNA载体源自甲病毒。在另一实施方案中，甲病毒为VEE。

本公开文本也提供了包含异位的RNA复制子的分离的人体细胞，所述复制子包含一个或多个去分化多核苷酸序列。在另一实施方案中，其中在表达异位的RNA复制子中去分化多核苷酸的培养条件下，体细胞去分化。

本公开文本也提供了包含人体细胞的细胞群，所述人体细胞含有异位的RNA复制子，所述复制子包含一个或多个去分化多核苷酸序列。

本公开文本也提供了通过以下方法获得的细胞群：通过使人体细胞与异位的自我复制的RNA复制子接触，所述复制子包含编码至少四个选自以下的去分化因子的多核苷酸：(i)KLF4，(ii)OCT4，(iii)SOX2，(iv)c-MYC或n-MYC或L-MYC，(v)GLIS1和(vi)NANOG；培养体细胞以表达去分化因子；选择呈现干细胞形态学和/或干细胞标志物的细胞；和继代培养细胞以获得诱导性干细胞群。在一实施方案中，通过检测肿瘤排斥抗原1-60和/或1-81的表达选择细胞。

本公开文本也提供了含有编码B18R的异位的RNA分子的重组的人成纤维细胞。在一实施方案中，编码B18R的RNA包含SEQ IDNO:39，其中“T”被“U”代替。在另一实施方案中，RNA编码包含SEQID NO:40所示序列的多肽。

本公开文本也提供了制备B18R条件培养基的方法，其包括在允许B18R表达的条件下培养用编码B18R的RNA转化的人成纤维细胞，和从培养分离培养基。

附图简述

图1A-E显示了亲代人成纤维细胞中合成的VEE-RF RNA复制子的结构和持久性。(A)VEE-RF RNA复制子的示意图。5’末端nsP1-4:非结构蛋白1-4；3’末端C,E2,E1:结构蛋白。26S内部启动子，核糖体转移2A肽，IRES序列，嘌呤霉素(Puro)耐药基因和用于PCR检测复制子的区域的位置如所示。(B)B18R mRNA与VEE RNA复制子的共转染能够在第1天表达VEE-GFP。(C)B18R条件培养基(B18R-CM)和嘌呤霉素选择是VEE-GFP RNA持久超过7天必需的。(D)B18R-CM和嘌呤霉素是VEE-GFP RNA保留必需的。如所示的在第7天GFP表达的图片。条，200μm。(E)VEE RNA的免疫印迹分析表示的在第1天HFF细胞中表达的重编程因子，与逆转录病毒(RV-4Fs)表达比较。

图2A-E显示了通过VEE-RF RNA产生iPS细胞。(A)表观遗传的VEE-RF RNA iPS细胞产生方案的示意图。在第0天(d0)平板接种人成纤维细胞并且在第1天用VEE-RF RNA复制子加上B18R mRNA(3:1比率)共转染(Tfx)(汇合，约4×10⁵个细胞)并且如所示的用嘌呤霉素处理直到第7天(或第10天)。细胞在B18R-CM中培养直到在第25-30天分离iPS细胞集落。(B)VEE-OKS-iM RNA产生用碱性磷酸酶染色的iPS细胞集落，但VEE-OMKS RNA不产生。(C)如所示的从第1、4、7、10天转染方案，从BJ或HFF所产生的iPS细胞集落的碱性磷酸酶染色。(D)如所示的来自BJ或HFF成纤维细胞的VEE-OKS-iM RNA第26天和VEE-OKS-iG RNA第22天的iPS细胞集落的典型图像。条，100μm。(E)如所示的产生分离的iPS细胞克隆中多能ES标志物基因的免疫组化染色。从26个其他iPS细胞克隆(总共30个克隆)获得的相似的结果。条，100μm；插图，10倍放大率。

图3A-E显示了VEE-RF RNA iPS细胞克隆的特征。(A)如所示的通过qRT-RCR分析BJ和HFF的VEE-OKS-iM iPS克隆的ES标志物基因的表达。(B)NANOG和OCT4启动子区域的DNA甲基化分析。实心圆，甲基化的；空心圆，去甲基化的。顶部数字指示相对于转录起始位点的CpG数字。(C)与带有所示多能性NANOG、OCT4、SOX2的亲代人BJ成纤维细胞和人HUES9胚胎干细胞比较BJ-OKS-iM#2和BJ-OKS-iG#5的全基因组mRNA序列资料散点图分析。(D)全基因组RNA序列分析的非监督式分层系统树图显示了与BJ成纤维细胞比较，四个独立的带有HUES9的iPS细胞克隆的聚集。(E)裸鼠中BJ-OKS-iM#21克隆的畸胎瘤形成。AE1/AE3(细胞角蛋白)、NF-1(神经元细胞)和GFAP(神经元细胞)用作外胚层的标志物；肌间线蛋白(肌肉细胞)用作中胚层的标志物；以及AFP(原始的和定形内胚层)用作内胚层的标志物。条,100μm。

图4显示了用于检查RNA复制子的存在的RT-PCR分析。OKS-iM-RNA复制子的质粒PCR敏感性的测量。用100、10和1fg质粒(上图)进行nsP2、nsP4和OCT4-T2A-KLF4(OK)区域的PCR。HFF-OKS-iM iPSC克隆的RT-PCR。+；阳性对照，在OKS-iM-RNA复制子的转染后一天制备总RNA。-；阴性对照，从模拟的转染HFF制备总RNA。从第8代制备来自iPS细胞克隆的总RNA(下图)。

图5显示了iPS细胞克隆的核型分析。在每一克隆20个G显带分裂中期细胞进行HFF-OKS-iM-1、BJ-OKS-iM-2、BJ-OKS-iM-21和BJ-OKS-iG-5克隆的G显带核型分析并且在所有克隆中判断为正常的男性核型(细胞系GENETICS)。

图6A-B显示了用STO饲养细胞培养iPS细胞克隆。收集细胞，然后肌内地或皮下地注射到裸鼠的后肢肌肉或背侧。在注射5-8周后，切开肿瘤并且用4％多聚甲醛固定。(A)裸鼠中HFF-OKS-iM#1克隆的畸胎瘤分析。AE1/AE3(细胞角蛋白)和NF-1(神经元细胞)用作外胚层的标志物；肌间线蛋白(肌肉细胞)用作中胚层的标志物；以及AFP(原始的和定形内胚层)用作内胚层的标志物。条，100μm。(B)来自BJ-OKS-iG克隆3和5的畸胎瘤的H&E染色。条，100μm。

图7A-D显示(A)B18R条件培养基对VEE RNA复制子的持久存在有用。顶部：GFP阳性细胞的％，底部：GFP阳性群中GFP荧光的平均值。(B)细胞的图片。条，200μm。(C)如所示的在第10天RF的蛋白表达。(D)B18R-CM是饲养培养中iPS细胞产生所必需的。如所示的用OKS-iM RNA和B18R mRNA共转染HFF，然后在B18R-CM和嘌呤霉素存在的情况下培养细胞。在第10天(第1、3、8天转染)或第11天(第1、4、7、10天转染)将细胞传代至STO饲养细胞，在B18R-CM加上/减去嘌呤霉素存在或不存在的情况下培养细胞。

发明详述

如本文和所附的权利要求中所用的，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另有明确地规定。因此，例如提及“一细胞”包括许多此类细胞和提及“一试剂”包括提及本领域中那些技术人员已知的一个或多个试剂等。

而且，“或”意指“和/或”除非另有说明。相似地，“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”为可互换的并且不以此为限。

还应理解的是其中各自实施方案的描述使用术语“包含”，本领域中那些技术人员应理解在一些具体实例中，可选地使用语言“基本上由……组成”或“由……组成”描述实施方案。

尽管与本文所述的那些相似的方法和材料或等同物可以用于实施所公开的方法和组合物，本文描述了示例性方法、装置和材料。

除非另有定义，本文所用的所有科技和科学术语都具有与本公开内容所属的领域中普通技术人员通常理解的相同的意义。因此，如贯穿本申请中所用的，下列术语将具有下列的意义。

虽然诱导性多能干细胞(iPS细胞)实际上在分子水平和功能水平上与ES细胞相同，存在将它们的治疗潜能转化成医学应用的关键障碍。问题之一为因为目前iPS细胞的重编程和繁殖的标准方案包括不适用于潜在的临床目的的动物衍生的材料，需要研发产生和扩增hiPS细胞的完全确定的方法。

日本京都大学Shinya Yamanaka小组描述了诱导性多能干细胞(iPS)。Yamanaka鉴定了在胚胎干细胞中特别活跃的基因并且将逆转录病毒用于用精选的那些基因转染小鼠成纤维细胞。最后，分离了四个对多能干细胞产生至关重要的关键的多能性基因：Oct-3/4、SOX2、c-Myc和Klf4。通过Fbx15⁺细胞的抗生素选择分离细胞。相同的小组与其他两个来自哈佛，MIT和洛杉矶加利福尼亚大学的独立的研究小组一起发表了研究，表明将小鼠成纤维细胞成功的重编程到iPS并且甚至产生了可存活的嵌合体。

通过四个重编程的因子(RF；也称为去分化因子)的逆转录病毒的表达产生人iPS细胞开启了基于患者特异的个人化干细胞的再生医学治疗的潜能。然而，逆转录病毒的插入致突变潜能连同休眠的RF基因特别是c-MYC活化的潜能，几乎消除了基于整合的DNA的方法用于再生医学治疗。已研发了其他基于DNA的iPS方法，使用附加型载体，腺病毒，整合的和离体的piggyBac转位子或敲除的慢病毒；然而，这些方法或受iPS细胞产生的低效率之苦或需要留下插入的DNA元件标签的基因组删除策略。使用仙台病毒或mRNA转染的基于RNA的iPS细胞方法避免了与基于DNA的方法有关的潜在的整合问题并且为内在地更安全的用于临床应用的方法。尽管仙台病毒提供了相当有效的iPS方法，与在iPS细胞克隆中持久的仙台病毒复制有关的问题需要阴性选择步骤，接着是几个来自单细胞水平的再克隆步骤以分离无病毒的iPS细胞，此类过程导致了过度的iPS细胞分裂和传代。更有希望的非基于DNA的方法之一涉及四个单独的RF mRNA(加上GFPmRNA)在16天里每天转染。不幸地，这种方法仍然是有问题的。例如，进行用相应的转染的mRNA取代KLF4和c-MYC逆转录病毒的试验并且验证结果；然而不能用转染的mRNA取代OCT4和SOX2逆转录病毒。这问题看来起源于RF mRNA的快速降解以及随着时间不一致的细胞-细胞阈值表达水平变异，其源自在重编程期间尝试每天转染四个独立的mRNA到相同的细胞，持续大于14天。因此，仍然存在着对产生人iPS细胞简单的、高度可再生的、非基于DNA的方法的重要的需求。

本公开文本提供了用于产生来自体细胞(例如成纤维细胞)的iPS细胞的方法和组合物。组合物和方法包括衍生自甲病毒的复制子的使用。复制子包含复制所必需的编码非结构性甲病毒蛋白的RNA序列和1、2、3、4个或更多的与甲病毒异源的编码序列，其诱导体细胞到干细胞表型的去分化。

如本文所用的，术语“甲病毒”具有它在本领域中常规的意义，并且包括各种物种，诸如委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒、东方马脑炎(EEE)病毒、埃弗格赖德病毒(EVE)、穆坎博病毒(MUC)、皮春纳病毒(PIX)和西方马脑炎病毒，所有这些都是甲病毒的VEE/EEE组的成员。其他甲病毒包括，例如塞姆利基森林病毒(SFV)、辛德毕斯病毒、罗斯河病毒、基孔肯雅病毒、S.A.AR86、巴马森林病毒、米德尔堡病毒、阿尼昂尼昂病毒、盖他病毒、鹭山病毒、贝巴鲁病毒、马雅罗病毒、乌纳病毒、奥拉病毒、瓦塔罗阿病毒、巴班肯病毒、Kyz病毒、高地J病毒、摩根堡病毒、恩杜姆病毒和博吉河病毒。在本文所述的构建体和方法中特别有用的甲病毒为VEE/EEE组甲病毒。

术语“甲病毒RNA复制子”、“甲病毒复制子RNA”、“甲病毒RNA载体复制子”和“载体复制子RNA”可互换地使用，指的是表达非结构性蛋白基因的RNA分子从而使得它可以引导它自己的复制(扩增)并且在最低限度上包含5’和3’甲病毒复制识别序列，甲病毒非结构性蛋白的编码序列，和多聚腺苷酸尾。它可额外地包含一个或多个指导异源性RNA序列的表达，即转录和翻译，的元件(例如IRES序列、核心或迷你启动子等)。在一实施方案中，本公开文本的甲病毒复制子可以包含5’和3’甲病毒复制识别序列、甲病毒非结构性蛋白的编码序列、多聚腺苷酸尾和一个或多个选自SOX-2、c-Myc、OCT-3/4、Klf、Glis1和Nanog的编码序列。

术语“多核苷酸”、“核酸”或“重组的核酸”指的是诸如脱氧核糖核酸(DNA)，并且在适当的情况下(特别是关于复制子)，核糖核酸(RNA)的多核苷酸。

关于基因或多核苷酸的术语“表达”指的是基因或多核苷酸的转录，并且视情况而定，mRNA转录本到蛋白或多肽的翻译。因此，如从上下文中清楚的是，蛋白或多肽的表达由开放阅读框的转录和/或翻译引起。

本领域中那些技术人员应认识到的是，由于基因密码的简并性质，各种各样在它们的核苷酸序列中不同的密码子可以用于编码给定的氨基酸。只不过引用本文所述的特别的多核苷酸或编码多肽的基因序列来例证本公开文本的实施方案，并且本公开文本包括编码包含与本公开文本的方法中利用的酶的蛋白和多肽相同的多肽氨基酸序列的任何序列的多核苷酸。同样，多肽通常可以忍受一个或多个在它的氨基酸序列中的氨基酸取代，删除和插入而没有缺失或显著的缺失期望的活性。本公开文本包括此类具有可选的氨基酸序列的多肽，本文所示的通过RNA或DNA序列所编码的氨基酸序列只不过例证本公开文本的实施方案。

本公开文本提供了重组的DNA表达载体、RNA复制子或质粒形式的多核苷酸，如在本文他处更详述的编码一个或多个多肽。

使用cDNA、mRNA或可选地基因组DNA作为模板和适当的寡核苷酸引物，根据标准的PCR扩增技术和以下实施例部分中所述的那些程序可以扩增本公开文本的多核苷酸。由此扩增的核酸可以克隆到适当的载体并且通过序列分析表征。而且，通过标准的合成技术，例如使用自动化DNA合成仪可以制备对应于核苷酸序列的寡核苷酸。

在一实施方案中，本公开文本的复制子包含从大约位置1至大约位置7561与SEQ ID NO:29、30、31或32有90％、95％、98％、99％或100％同一的序列(包括其中序列的，“T”被“U”取代)，接着是一个或多个选自Oct-3/4、Sox-2、Klf4、c-Myc、Nanog和Glis1的RF。当存在多个RF时，编码序列可被内部核糖体进入位点(IRES)或诸如SP1小的(例如核心)启动子所分隔。对本公开文本而言RF的顺序并不是关键的；因此顺序可为Klf4、Oct-3/4、Sox-2、c-Myc或可为Sox-2、Klf4、Oct-3/4、c-Myc或Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc或RF顺序的任何变化。复制子还包含选择性标记物(例如抗生素抗性标记物)。在其他实施方案中，RF的编码序列可被诸如T2A和/或E2A自切割的肽分隔。在其他实施方案中，复制子从5’到3’包含：(VEE RNA复制酶)-(26S启动子)-(RF₁)-(自切割肽)-(RF₂)-(自切割肽)-(RF₃)-(IRES或核心启动子)-(RF₄)-(IRES或任选的启动子)-(任选的选择性标记物)-(VEE 3’UTR和聚腺苷酸尾)；其中RF_1-4为诱导体细胞去分化为多能细胞的因子，其中RF_2-3为任选的，RF_3-4为任选的，或RF₄为任选的；其中RF_1-4选自Oct-4、Klf4、Sox-2、c-Myc、Nanog和Glis1。在一实施方案中，上文的复制子为RNA分子。在另一实施方案中，复制子衍生于VEE并且包括减少致病性的突变。在一实施方案中，VEE为TC-83株(疫苗株)-带有一个点突变(nsP2P₇₇₃-S突变)的基于RNA的复制子，其减少了复制子的细胞病变效应。

在上文的任何实施方案中，RF包括变体和简并的多核苷酸序列。例如，RF可以包含OCT-4多肽、KLF4多肽、SOX-2多肽、c-MYC多肽、NANOG多肽或GLIS1的同源物和变体。例如，在本文所述的任何复制子实施方案中有用的NANOG RF编码序列可以包含(i)编码SEQ ID NO:2多肽的多核苷酸；(ii)包含与SEQ ID NO:1至少95％同一性并且编码具有NANOG活性的多肽的多核苷酸；(iii)具有如前所述的SEQ ID NO:1的多核苷酸或(iv)编码含有1-10个保守的氨基酸取代并且其中多肽具有Nanog活性的SEQ ID NO:2多肽的多核苷酸；其中任何上文所述的核酸序列可以具有被“U”取代的“T”。例如，在本文所述的任何复制子实施方案中有用的Oct-4RF编码序列可以包含(i)编码SEQ ID NO:4多肽的多核苷酸；(ii)包含与SEQ ID NO:3至少95％同一性并且其编码具有Oct-4活性的多肽的多核苷酸；(iii)具有如前所述的SEQ ID NO:3的多核苷酸或(iv)编码含有1-10个保守的氨基酸取代并且其中多肽具有Oct-4活性的SEQ ID NO:4多肽的多核苷酸；其中任何上文所述的核酸序列可以具有被“U”取代的“T”。例如，在本文所述的任何复制子实施方案中有用的Sox-2RF编码序列可以包含(i)编码SEQ ID NO:6多肽的多核苷酸；(ii)包含与SEQ ID NO:5至少95％同一性并且其编码具有SOX-2活性的多肽的多核苷酸；(iii)具有如前所述的SEQ ID NO:5的多核苷酸或(iv)编码含有1-10个保守的氨基酸取代并且其中多肽具有SOX-2活性的SEQ ID NO:6多肽的多核苷酸；其中任何上文所述的核酸序列可以具有被“U”取代的“T”。例如，在本文所述的任何复制子实施方案中有用的KLF4RF编码序列可以包含(i)编码SEQ ID NO:8多肽的多核苷酸；(ii)包含与SEQ ID NO:7至少95％同一性并且其编码具有KLF4活性的多肽的多核苷酸；(iii)具有如前所述的SEQ ID NO:7的多核苷酸或(iv)编码含有1-10个保守的氨基酸取代并且其中多肽具有KLF4活性的SEQ ID NO:8多肽的多核苷酸；其中任何上文所述的核酸序列可以具有被“U”取代的“T”。例如，在本文所述的任何复制子实施方案中有用的c-MYC RF编码序列可以包含(i)编码SEQ ID NO:10多肽的多核苷酸；(ii)包含与SEQ ID NO:9至少95％同一性并且其编码具有c-MYC活性的多肽的多核苷酸；(iii)具有如前所述的SEQ ID NO:7的多核苷酸或(iv)编码含有1-10个保守的氨基酸取代并且其中多肽具有c-MYC活性的SEQ ID NO:10多肽的多核苷酸；其中任何上文所述的核酸序列可以具有被“U”取代的“T”。例如，在本文所述的任何复制子实施方案中有用的GLIS1RF编码序列可以包含(i)编码SEQ ID NO:34多肽的多核苷酸；(ii)包含与SEQ ID NO:33至少95％同一性并且其编码具有GLIS1活性的多肽的多核苷酸；(iii)具有如前所述的SEQ ID NO:33的多核苷酸或(iv)编码含有1-10个保守的氨基酸取代并且其中多肽具有GLIS1活性的SEQ ID NO:34多肽的多核苷酸；其中任何上文所述的核酸序列可以具有被“U”取代的“T”。

Nanog为在胚胎干细胞(ESC)中表达的基因并且在维持多能性方面发挥重要作用。Nanog被认为是与SOX2一起行使功能。编码Nanog的多核苷酸和多肽分别示于SEQ ID NO:1和2中。而且，SEQ ID NO:1包含被“T”可以被“U”取代的DNA序列。人NANOG蛋白(例如见通过引用并入本文的检索号NP_079141)为带有位于细胞的核部分的同源域基序的305个氨基酸蛋白。与小鼠的NANOG相似，人NANOG的N末端区域富含Ser、Thr和Pro残基并且C末端包含Trp重复序列。人NANOG中的同源域范围在大约95个残基-大约155个残基。已知人Nanog的同源物。

“Oct多肽”指的是转录因子的八聚物家族的任何天然存在的成员，或与最相关的天然存在的家族成员相比维持相似的转录因子活性(在至少50％、80％或90％活性内)的变体，或包含至少天然存在的家族成员的DNA结合域的多肽，还可以包含转录激活域。示例性Oct多肽包括Oct-1、Oct-2、Oct-3/4、Oct-6、Oct-7、Oct-8、Oct-9和Oct-11。例如Oct3/4(本文称作“Oct4”)包含POU域，在Pit-1、Oct-1、Oct-2和uric-86之间保守的150个氨基酸序列。见Ryan,A.K.&Rosenfeld,M.G.Genes Dev.11,1207-1225(1997)。在一些实施方案中，变体在它们的全序列与天然存在的Oct多肽家族成员，诸如以上所列的或诸如基因库登录号NP002692.2(人Oct4)或NP038661.1(小鼠Oct4)中所列的那些序列比较具有至少85％,90％或95％氨基酸序列同一性。Oct多肽(例如Oct3/4)可以来源于人、小鼠、大鼠、牛、猪或其他动物。通常，相同的蛋白种类可与基因改造的细胞种类一起使用。Oct-4(八聚物-4)为POU家族的同源域转录因子并且调节许多基因的表达(例如见J.Biol.Chem.,Vol.282,Issue 29,21551-21560,2007年7月20日，通过引用并入本文)。编码Oct4的多核苷酸和多肽分别示于SEQ ID NO:3和4中。而且，SEQ ID NO:3包含被“T”可以被“U”取代的DNA序列。人Oct-4的同源物为已知的，示于下列的检索号NP_038661.1和NM_013633.1(小家鼠)、NP_001009178和NM_001009178(褐家鼠)、以及NP_571187和NM_131112(斑马鱼)，通过引用将这些并入本文。

SPY(性别决定区Y)-盒2，又名SOX2，为在未分化的胚胎干细胞的自我更新、Fgf4的反式激活以及调控DNA弯曲度中发挥作用的转录因子(例如见Scaffidi et al.J.Biol.Chem.,Vol.276,Issue 50,47296-47302,2001年12月14日，通过引用并入本文)。“Sox多肽”指的是SRY有关的HMG-盒(Sox)转录因子的任何天然存在的成员，通过高迁移率族(HMG)域的存在所表征，或其维持与最相关的天然存在的家族成员相比相似的转录因子活性(在至少50％、80％或90％活性内)的变体，或包含至少天然存在的家族成员的DNA结合域的多肽，还可以包含转录激活域。例如见Dang,D.T.,et al.,Int.J.Biochem.CellBiol.32:1103-1121(2000)。示例性Sox多肽包括，例如Sox1、Sox-2、Sox3、Sox4、Sox5、Sox6、Sox7、Sox8、Sox9、Sox10、Sox11、Sox12、Sox13、Sox14、Sox15、Sox17、Sox18、Sox-21和Sox30。Sox1已显示以如Sox2相似的效率产生iPS细胞，并且基因Sox3、Sox15和Sox18也显示了产生iPS细胞，尽管比Sox2的效率稍低。见Nakagawa,et al.,Nature Biotechnology 26:101-106(2007)。在一些实施方案中，变体在它们的全序列与天然存在的Sox多肽家族成员，诸如以上所列的或诸如基因库登录号CAA83435(人Sox2)中所列的那些比较具有至少85％,90％或95％氨基酸序列同一性。Sox多肽(例如Sox1、Sox2、Sox3、Sox15或Sox18)可以来源于人、小鼠、大鼠、牛、猪或其他动物。通常，相同的蛋白种类可与基因改造的细胞种类一起使用。编码Sox2的多核苷酸和多肽分别示于SEQ ID NO:5和6中。而且，SEQ ID NO:5包含被“T”可以被“U”取代的DNA序列。人Sox2的同源物为已知的。

Kruppel样因子4，又名KLF4，在干细胞维持和生长中发挥作用。“Klf多肽”指的是Kruppel样因子(Klf)家族，含有与果蝇胚胎模式调节子Kruppel那些相似的氨基酸序列的锌指蛋白，的任何天然存在的成员，或维持与最相关的天然存在的家族成员相比相似的转录因子活性(在至少50％、80％或90％活性内)的变体，或包含至少天然存在的家族成员的DNA结合域的多肽，还可以包含转录激活域。见Dang,D.T.,Pevsner,J.&Yang,V.W.,Cell Biol.32,1103-1121(2000)。示例性Klf家族成员包括Klf1、Klf2、Klf3、Klf-4、Klf5、Klf6、Klf7、Klf8、Klf9、Klf10、Klf11、Klf12、Klf13、Klf14、Klf15、Klf16和Klf17。发现Klf12和Klf14为能够在小鼠中产生iPS细胞的因子，并且有关的基因Klf1和Klf5也可以，尽管效率减低。见Nakagawa等,NatureBiotechnology 26:101-106(2007)。在一些实施方案中，变体在它们的全序列与天然存在的Klf多肽家族成员，诸如以上所列的或诸如基因库登录号CAX16088(小鼠Klf4)或CAX14962(人Klf4)中所列的那些比较具有至少85％、90％或95％氨基酸序列同一性。Klf多肽(例如Klf1、Klf4和Klf5)可以来源于人、小鼠、大鼠、牛、猪或其他动物。通常，相同的蛋白种类可与基因改造的细胞种类一起使用。到了本文所述的Klf多肽的程度，可以用雌激素有关的受体β(Essrb)多肽取代它。因此，对本文所述的每一Klf多肽实施方案而言意图是，同样地描述了使用Essrb取代Klf4多肽的对应的实施方案。编码KLF4的多核苷酸和多肽分别示于SEQ ID NO:7和8中。而且，SEQ ID NO:7包含被“T”可以被“U”取代的DNA序列。人KLF4的同源物为已知的并且包括NP_034767、NM_010637(小家鼠)，通过引用将其并入本文。

细胞基因的MYC家族由c-myc、N-myc和L-myc组成，三个在调节细胞增殖、分化和凋亡中发挥功能的基因(Henriksson and Luscher1996；Facchini and Penn 1998)。“Myc多肽”指的是Myc家族的任何天然存在的成员(例如见Adhikary,S.&Eilers,M.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.6:635-645(2005))，或其维持与最相关的天然存在的家族成员相比相似的转录因子活性(在至少50％、80％或90％活性内)的变体，或包含至少天然存在的家族成员的DNA结合域的多肽，还可以包含转录激活域。示例性Myc多肽包括，例如c-Myc、N-Myc和L-Myc。在一些实施方案中，变体在它们的全序列与天然存在的Sox多肽家族成员，诸如以上所列的或诸如基因库登录号CAA25015(人Myc)中所列的那些比较具有至少85％、90％或95％氨基酸序列同一性。Myc多肽(例如c-Myc)可以来源于人、小鼠、大鼠、牛、猪或其他动物。通常，相同的蛋白种类可与基因改造的细胞种类一起使用。尽管myc家族基因具有共同的结构和生物学活性。N-Myc为MYC家族的成员并且编码具有碱性螺旋(bHLH)域蛋白。c-myc和N-myc的基因组结构为相似地组织的并且包括三个外显子。第一外显子的大部分和第三外显子的3’部分包含运载转录或转录后调节序列的非翻译区。在细胞核中发现N-myc蛋白并且与另一bHLH蛋白形成二聚物以便结合DNA。编码c-Myc的多核苷酸和多肽分别示于SEQ ID NO:9和10中。而且，SEQID NO:9包含被“T”可以被“U”取代的DNA序列。蛋白的Myc家族的同源物和变体为本领域中已知的。

Glis1(Glis家族锌指1)为编码相同名称的Krüppel样蛋白的基因，在染色体1p32.3上发现了它的基因座。在未受精卵和某一细胞阶段的胚胎中富含该基因，并且其可以用于促进直接重编程体细胞为诱导性多能干细胞。Glis1可以用作重编程体细胞为诱导性干细胞中所用的四个因子的其中之一。所用的其他三个转录因子为Oct3/4、Sox2和Klf4。人Glis1(NM_147193)和多肽示于SEQ ID NO:33和34中(分别为cDNA和多肽)。

使用本领域中已知的技术可以克隆和表达编码人oct4(pour5f1)、sox2、klf4、c-myc(n-myc或L-myc)、Glis1和nanog的cDNA，其变体和同源物。使用本文所示的编码一个或多个去分化因子的多核苷酸序列可以克隆到合适的载体用于在目标细胞类型中表达。

RF“活性”(例如RF变体活性)指的是当与本领域中已知的其他RF组合表达时去分化体细胞的能力。例如，通过在体细胞中与klf4、Sox-2和c-myc共表达Oct-4变体并且检测体细胞是否去分化来测量Oct-4变体的Oct-4活性。如果细胞去分化，然后就可以说Oct-4变体具有Oct-4活性。

在另一实施方案中，复制子包含如SEQ ID NO:29、30、31或32中所示的序列。还在另一实施方案中，复制子包含与SEQ ID NO:29、30、31或32大约90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％同一的序列，其中当复制子被转染到体细胞中时，体细胞被“诱导”变为干细胞。另外，任何SEQ ID NO:29、30、31或32，其中“T”被“U”取代。

在一实施方案中，SEQ ID NO:29提供了本公开文本的复制子。在另一实施方案中，SEQ ID NO:29的序列具有被“U”取代的“T”。复制子包含核苷酸1至大约核苷酸7561的VEE RNA复制酶，核苷酸7562-8671的人Oct-4序列，核苷酸8678-8731的T2A自切割肽的编码序列，8738-10147的人Klf4序列，核苷酸10154-10213的自切割E2A肽的编码序列，10223-11176的人Sox-2序列，11195-11805的内部核糖体进入位点，11818-13140的人c-Myc序列，13165-13776的内部核糖体进入位点，13777-14376的嘌呤霉素抗性基因，14383-14510的VEE 3’UTR和多聚腺苷酸尾，14679-15539的氨苄青霉素抗性基因和16320-16337的SP6启动子。

在一实施方案中，SEQ ID NO:30提供了本公开文本的复制子。在另一实施方案中，SEQ ID NO:30具有被“U”取代的“T”。复制子包含核苷酸1至大约核苷酸7561的VEE RNA复制酶，核苷酸7592-8671的人Oct-4序列，核苷酸8678-8731的T2A自切割肽的编码序列，8738-10147的人Klf4序列，核苷酸10154-10213的自切割E2A肽的编码序列，10223-11176的人Sox-2序列，11195-11805的内部核糖体进入位点，11818-13140的人c-Myc序列，13165-13776的内部核糖体进入位点，13777-14376的嘌呤霉素抗性基因，14383-14510的VEE 3’UTR和多聚腺苷酸尾，14679-15539的氨苄青霉素抗性基因和16319-16336的T7启动子。

在一实施方案中，SEQ ID NO:31提供了本公开文本的复制子。在另一实施方案中，SEQ ID NO:31具有被“U”取代的“T”。复制子包含核苷酸1至大约核苷酸7561的VEE RNA复制酶，核苷酸7592-8671的人Oct-4序列，核苷酸8678-8731的T2A自切割肽的编码序列，8738-10147的人Klf4序列，核苷酸10154-10213的自切割E2A肽的编码序列，10223-11176的人Sox-2序列，11195-11805的内部核糖体进入位点，11818-13680的人Glis1序列，13689-14300的内部核糖体进入位点，14301-14900的嘌呤霉素抗性基因，14907-15034的VEE 3’UTR和多聚腺苷酸尾，15203-16063的氨苄青霉素抗性基因和16844-16861的SP6启动子。

在一实施方案中，SEQ ID NO:32提供了本公开文本的复制子。在另一实施方案中，SEQ ID NO:32具有被“U”取代的“T”。复制子包含核苷酸1至大约核苷酸7561的VEE RNA复制酶，核苷酸7592-8671的人Oct-4序列，核苷酸8678-8731的T2A自切割肽的编码序列，8738-10147的人Klf4序列，核苷酸10154-10213的自切割E2A肽的编码序列，10223-11176的人Sox-2序列，11195-11805的内部核糖体进入位点，11818-13680的人Glis1序列，13689-14300的内部核糖体进入位点，14301-14900的嘌呤霉素抗性基因，14907-15034的VEE 3’UTR和多聚腺苷酸尾，15203-16063的氨苄青霉素抗性基因和16843-16860的T7启动子。

在另一实施方案中，可使用多个甲病毒复制子，每一复制子包含一个或多个诱导体细胞变为干细胞的因子的编码序列，其中多个甲病毒复制子的组合包括所有用于诱导去分化到干细胞所必需的所有RF的编码序列。

在更为具体的实施方案中，甲病毒复制子包含用于OCT-3/4、SOX-2、KLF、c-MYC、GLIS1和/或NANOG表达的编码序列。在具体的实施方案中，甲病毒复制子包含用于OCT-4、KLF4、SOX-2、GLIS1和c-MYC的编码序列。

复制子也可被基因改造为表达甲病毒结构蛋白。美国专利7,045,335、7,078,218、7,425,337和7,442,381号描述了许多此类甲病毒RNA复制子的构建体，其由5’和3’甲病毒复制识别序列、甲病毒非结构性蛋白的编码序列和多聚腺苷酸尾组成，并且通过引用将此类构建体并入本文。甲病毒RNA复制子的具体实施方案可包含一个或多个减毒突变，减毒突变为核苷酸删除、添加、或一个或多个核苷酸的取代、或包含重排或嵌合构建的突变，该突变导致了含有突变的活病毒中毒力相对于适当的野生型甲病毒有损失。

术语“一个或多个甲病毒结构蛋白”指的是一个甲病毒所编码的结构蛋白或甲病毒所编码的结构蛋白的组合。通过病毒产生的这些蛋白如多聚蛋白并且在文献中通常表示为C-E3-E2-6k-E1。E3和6k用作两个糖蛋白E2和E1的膜易位/转运信号。因此，本文术语E1的使用可以指的是E1、E3-E1、6k-E1或E3-6k-E1，本文术语E2的使用可以指的是E2、E3-E2、6k-E2或E3-6k-E2。减毒突变可以引入到任何一个或多个甲病毒结构蛋白。

另外，如以上所提及的，用于产生代谢物有用的酶的同源物包含在本文所提供的微生物和方法中。第一家族或物种的初始酶或基因所用的术语“同源物”指的是第二家族或物种的不同的酶和基因，通过功能的、结构的或基因组的分析确定对应于第一家族或物种的初始酶或基因的第二家族或物种的酶或基因。通常来说，同源物具有功能的、结构的或基因组的相似性。通过已知的技术使用基因探针和PCR可以容易地克隆酶或基因的同源物。使用功能测定和/或通过基因的基因组作图可以确定如同源物的克隆序列的同一性。

如果编码蛋白的核酸序列具有与编码第二蛋白的核酸序列相似的序列，则蛋白与第二蛋白具有“同源性”或为“同源的”。可选地，如果两个蛋白具有“相似的”氨基酸序列，则蛋白具有与第二蛋白的同源性。(因此，术语“同源蛋白”定义为两个蛋白具有相似的氨基酸序列)。

如本文所用的，当氨基酸序列具有至少大约30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性时，两个蛋白(或蛋白的区域)是基本上同源的。为检测两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，出于最佳比对的目的比对序列(例如可以将缺口引入到第一和第二氨基酸或核酸序列的一个或两个用于最佳比对并且出于比较的目的可以忽视非同源性序列)。在一实施方案中，比对用于比较目的的参考序列的长度为至少30％、通常至少40％、更通常至少50％、甚至更通常至少60％、并且甚至更通常至少70％、80％、90％、100％的参考序列的长度。然后比较在对应的氨基酸位置或核苷酸位置处氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中位置如第二序列中对应的位置被相同的氨基酸残基或核苷酸所占据，然后分子在那个位置是相同的(如本文所用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间百分比同一性为序列所共用的相同的位置数目的函数，考虑到缺口的数目，每一缺口的长度，其需要引入用于两个序列的最佳比对。

当所用的蛋白或肽“同源的”时，应认识到的是不同的残基位置通常相差保守的氨基酸取代。“保守的氨基酸取代”为其中氨基酸残基被另一具有侧链(R基)和相似的化学特性(例如电荷或疏水性)氨基酸残基所取代的那个。通常，保守的氨基酸取代基本上不会改变蛋白的功能特性。在两个或多个氨基酸序列彼此不同于保守的取代的情况下，可向上调整百分比序列同一性或同源性的程度以校正取代的保守性。进行这种调整的方法为本领域中那些技术人员熟知的(例如见Pearsonet al.,1994,在此通过引用将其并入)。

“保守的氨基酸取代”为其中用一具有相似的侧链的氨基酸残基取代氨基酸残基。本领域中已定义了具有相似的侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括带有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。下列六组每一组包含彼此保守取代的氨基酸：1)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

通常使用序列分析软件测量多肽的序列同源性，其也可称为百分比序列同一性。例如见遗传学计算机组(GCG)的序列分析软件包，威斯康星大学生物技术中心，910大学路，麦迪逊，Wis。53705。使用分配给各种取代、删除和其他修饰，包括保守的氨基酸取代的同源性测量蛋白分析软件匹配相似的序列。例如，GCG包含诸如“Gap”和“Bestfit”的程序，其可以使用缺省参数以检测密切相关的多肽之间序列同源性或序列同一性，诸如来自不同有机体物种的同源多肽或野生型蛋白与其突变蛋白之间同源多肽。例如见GCG 6.1版本。

所用的比较分子序列与包含来自不同有机体的大量序列的数据库典型的算法为计算机程序BLAST(Altschul,1990；Gish,1993；Madden,1996；Altschul,1997；Zhang,1997)，特别是blastp或tblastn(Altschul,1997)。BLASTp典型的参数为：期望值:10(缺省)；滤波器:段(缺省)；空位打开罚分:11(缺省)；空位延伸罚分：1(缺省)；最大的比对:100(缺省)；字长:11(缺省)；描述数:100(缺省)；罚分矩阵:BLOWSUM62。

当搜素包含来自大量不同有机体的序列的数据库时，通常比较氨基酸序列。通过本领域中已知的算法而不是blastp可以测量使用氨基酸序列数据库搜索。例如，使用FASTA，GCG 6.1版本中的程序可以比较多肽序列。FASTA提供了查询和搜索序列之间最佳重叠的区域的比对和百分比序列同一性(Pearson,1990,在此通过引用将其并入)。例如，使用FASTA，其缺省参数(字长2，得分矩阵PAM250)，如GCG 6.1版本中所提供的可以检测氨基酸序列之间百分比序列同一性，在此通过引用将其并入。

如本文所用的，本公开文本的组合物和方法提供了去分化体细胞形成干细胞的能力(例如诱导干细胞的形成)。干细胞为能够分化为其他细胞类型的细胞，其包括具有特别的、特异的功能的那些(例如组织特异性细胞、实质细胞和其祖细胞)。有各种种类的干细胞，其可以以他们分化为期望的细胞/组织类型的能力表征。例如，“祖细胞”为专能干细胞或多能干细胞。祖细胞为可以产生不同终末分化的细胞类型的细胞，能够产生各种祖细胞的细胞。术语“多能的”或“多能性”指的是具有产生后代细胞能力的细胞，在适当的条件下可以经历分化为细胞类型，其共同地展示了与来自所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)细胞系有关的特征。多能干细胞可以有助于产前的、出生后的或成年动物的所有胚胎源性组织。标准的本领域公认的测试，诸如在8-12周龄SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力，可以用于建立细胞群的多能性；然而各种多能干细胞特征的鉴定也可用于检测多能细胞。“多能干细胞特征”指的是从其他细胞中区别多能干细胞的细胞的特征。在适当条件下可以经历分化为共同地展示了与来自所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)细胞系有关的特征的细胞类型的产生后代的能力为多能干细胞特征。分子标志物的某些组合的表达或非表达也为多能干细胞特征。例如，人多能干细胞表达至少一些，并且在一些实施方案中，所有来自下列非限制列表的标志物：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-钙黏蛋白、UTF-1、Oct4、Rex1和Nanog。与多能干细胞有关的细胞形态也是多能干细胞的特征。相比之下，与多能干细胞比较，多能干细胞能够分化为细胞子集。例如，多能干细胞能够经历分化为三个胚层的一个或两个。如本文所用的，“非多能细胞”指的是不是多能细胞的哺乳动物细胞。此类细胞的实例包括分化细胞及专能细胞。分化细胞的实例包括但不限于来自骨髓、皮肤、骨骼肌、脂肪组织和外周血组织的细胞。示例性细胞类型包括但不限于成纤维细胞、肝细胞、成肌细胞、神经元、成骨细胞、破骨细胞和T细胞。

甚至比多能干细胞更原始的(即定向的特别分化命运)另一细胞种类为所谓的“全能的”干细胞(例如已受精的卵母细胞，处于发育的两个和四个细胞阶段胚胎细胞)，其具有分化为任何特定物种的细胞类型的能力。例如，单一的全能干细胞可产生完整的动物及特定物种(例如人)中发现的无数细胞类型的任何。

多能干细胞为经历自我更新同时维持产生所有三个胚层源性组织和生殖细胞系的能力的细胞类型。尽管源自人囊胚的多能人胚胎干细胞(hES)细胞为有希望的基于细胞治疗来治疗诸如帕金森疾病、心肌梗塞、脊髓损伤、糖尿病的疾病和病症的来源，它们的临床潜能受限于它们的免疫原性和伦理关怀。

术语“前体细胞”、“祖细胞”和“干细胞”在本领域中可互换地使用，并且在本文中指的是多能的或谱系定向祖细胞，其潜在地能够无限量的有丝分裂以更新它的细胞系或产生后代细胞，其将分化为成纤维细胞或能够自我更新并且能够分化为实质细胞类型的谱系定向祖细胞和它的后代。不同于多能干细胞，通常认为谱系定向祖细胞能够产生许多彼此表型不同的细胞类型。反而，它们产生一种或可能两种谱系定向的细胞类型。

本公开文本显示了使用异位的mRNA表达系统(例如复制子系统)可以诱导终末分化的人细胞(例如人皮肤成纤维细胞)去分化。本公开文本考虑了各种去分化(也称为重编程的因子(RF))编码序列的使用，例如包含编码KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC(L-Myc)、GLIS1、NANOG或其任何组合(例如KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC(L-Myc)和任选地NANOG)的多核苷酸。通过体内或体外将细胞与一个或多个自我复制的RNA载体接触完成去分化，所述载体保持对宿主细胞基因组异位的并且编码诱导去分化的因子。在各种实施方案中，通过在B18R存在的情况下培养自我复制的RNA转化的宿主细胞可以控制本公开文本异位的自我复制的RNA载体。用于促进去分化的方法提供了促进被损伤或疾病所损害的哺乳动物细胞和组织的再生的方法。本公开文本也提供了用于富集诱导性干细胞和包含此类丰富干细胞的细胞群的方法。

患者特异性多能干细胞的产生具有急剧加速干细胞实现临床用途从而治疗退行性疾病的潜能。本公开文本提供了应用来自患者的易于捐献的基质细胞诸如皮肤成纤维细胞并且通过一套包含编码(i)KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC(L-Myc)、NANOG或其任何组合；(ii)KLF4、OCT4、SOX2和GLIS1；以及(iii)KLF4、OCT4、SOX2和NANOG的RNA去分化因子的异位表达产生人诱导性多能干细胞(hiPS或iPS)的方法。产生的细胞系在生理学和形态学上与人胚胎的内细胞团所产生的人胚胎干细胞(HESC)没有区别。hiPS细胞与两个已建立的HESC细胞系分享了几乎同一的基因表达谱。

术语“去分化”为本相关领域中技术人员所熟悉。通常去分化表示谱系定向细胞退化为干细胞的状态，例如通过“诱导”去分化的表型。例如如本文进一步地所述的，KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、GLIS1和/或Nanog可以诱导谱系定向有丝分裂抑制的细胞中有丝分裂的去分化和诱导。

在一实施方案中，本公开文本提供了包含已用本公开文本的复制子转化的人体细胞的细胞培养。在一实施方案中，体细胞为成纤维细胞。在另一实施方案中，体细胞为角质细胞。在另一实施方案中，复制子包含与SEQ ID NO:29、30、31或32从大约位置1-大约位置7561有90％、95％、98％、99％或100％同一的序列(包括其中序列的“T”被“U”取代)，接着是一个或多个选自Oct-3/4、Sox-2、Klf4、c-Myc、Nanog和Glis1的RF，再接着是VEE3’UTR和聚腺苷酸尾。其中当存在多个RF时，编码序列可被内部核糖体进入位点(IRES)或小(例如核心)启动子诸如SP1所分隔。对本公开文本而言RF的顺序并不是关键的；因此顺序可为Klf4、Oct-3/4、Sox-2、c-Myc或可为Sox-2、Klf4、Oct-3/4、c-Myc或Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc或RF顺序的任何变化。在一实施方案中，复制子包含与SEQ ID NO:29、30、31或32所示的序列至少大约95％、98％、99％或100％同一的序列。还在另一实施方案中，细胞培养在包含B18R的条件培养基中和/或与编码B18R的多核苷酸共转化。

本公开文本也提供了制备来自于包含已用本公开文本的复制子转化的人体细胞的干细胞、在促进复制子中编码序列表达的条件下培养体细胞和培养细胞足够的时间段以便去分化细胞为干细胞的方法。在一实施方案中，细胞传代至少5、10、15、20或更多次。在另一实施方案中，培养细胞至少10、20、30或更多天。还在另一实施方案中，细胞培养在包含B18R的条件培养基中和/或与编码B18R的多核苷酸共转化。

本公开文本也提供了通过本文所述的方法诱导性干细胞培养。在一实施方案中，干细胞不包含细胞的基因组DNA中任何异源性RF因子。在另一实施方案中，干细胞不包含任何逆转录病毒的DNA或RNA(例如无逆转录病毒的DNA或RNA的干细胞)。

在一实施方案中，本公开文本提供了单独地或群体地分离的诱导性干细胞。当提及本公开文本的干细胞时术语“分离的”或“纯化的”意指基本上没有携带与谱系专有有关标志物的细胞的细胞。在特别的实施方案中，人诱导性多能干细胞为至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％没有此类污染的细胞类型。在另一实施方案中，分离的干细胞也基本上无可溶的天然存在的分子。如下文更完全谈论的，例如可以通过从培养源提取(例如经由密度梯度离心和/或流式细胞术)获得本公开文本基本上纯化的干细胞。可以通过任何适当的方法测量纯度。例如可以通过流式细胞术(例如FACS分析)纯化本公开文本的干细胞，如本文所述的。此类纯化的iPS细胞没有任何逆转录病毒的DNA或RNA。

在一实施方案中，本公开文本提供了诱导性干细胞的富集群。“诱导性干细胞的富集群”为其中本公开文本的诱导性干细胞与其他细胞类型部分地分离从而使得由此得到的细胞群具有比初始的细胞群更高的诱导性干细胞的浓度。诱导性干细胞的富集群可以具有比分离之前初始细胞群高大约10倍、100倍、500倍、1,000倍、2,000倍、3,000倍、4,000倍、5,000倍、6,000倍、7,000倍、8,000倍、9,000倍、10,000倍或更高的浓度的诱导性干细胞。例如本公开文本诱导性干细胞由至少5％、10％、15％、20％、35％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多的干细胞富集群组成。例如通过选择抗与分化细胞有关的细胞显示标志物、或其他不期望的细胞类型、和/或选择与本公开文本的人诱导性多能干细胞有关的细胞显示标志物(例如TRA-1-81和/或TRA-1-60)，和/或通过在特定的培养系统中再生分离的干细胞可获得诱导性干细胞的富集群。可选地，或除标志物表达富集之外，标志物表达的缺失也可用作富集。此类富集的iPS细胞将没有任何逆转录病毒的RNA或DNA通常用于转化带有RF的细胞。

在另一实施方案中，本公开文本提供了诱导性干细胞的细胞系。如本文所用的，“细胞系”意指本公开文本的干细胞培养或在延长的时间段优选无限期地可以再生的其后代细胞，并且术语包括例如，培养、低温贮藏和再培养接下来低温贮藏的细胞。如本文所用的“培养”意指生长在培养基中并且任选地相应地传代的诱导性干细胞群。干细胞培养可为原代培养(例如没有传代的培养)或为继代或随后的培养(例如再培养或传代一次或多次的细胞群)。

在一实施方案中，本公开文本提供了去分化为干细胞(例如诱导性干细胞)的细胞，所述干细胞包含包括自我更新的能力和分化为中胚层、内胚层和外胚层特征，其中通过使用复制RNA载体一个或多个RF异位表达到宿主细胞基因组可以产生去分化的细胞。在一实施方案中，复制子载体衍生于甲病毒(例如委内瑞拉马脑炎病毒)。

本公开文本的人诱导性多能干细胞的治疗用途包括移植人诱导性多能干细胞、干细胞群或其后代细胞到个体以治疗包括癌症、肿瘤、损伤、病毒感染、糖尿病等造成的疾病和病症的各种病理状态。干细胞或干细胞群(包括基因改造的干细胞)被引入到需要此类干细胞或后代细胞或需要KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、GLIS1或任何其编码的或基因改造的细胞所产生的蛋白或分子组合的个体中。例如，在一实施方案中，人诱导性多能干细胞可以给药于经受已杀死、减少或损害了个体的干细胞或其他细胞的化疗的癌症患者，其中诱导性干细胞取代损害的或死亡的细胞。在另一实施方案中，可以用至少一种额外的治疗因子(除了去分化因子之外)转染或转化人诱导性多能干细胞。例如，一旦通过本公开文本的方法分离或获得本公开文本人诱导性多能干细胞，就可用编码治疗多肽的多核苷酸转化干细胞。此类方法和组合物可以提供用于期望的多肽产生的干细胞生物反应器或可用作基因递送或基因治疗。在这一实施方案中，可用编码治疗多肽的多核苷酸分离、转化iPS细胞然后植入或给药于个体，或可分化为期望的细胞类型并且植入和递送到个体。在此类条件下多核苷酸表达在用于递送多肽产物的个体中。

如果人细胞与受体相比是异源的(非自体同源的/同种异体的)，通常进行伴随免疫抑制治疗，例如免疫抑制剂环孢霉素或FK506的给药。然而，由于本公开文本的人诱导性多能干细胞的不成熟的状态，可不需要此类免疫抑制治疗。因此，在一实施方案中，不存在免疫调节(例如免疫抑制)治疗时本公开文本的人诱导性多能干细胞可以给药于受体。可选地，细胞可被膜密封，其允许流体交换但是阻止细胞/细胞接触。微胶囊化细胞的移植为本领域中已知的，例如Balladur等,1995,Surgery 117:189-94,1995；和Dixit等,1992,Cell Transplantation1:275-79。

可直接地将细胞引入到外周血或存放在遍及全身的其他位置中，例如期望的组织或腹膜中的微载体珠。例如，单程序中可以移植10²个至10⁹个细胞，并且可以如所需的进行额外的移植。

可以体外诱导人诱导性多能干细胞的分化或谱系定向(有丝分裂抑制的)细胞的去分化，或可选地通过体内组织接触诱导(例如通过与成纤维细胞或细胞基质成分接触)。任选地，分化剂或去分化剂(例如KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、GLIS1或其任何组合或其激动剂)可共给药于或随后给药于个体。

以前已显示了β胰岛细胞的移植为糖尿病患者提供了治疗(Shapiro等,2000)。本公开文本的人诱导性多能干细胞提供了可选的胰岛细胞来源用以预防或治疗糖尿病。例如，本公开文本的诱导性多能干细胞可以产生、分离和分化为胰腺细胞类型并且递送到个体。可选地，诱导性多能干细胞可以被递送到个体的胰腺并且在体内分化为胰岛细胞。因此，细胞对移植以便预防或治疗糖尿病的发生有用。

本公开文本考虑本文所述的体外方法可以对去分化的或再分化的细胞(例如从相同的个体收获细胞并且返回到相同的个体)。本公开文本还考虑本文所述的体外方法可对非自体移植有用。在一实施方案中，移植发生在基因相关的供体和受体之间。在另一实施方案中，移植发生在基因不相关的供体和受体之间。在任何以上的实施方案中，本公开文本考虑可以在培养中扩展去分化的细胞并且储存用于以后的检索和使用。相似地，本公开文本考虑可以在培养中扩展再分化的细胞并且储存用于以后的检索和使用。

本公开文本的组合物和方法可应用于其中分化的(谱系定向的)细胞从个体移除，培养中去分化，然后再引入到个体或虽然仍在培养中，基因改造用以沿着特异的分化途径再分化(例如胰细胞、神经元、干细胞、皮肤细胞、心血管细胞、胃肠细胞等)的程序。然后可以将此类再分化的细胞引入到个体。例如，可以移除分化的成纤维细胞，去分化(例如用本公开文本包含KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、GLIS1、NANOG或其任何组合的复制子的异位表达)并且有丝分裂地扩展然后再分化(例如用KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、GLIS1的拮抗剂或其任何组合)或已知的因子(包括物理刺激)用以沿着谱系定向的途径引起hESCs的分化。在一实施方案中，方法包括从受伤的或生病的个体移除分化的细胞。来自从受伤个体收获的细胞的去分化的细胞稍后可以返回到受伤的或生病的个体用以治疗伤口或退行性疾病。去分化的细胞可以再引入到受伤处，或细胞可以再引入到远离受伤处的位点。相似地，可以从受伤的个体收获细胞，体外去分化，体外再分化，并且移植回到个体用以治疗伤口或退行性疾病。

本公开文本的人诱导性多能干细胞可以从获自哺乳动物个体的样品分离。个体可以为任何哺乳动物(例如牛、绵羊、猪、犬科、猫科动物、马、灵长类)，包括人。细胞样品可获自任何数目的不同来源，包括，例如骨髓、胎儿组织(例如胎儿肝组织)、外周血、脐带血、胰腺等。

在另一实施方案中，本公开文本提供了建立和/或维持干细胞群或其后代细胞及包含干细胞和后代细胞混合的细胞群，和所产生的细胞群的方法。就本公开文本的人诱导性多能干细胞而言，一旦建立了细胞培养或干细胞的混合培养，就通过在诱导细胞增殖的条件下传代到新鲜的培养基体外有丝分裂地扩增细胞群，如细胞密度指示，伴有或不伴有组织形成。此类培养方法可以包括在缺乏特别的诱导分化的生长因子(例如IGF、EGF、FGF、VEGF和/或其他生长因子)的培养基中使细胞传代，在KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、GLIS1或其任何组合的起刺激作用的制剂(例如激动剂)存在的情况下，在KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、Glis1或其任何组合，或以上的任何组合存在的情况下。包含成纤维细胞或成纤维细胞样细胞的培养和包含干细胞和成纤维细胞的混合的培养都可以转移到新鲜的培养基当达到足够的细胞密度时。一些干细胞类型不显示典型的接触抑制-凋亡或它们变成静止的当密度为最大限度时。因此，适当的传代技术可以用于减少接触抑制和静止。因此，在一实施方案中，例如将细胞的一部分转移到具有新鲜培养基的新的培养皿。此类移除或转移可以在任何培养皿中完成。

一旦在培养中建立了本公开文本的人诱导性多能干细胞，如以上所述的，它们就可以维持或储存在细胞“库”中，其包含需要定期的转移的体外连续的细胞培养或已被低温贮藏的细胞。

根据已知的方法进行本公开文本的干细胞或其他细胞的低温贮藏，诸如Doyle等,(eds.),1995,Cell&Tissue Culture:LaboratoryProcedures,John Wiley&Sons,Chichester中描述的那些。例如，但不限制于，细胞可悬浮在“冻结培养基”中，诸如，例如培养基还包含15-20％胎牛血清(FBS)和10％二甲亚砜(DNSO)，有或没有5-10％甘油，例如大约4-10×10⁶个细胞/ml的密度。细胞可分配在玻璃瓶或塑料瓶中，然后将其密封并且转移到可编程的或被动式冰箱的冷冻室。可经验主义地检测最佳的冷冻速率。例如，可使用通过溶解热产生-1℃/min温度改变的冷冻程序。一旦包含细胞的小瓶到达-80℃，就将它们转移到液氮存储区。低温贮藏的细胞可以存储年多的时间，尽管应至少每5年检查它们以保持活力。

本公开文本的低温贮藏的细胞组成细胞库，根据需要其部分可以通过融化取出然后用于产生包含干细胞的干细胞培养。例如通常通过将小瓶从液氮转移到37℃水浴快速进行融化。在无菌的条件下应即刻转移小瓶的融化内容物到包含适当的培养基的培养皿。明智的是培养基中的细胞可以调整为大约1-3×10⁵个细胞/ml的初始密度。一旦开始培养，就每天检查细胞，例如，用倒置显微镜检测细胞增殖，并且只要他们达到/适当的密度就再培养。

根据需要本公开文本的人诱导性多能干细胞可从细胞库中取出，并且用作体外新的干细胞的产生，例如作为三维组织培养，如下文所述的，例如体内通过直接地将细胞给予到需要新的成纤维细胞或组织之处的位点。如本文所述的，本公开文本的人诱导性多能干细胞可用于产生个体中使用的新的组织，其中最初从个体自己的血液或其他组织(即自体细胞)分离细胞。可选地，本公开文本的细胞可用作普遍存在的的供体细胞用以产生新的组织供任何个体中使用(即异源性细胞)。

一旦建立，干细胞的培养就可以用于产生能够产生新的组织后代细胞和/或成纤维细胞。可以通过特异的外源性生长因子或通过改变干细胞培养的培养条件(例如密度)触发干细胞分化为成纤维细胞或其他细胞类型，随后由此组织的产生。因为细胞为多能的，它们可以用于重组已辐照的个体和/或化疗治疗的个体；或作为特定谱系的细胞来源，通过为它们的成熟、增殖和分化提供一个或多个选择的谱系。可以用于诱导分化的因子的实例包括红细胞生成素，集落刺激因子，例如GM-CSF、G-CSF或M-CSF、白细胞介素，例如IL-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8等，白血病抑制因子(LIF)，青灰因子(Stl)等，与组织定向的细胞或其他谱系定向的细胞类型共培养，从而诱导干细胞变成定向的特定谱系。

在另一实施方案中，人诱导性多能干细胞为基因改造的用以表达针对特异的生长因子类型的基因用于成功的和/或改进分化为成纤维细胞、其他基质细胞或实质细胞和/或可翻转的移植前或移植后。

本公开文本的细胞可用于治疗需要由疾病或创伤造成的组织的修复或置换的个体。治疗需要使用本公开文本的细胞用于产生新的组织，使用因此产生的组织，根据本领域中目前已知的或在未来研发的任何方法。例如，本公开文本的诱导性细胞(例如包含表达KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、Glis1或其任何组合的异位表达载体的细胞)可为植入的，注射的或相反直接地给药到组织损害部位从而使得它们可在体内产生新组织。在一实施方案中，给药包括基因改造的干细胞的给药。

在一实施方案中，制备用于直接注射到期望新组织产生之处的位点的包含本公开文本的细胞的制剂。例如，非限制性的，本公开文本的细胞可悬浮在用于注射的水凝胶溶液中。可选地，例如可允许包含细胞的水凝胶溶液在模具中变硬从而形成具有移植之前细胞分散在其中的基质。一旦基质变硬，可培养细胞形成从而使得在移植前有丝分裂地扩增细胞。水凝胶为经由共价键、离子键或氢键交联的有机聚合物(天然的或合成的)从而创建其中使水分子陷入以便形成凝胶的三维的晶格结构。可以用于形成水凝胶的材料实例包括多糖诸如褐藻酸盐及其盐，聚膦嗪，和离子键地、聚氧化乙烯-聚丙二醇嵌段共聚物分别通过温度和pH交联的聚丙烯酸酯。水凝胶材料的合成方法及制备此类水凝胶的方法为本领域中已知的。

此类细胞制剂还可包含一个或多个其他组分，包括选择的细胞外基质组分，诸如一种或多种本领域中已知的胶原类型，和/或生长因子和药物。可有效地掺入到细胞制剂中的生长因子包括一个或多个本领域中已知的组织生长因子，诸如但不限于TGF-β家族的任何成员、IGF-I和-II、生长激素，诸如BMP-13的BMPs等。可选地，可基因改造本公开文本的细胞用以表达和产生诸如BMP-13或TGF-β的生长因子。也可包括在制剂中的其他组分包括，例如缓冲液用以提供适当的pH和等渗性，润滑剂，用来保持细胞在给药处或靠近给药处(例如褐藻酸盐、琼脂和植物胶)的粘性材料和可产生给药处期望的效应的其他细胞类型(例如增强或修饰组织的形成或它的物理化学特性，支持细胞存活力或炎症抑制或排斥)。可以通过适当的伤口遮盖物用以防止细胞离开位点覆盖细胞。此类伤口遮盖物为本领域中技术人员已知的。

可选地，本公开文本的人诱导性多能干细胞可接种于三维的框架或支架并且培养以允许细胞分化，生长和填充基质或即刻体内移植，其中接种的细胞将在框架的表面上增殖并且与个体的细胞合作形成体内置换组织。可以植入与任何一个或多个生长因子，药物，额外的细胞类型或刺激形成或相反增强或改善本公开文本的实践的其他组分组合的此类框架。

还在另一实施方案中，本公开文本的人诱导性多能干细胞与三维的培养系统可以共同在“生物反应器”中使用用来产生组织构建体，其拥有原始的人组织关键的生化的、物理的和结构特性，通过培养细胞并且在环境条件下产生通常原生组织富有经验的组织。生物反应器可包括许多设计。通常培养条件包括将生理应激置于与包含体内遇到的那些相似的细胞的构建体上。

可以在各种应用中使用本公开文本的人诱导性多能干细胞，它们的后代细胞和组织。这些包括但不限于分化型、未分化型、去分化型细胞的移植或植入。此类细胞和组织用于修复、置换或增大由于疾病或创伤损害或不能正常发育的组织。

根据本公开文本所产生的人诱导性多能干细胞和组织可以用于修复或置换被损害的或被破坏的组织或增大现存的组织。

另外，例如本公开文本的细胞或组织可以用于体外筛选化合物、过敏原、生长因子/调节因子、药物组合物等对干细胞的功效和/或细胞毒性从而通过检测干细胞的生物活性中的变化(例如KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、Glis1或其任何组合表达或活性，增殖力，附着力的变化)阐明某些疾病的机制，研究药物和/或生长因子通过机制起作用从而调节干细胞生物活性(例如KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、Glis1或其任何组合表达或活性)，诊断和监控患者的癌症用于基因治疗、基因递送或蛋白递送；以及产生生物活性的产物。

人诱导性多能干细胞也可用在分离和评估与干细胞分化和成熟有关的因子。因此，人诱导性多能干细胞可用在检测诸如条件培养基的培养基的活性的测定，评估用于细胞生长活性，涉及特定谱系等奉献的流体。各种系统为可应用的并且可以设计用于基于各种生理应激人诱导性多能干细胞的诱导性分化。

本公开文本的人诱导性多能干细胞、其后代细胞和其衍生的组织可体外用于筛选广泛多样的用于药物制剂、生长因子/调节因子、抗炎症因子等的有效性和细胞毒性制剂。为此，本公开文本的细胞或组织培养可以体外维持和暴露于待被测试的制剂。可以通过它的损害或杀死干细胞或培养中它们的后代细胞的能力测量细胞毒性剂的活性。通过染色技术可以易于评估。通过分析体外活细胞的数目，例如总细胞计数和分化细胞计数可以评估生长因子/调节因子的效应。使用标准的细胞学的和/或组织学的技术可以实现，包括应用定义类型特异的细胞抗原的抗体的免疫细胞化学技术的使用。在悬浮培养或三维系统中可以评估各种药物对本公开文本的细胞的影响。在一方面，可以分析测试剂对本公开文本的人诱导性多能干细胞的影响。

表达目标基因产物或体外由此产生的组织的干细胞可以植入到否则缺乏那个基因产物的个体中。例如，表达能够预防或改善各种类型的血管疾病或病症的症状的产物或预防或促进炎性疾病的基因为特别目标。在一实施方案中，基因改造从而表达抗炎性基因产物的本公开文本的细胞用于降低植入失败的风险或减少由于炎症反应组织中进一步的退行性改变。例如，可以基因改造从而表达一个或多个例如包括对应于抗体的个体基因型的肽或多肽的抗炎性基因产物的本公开文本的干细胞中和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、TNF、IL-1、IL-2或其他炎性细胞因子。IL-1已显示减少蛋白聚糖和II、IX、和XI型胶原的合成(Tyler等,1985,Biochem.J.227:69-878；Tyler等,1988,Coll.Relat.Res.82:393-405；Goldring等,1988,J.Clin.Invest.82:2026-2037；和Lefebvre等,1990,Biophys.Acta.1052:366-72)。TNF也抑制蛋白聚糖和II型胶原的合成，尽管它比IL-1有效性低很多(Yaron,I等,1989,Arthritis Rheum.32:173-80；Ikebe,T等,1988,J.Immunol.140:827-31；和Saklatvala,J.,1986,Nature 322:547-49)。例如还可基因改造从而表达编码人补体调节蛋白的基因本公开文本的细胞防止移植物被宿主排斥。例如见McCurry等,1995,Nature Medicine1:423-27。在另一实施方案中，可基因改造从而包括基因或多核苷酸序列的人诱导性多能干细胞表达或引起血管生成因子的表达。

本公开文本的诱导性干细胞表达一个或多个与人多能干细胞表型有关的标志物和/或缺少一个或多个与分化细胞(例如具有自我更新、再生或分化能力减少的细胞)和/或神经元起源的细胞有关的标志物。分子为期望的细胞类型的“标志物”如果在期望的细胞类型的足够高百分比的细胞上发现它或在不期望的细胞类型的足够低百分比的细胞上发现它。通过从细胞群中选择具有标志物的细胞从包含期望的和不期望的细胞类型的细胞群中可以使人实现期望的细胞类型的期望的纯化水平。标志物可以显示在，例如30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多的期望的细胞类型上并且可以显示在少于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％或更少的不期望的细胞类型上。

如以上所讨论的，本公开文本的诱导性干细胞或已分化的诱导性干细胞通过被分子特异地识别某些标志物的存在和/或缺乏所表征。因此，在一方面，本公开文本提供了标记本公开文本的诱导性干细胞的方法。在一实施方案中，用特异性识别与本公开文本的诱导性干细胞有关的标志物的分子标记人诱导性多能干细胞。在另一实施方案中，细胞群与特异地结合标志物(例如TRA-1-81)的分子在允许分子结合标志物的条件下接触，其中细胞群包含至少一个具有所述标志物的干细胞。在另一实施方案中，细胞群与特异地结合标志物(例如TRA-1-81)的分子在允许分子结合标志物的条件下接触，其中细胞群包含没有标志物的干细胞和具有标志物的非干细胞。例如所用的分子可以为抗体，抗体衍生物或配体。分子任选地可以包含额外的部分，例如可检测的(例如荧光的或比色的标记)部分或帮助标记细胞分离的部分(例如其他分子或磁粒所结合的部分)。

在一实施方案中，转化的体细胞群经历了肿瘤排斥抗原1-61和1-81(TRA-1-60、TRA-1-81)的活体染色。TRA-1-60和TRA-1-81可商购获得，例如购自Chemicon国际有限公司(Temecula,Calif.,USA)。使用单克隆抗体这些抗原的免疫学检测已用于与其他标志物组合表征多能干细胞(Shamblott M.J等.(1998)PNAS 95:13726-13731；SchuldinerM.等.(2000).PNAS 97:11307-11312；Thomson J.A等.(1998).Science282:1145-1147；Reubinoff B.E等.(2000).Nature Biotechlnology 18:399-404；Henderson J.K等.(2002).Stem Cells 20:329-337；Pera M.等.(2000).J.Cell Science 113:5-10)。在一实施方案中，已用至少一个包含KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC并且任选地或可选地NANOG或Glis1的异位的RNA载体转化的体细胞群富集包含TRA-1-81或TRA-1-60表达的细胞。在另一实施方案中，细胞也可富集与逆转录病毒的载体有关的可检测的标志物的缺失。

在另一方面，本公开文本提供了分离本公开文本的诱导性干细胞的方法。例如通过利用结合人诱导性多能干细胞上的标志物(例如TRA-1-81、TRA-1-60或标志物的组合)的分子(例如抗体、抗体衍生物、配体或Fc肽融合分子)因此阳性地选择结合分子的细胞(即阳性选择)可以分离本公开文本的人诱导性多能干细胞。阳性选择方法的其他实例包括在期望的和不期望的细胞类型的混合群中优选地促进期望的细胞类型生长的方法。可选地，通过使用结合不存在于期望的细胞类型但是存在于不期望的细胞类型上的标志物的分子，可以从期望的细胞中移除包含此类标志物的不期望的细胞(即阴性选择)。其他阴性选择方法包括在期望的和不期望的细胞类型的混合群中优选地杀死或抑制不期望的细胞类型的生长。因此，通过使用阴性选择，阳性选择，或其组合，可以制备富集的干细胞群。

分离程序可包括使用抗体包被的磁珠的磁力分离，亲和色谱法，连接到单克隆抗体的细胞毒素剂，或与单克隆抗体联合使用的此类制剂，例如补体和细胞毒素，并且“淘选”结合固体基质(例如平板)的抗体，或其他便利的技术。提供精确的分离的技术包括荧光激活细胞分选，其可以具有不同的成熟程度，例如许多色彩通道，低角度和钝光散射检测通道以及阻抗通道。抗体可便利地与标记结合，诸如磁珠其允许直接的分离，生物素其可与结合到载体上的抗生素蛋白或链霉亲和素一起除去，荧光染料其可以与荧光激活细胞分选一起使用，诸如此类，从而允许以便于特定的细胞类型的分离。可应用任何对人诱导性多能干细胞的活力没有过度地毒害的技术。在一实施方案中，用抗标志物的抗体(例如TRA-1-81抗体)孵育细胞，并且人工地选择标志物染色阳性的细胞及再培养。

富集方法的组合可用于改进纯化或富集的时间或效率。例如，在除去具有不指示目标细胞类型的标志物的细胞的富集步骤后，通过荧光激活细胞分选(FACS)或其他具有高特异性的方法可进一步地分离或富集细胞。多色分析可与FACS一起应用。在针对特定抗原或缺乏其染色水平的基础上分离细胞。荧光染料可用于标记针对特定抗原特异的抗体。此类荧光染料包括藻胆蛋白，例如藻红蛋白和别藻蓝蛋白，荧光素，德克萨斯红等。

任何细胞类型特异的标志物都可以用于对特定的细胞类型或抗特定的细胞类型的选择。对富集有用的诱导性干细胞标志物包含表达的标志物诸如TRA-1-81和与逆转录病毒载体或其他外源性载体有关的标志物的缺失(例如GFP)。

一旦分离了干细胞，就可以将它们任选地繁殖在适当的培养基中在饲养层存在或不存在的情况下。另外，本发明的人诱导性多能干细胞可培养在生物反应器系统中。

一旦在培养中建立了本公开文本的人诱导性多能干细胞，如上文所述的，它们就可以维持或储存在细胞“库”中，其包含需要定期的转移的体外连续的细胞培养或已被低温贮藏的细胞。在一些实施方案中，库存细胞对个体的自体治疗有用。

通过分解用作成纤维细胞来源的适当的器官或组织可易于分离成纤维细胞。使用本领域中技术人员已知的技术可容易地实现。例如，可以机械地分解和/或用消化酶和/或螯合剂处理组织或器官，所述螯合剂减弱相邻细胞间连接使得组织可能分散到个体细胞的悬浮液中而没有很大的细胞破坏。通过切碎组织并且用任何数量的消化酶单独地或组合地处理切碎的组织可以实现酶分解。这些包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶和/或透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶、链酶蛋白酶、分散酶等。也可通过许多方法包括但不限于略举数例螺纹磨床、搅拌器、筛、均质器、压敏元件或绝缘体的使用实现机械破碎。组织分解技术的综述见Freshney,Culture of Animal Cells.AManual of Basic Technique,2d Ed.,A.R.Liss,Inc.,New York,1987,Ch.9,pp.107-126。

一旦组织变成单个细胞的悬浮液，就可以分馏悬浮液到亚群，从其中可以获得成纤维细胞和/或其他基质细胞和/或成分。也可使用标准的细胞分离技术实现，所述技术包括但不限于特异细胞类型的克隆和选择，不想要的细胞的选择性破坏(阴性选择)，混合群中基于差别细胞可凝集性的分离，冻融过程，混合群中细胞的差别粘附特性，过滤，常规的和区带离心，离心淘选(逆流离心)，单元重力分离，逆流分配，电泳和荧光激活细胞分选。克隆选择和细胞分离技术的综述见Freshney,Culture of Animal Cells.A Manual of Basic Techniques,2d Ed.,A.R.Liss,Inc.,New York,1987,Ch.11 and 12,pp.137-168。

例如可如下所述地进行成纤维细胞的分离：彻底洗涤新鲜的组织样品并且在汉克斯平衡盐溶液(HBSS)中切碎以便除去血清。切碎的组织在新鲜制备的分裂酶诸如胰蛋白酶的溶液中孵育1-12小时。此类孵育后，分裂的细胞为悬浮的，通过离心压成丸，并且接种到培养皿。所有成纤维细胞将在其他细胞之前粘附，因此，可以选择性分离适当的基质细胞并且使其生长。

去分化细胞将用于体内移植或植入之处对获得来自于患者自身组织的基质细胞有用。

寡核苷酸探针和引物可以用于鉴定本文所述的及克隆和扩增过程中各种因子的表达。寡核苷酸探针和引物指的是长度8-2000个核苷酸的核酸分子。更具体地，这些寡核苷酸的长度范围大约8、10、15、20或30-100个核苷酸，但是通常为大约10-50个(例如15-30个核苷酸)。本领域中技术人员可以经验为主地确定在特定条件下本公开文本的测定中适当长度的寡核苷酸。

通过任何合适的方法，包括但不限于适当的序列的克隆和限制和基于已知的KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG或其任何组合多核苷酸和多肽序列直接的化学合成可以制备寡核苷酸引物和探针。各种来自其他物种的直系同源物为本领域中已知的。

寡核苷酸引物和探针可以包含核酸类似物，诸如例如肽核酸，锁核酸(LNA)类似物和吗啉基类似物。可以用捕获或可检测的标记使探针的3’末端功能化从而帮助KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、Glis1或其任何组合核酸的检测。

可以通过合并可检测的标记来标记任何本公开文本的寡核苷酸或核酸，其通过光谱学的，光化学的，生物化学的，免疫化学的或化学的方法为可测的。例如，此类标记可以包含放射性物质(³²P、³⁵S、³H、¹²⁵I)，荧光染料(5-溴脱氧尿苷，荧光素，乙酰氨基芴，地高辛)，生物素，纳米颗粒等。此类寡核苷酸通常标记在它们的3’和5’末端。

寡核苷酸引物和探针可以固定化在固相载体上。固相载体为本领域中那些技术人员已知的并且包括反应盘、测试管、聚苯乙烯珠、磁珠、硝化纤维素条、膜、诸如胶乳粒子的微粒，玻璃等的孔壁。固相载体不是关键的并且可以通过本领域中技术人员所选择。因此，胶乳粒子、微粒、磁珠或非磁珠、膜、塑料管、微量测试孔壁、玻璃或硅片等为所有合适的实例。使寡核苷酸固定化在固相的合适的方法包括离子的，疏水的，共价的相互作用等。可以根据它的吸引和固定捕获试剂的固有能力选择固相载体。寡核苷酸探针或引物可以单独地或以本公开文本的大约2-10000个独特的寡核苷酸的组粘附到单一的固相载体或固定化到固相载体上。包含多个本公开文本的寡核苷酸引物或探针的底物可用于检测或扩增KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、Glis1或其任何组合。例如，寡核苷酸探针可用在寡核苷酸芯片诸如Affymetrix所售的或美国专利5,143,854号；PCT出版物WO 90/15070和92/10092号中所述的那些，在此通过引用将这些发明并入本文。使用机械的合成方法或光直接合成方法可以产生这些测定，所述光直接合成方法包含光刻法方法和固相寡核苷酸合成的组合。本公开文本还考虑能够特异地结合KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG或Glis1多肽的抗体。

参照或对照群指的是一组预测代表总群体个体或个人。测量测试样品的样品中KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、Glis1或其任何组合的量，其中数量与对照样品比较。

在另一方面，本公开文本提供了沿着定向谱系分化干细胞的方法，所述方法包括抑制KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、Glis1或其任何组合的表达或活性。就这一点而言有用的分化剂包括，例如抗体，反义寡核苷酸，RNAi构建体或核糖酶。

本公开文本的方法中有用的培养技术公开在国际专利出版WO2010/120785号中，其通过引用并入本文。

提供下列的实施例用以例证本公开文本的某些方面并且帮助本领域中那些技术人员实践本公开文本。绝不认为这些实施例以任何方式限制了本公开文本的范围。

实施例

实施例1

细胞。BJ包皮成纤维细胞和STO细胞系获自ATCC。原代人包皮成纤维细胞(HFF)和HUES-9人ES细胞系获自现有的资源。BJ、HFF和STO培养在包含10％FBS，MEM非必需氨基酸(NEAA)，丙酮酸，盘尼西林和链霉素的DMEM中。HUES-9和iPS细胞与ES培养基一起培养在包含20％基因敲除的SR、GlutaMAX、NEAA、2-巯基乙醇(所有都来自Invitrogen)，盘尼西林，链霉素和bFGF(10ng/ml)的基因敲除的D-MEM。通过丝裂霉素C(10μg/ml,Sigma)处理制备STO饲养细胞。对iPS细胞克隆和HUES-9的无饲养的培养而言，细胞在Matrigel^TM(BD Bioscience)包被的孔传代并且与ES培养基在制备于STO饲养细胞的条件培养基中培养。

质粒构建。OCT4(登录号NM_002701)、c-MYC(登录号NM_002467)和GLIS1(登录号BC104911)的编码cDNA获自Open生物系统。SOX2(登录号NM_003106)、KLF4(登录号NM_004235)、NANOG(登录号BC099704)获自ATCC。B18R(登录号D01019)获自Addgene。通过引用将与每一以上的登录号有关的多核苷酸和多肽序列并入本文。cDNA用作PCR扩增的模板以增加限制性酶位点和/或Kozak序列，并且被克隆到pBluescript SK+载体用于核对cDNA序列。然后cDNA被克隆到用于mRNA合成的pTNT载体(Promega)和用于逆转录病毒产生的pCX4bsr1。对使用病毒的2A肽序列的多顺反子表达而言，使F2A寡核苷酸、T2A寡核苷酸和E2A寡核苷酸(表1)退火的并且分别克隆到pBluescript SK+载体的EcoRI/SpeI、SpeI/XbaI和XbaI/NotI位点。重编程因子的cDNA与框架中的2A肽序列连接，然后克隆到pVEE-S-IRES-Puro。从p5’VEE/S/GFP/Pac3构建pVEE-S-IRES-Puro用以克隆重编程的因子。简略地，用XbaI/MfeI消化删除p5’VEE/S/GFP/Pac中的GFP/Pac基因和部分的3’UTR，然后引入多克隆位点(MCS；NdeI、AscI、BbvCI、ClaI、MfeI、FseI和NotI)(表1)，IRES和来自pCX4puro的嘌呤霉素抗性基因。为了方便起见，这一载体被改名为pVEE-IRES-Puro。为了产生带有T7RNA核糖核酸聚合酶的RNA，通过使用VEE载体的SacI/BstZ17I片段作为模板的PCR(表1)，SP6启动子(ATTTAGGTGACACTATAG(例如见SEQ ID NO:31，16844-16861))被T7启动子(TAATACGACTCACTATAG(例如见SEQID NO:32，16843-16860))取代(SP6启动子位于SacI位点旁边)。

表1：PCR克隆引物

mRNA和复制子RNA合成。pTNT-B18R质粒用于B18R mRNA的合成。pTNT载体包含5’β-球蛋白前导序列和合成的多聚腺苷酸尾(30个碱基)从而增强基因表达。多聚腺苷酸的30个碱基不足以稳定mRNA，因此通过多聚腺苷酸尾聚合酶添加额外的多聚腺苷酸尾。使用RiboMAX大规模RNA产生系统-SP6(Promega)试剂盒用修饰的核苷酸进行B18R-mRNA的合成。用100％的带有假尿苷(Psi)的UTP(TriLink Biotechnologies)或25％的分别带有Psi和5-甲基胞苷(5mc)的UTP和CTP(TriLink Biotechnologies)的置换进行修饰。转录反应后，通过DNA酶消化移除DNA模板。通过用苯酚/氯仿/异戊醇(PCI)和氯仿/异戊醇(CI)萃取纯化mRNA，然后通过乙酸铵沉淀(2.5M)浓缩，根据厂商说明书(Epicentre)选择性沉淀RNA，同时将绝大多数蛋白、DNA和未合并的NTP留在上清液中。通常100μl反应规模使用10μg线性化质粒，并且接收大约400μg mRNA。对mRNA的5’帽化而言，使用ScriptCap m7G帽化系统^TM并且ScriptCap 2’-O-甲基转移酶(Epicentre，目前可购于CELLSCRIPT)从而产生帽1-帽化的RNA，其继续进行帽化的定量完成。5’帽化后，通过乙酸铵沉淀简单地纯化mRNA，然后通过多聚腺苷酸聚合酶(Epicentre，目前可购于CELLSCRIPT)添加额外的多聚腺苷酸。通过PCI和CI萃取纯化mRNA产生的5’帽化和多聚腺苷酸尾，接下来是铵沉淀。对复制子RNA的合成而言，通过M1uI消化线性化模板质粒，然后以与mRNA合成相同的方式用于RNA合成。进行没有RNA修饰的RNA复制子合成。DNA酶处理后，通过乙酸铵沉淀纯化合成的RNA，没有有机纯化因为绝大多数大的RNA在有机萃取后陷于中间相。如上文所述的向复制子RNA添加5’帽化和多聚腺苷酸尾，然后通过没有有机纯化的乙酸铵沉淀纯化。所有RNA都以1μg/μl浓度再悬浮在RNA储存液(Ambion)中并且储存在-80℃下直到使用。

B18R条件培养基(B18R-CM)的制备。将25％双修饰的B18RmRNA(1μg对应6孔平板的1孔)转移到带有Lipofectamine 2000的HFF(Invitrogen)。3小时后，将细胞培养在含有15％FCS(合格的ES细胞,Millipore)、盘尼西林和链霉素的Advanced DMEM(Invitrogen)或ES培养基中。第二天收集培养基，过滤并且用细胞培养基稀释5倍，然后用作B18R-CM(20％B18R-CM)。通过mRNA的重复转染的效率简单地测量B18R-CM的活性。

通过复制子转染产生iPS。在第0天将BJ或HFF传代到6孔平板上并且在第1天培养到约90-100％克隆率(4×10⁵个细胞/孔)。用Lipofectamine 2000转染1μg RNA混合物(VEE RNA复制子与B18RmRNA比率3:1)。25％双修饰的B18-mRNA或100％Psi修饰的mRNA用于共转染。3小时后，将转染培养基变为含有15％FCS(合格的ES细胞,Millipore)、盘尼西林和链霉素的Advanced DMEM(Invitrogen)。从第2天起细胞培养在含有B18R-CM和嘌呤霉素(0.8μg/ml)的培养基中。每天替换培养基并且每3天(第1、4、7、10或14天)进行转染。从第7天起使用ES培养基。在第7天或第11天移除嘌呤霉素。最后一次转染后1天，将细胞传代到STO饲养层，并且培养在含有B18R-CM的ES培养基中。每天替换ES培养基并且培养直至产生iPS细胞克隆。机械地挑选用于克隆分离的集落或用碱性磷酸酶检测试剂盒(Millipore)染色或在含有1mg/ml FastRed TR(Sigma)和0.4mg/ml 1-萘基磷酸盐(Sigma)的AP缓冲液(100mM Tris、100mM NaCl和50mMMgCl₂,pH 9.5)中人工地制备AP-染色的溶液。

RT-PCR用于RNA复制子的检测。用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)或TRIzol(Invitrogen)分离总RNA。然后用乙酸铵沉淀纯化TRIzol纯化的RNA。用QuantiTect Rev进行cDNA的合成。用转录试剂盒(Qiagen)或iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)从1μg总RNA。20μl RT反应中1-2μl用于PCR扩增。用PCRx增强子(Invitrogen)补充的Taq DNA聚合酶(NEB)进行PCR：94℃下3分钟，初始变性；94℃下25秒，56℃下25秒，68℃下30秒的36个循环；接下来是72℃下5分钟。RT-PCR所用的引物序列描述于表1中。

TaqMan RT-PCR。用RNeasy迷你试剂盒从iPSC克隆、HUES-9、BJ和HFF的无饲养细胞培养中分离总RNA。根据制造厂商说明书使用RNA-Ct一步反应(Applied Biosystem)进行TaqMan RT-PCR反应。每一反应使用10ng总RNA。引物和探针获自AB TaqMan基因表达分析产品目录(GAPDH,Hs99999905_m1；POU5F1 Hs03005111_g1；Sox2Hs01053049_s1；DNMT3B Hs00171876_m1；TERTHs00972656_m1；Lin28 Hs00702808_s1；Nanog Hs02387400_g1；TDGF1 Hs02339499_g1)。以一式三份地进行定量PCR反应，条件如下：55℃下20分钟，95℃下10分钟，40个循环的95℃下0.15分钟和65℃下1分钟。在7300实时PCR系统(Applied Biosystems)上使用δ-δCt方法分析数据。

重亚硫酸盐基因组测序。根据制造厂商说明书用EZ DNA甲基化金试剂盒(Zymo Research)将基因组DNA的未甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶。然后将转换的基因组DNA用于使用ZymoTaq^TM DNA聚合酶(Zymo Research)PCR扩增OCT4或NANOG的启动子区域。将PCR产物从pBluescript SK+克隆到T载体，然后测序。PCR所用的引物序列描述于表1中。

畸胎瘤形成。用STO饲养细胞培养iPSC克隆。通过accutase处理收集细胞，然后肌内地或皮下地注射到裸鼠的后肢肌肉或背侧(大约10cm培养皿培养的细胞用于1次注射)。注射后5-8周，切开肿瘤并且用4％多聚甲醛固定。肿瘤包埋在石蜡中，切片，然后进行三个胚层标志物的苏木色素和伊红(H&E)染色或免疫染色。AE1/AE3(细胞角蛋白)、NF-1(神经元细胞)和GFAP(神经元细胞)用于外胚层的标志物，肌间线蛋白(肌细胞)用于中胚层标志物，AFP(原始的和明确的内胚层)用于内胚层标志物。

免疫荧光染色。在PBS中洗涤细胞两次，用4％多聚甲醛固定10分钟。用含0.1％Triton X-100的PBS处理洗涤的细胞10分钟。室温下用2％BSA封闭细胞1小时，然后在PBS中，在4℃下用第一抗体孵育过夜。洗涤细胞并且用第二抗体孵育随后用DAPI或Hoechst33342孵育，然后洗涤并且储存在PBS中。以1:100-1:500稀释使用第一抗体诸如兔抗-Oct4、羊抗-Nanog和抗-Sox2，鼠抗-SSEA4、抗Tra-1-60和抗-Tra-1-81抗体。以1:800稀释使用Alexa Fluor 488(BDBiosciences)第二抗体。

抗体。本研究中所用的抗体如下：抗-OCT4(sc-9081)、抗-KLF4(sc-20691)、抗-GLIS1(sc-67584)、抗-c-MYC(sc-42),抗-LIN28(sc-54030)、TRA-1-60(sc-21705)、来自Santa Cruz的SSEA1(sc-21702)和SSEA4(sc-21704)；来自R&D Systems的抗-SOX2(AF2018)和抗-NANOG(AF1997)；来自Stemgent的TRA-1-81(09-0011)；来自Labvision的AE1/AE3(RB-9010P0)、肌间线蛋白(MS-376-S0)、AFP(RB-365)和GFAP(RB-087)；来自NovusBiological的NF-1(NB-300-155)。

RNA序列。用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)分离总RNA，如本领域中已知的合成并且分析每一细胞的cDNA文库。

为研究基于RNA的iPS产生方案，努力集中于方法：1)利用能够自我复制有限数目的细胞分裂的单一RNA种类，因此减少转染的数量；2)能够编码至少四个重编程的因子开放阅读框(ORF)；以及3)在高阈值水平随多细胞分裂持续地表达所有4个RF基因。为异位表达所有四个RF，使用修饰的非传染的，自我复制的委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒RNA复制子，所述VEE被目前研究用作疫苗研发的表达平台。VEE复制子为阳性链，模拟细胞的带有5’-帽和多聚腺苷酸尾mRNA的单RNA种类，不利用DNA中间物，从而没有基因组整合的风险。VEE编码四个非结构复制复合体蛋白(nsP)作为RNA的5’末端中单一的ORF，其与3’末端中病毒结构蛋白ORF分离(图1a)。Petrakova等显示了通过用GFP置换3’结构蛋白ORF表达外源性蛋白的能力。然而，细胞暴露于单链的VEE RNA诱导了强烈的IFN-α/β固有性免疫反应，这严重限制了本方法。

为评估VEE RNA复制子，用GFP，随后内部核糖体进入位点(IRES)和嘌呤霉素抗性基因(Puror)(图1a)置换3’ORF。使用标准的SP6聚合酶体外转录试剂盒产生VEE-GFP RNA，随后5’-帽化和多聚腺苷酸尾添加而由此得到高产率的全长11500ntRNA转录。为缓解针对VEE-GFP RNA的固有性免疫反应，使用来自于西式牛痘病毒的B18R蛋白，其结合并且中和I型IFNs。进行在重组的B18R蛋白存在的情况下单独地用VEE-GFP RNA转染原代人包皮成纤维细胞(HFF)或VEE-GFP RNA与B18R mRNA共转染原代人包皮成纤维细胞(HFF)的比较。与诱导暴露于单链的RNA的细胞强烈的固有性免疫反应相符，没有B18R时，几乎观察不到GFP表达(图1b)。尽管重组的B18R蛋白的添加增加了GFP表达，GFP荧光水平还是非常低的。然而，VEE-GFP RNA复制子与B18R mRNA的共转染产生了HFF中高水平的GFP表达(图1b-d)，这显示了B18R为有效表达来自VEE-RNA复制子蛋白所必需。

iPS细胞的产生需要重编程的因子持续的，高水平表达大于7天；因此，检测成纤维细胞中VEE-GFP复制子的持久性。在第1天用VEE-GFP RNA复制子和B18R mRNA(3:1比率)共转染HFF，然后在第2天在B18R条件培养基(CM)加上/减去嘌呤霉素存在或不存在的情况下培养细胞HFF。尽管未处理的VEE-GFP RNA/B18R mRNA转染的细胞在第1天显示了高水平的GFP表达，随后几天表达水平快速下降到第7天到基线值(图1e)。而且，在不存在持续的B18R-CM暴露时，VEE-GFP RNA转染的细胞停止生长和/或倍固有性免疫反应杀死(图1d)。相比之下，B18R-CM/嘌呤霉素处理的VEE-GFP RNA/B18R mRNA转染的细胞维持持久的高水平的GFP表达，大于90％细胞具有健康生长的特征(图1d,e)。这些结果显示B18R暴露克服VEE RNA诱导的固有性免疫反应问题的能力并且还展示了通过B18R-CM的暴露或取消选择性保持或降解细胞的VEE RNA复制子。

基因改造VEE RNA复制子3’ORF从而编码三个重编程的因子OCT4、KLF4、SOX2，被内部核糖体跳跃2A肽所分隔的单一组合的ORF。ORF随后为IRES，然后是c-MYC(OKS-iM)或GLIS18(OKS-iG)，这避免了c-MYC所诱导的基因组的不稳定性，随后是第二IRES和嘌呤霉素抗性基因(Puror)(图1a；表1)。与VEE-GFP RNA方案相似，通过SP6体外转录产生VEE-RF RNA，5’-帽化和多聚腺苷酸尾添加由此得到高产率的全长约14,500nt VEE-OKS-iM RNA或约15,000ntVEE-OKS-iG RNA。VEE-OKS-iM RNA或VEE-OKS-iG RNA复制子加上B18R mRNA(3:1比率)共转染到BJ或HFF人成纤维细胞导致了所有四个RF超过逆转录病毒RF表达水平的延长的高水平的表达(图1f)。这些观察结果显示单一合成的VEE-RF RNA复制子在原代的人细胞中表达四个重编程的因子同时利用B18R阻断固有性免疫反应的能力。

为研究基于RNA的iPS细胞产生方案，评估几个参数，包括VEE-RF RNA转染的数量和时间，嘌呤霉素对VEE-RF RNA复制子保留的选择，和VEE-RF RNA复制子的基因组成(图1a、2a)。尽管RF-RNA的复合转染甚至单转染导致iPS细胞产生，在B18R存在的情况下三个或四个转染持续地导致最高数量的碱性磷酸酶阳性(AP+)集落产生(Fig.2b-d)。VEE-OKS-iM和VEE-OKS-iG RNA方案机械地分离大于100个iPS细胞集落并且大于95％成功率具有分离的iPS样克隆持续性分裂并且保持人胚胎干细胞(hESC)形态的能力。在分离的大于100个iPS样集落中，分离30个集落用于免疫荧光标记干细胞的表达。分析的所有30个VEE RF-RNA iPS克隆(6个HFF-OKS-iM克隆、12个BJ-OKS-iM克隆、6个HFF-OKS-iG克隆、6个BJ-OKS-iG克隆显示了外源性OCT4、SOX2及NANOG强的细胞核染色和SSEA4、TRA-1-60及TRA-1-81强的细胞表面染色，SSEA1阴性染色(图2e)。为除去VEE-RF RNA复制子，所有iPS方案在重编程期间第7天或第10天移除B18R-CM和嘌呤霉素(图2a)。为确认VEE-RF RNA复制子的完全消失，研发能够检测<10毫微微克VEE RF-RNA复制子的高度敏感和特异的qRT-PCR方案(图4)。如所期望的，qRT-PCR分析显示所有iPS细胞克隆都已没有VEE-RF RNA复制子(表2)。而且，4个独立的iPS细胞克隆(BJ-OKS-iM#2&#21,BJ-OKS-iG#5,HFF-OKS-iM#1)的核型分析显示了正常的二倍体核型(图5)。

表2：通过qRT-PCR检测RF-RNA复制子

a；iM指来自OKS-iM RNA复制子的克隆，iG指来自OKS-iG RNA复制子的克隆。b；RT-PCR区域,R1；nsP2,R2；nsP4,R3；Oct4-T2A-Klf4(OK),c；传代到饲养细胞之前培养皿上的转染(PL)，d；传代到饲养细胞后转染(FD)。+；检测的阳性条带，+/-；检测的模糊条带,-；没有检测到条带。ND；没有做。

为进一步地表征建立的iPS细胞克隆，分析通过qRT-PCR人ES标志物基因的表达。与人HUES9ES细胞中表达水平相符，用OKS-iM或OKS-iG VEE-RF RNA方案从亲代的BJ和HFF成纤维细胞产生的iPS克隆表达了稳健水平的外源性OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、TDGF1、DNMT3B和TERT，与起始的亲代BJ和HFF成纤维细胞中低水平表达或无表达形成对照(图3a)。诱导的多能性的标志为OCT4和NANOG启动子区域中减少的CpG二核苷酸的DNA甲基化。OCT4和NANOG启动子区域的重亚硫酸盐基因组测序显示iPS细胞克隆与亲代成纤维细胞相比有广泛的去甲基化(图3b)。为研究iPS细胞克隆中基因组宽度mRNA表达谱，对OKS-iM和OKS-iG VEE-RF RNA所产生的iPS细胞克隆进行全基因组RNA测序(RNA-seq)，亲代BJ和HUES-9ES细胞对照。通过RNA-seq分析的所有四个iPS细胞克隆显示了高度分化的亲代人成纤维细胞人HUES-9ES细胞特有的无人监督的层次聚类和表达特征(图3c,d)。最后，通过免疫功能不全的小鼠中畸胎瘤形成，它们分化为所有三个胚层的细胞的能力，测试人iPS细胞克隆的体内多能性。所有VEE-RF RNA iPS克隆分析所形成的含有来自三个胚层的代表性细胞类型畸胎瘤，通过免疫组织化学染色所确认的H&E染色检测(图3e；图6)。共同地，这些观察结果确认了OKS-iM和OKS-iG VEE RF-RNA复制子有效地产生多能的人iPS细胞的能力。

iPS细胞的产生对个性化干细胞治疗的发展具有很大的潜能；然而，明确的一致的基于RNA产生iPS细胞的方法仍然是难题。本公开文本提供了简单的，高度可再生的基于RNA，通过单一的合成的表达一个、两个、三个、四个或多个独立的重编程的因子的VEE-RF RNA复制子的转染产生iPS细胞的方法。通过与人ES细胞平行的严格的体内生物学标准和分子标准VEE-RF RNA产生的iPS细胞获得所有全能性。VEE-RF RNA转录的产生利用不需要特殊条件标准的SP6体外转录试剂盒，因此进一步地简化了方法以便广泛使用。通过持续性高水平地随时间表达四个RF连同用于有限数量的多重细胞产生的VEE-RFRNA复制，VEE-RF RNA方法解决了与通过四个个体的RF mRNA的每天重复每天转染持续大于14天尝试产生iPS细胞有关的主要的低效率问题。重要地，VEE-RF RNA为异位的不利用DNA中间物的击跑配合的方法，因此没有机会发生基于DNA载体的iPS细胞方法可能发生的整合突变。而且，通过将B18R从培养基撤出可以调节降解所造成的VEE-RF RNA复制子丧失的时间点。使用VEE-RF RNA方法,OCT4/KLF4/SOX2/c-MYC和OCT4/KLF4/SOX2/GLIS1 VEE-RF RNA方案从两个独立的亲代人成纤维细胞群产生大于100个独立的iPS细胞克隆。另外，可以基因改造VEE-RF RNA从而表达可选的RF组合和/或额外的RF ORF插入到RF-RNA骨架用于从特定的细胞类型提纯iPS细胞产生或用于驱动转分化。总之，对有效的产生人iPS细胞最终用于人干细胞治疗和再生医学而言，VEE-RF RNA复制子方法具有广泛的适用性。

登录号。已提交RNA-Seq数据并且可以通过基因表达综合数据库(GFO)登录号GSE38265访问。

表3：VEE-RF RNA复制子iPS细胞产生

尽管以上已描述了许多实施方案和特征，本领域中那些技术人员应理解的是可以对所述的实施方案和特征进行各种修改和变化，而没有背离本公开文本的教导或附加的权利要求所限定的本公开文本的范围。

Claims

1.甲病毒复制子RNA，其包含：

至少一个来自甲病毒的非结构性复制酶域和至少一个编码因子的非甲病毒的异源性序列，所述因子用于当在体细胞中表达时诱导多能干细胞的产生。

2.如权利要求1所述的甲病毒复制子RNA，其中所述复制子包含获自甲病毒的序列，所述甲病毒选自东方马脑炎病毒(EEE)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、埃弗格赖德病毒、穆坎博病毒、皮春纳病毒和西方马脑炎病毒(WEE)。

3.如权利要求1所述的甲病毒复制子RNA，其中所述复制子包含获自甲病毒的序列，所述甲病毒选自辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒、米德尔堡病毒、基孔肯雅病毒、阿尼昂尼昂病毒、罗斯河病毒、巴马森林病毒、盖他病毒、鹭山病毒、贝巴鲁病毒、马雅罗病毒、乌纳病毒、奥拉病毒、瓦塔罗阿病毒、巴班肯病毒、Kyz病毒、高地J病毒、摩根堡病毒、恩杜姆病毒和博吉河病毒。

4.如权利要求1所述的甲病毒复制子RNA，其中所述至少一个非甲病毒的异源性序列包含至少2、3、4或5个非甲病毒的异源性序列。

5.如权利要求1-4中任一项所述的甲病毒复制子RNA，其中所述非甲病毒的异源性序列选自编码KLF多肽、SOX-2多肽、OCT-3/4多肽、c-MYC或n-MYC或L-MYC多肽、GLIS1多肽、NANOG多肽及其任何组合的多核苷酸。

6.如权利要求5所述的甲病毒复制子RNA，其中所述编码KLF多肽的多核苷酸编码与SEQ ID NO:8序列具有至少95％同一性的KLF多肽。

7.如权利要求5所述的甲病毒复制子RNA，其中所述编码KLF多肽的多核苷酸编码具有SEQ ID NO:8序列的KLF多肽。

8.如权利要求5所述的甲病毒复制子RNA，其中所述编码KLF多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:7所示的序列，其中“T”为“U”。

9.如权利要求5所述的甲病毒复制子RNA，其中所述编码SOX-2多肽的多核苷酸编码与SEQ ID NO:6序列具有至少95％同一性的SOX-2多肽。

10.如权利要求5所述的甲病毒复制子RNA，其中所述编码SOX-2多肽的多核苷酸编码具有SEQ ID NO:6序列的SOX-2多肽。

11.如权利要求5所述的甲病毒复制子RNA，其中所述编码SOX-2多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:5所示的序列，其中“T”为“U”。

12.如权利要求5所述的甲病毒复制子RNA，其中所述编码OCT-4多肽的多核苷酸编码与SEQ ID NO:4序列具有至少95％同一性的OCT-4多肽。

13.如权利要求5所述的甲病毒复制子RNA，其中所述编码OCT-4多肽的多核苷酸编码具有SEQ ID NO:4序列的OCT-4多肽。

14.如权利要求5所述的甲病毒复制子RNA，其中所述编码OCT-4多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:3所示的序列，其中“T”为“U”。

15.如权利要求5所述的甲病毒复制子RNA，其中所述编码c-MYC多肽的多核苷酸编码与SEQ ID NO:10序列具有至少95％同一性的c-MYC多肽。

16.如权利要求5所述的甲病毒复制子RNA，其中所述编码c-MYC多肽的多核苷酸编码具有SEQ ID NO:10序列的c-MYC多肽。

17.如权利要求5所述的甲病毒复制子RNA，其中所述编码c-MYC多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:9所示的序列，其中“T”为“U”。

18.如权利要求5所述的甲病毒复制子RNA，其中所述编码GLIS1多肽的多核苷酸编码与SEQ ID NO:34序列具有至少95％同一性的GLIS1多肽。

19.如权利要求5所述的甲病毒复制子RNA，其中所述编码GLIS1多肽的多核苷酸编码具有SEQ ID NO:34序列的GLIS1多肽。

20.如权利要求5所述的甲病毒复制子RNA，其中所述编码GLIS1多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:33所示的序列，其中“T”为“U”。

21.如权利要求5所述的甲病毒复制子RNA，其中所述编码NANOG多肽的多核苷酸编码与SEQ ID NO:2序列具有至少95％同一性的NANOG多肽。

22.如权利要求5所述的甲病毒复制子RNA，其中所述编码NANOG多肽的多核苷酸编码具有SEQ ID NO:2序列的NANOG多肽。

23.如权利要求5所述的甲病毒复制子RNA，其中所述编码NANOG多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:1所示的序列，其中“T”为“U”。

24.如权利要求1所述的甲病毒复制子RNA，其中所述复制子从5’到3’包含：(VEE RNA复制酶)-(启动子)-(RF₁)-(自切割肽)-(RF₂)-(自切割肽)-(RF₃)-(IRES或核心启动子)-(RF₄)-(IRES或任选的启动子)-(任选的选择性标记物)-(VEE 3’UTR和聚腺苷酸尾)-(任选的选择性标记物)-启动子；其中RF_1-4为诱导体细胞去分化为多能细胞的因子，其中RF_2-3为任选的，RF_3-4为任选的，或RF₄为任选的；其中RF_1-4选自Oct-4、Klf4、Sox-2、c-Myc、Nanog和Glis1。

25.如权利要求1或24所述的甲病毒复制子RNA，其中所述复制子包含与SEQ ID NO:29、30、31或32从大约位置1到大约位置756190％、95％、98％、99％或100％同一的序列，其中所述序列的“T”被“U”取代，接着是一个或多个RF，再接着是3’UTR和聚腺苷酸尾，其中所述一个或多个RF选自Oct-3/4、Sox-2、Klf4、c-Myc、Nanog和Glis1；其中当存在多个RF时，编码序列可被内部核糖体进入位点(IRES)或小启动子所分隔。

26.如权利要求25所述的甲病毒复制子RNA，其中所述复制子包含与选自SEQ ID NO:29、30、31或32的序列至少95％、98％、99％或100％同一的序列，其中“T”为“U”。

27.组合物，其包含用权利要求1-26中任一项所述的复制子转化的人细胞。

28.如权利要求27所述的组合物，其还包含B18R条件培养基。

29.如权利要求27所述的组合物，其中所述人细胞为体细胞。

30.如权利要求29所述的组合物，其中所述人细胞为成纤维细胞。

31.制备干细胞的方法，其包括在表达复制子的编码序列的条件下培养权利要求27所述的组合物至少30天，和分离干细胞。

32.制备干细胞的方法，其包括用权利要求1-26中任一项所述的复制子转化体细胞，在促进所述复制子表达的条件下培养所述体细胞，和分离干细胞。

33.如权利要求31或32所述的方法，其中所述培养包括在B18R条件培养基中培养所述细胞。

34.如权利要求33所述的方法，其中通过将B18R mRNA转染到原代人成纤维细胞来产生所述B18R条件培养基。

35.从权利要求31或33所述的方法所获得的分离的干细胞，其中所述干细胞没有逆转录病毒的DNA或RNA。

36.方法，其包括：

使人体细胞与异位的自我复制的RNA复制子接触，所述复制子包含编码至少四种选自以下的去分化因子的多核苷酸：(i)KLF4，(ii)OCT4，(iii)SOX2，(iv)c-MYC或n-MYC或L-MYC，(v)GLIS1和(vi)NANOG；

培养所述体细胞以表达所述去分化因子；

选择呈现干细胞形态和/或干细胞标志物的细胞；以及

继代培养所述细胞以获得诱导性干细胞群。

37.如权利要求36所述的方法，其中通过检测肿瘤排斥抗原1-60和/或1-81的表达来选择所述细胞。

38.用于产生人干细胞的载体系统，其包含

至少一个自我复制的RNA复制子，所述复制子包含一个或多个编码选自以下的去分化因子的多核苷酸：KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、GLIS1、NANOG或其任何组合。

39.如权利要求38所述的载体系统，其中所述复制子包含：

(a)Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，或

(b)Oct4、Sox2、Klf4和Glis1。

40.如权利要求38所述的载体系统，其中一个自我复制的RNA载体源自甲病毒。

41.如权利要求40所述的载体系统，其中所述甲病毒为VEE。

42.包含异位的RNA复制子的分离的人体细胞，所述复制子包含一个或多个去分化多核苷酸序列。

43.如权利要求42所述的人体细胞，其中在表达所述异位的RNA复制子中的去分化多核苷酸的培养条件下，所述体细胞去分化。

44.细胞群，包含权利要求43所述的细胞。

45.通过权利要求35所述的方法获得的细胞群。

46.如权利要求44或45所述的细胞群或权利要求35或36所述的方法，其中所述细胞或方法包括在抑制所述异位的RNA复制子降解的培养基中培养所述细胞。