CN114072513A - 用表达永生化蛋白的自我复制型rna载体的细胞扩增 - Google Patents

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Abstract

包含编码至少一种永生化蛋白的序列的合成的、自我复制型RNA载体，以及自我复制型RNA载体延长原代细胞群体的寿命和扩增所述原代细胞群体的用途。

Description

用表达永生化蛋白的自我复制型RNA载体的细胞扩增
相关申请
本申请要求于2019年6月27日提交的美国优先权专利申请号62/867,505的优先权利益，所述美国优先权专利申请的全部内容整体引入本文。
技术领域
本公开内容涉及用于扩增原代细胞群体的组合物和方法。
背景技术
原代细胞直接从人组织或动物组织中分离。因此，它们更类似于体内状态并且显示出正常的细胞生理学。然而，原代细胞会死亡并且具有有限的寿命，即它们在一定次数的细胞分裂后停止分裂(或衰老)。永生化基因如端粒酶、细胞癌基因和病毒癌基因已用于原代细胞的永生化。然而，将这些永生化基因例如病毒癌基因整合到原代细胞的基因组内可改变原代细胞的完整性。用于使原代细胞可逆地永生化的手段将是非常有益的。
发明内容
在本公开内容的各个方面提供了编码一种或多种永生化蛋白的自我复制型RNA载体。一般而言，自我复制型RNA载体基于甲病毒(例如委内瑞拉马脑炎病毒)，其中编码病毒结构蛋白的序列缺失并替换为编码至少一种永生化蛋白的序列。在一些实施方案中，至少一种永生化蛋白选自人端粒酶(hTert)、人乳头状瘤病毒16型E6蛋白(HPV16 E6)、人乳头状瘤病毒16型E7蛋白(HPV16 E7)、猿猴空泡病毒40大T抗原(SV40 LT)、cMyc-T58A蛋白、同源框HoxB8蛋白、同源框HoxA9蛋白、同源框HoxA10蛋白、腺病毒E1A蛋白、腺病毒E1B蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶4 (CDK4)、Ras V12蛋白、多梳复合体蛋白Bmi1、hsp70成员9 (HSPA9)或其组合。
本公开内容的另一个方面提供了包含本文公开的任何自我复制型RNA载体的原代细胞。
本公开内容的另外一个方面包括编码本文公开的任何自我复制型RNA载体的质粒载体。
本公开内容的一个进一步方面提供了用于延长原代细胞群体中的寿命的方法，所述方法包括将本文公开的任何自我复制型RNA载体引入原代细胞群体内，其中在至少一种永生化蛋白表达后，与未用自我复制型RNA载体转染和/或未暴露于至少一种永生化蛋白的对照原代细胞群体相比，所述原代细胞群体具有增加的寿命。
本公开内容的再一个方面包括用于扩增原代细胞群体的方法，所述方法包括(a)将本文公开的任何自我复制型RNA载体引入原代细胞群体内，其中在至少一种永生化蛋白表达后，与未用自我复制型RNA载体转染和/或未暴露于至少一种永生化蛋白的对照原代细胞群体相比，所述原代细胞群体具有增加的寿命；并且(b)一旦原代细胞群体达到适当的细胞数量，就通过稀释和/或经由干扰素先天性免疫应答，从原代细胞群体中去除自我复制型RNA载体。
下文更详细地描述了本公开内容的其它方面和迭代。
附图说明
专利或申请文件含有至少一个彩色绘制的附图。本专利或专利申请公开的具有彩色附图的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。
图1呈现了显示本文公开的几种自我复制型RNA载体的结构的图示。
图2显示了在细胞经受衰老相关的β-半乳糖苷酶染色方案后，模拟转染和RFP-hTert转染的BJ成纤维细胞的图像。
图3呈现了RFP-hTert (无E3L)转染和RFP-hTert-E3L转染的MSC的荧光(左)和明场(右)图像。
图4呈现了模拟转染、RFP-hTert-E3L转染、RFP-hTert-E6E7-E3L转染和RFP-htert-T58A-E3L转染的成人HEK细胞的明场图像。
图5A显示了在自我复制型RNA载体去除之前和之后，RFP-hTert-E3L转染、RFP-hTert-E6E7-E3L转染和RFP-htert-T58A-E3L转染的MSC的明场图像。
图5B示出了在指示的自我复制型RNA载体去除之前和之后，MCS标记物基因CD44和CD105的表达。
图6呈现了用指示的自我复制型RNA载体转染的HEK细胞的明场(左)和荧光+明场(右)图像。
图7A显示了通过流式细胞术测量的S-ATG、S-ATA、S-ATC、S-ATT、P-ATG、P-ATA、P-ATC和P-ATT的GFP表达。细胞在嘌呤霉素(P)、B18R蛋白(B)和鲁索替尼(R)的存在下培养4周。
图7B呈现了在第14天时S-ATG、S-ATA、S-ATC、S-ATT、P-ATG、P-ATA、P-ATC和P-ATT的GFP表达的荧光图像。
图8A显示了在HFF中通过流式细胞术在第1天时，使用ATC形式对于在nsP2-773处的位置的所有20种氨基酸的GFP表达。
图8B显示了在HFF中通过流式细胞术在第7天时，使用ATC形式对于在nsP2-773处的位置的14种氨基酸的GFP表达。
图8C显示了在HFF中通过流式细胞术在第14天时，使用ATC形式对于在nsP2-773处的位置的14种氨基酸的GFP表达。
图8D显示了在NIH3T3细胞中通过流式细胞术在第1天时，使用ATC形式对于在nsP2-773处的位置的所有20种氨基酸的GFP表达。
图8E显示了在NIH3T3细胞中通过流式细胞术在第7天时，使用ATC形式对于在nsP2-773处的位置的8种氨基酸的GFP表达。
图8F显示了在NIH3T3细胞中通过流式细胞术在第14天时，使用ATC形式对于在nsP2-773处的位置的8种氨基酸的GFP表达。
图9A呈现了在HFF中在用S-ATG-E6E7-GFP2和W-ATC-E6E7-GFP2转染后第5天时GFP的荧光图像。
图9B显示了在用S-ATG-E6E7-GFP2和W-ATC-E6E7-GFP2转染到成人HEK细胞内之后的群体倍增水平(PDL)。细胞在B18R蛋白(200 ng/mL)、嘌呤霉素(0.2-0.8 µg/mL)和鲁索替尼(1 µM)的存在下进行培养。
图10显示了在VEE基因组的第三个核苷酸以及在nsP2-773处的氨基酸位置处的突变概括。
具体实施方式
本公开内容提供了包含编码至少一种永生化蛋白的序列的合成的自我复制型RNA载体。自我复制型RNA载体可以用于对原代细胞群体提供瞬时永生化和所述细胞群体的扩增。此外，原代细胞的完整性得以保持，因为永生化序列没有整合到细胞的基因组内。一旦已达到所需的细胞扩增程度，就可以通过稀释或经由干扰素免疫应答，从细胞中去除自我复制型RNA载体。
(I)编码永生化蛋白的自我复制型RNA载体
本公开内容的一个方面提供了编码至少一种永生化蛋白的合成的自我复制型RNA载体。自我复制型RNA载体基于修饰的甲病毒，其中编码病毒结构蛋白的序列已缺失并替换为编码至少一种永生化蛋白的序列。自我复制型RNA载体包含编码多种复制复合体蛋白的序列，其确保RNA载体在几代细胞中复制，但由于病毒结构基因的缺失，病毒载体并不形成感染性颗粒。在进入细胞内之后，RNA载体充当病毒复制复合体蛋白和一种或多种永生化蛋白翻译的模板。复制的RNA不能与细胞DNA重组，并且因此，不存在将永生化基因整合到细胞的基因组内的风险。此外，在不存在基因组整合的情况下，原代细胞的完整性可以得到维持。
(a)合成的自我复制型RNA
合成的自我复制型RNA(或复制子)含有编码蛋白的翻译和RNA载体的复制所需的所有序列元件。特别地，复制子基于修饰的甲病毒，其中非结构复制酶基因得到维持，并且结构基因(制备感染性颗粒所需的)被去除。在各个实施方案中，修饰的甲病毒可以衍生自奥拉病毒、巴班肯病毒、巴马森林病毒、贝巴鲁病毒、Buggy Creek病毒、基孔肯雅病毒、东部马脑炎病毒、大沼泽地病毒、摩根堡病毒、盖塔病毒、高地J病毒、Kyz病毒、马亚罗病毒、米德尔堡病毒、穆坎布病毒、恩杜姆病毒、皮克孙纳病毒、奥尼翁尼翁病毒、罗斯河病毒、鹭山病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒、乌纳病毒、委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒、西方马脑炎病毒或沃达罗河病毒。在某些实施方案中，合成的自我复制型RNA基于修饰的塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒或委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒，其中结构基因已被去除。在具体实施方案中，合成的自我复制型RNA基于修饰的VEE病毒，其中结构基因已被去除。参见例如，Yoshioka等人(Cell Stem Cell 13，246–254，2013年8月1日)和/或Petrakova等人(J.Virology；第72卷，第12期，2005年6月，第7597-7608页)，所述参考文献各自在此整体引入本文作为参考。
自我复制型RNA包含编码多种非结构复制复合体蛋白的序列。在具体实施方案中，合成的自我复制型RNA可以编码四种非结构复制复合体蛋白(即nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)。非结构复制复合体蛋白可以由单个开放读码框(ORF)编码。在一些实施方案中，编码非结构复制复合体蛋白的序列包含相对于野生型病毒的至少一个核苷酸变化。
自我复制型RNA载体进一步包含编码至少一种永生化蛋白的序列，其在下文部分(I) (b)中详述。
一般而言，自我复制型RNA包含5'帽、在5'端处的5'非翻译区(UTR)、以及在3'端处的3' UTR和多聚A尾。自我复制型RNA载体一般包含在编码一种或多种永生化蛋白的序列上游的启动子。上游启动子可以是26S亚基因组启动子。
在一些实施方案中，自我复制型RNA可以进一步包含编码至少一种可选择标记物的序列。合适的可选择标记物的非限制性实例包括嘌呤霉素、遗传霉素、新霉素、潮霉素B、杀稻瘟菌素(blastidinin) S等等。
在其它实施方案中，自我复制型RNA可以进一步包含编码干扰素应答的抑制剂的序列。合适的干扰素应答抑制剂的实例包括但不限于牛痘病毒蛋白E3L、牛痘病毒蛋白B18R、流感病毒蛋白NS1或淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒核蛋白。
在另外其它实施方案中，自我复制型RNA可以进一步包含编码至少一种荧光蛋白的序列。合适的荧光蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白(例如GFP、eGFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、Emerald、Azami Green、Monomeric Azami Green、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黄色荧光蛋白(例如YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、蓝色荧光蛋白(例如BFP、EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)、青色荧光蛋白(例如ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-Cyan)、红色荧光蛋白(例如mKate、mKate2、mPlum、DsRed单体、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)、橙色荧光蛋白(例如mOrange、mKO、Kusabira-Orange、Monomeric Kusabira-Orange、mTangerine、tdTomato)或其组合。荧光蛋白可以包含一种或多种荧光蛋白(例如，Suntag)的串联重复。
各种蛋白编码序列可以通过内部核糖体进入序列(IRES)或编码2A肽的序列分开。合适的2A肽的非限制性实例包括明脉扁刺蛾病毒(thosea asigna virus) 2A肽或T2A、口蹄疫病毒2A肽或F2A、马鼻炎A病毒2A肽或E2A和猪捷申病毒-1 2A肽或P2A。
在特定实施方案中，自我复制型RNA可以基于修饰的委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒，并且从5'到3'可以包含：5'帽、5' UTR、编码来自VEE的四种非结构复制酶的序列、启动子、编码永生化蛋白的序列(如果编码多于一种永生化蛋白，则每个序列可以由IRES或2A肽序列分开)、任选的IRES、编码E3L蛋白的任选序列、任选的IRES、编码可选择标记物的任选序列、甲病毒3’ UTR和多聚A尾。
(b)永生化蛋白
自我复制型RNA载体还包含编码至少一种永生化蛋白的序列。永生化蛋白赋予细胞无限增殖的能力。合适的永生化蛋白的非限制性实例包括人端粒酶(hTert)、人乳头状瘤病毒16型E6蛋白(HPV16 E6)、人乳头状瘤病毒16型E7蛋白(HPV16 E7)、猿猴空泡病毒40大T抗原(SV40 LT)、cMyc-T58A蛋白、同源框HoxB8蛋白、同源框HoxA9蛋白、同源框HoxA10蛋白、腺病毒E1A蛋白、腺病毒E1B蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶4 (CDK4)、Ras V12蛋白、多梳复合体蛋白Bmi1、hsp70成员9 (HSPA9)或其组合。在特定实施方案中，至少一种永生化蛋白可以是hTert、HPV16 E6-E7、SV40 LT、cMyc-T58A或其组合。
在各种实施方案中，至少一种永生化蛋白可以连接到至少一种纯化标签或表位标签。合适的纯化标签或表位标签的非限制性实例包括His、6xHis、Flag、3XFlag、HA、GST、Myc、SAM等等。
在其中自我复制型RNA载体编码多于一种永生化蛋白的实施方案中，编码序列可以通过内部核糖体进入序列(IRES)或编码2A肽的序列分开。
(c)具体实施方案
在一个实施方案中，自我复制型RNA载体基于修饰的VEE病毒，并且包含编码hTert的序列。在另一个实施方案中，自我复制型RNA载体基于修饰的VEE病毒，并且包含编码HPV16 E6-E7的序列。在另外一个实施方案中，自我复制型RNA载体基于修饰的VEE病毒，并且包含编码SV40 LT的序列。在另一个实施方案中，自我复制型RNA载体基于修饰的VEE病毒，并且包含编码hTert和HPV16 E6-E7的序列。在再一个实施方案中，自我复制型RNA载体基于修饰的VEE病毒，并且包含编码hTert和SV40 LT的序列。在一个进一步实施方案中，自我复制型RNA载体基于修饰的VEE病毒，并且包含编码hTert和cMyc-T58A的序列。
(II)包含自我复制型RNA载体的原代细胞
本公开内容的另一个方面包含原代细胞，所述原代细胞包含上文部分(I)中描述的任何一种自我复制型RNA载体。也就是说，原代细胞已用自我复制型RNA载体之一进行转染。一种或多种永生化蛋白在所述原代细胞中的表达致使细胞变得“永生化”，并且与未用本文公开的自我复制型RNA载体转染和/或未暴露于永生化蛋白的可比较的对照细胞相比，显示出延长的寿命和/或经历另外轮次的细胞分裂。因为编码永生化蛋白的序列并未整合到原代宿主细胞的基因组内，所以永生化表型通过稀释和/或经由干扰素免疫应答而去除自我复制型RNA载体是可逆的。此外，因为编码永生化蛋白的序列并未整合到宿主细胞的基因组内，所以这些细胞维持了原始组织的特征和特性，这些细胞从所述原始组织分离。
在一些实施方案中，包含本文公开的自我复制型RNA载体的原代细胞可以进一步包含p53 siRNA/shRNA和/或RB siRNA/shRNA。阻断细胞周期进程的p53蛋白和/或RB蛋白的干扰或敲减可能提供另外的细胞永生化。
在其它实施方案中，包含本文公开的自我复制型RNA载体的原代细胞可以进一步包含牛痘病毒E3L蛋白、牛痘病毒B18R蛋白或其组合，其可能提供自我复制型RNA载体的持续表达。
原代细胞是直接从人组织或动物组织中分离的细胞。合适的原代细胞的非限制性实例包括脂肪细胞、星形胶质细胞、血细胞(例如红细胞系、淋巴样)、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、毛细胞、肝细胞、角质形成细胞、黑素细胞、肌细胞、神经元、成骨细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、干细胞(例如间充质干细胞、造血干细胞等)或滑膜细胞。
在一些实施方案中，原代细胞可以是哺乳动物的。在具体实施方案中，原代细胞可以具有人起源。
(III)编码自我复制型RNA载体的质粒载体
本公开内容的一个进一步方面提供了编码上文部分(I)中所述的自我复制型RNA的质粒载体。特别地，质粒载体包含编码来自甲病毒的非结构复制复合体蛋白的序列，编码一种或多种永生化蛋白的序列，以及另外的病毒序列例如5’ UTR、亚基因组启动子和3’UTR，任选的可选择标记物序列，任选的干扰素抑制剂序列，任选的IRES等。
一般而言，编码自我复制型RNA的质粒载体是DNA载体。编码自我复制型RNA的序列可以与启动子序列可操作地连接用于体外RNA合成，所述启动子序列由噬菌体RNA聚合酶识别。例如，启动子序列可以是T7、T3或SP6启动子序列，或者T7、T3或SP6启动子序列的变体。启动子序列可以是野生型的，或者它可以进行修饰用于更有效或高效的表达。质粒载体可以进一步包含至少一种转录终止序列，以及用于在细菌细胞中繁殖的至少一种复制起点和/或可选择标记物序列(例如抗生素抗性基因)。质粒载体可以衍生自pUC、pBR322、pET、pBluescript或其变体。关于载体及其用途的另外信息可以在“Current Protocols inMolecular Biology" Ausubel等人，John Wiley & Sons，New York，2003，或者“MolecularCloning: A Laboratory Manual” Sambrook & Russell，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，第3版，2001中找到。
在自我复制型RNA的体外合成后，RNA可以使用标准程序或商购可得的试剂盒进行纯化、5'加帽和多聚腺苷酸化。
(IV)用于延长细胞寿命和扩增细胞群体的方法
本公开内容的一个进一步方面包括用于延长原代细胞群体中的细胞寿命的方法。该方法包括将如本文公开的编码至少一种永生化蛋白的任何一种自我复制型RNA载体引入原代细胞群体内，其中在至少一种永生化蛋白表达后，与未用编码永生化蛋白的自我复制型RNA载体转染和/或未暴露于永生化蛋白的对照原代细胞群体相比，所述原代细胞群体具有增加的寿命。
自我复制型RNA载体可以通过各种转染手段引入细胞群体内。合适的转染方法包括核转染(或电穿孔)、磷酸钙介导的转染、阳离子聚合物转染(例如，DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺)、脂质体转染、阳离子脂质体转染、免疫脂质体转染、非脂质体脂质转染、树枝状聚合物转染、热休克转染、磁性转染、脂转染、基因枪递送、穿刺转染(impalefection)、声致穿孔、光学转染和专有试剂增强的核酸摄取。
一般而言，将细胞群体维持在适合于细胞生长和/或维持的条件下。本领域技术人员了解用于培养细胞的方法是本领域已知的，并且可以且将根据细胞的类型而变。在所有情况下，常规优化都可以用于确定用于特定细胞类型的最佳技术。
原代细胞具有有限的寿命，所述寿命在不同类型的原代细胞中以及在来自不同供体的相同类型的细胞中可能不同。与未处理的可比较的对照细胞相比，在用本文公开的自我复制型RNA载体转染的原代细胞中，可以增加寿命(例如，数天、数周等)。一般而言，相对于未处理的对照细胞，在用本文公开的自我复制型RNA载体转染的原代细胞群体中，平均寿命可以增加至少约20%、至少约50%、至少约80%、至少约1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约8倍或至少约10倍。
类似地，原代细胞具有有限的复制能力，例如，它们经历预定的、有限次数的细胞分裂(或细胞倍增)，其在不同类型的原代细胞中以及在来自不同供体的相同类型的细胞中可能不同。与未处理的可比较的对照细胞相比，在用本文公开的自我复制型RNA载体转染的原代细胞中，细胞分裂的次数可以是增加的。一般而言，相对于未处理的对照细胞，在用本文公开的自我复制型RNA载体转染的原代细胞群体中，细胞分裂的次数可以增加至少约20%、至少约50%、至少约80%、至少约1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约8倍或至少约10倍。
在自我复制型RNA载体的复制过程中，不存在DNA中间体。因此，复制的RNA不能与细胞DNA重组，并且不存在将永生化序列整合到细胞的基因组内的风险。因为不存在癌基因或永生化序列的基因组整合，所以原代细胞的完整性得到维持。也就是说，原代细胞维持原始组织的真实特性，其中原代细胞从所述原始组织分离。另外，因为不存在癌基因或永生化序列的基因组整合，所以染色体的稳定性得到维持。
上文详述的方法可以进一步包括一旦原代细胞群体达到适当的细胞数量，就从原代细胞群体中去除自我复制型RNA载体的步骤。倍数扩增或适当的细胞数量可以并且将取决于扩增细胞的细胞类型和预期用途而变。可以经由稀释随时间从细胞群体中去除自我复制型RNA载体。还可以通过允许(例如，不压制)由RNA载体引发的强干扰素(IFN)免疫应答，从细胞群体中去除自我复制型RNA载体。例如，可以从细胞中去除干扰素抑制因子E3L和/或B18R。
在自我复制型RNA载体去除后，扩增的原代细胞群体可以恢复到原始的非永生化状态，例如，具有有限寿命并具有原始组织特性的原代细胞。
扩增的原代细胞群体可以在临床或治疗上使用。非限制性治疗用途包括T细胞疗法、间充质干细胞疗法、骨髓细胞疗法、免疫细胞疗法等等。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有由本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。下述参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (第2版，1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker编辑，1988)；The Glossary of Genetics，第5版，R. Rieger等人(编辑)，Springer Verlag (1991)；以及Hale & Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。如本文使用的，除非另有说明，否则下述术语具有归于其的含义。
当介绍本公开内容或其优选实施方案的要素时，冠词“一个”、“一种”、“该”和“所述”预期意指存在一个或多个要素。术语“包含”、“包括”和“具有”预期是包含性的，并且意指可以存在除所列要素外的另外要素。
当关于数值例如x使用时，术语“约”意指x ± 5%。
就基因或多核苷酸而言的术语“表达”指基因或多核苷酸的转录，以及适当时，mRNA转录物翻译成蛋白或多肽。因此，如根据上下文将明确的，蛋白或多肽的表达起因于开放读码框的转录和/或翻译。
如本文使用的，“基因”指编码基因产物的DNA区域(包括外显子和内含子)，以及调控基因产物的产生的所有DNA区域，无论此类调控序列是否与编码序列和/或转录序列相邻。相应地，基因包括但不一定限于启动子序列、终止子、翻译调控序列例如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点和基因座控制区域。
术语“多肽”和“蛋白”可互换使用，以指氨基酸残基的聚合物。
由于可以在上述细胞和方法中进行各种改变而不脱离本发明的范围，因此预期上文说明书和下文给出的实施例中含有的所有内容都应该被解释为说明性的而不是以限制性含义进行解释。
实施例
下述实施例说明了本公开内容的某些方面。
实施例1. 用于永生化的自我复制型RNA载体的构建
编码hTert、HPV16-E6E7、cMyc-T58A、SV40 LT或其组合的合成的、多顺反子的、自我复制型RNA基于修饰的委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒而生成，在所述修饰的委内瑞拉马脑炎病毒中，结构基因已被去除(即，SimpliconTMCloning Vector E3L；MilliporeSigma)。各种载体的示意图在图1中进行图解。还将hTert克隆到并不编码E3L的VEE克隆载体内(E3L压制对RNA的自我复制的干扰素(IFN)应答。)
对于RNA合成，在37℃下在CleanCap® Reagent AG (Trilink)的存在下，使用RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7 (Promega)试剂盒，使每种载体线性化并且合成RNA并进行5'加帽，持续2小时。在一些情况下，用酶促加帽方法(例如，ScriptCap™ Cap1 Capping System)进行5'加帽。在纯化和用2.5 M乙酸铵的沉淀后，RNA以1 μg/μl的浓度重悬浮于RNA Storage Solution (Ambion)中，并且贮存于-80°C下。
实施例2. 人原代成纤维细胞和人间充质干细胞的永生化
将Simplicon-RFP-hTert (无E3L)转染到人原代包皮(BJ)成纤维细胞内，并且细胞在B18R蛋白(也压制IFN应答)和嘌呤霉素的存在下进行连续培养。模拟转染的BJ细胞在传代28次左右停止生长，而RFP-hTert转染的BJ细胞在传代28次后保持生长。衰老相关的β-半乳糖苷酶染色显示了模拟转染的BJ细胞中的强染色，而表达RFP-hTert的BJ细胞中存在非常弱的染色(图2)。
这些结果指示了hTert表达可以使人原代成纤维细胞永生化。
人间充质干细胞(MSC)用RFP-hTert (无E3L)或RFP-hTert-E3L RNA进行转染，并且在B18R蛋白和嘌呤霉素的存在下进行连续培养。将MSC传代9次，并且用荧光显微镜捕获RFP表达和增殖状态(图3)。表达RFP-hTert-E3L的MSC比表达RFP-hTert (无E3L)的细胞生长得更好，指示了E3L表达似乎是MSC的永生化所需的。
实施例3. 经由hTert和病毒癌基因的组合使成年人表皮角质形成细胞永生化
人表皮角质形成细胞(HEK)用RFP-hTert-E3L、RFP-hTert-E6E7-E3L或RFP-hTert-T58A-E3L进行转染，并且在B18R蛋白和嘌呤霉素的存在下进行连续培养。捕获第4代细胞(4次传代的细胞)并且在显微镜下显现。模拟和RFP-hTert-E3L转染的HEK细胞显示了扩大的、部分分化的形态，具有减少的细胞密度(指示了缓慢增殖)，而大多数RFP-hTert-E6E7-E3L转染的HEK细胞保持正常的形态和增殖率(图4)。就正常形态和增殖而言，RFP-hTert-T58A-E3L转染的细胞介于RFP-hTert-E3L和RFP-hTert-E6E7-E3L转染的细胞之间。这些结果指示hTert和HPV16-E6E7表达的组合可能是HEK细胞的永生化需要的。
实施例4. 在Simplicon RNA去除后表型的恢复
MSC用RFP-hTert-E3L、RFP-hTert-E6E7或RFP-hTert-T58A RNA进行转染，并且在B18R蛋白和嘌呤霉素的存在下进行连续培养。MSC细胞传代四次，然后在不存在B18R蛋白和嘌呤霉素的情况下进行培养，以去除Simplicon RNA，然后进一步传代两次。
表达RFP-hTert的细胞显示了正常形态，而hTert与E6E7或cMyc-T58A的组合显示了略微转化的表型。这些转化的表型在Simplicon RNA去除后得到恢复。(图5A)。细胞增殖率也通过hTert和E6E7的组合得到显著增加(数据未显示)。
使用Alexa Fluor 488(绿色荧光)标记的抗体和流式细胞术，在Simplicon RNA去除之前和之后，检查了MSC标记物基因的表达(图5B)。在用hTert永生化的细胞中，标记物基因例如CD44和CD105的表达并未改变。在用hTert-E6E7永生化的细胞中，CD44和CD105的表达是降低的(绿线)，但在Simplicon RNA去除后，这些标记物基因的表达得到恢复(蓝线)。在用hTert-T58A永生化的细胞中，CD105标记物基因的表达是降低的(绿线)，但在Simplicon RNA去除后，CD015表达得到恢复(蓝线)。
实施例5. 成人HEK细胞仅经由病毒癌基因的永生化
HEK细胞用RFP-hTert-E6E7、E6E7-RFP或RFP-SV40 LT进行转染，然后在B18R蛋白和嘌呤霉素的存在下连续培养7天。模拟细胞显示了扩大和平坦的表型(部分分化的)和减慢的增殖，而表达RFP-hTert-E6E7和E6E7-RFP的细胞显示了正常的角质形成细胞形态并保持增殖。SV40 LT转染的细胞显示了转化表型和正常表型的混合表型(图6)。这些数据指示了E6E7表达可能足以使HEK细胞永生化。
实施例6. 用VEE主链突变体调整基因表达水平
永生化基因的表达水平影响永生化的效率和质量。为了用自我复制型RNA调整永生化基因的表达，我们测试了已知影响表达和致细胞病变效应的VEE主链的点突变体。首先，我们测试了已知影响对细胞的致细胞病变效应的VEE基因组的第三个核苷酸(Journalof Virology，2005，P7597-7608，doi:10.1128/JVI.79.12.7597–7608.2005)。我们测试了各种核苷酸(A、C、G、T)的GFP表达。其次，我们测试了在nsP2蛋白位置773处的氨基酸点突变体。原始VEE在此位置处具有“脯氨酸(P)”，而非致细胞病变突变体在此位置处具有“丝氨酸(S)”。我们比较了第三个核苷酸(A、C、G、T)和nsP2-773氨基酸(P和S)的所有组合(总共8种)的GFP表达。简言之，这些突变体如下命名：对于在位置nsP2-773处的“S”或“P”，氨基酸分别标记为“S”或“P”，并且“A”、“C”、“G”和“T”的第三个核苷酸分别标记为ATA、ATC、ATG和ATT。生成含有TagGFP2的所有种类的自我复制型RNA (S-ATG、S-ATA、S-ATC、S-ATT、P-ATG、P-ATA、P-ATC和P-ATT)，并且转染到HFF内且检查GFP表达。突变的定位概括于图10中。
在4周的长期表达中，用P-ATC形式获得了强表达(图7A和7B)。因此，我们测试了具有第三个核苷酸“C” (ATC形式)的更多组合。接下来，我们用ATC形式测试了在nsP2-773处的位置的所有20种氨基酸。如图8A、8B和8C (分别为第1天、第7天和第14天)中所示，我们获得了在HFF中的nsP2-773处具有不同氨基酸的高、中、低和无表达水平。在nsP2-773位置处的“P”和“W”为高表达，“G”、“S”和“A”为中表达，而其它为低表达或无表达。当使用NIH3T3细胞时，获得了类似的结果(图8D、8E和8F)。“M”、“F”和“T”在HFF和NIH3T3细胞两者中均表达低水平。因此，我们将“M”、“F”和“T”分类为低的。总之，对于第三个核苷酸“C” (ATC形式)，我们将nsP2-773突变体“P”和“W”鉴定为高表达，“G”、“S”、“A”鉴定为中表达，“M”、“F”、“T”鉴定为低表达。这些不同的表达主链可用于调整基因表达。
实施例7. 成人HEK细胞用高表达主链(W-ATC)的永生化
接下来，我们测试了VEE主链的W-ATC形式用于成年人角质形成细胞(HEK)的永生化。我们用W-ATC主链生成了含有E6E7癌基因和TagGFP2的自我复制型RNA。如图9A中所示，W-ATC主链在HFF中显示了比S-ATG主链更强的GFP表达。然后，我们将E6E7癌基因引入HEK细胞内，并且使HEK细胞永生化。如图9B中所示，与模拟转染的细胞相比，HEK-W-E6E7细胞(W-ATC)以及HEK-S-E6E7 (S-ATG)细胞显示了延长的寿命。

Claims (35)

1.一种基于甲病毒的自我复制型RNA载体，其中编码病毒结构蛋白的序列缺失并替换为编码至少一种永生化蛋白的序列。
2. 权利要求1的自我复制型RNA载体，其中所述至少一种永生化蛋白选自人端粒酶(hTert)、人乳头状瘤病毒16型E6蛋白(HPV16 E6)、人乳头状瘤病毒16型E7蛋白(HPV16E7)、猿猴空泡病毒40大T抗原(SV40 LT)、cMyc-T58A蛋白、同源框HoxB8蛋白、同源框HoxA9蛋白、同源框HoxA10蛋白、腺病毒E1A蛋白、腺病毒E1B蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、Ras V12蛋白、多梳复合体蛋白Bmi1、hsp70成员9 (HSPA9)或其组合。
3. 权利要求2的自我复制型RNA载体，其中所述至少一种永生化蛋白选自hTert、HPV16E6和HPV16 E7 (HPV16 E6-E7)、SV40 LT、cMyc-T58A或其组合。
4. 权利要求1至3中任一项的自我复制型RNA载体，其中所述甲病毒为奥拉病毒、巴班肯病毒、巴马森林病毒、贝巴鲁病毒、Buggy Creek病毒、基孔肯雅病毒、东部马脑炎病毒、大沼泽地病毒(Everglades virus)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)、盖塔病毒、高地J病毒、Kyz病毒(Kyzylagach virus)、马亚罗病毒、米德尔堡病毒、穆坎布病毒、恩杜姆病毒、皮克孙纳病毒(Pixuna virus)、奥尼翁尼翁病毒(O'nyong-nyong virus)、罗斯河病毒、鹭山病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒、乌纳病毒、委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒、西方马脑炎病毒或沃达罗河病毒(Whataroa virus)。
5.权利要求4的自我复制型RNA载体，其中所述甲病毒是塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒或VEE。
6.权利要求4或5的自我复制型RNA载体，其中所述甲病毒是VEE。
7.权利要求1至6中任一项的自我复制型RNA载体，其中编码所述甲病毒的非结构复制复合体蛋白的序列包含相对于野生型甲病毒的至少一个核苷酸变化。
8.权利要求1至7中任一项的自我复制型RNA载体，其中所述载体进一步包含编码至少一种荧光蛋白的序列。
9.权利要求1至8中任一项的自我复制型RNA载体，其中所述载体进一步包含编码至少一种可选择标记物的序列。
10.权利要求1至9中任一项的自我复制型RNA载体，其中所述载体进一步包含编码牛痘病毒E3L蛋白的序列。
11. 权利要求1至10中任一项的自我复制型RNA载体，其中所述RNA载体基于VEE病毒，并且包含编码hTert、HPV16 E6-E7、SV40 LT或cMyc-T58A的序列。
12. 权利要求1至10中任一项的自我复制型RNA载体，其中所述RNA载体基于VEE病毒，并且包含编码hTert和HPV16 E6-E7的序列。
13. 权利要求1至10中任一项的自我复制型RNA载体，其中所述RNA载体基于VEE病毒，并且包含编码hTert和SV40 LT的序列。
14.权利要求1至10中任一项的自我复制型RNA载体，其中所述RNA载体基于VEE病毒，并且包含编码hTert和cMyc-T58A的序列。
15.一种原代细胞，其包含权利要求1至14中任一项的自我复制型RNA载体。
16. 权利要求15的原代细胞，其进一步包含p53 siRNA和/或RB siRNA。
17.权利要求15或16的原代细胞，其进一步包含牛痘病毒E3L蛋白、牛痘病毒B18R蛋白或其组合。
18.权利要求15至17中任一项的原代细胞，其具有人起源。
19.权利要求15至18中任一项的原代细胞，其选自脂肪细胞、星形胶质细胞、血细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、毛细胞、肝细胞、角质形成细胞、黑素细胞、肌细胞、神经元、成骨细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、干细胞或滑膜细胞。
20.一种质粒载体，其编码如权利要求1至14中任一项指定的自我复制型RNA载体。
21.权利要求20的质粒载体，其进一步包含用于体外转录的T7或SP6启动子。
22.一种用于延长原代细胞群体中的寿命的方法，所述方法包括将如权利要求1至14中任一项指定的自我复制型RNA载体引入原代细胞群体内，其中在所述至少一种永生化蛋白表达后，与未用自我复制型RNA载体转染和/或未暴露于至少一种永生化蛋白的对照原代细胞群体相比，所述原代细胞群体具有增加的寿命。
23.权利要求22的方法，其中与对照原代细胞群体相比，所述原代细胞群体经历另外的细胞分裂。
24.权利要求22或23的方法，其进一步包括将牛痘病毒E3L蛋白、牛痘病毒B18R蛋白或其组合引入所述原代细胞群体内。
25. 权利要求22至24中任一项的方法，其进一步包括将p53 siRNA和/或RB siRNA引入所述原代细胞群体内。
26.权利要求22至25中任一项的方法，其中所述原代细胞群体具有人起源。
27.权利要求22至26中任一项的方法，其中所述原代细胞群体选自脂肪细胞、星形胶质细胞、血细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、毛细胞、肝细胞、角质形成细胞、黑素细胞、肌细胞、神经元、成骨细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、干细胞或滑膜细胞。
28. 一种用于扩增原代细胞群体的方法，所述方法包括：
(a)将如权利要求1至14中任一项指定的自我复制型RNA载体引入原代细胞群体内，其中在所述至少一种永生化蛋白表达后，与未用自我复制型RNA载体转染和/或未暴露于至少一种永生化蛋白的对照原代细胞群体相比，所述原代细胞群体具有增加的寿命；和
(b)一旦所述原代细胞群体达到适当的细胞数量，就通过稀释和/或经由干扰素先天性免疫应答，从所述原代细胞群体中去除自我复制型RNA载体。
29.权利要求28的方法，其中在步骤(a)时，与对照原代细胞群体相比，所述原代细胞群体经历另外的细胞分裂。
30.权利要求28或29的方法，其中步骤(a)进一步包括将牛痘病毒E3L蛋白、牛痘病毒B18R蛋白或其组合引入所述原代细胞群体内。
31. 权利要求28至30中任一项的方法，其中步骤(a)进一步包括将p53 siRNA和/或RBsiRNA引入所述原代细胞群体内。
32.权利要求28至31中任一项的方法，其中步骤(b)包括通过稀释去除所述自我复制型RNA载体。
33.权利要求28至32中任一项的方法，其中步骤(b)包括经由干扰素免疫应答去除所述自我复制型RNA载体。
34.权利要求28至33中任一项的方法，其中所述原代细胞群体具有人起源。
35.权利要求28至34中任一项的方法，其中所述原代细胞群体选自脂肪细胞、星形胶质细胞、血细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、毛细胞、肝细胞、角质形成细胞、黑素细胞、肌细胞、神经元、成骨细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、干细胞或滑膜细胞。
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