CN111770998A - 神经系统细胞的制作方法 - Google Patents

Abstract

一种神经系统细胞的制作方法，其包括：准备干细胞的步骤；通过感染将仙台病毒导入至干细胞，在干细胞内表达在仙台病毒中合成诱导因子的mRNA，从而将干细胞诱导为神经系统细胞的步骤。

Description

神经系统细胞的制作方法

技术领域

本发明涉及细胞技术，涉及神经系统细胞的制作方法。

背景技术

诱导性多能干细胞(iPS细胞)能够转化为构成身体的任意细胞。因此，期待将能够转化为各种体细胞或组织的iPS细胞用于细胞移植治疗或药物研发研究中。而且，例如在2014年，由iPS细胞制作的视网膜细胞被应用于移植治疗中。不仅在日本，而且在世界其他国家，也在推进由iPS细胞制作脑细胞、各种器官的细胞并将其用于移植治疗的项目。

目前，有许多使iPS细胞转化为分化细胞的方法。然而，为了将iPS细胞用于移植治疗中，重要的是确立iPS细胞的效率良好的诱导方法。具体而言，需要确立在将iPS细胞诱导为分化细胞时使用的技术，使诱导的效率及精度提高，从而使所制作的分化细胞的功能性等能够耐受移植治疗。

目前，由iPS细胞或胚胎干细胞(ES细胞)诱导为分化细胞的方法以如下方式进行：通过将决定细胞性质的激素或生长因子、以及低分子化合物组合，且使它们的量比或浓度随时间变化，由此模仿产生的过程。然而，难以在试管中完全模仿产生的过程且效率差。而且，与小鼠的体细胞的诱导期相比而言，人类需要非常长的诱导期，例如在目前，需要3个月以上来制作成熟的神经。

另外，诱导的效率根据ES/iPS细胞株而有较大的不同，存在所诱导的体细胞的性质不均一等的问题。实际地在多个ES细胞克隆中添加化学物质以制造各种细胞时，结果表明：存在容易诱导为胰腺细胞的克隆、或容易诱导为心脏细胞的克隆等，在通过克隆而诱导的容易度上存在差异(例如参照非专利文献1)。而且，利用被称为无血清凝聚悬浮培养法(SFEBq方法)由数十种iPS细胞制作神经细胞时，结果证明：存在难以变化为神经细胞的iPS/ES细胞克隆(例如参照非专利文献2)，上述SFEBq方法是通过在不包含血清或抑制诱导为神经细胞的化学物质的培养基中培养iPS细胞，由iPS细胞/ES细胞制作神经细胞。

具体而言，以下已被确认，即使用利用激素或化学物质的方法由人类ES/iPS细胞所诱导的细胞在初期阶段为胎儿阶段的体细胞。人类成熟体细胞的诱导极其困难，需要经过数个月的长期培养。然而，在以完成发育的个体为对象的药物研发或移植医疗中，重要的是制作与个体的成熟度一致的体细胞。

而且，在神经细胞中存在各种亚型细胞，但在利用激素或化学物质的方法中，无法由ES/iPS细胞均一地诱导这些亚型神经。因此，无法进行特定的神经亚型特异性药物研发筛选。因此，药物研发筛选的效率低。而且，在移植医疗中，也无法仅浓缩移植疾病的某种特定细胞。

对此，提出了如下的方法：使用整合到基因组中的脱氧核糖核酸(DNA)病毒将用于规定特定体细胞性质的基因直接导入到ES/iPS细胞中，以制作目标体细胞。与利用激素或化学物质的方法相比而言，使用整合到基因组中的DNA病毒的方法可以在例如2周这样的非常短的时间内特异性地制作成熟的神经细胞。而且，如果通过导入特定基因来制作神经细胞，则可以均一地仅获得例如兴奋性神经。因此，可以进行特定的神经亚型特异性药物研发筛选，在移植医疗中，也可以仅浓缩移植疾病的某种特定细胞。

然而，在为了表达特定基因而使用整合到基因组中的DNA病毒将干细胞诱导为体细胞的方法中，基因被插入到ES/iPS细胞的基因组上，对内源性基因造成损伤。其结果，不能正确地进行药物研发筛选，并且存在在移植中伴随有癌变风险的问题(例如参照非专利文献3、4)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Nature Biotechnol 26(3):313-315,2008.

非专利文献2：PNAS,111:12426-12431,2014

非专利文献3：N Eng J Med,346:1185-1193,2002

非专利文献4：Science 302:415-419,2003

发明内容

发明所欲解决的课题

本发明的课题在于提供一种神经系统细胞的制作方法，其可以并不对细胞的基因造成损伤地在短时间内效率良好地制作神经系统细胞。

解决课题的手段

根据本发明的实施方式提供一种神经系统细胞的制作方法，其包括：准备干细胞的步骤；通过感染将仙台病毒导入至干细胞，在干细胞内表达在仙台病毒中合成诱导因子的信使核糖核酸(mRNA)，从而将干细胞诱导为神经系统细胞的步骤。

于上述神经系统细胞的制作方法中，干细胞可以是诱导性多能干细胞(iPS细胞)。

于上述神经系统细胞的制作方法中，干细胞可以是胚胎干细胞(ES细胞)。

于上述神经系统细胞的制作方法中，诱导因子可以包含neurogenin(神经原素，NGN)。诱导因子可以仅包含neurogenin(神经原素，NGN)。

于上述神经系统细胞的制作方法中，诱导因子可以包含achaete-scute homolog(无刚毛鳞甲同源物，ASCL)。

于上述神经系统细胞的制作方法中，诱导因子可以包含myelin transcriptionfactor(髓鞘转录因子，MYT)。

于上述神经系统细胞的制作方法中，诱导因子可以包含distal-less homeobox(无远端同源框，DLX)。

于上述神经系统细胞的制作方法中，神经系细胞可以是神经细胞、神经干细胞及神经元前体细胞的任意一种。神经细胞可以是选自由兴奋性神经细胞、抑制性神经细胞、多巴胺能神经细胞、运动神经细胞及脑神经细胞所组成的群组的至少一种。神经系统细胞可以是少突胶质前体细胞及少突胶质细胞。

于上述神经系统细胞的制作方法中，神经系统细胞可以是选自NGN基因阳性、ASCL基因阳性、MYT基因阳性、及DLX基因阳性的至少一种。

于上述神经系统细胞的制作方法中，神经系统细胞可以是选自由酪氨酸羟化酶(TH)阳性、TUJ1阳性、BRN2阳性、NGN阳性、β-III微管蛋白阳性、MAP2阳性、PSA-NCAM阳性、vGLUT阳性、SATB2阳性、chAT阳性、HB9阳性、MUNC13阳性、HOMER1阳性、vGAT阳性、及GAD65/67阳性所组成的群的至少一种。

于上述神经系统细胞的制作方法中，仙台病毒可以在干细胞内表达耐药性基因的mRNA。

于上述神经系统细胞的制作方法中，耐药性基因可以是选自耐嘌呤霉素性基因、耐杀稻瘟菌素性基因、耐潮霉素性基因、及耐新霉素性基因所组成的群的至少一种。

上述神经系统细胞的制作方法还可以包括：在使干细胞感染了仙台病毒之后，选择显示出耐药性的细胞的步骤。

上述神经系统细胞的制作方法还可以包括：在使干细胞感染了仙台病毒之后，选择显示出选自由耐嘌呤霉素性、耐杀稻瘟菌素性、耐潮霉素性、及耐新霉素性所组成的群的至少一种耐药性的细胞。

于上述神经系统细胞的制作方法中，感染仙台病毒时的干细胞密度可以是在12孔板的孔中为0.2×10⁵个/孔～1.0×10⁶个/孔。

于上述神经系统细胞的制作方法中，仙台病毒的感染复数(MOI：multiplicity ofinfection)可以是每次0.1～100.0。

于上述神经系统细胞的制作方法中，使干细胞感染仙台病毒时的培养基可以是选自mTeSR(注册商标)1、TeSR2(注册商标)及Stem Fit的任一种。

发明的效果

根据本发明，可提供一种神经系统细胞的制作方法，其可以并不对细胞的基因造成损伤地在短时间内效率良好地制作神经系统细胞。

附图说明

图1是实施例1的细胞的显微镜照片。

图2是实施例1的使用抗BRN2抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图3是实施例2的使用抗HOMER1抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图4是实施例3的使用抗MAP2抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图5是实施例4的使用抗MUNC13-1抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图6是实施例5的使用抗SATB2抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图7是实施例6的使用抗TUJ1抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图8是实施例7的使用抗vGLUT抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图9是实施例8的使用抗chAT抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图10是实施例9的使用抗HB9抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图11是实施例10的使用抗TH抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图12的(a)及图12的(b)是实施例11的细胞的显微镜照片。图12的(c)是实施例11的使用抗TUJ1抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图13是实施例12的使用抗BRN2抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图14是实施例13的使用抗GAD65/67抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图15是实施例14的使用抗MAP2抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图16是实施例15的使用抗vGAT抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图17是实施例16的使用抗TUJ1抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图18是实施例17的使用抗MAP2抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图19是实施例18的使用抗BRN2抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图20是实施例19的使用抗vGAT抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图21是实施例20的使用抗GAD65/67抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图22是实施例21的使用抗TH抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图23是实施例22的使用抗chAT抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图24是实施例23的使用抗vGLUT抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图25是实施例24的使用抗SATB2抗体而进行了荧光标识的细胞的荧光显微镜照片。

图26是表示实施例25的流式细胞术的结果的图表。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式加以详细说明。另外，以下所示的实施方式例示了用以体现本发明的技术思想的装置或方法，本发明的技术思想并不将构成构件的组合等特定为下述内容。本发明的技术思想可以在权利要求的范围内加以各种变更。

本发明的实施方式的由干细胞制作体细胞的方法包含：准备干细胞的步骤；通过感染将仙台病毒导入至干细胞，在干细胞内表达在仙台病毒中合成诱导因子的mRNA，从而将干细胞诱导为神经细胞的步骤。

干细胞可使用诱导性多能干细胞(iPS细胞)及胚胎干细胞(ES细胞)的两者。干细胞可以是人类的干细胞，也可以是非人类动物的干细胞。

所谓诱导，是指重编程、启动、转形、分化转化(Transdifferentiation orLineage reprogramming)、分化诱导及细胞命运转变(Cell fate reprogramming)等。

作为被诱导的神经系统细胞的例子，可列举神经细胞、神经干细胞及神经元前体细胞。作为神经细胞的例子，可列举兴奋性神经细胞、抑制性神经细胞、多巴胺能神经细胞、运动神经细胞、及脑神经细胞。或者，神经系统细胞可以是少突胶质前体细胞及少突胶质细胞等。

导入至干细胞的仙台病毒(SeV)具有表达如下mRNA的RNA基因组：合成将干细胞诱导为神经细胞的诱导因子的mRNA。另外，可表达任意mRNA的重组仙台病毒载体的制作例如可委托ID Pharma株式会社利用专利技术进行。作为合成诱导因子的mRNA，例如可列举NGN2等NGN基因的mRNA、ASCL1等ASCL基因的mRNA、MYT1L等MYT基因的mRNA、及DLX2等DLX基因的mRNA。NGN2、ASCL1、MYT1L、及DLX2是生成神经细胞所需的开关蛋白质。NGN2可生成兴奋性神经细胞。ASCL1、MYT1L、DLX2分别可生成抑制性神经细胞。ASCL1与MYT1L的组合可生成兴奋性神经细胞、抑制性神经细胞、及多巴胺能神经细胞。

例如，导入至干细胞的仙台病毒表达选自NGN2等NGN基因的mRNA、ASCL1等ASCL基因的mRNA、MYT1L等MYT基因的mRNA、及DLX2等DLX基因的mRNA的至少一种作为合成诱导因子的mRNA。

仙台病毒还可以具有表达耐药性基因的mRNA的RNA基因组。所谓药剂，例如是嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、潮霉素、新霉素、G418、及博莱霉素等抗生素。例如，导入至干细胞的仙台病毒表达耐药性基因的mRNA。表达了耐药性基因的mRNA的细胞显示出耐药性。

在仙台病毒表达了耐药性基因的mRNA的情况下，可以在感染后选择显示耐药性的细胞。例如，在用仙台病毒表达耐嘌呤霉素性基因、耐杀稻瘟菌素性基因、耐潮霉素性基因、耐新霉素性基因、耐G418性基因、及耐博莱霉素(Zeocin、注册商标)性基因的mRNA的至少任一种的情况下，可通过将感染后的细胞暴露于对应的抗生素中，使导入了仙台病毒的细胞以外的细胞死亡，从而筛选导入了仙台病毒的细胞。

仙台病毒例如可具有能够表达如下mRNA的RNA：包含NGN2基因的mRNA及耐嘌呤霉素性基因的mRNA的mRNA(以下称为“NGN2-Puro mRNA”)。NGN2基因的mRNA的序列例如与序列编号1(小鼠)或序列编号2(人类)所示的DNA序列对应。表达了NGN2-Puro mRNA的细胞产生NGN2，且表现出耐嘌呤霉素性。

仙台病毒例如可具有能够表达如下mRNA的RNA：包含ASCL1基因的mRNA、MYT1L基因的mRNA、及耐嘌呤霉素性基因的mRNA的mRNA(以下称为“ASCL1-MYT1L-Puro mRNA”)。ASCL1基因的mRNA的序列例如与序列编号3(小鼠)或序列编号4(人类)所示的DNA的序列对应。MYT1L基因的mRNA的序列例如与序列编号5(小鼠)、序列编号6(小鼠)、序列编号7(小鼠)或序列编号8(人类)所示的DNA的序列对应。表达了ASCL1-MYT1L-Puro mRNA的细胞产生ASCL1及MYT1L，且表现出耐嘌呤霉素性。

仙台病毒例如可具有能够表达如下mRNA的RNA：包含DLX2基因的mRNA及耐杀稻瘟菌素性基因的mRNA的mRNA(以下称为“DLX2-Blast mRNA”)。DLX2基因的mRNA的序列例如与序列编号9(小鼠)或序列编号10(人类)所示的DNA的序列对应。表达了DLX2-Blast mRNA的细胞产生DLX2，且表现出耐杀稻瘟菌素性。

仙台病毒通过悬浮于细胞培养液而导入至干细胞。仙台病毒识别细胞表面抗原并感染干细胞。

感染仙台病毒时的干细胞密度例如在12孔板的孔中为0.2×10⁵个/孔～1.0×10⁶个/孔、0.5×10⁵个/孔～8.0×10⁵个/孔、或1.0×10⁵个/孔～4×10⁵个/孔。

所使用的仙台病毒的效值例如为1×10¹²CIU/mL～1×10⁵CIU/mL、1×10¹⁰CIU/mL～1×10⁶CIU/mL、或1×10⁹CIU/mL～1×10⁷CIU/mL。仙台病毒的感染复数(MOI：multiplicityof infection)例如为每次0.1～100.0、1.0～50.0、或1.0～20.0。

感染仙台病毒时所使用的培养基例如为mTeSR1、TeSR2(注册商标、干细胞技术公司)、及Stem Fit(ReproCELL株式会社)等干细胞培养基。感染仙台病毒后，还可以更换为适合将培养基诱导为神经系统细胞的培养基(以下称为“神经诱导培养基”)。作为神经诱导培养基，例如可列举NDiff 227(注册商标、TAKARA BIO INC.)、Neurobasal(注册商标、赛默飞世尔科技)、人类ES/iPS神经元分化培养基(Merck KGaA)、及N3培养基等。N3培养基例如可通过在500mL的DMEMF12中加入10mL的B27、5mL的N2补充剂(赛默飞世尔科技)和浓度为6.25mg/mL的1.6mL胰岛素而制备。

感染仙台病毒时、及其前后所使用的培养基还可以含有B18R蛋白质。B18R蛋白质缓和细胞的先天性抗病毒反应。B18R蛋白质可用于抑制伴随着病毒感染的免疫反应所造成的细胞死亡。但是，实施方式所涉及的方法可以在短时间内由干细胞制作神经系统细胞，培养基可以不含B18R蛋白质，或者可以以0.01％～1％的较低浓度含有B18R蛋白质。

在感染仙台病毒的25天以内、20天以内、10天以内、9天以内、8天以内、7天以内、6天以内、5天以内或4天以内将干细胞诱导为神经系统细胞。能否将干细胞诱导为神经系统细胞例如可通过选自MAP2、TUJ1(β-III微管蛋白)、BRN2、HOMER1、NGN2等NGN、PSA-NCAM、MUNC13-1、SATB2、vGLUT、chAT、HB9、LHX3、GAD65、GAD67、TH、ASCL1(MASH1)等ASCL、vGAT、SOX1、SOX2、CD133、巢蛋白(Nestin)、HB9、ISL1、O4、PLP1、MOG、及MBP的至少一种是否为阳性来进行确认。

NGN2是生成神经细胞所需的开关蛋白质，是兴奋性神经细胞的标记物。TUJ1(β-III微管蛋白)、MAP2、BRN2、ASCL1(MASH1)及PSA-NCAM是神经细胞的标记物。HOMER1及MUNC13-1是形成突触的成熟神经细胞的标记物。SATB2是大脑皮质神经细胞的标记物。vGLUT是谷氨酸能神经细胞之类的兴奋性神经细胞的标记物。chAT是胆碱能神经细胞等运动神经细胞的标记物。HB9是运动神经细胞的标记物。GAD65及GAD67是GABA能神经细胞之类的抑制性神经细胞的标记物。TH是多巴胺能神经细胞的标记物。vGAT是抑制性神经细胞的标记物。SOX1、SOX2、CD133、及巢蛋白(Nestin)是神经干细胞的标记物。LHX3、HB9及ISL1是运动神经细胞的标记物。O4、PLP1、MOG、及MBP是少突胶质前体的标记物。而且，作为星形胶质细胞前体及星形胶质细胞的标记物，可利用GFAP及CD44。

根据以上所说明的本发明实施方式的方法，通过在干细胞中表达合成诱导因子的mRNA，可以不对干细胞的基因造成损伤地，无整合地效率良好地制作神经系统细胞。

在仅利用激素或化学物质而由干细胞制作神经系统细胞的方法中，制作神经系统细胞需要非常长的时间。相对于此，根据本发明实施方式的方法，可以在短时间内制作神经系统细胞。

而且，在仅利用激素或化学物质而由干细胞制作神经系统细胞的方法中，仅干细胞中的一部分成为目标神经系统细胞。相对于此，根据本发明实施方式的方法，完成感染仙台病毒的细胞基本上能够成为目标神经系统细胞。

另外，在仅利用激素或化学物质而由干细胞制作神经系统细胞的方法中，即便遵循相同的方案，也存在成为目标神经系统细胞的克隆和并不成为目标神经系统细胞的克隆，在克隆间产生差异。

相对于此，根据本发明实施方式的方法，可以在多个克隆中获得较高的诱导效率。

而且，在使用细胞激素等对未分化的细胞群进行诱导而制造移植用细胞的情况下，存在于移植用细胞中残存未被诱导的细胞的可能性。存在如下的危险性：该残存的未被诱导的细胞在移植位置独立地细胞分裂、增殖，形成畸胎瘤等。对此，根据本发明实施方式的方法，还可以同时表达耐药性基因的mRNA，因此可以对导入了仙台病毒的细胞进行药剂选择。因此，可以避免混入未被诱导的细胞或形成畸胎瘤等危险性，适合移植医疗。

另外，根据本发明实施方式的方法，可以使用仙台病毒而不利用将基因插入到基因组中的病毒。因此，其为无整合的，并不对干细胞的基因造成损伤，在所制作的神经系统细胞中没有癌变的风险，因此可利用于临床中。

此外，例如在完全封闭系统的干净的环境中由血液细胞制作iPS细胞，接着，通过本发明实施方式的方法，在完全封闭系统的干净的环境中由iPS细胞制作神经系统细胞，则可以更清洁地制作安全的神经系统细胞。

另外，根据本发明实施方式的方法，可以在短时间内制作神经系统细胞，因此可以不使用B18R等，而且，即便在使用的情况下，也可以使浓度非常低。

(实施例1)

由ID Pharma株式会社准备可表达NGN2-Puro mRNA的仙台病毒。所准备的仙台病毒的效值为1×10⁹CIU/mL。

准备涂布了可溶化基底膜制剂(Matrigel、Corning)的12孔皿，在各孔中放入以10nmol/mL的浓度含有ROCK(Rho相关卷曲螺旋形成激酶(Rho-associated coiled-coilforming kinase)/Rho结合激酶)抑制剂(Selleck)的无饲养层培养基(mTeSR(注册商标)1、干细胞技术公司)。ROCK抑制剂抑制细胞死亡。

将iPS细胞分散于组织/培养细胞的剥离/分离/分散溶液(Accutase、InnovativeCell Technologies)中，将其接种于12孔皿中。以每1孔为2×10⁵个的密度接种感染了仙台病毒的iPS细胞。还以每1孔为2.0×10⁵个的密度接种未感染仙台病毒的对照iPS细胞。其后，将iPS细胞在无饲养层培养基中，在二氧化碳浓度为5％和氧气浓度为20％的气体条件下进行24小时的培养。

以MOI成为20的方式使iPS细胞感染可表达NGN2-Puro mRNA的仙台病毒。在感染仙台病毒后的第2天，将孔内的培养基置换为以2μg/mL的浓度含有嘌呤霉素的神经诱导培养基(N3培养基)，使未感染的细胞死亡。

N3培养基是在500mL的DMEMF12中添加10mL的B27、5mL的N2、和浓度为6.25mg/mL的1.6mL的胰岛素而制备的。

将感染仙台病毒后第2天、第3天、第5天、及第7天的细胞的显微镜照片示于图1的(a)。将感染仙台病毒后第24天的细胞的显微镜照片示于图1的(b)。如图1所示，从形态上确认了在感染仙台病毒后，细胞被诱导为神经系统细胞。

在感染仙台病毒后第28天，从平皿除去培养基，用PBS对细胞进行清洗。然后，将4％多聚甲醛(PFA)放入至平皿，在4℃下使其反应15分钟而将细胞固定。另外，用PBS对细胞进行2次清洗后，用含有5％CCS及0.1％Triton的PBS培养基对一次抗体进行稀释，添加于平皿上。一次抗体使用对于神经细胞的标记物BRN2的山羊单克隆抗体(Santa CruzBiotechnology)。

在室温下反应一小时后，在平皿上添加PBS，在平皿上充分融合后，将PBS废弃。再次添加PBS，然后废弃，之后将含有荧光标识的大猩猩抗山羊IgG(H+L)二次抗体(AlexaFluor、注册商标、555、缀合物、赛默飞世尔)的溶液添加到平皿上，在室温下使其反应30分钟。其后，用PBS对细胞进行2次清洗，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图2所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达BRN2。

(实施例2)

与实施例1同样地使iPS细胞感染可表达NGN2-Puro mRNA的仙台病毒，使用对于形成突触的成熟神经细胞的标记物HOMER1的兔单克隆抗体(SYNAPTIC SYSTEMS)作为一次抗体而对细胞进行荧光标识，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图3所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达HOMER1。

(实施例3)

与实施例1同样地使iPS细胞感染可表达NGN2-Puro mRNA的仙台病毒，使用对于神经细胞的标记物MAP2的小鼠单克隆抗体(Sigma Aldrich)作为一次抗体而对细胞进行荧光标识，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图4所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达MAP2。

(实施例4)

与实施例1同样地使iPS细胞感染可表达NGN2-Puro mRNA的仙台病毒，使用对于形成突触的成熟神经细胞的标记物MUNC13-1的兔单克隆抗体(SYNAPTIC SYSTEMS)作为一次抗体而对细胞进行荧光标识，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图5所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达MUNC13-1。

(实施例5)

与实施例1同样地使iPS细胞感染可表达NGN2-Puro mRNA的仙台病毒，使用对于脑神经细胞的标记物SATB2的小鼠单克隆抗体(Abcam)作为一次抗体而对细胞进行荧光标识，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图6所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达SATB2。

(实施例6)

与实施例1同样地使iPS细胞感染可表达NGN2-Puro mRNA的仙台病毒，使用对于神经细胞的标记物TUJ1的小鼠单克隆抗体(Biolegend)作为一次抗体而对细胞进行荧光标识，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图7所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达TUJ1。

(实施例7)

与实施例1同样地使iPS细胞感染可表达NGN2-Puro mRNA的仙台病毒，使用对于如谷氨酸能神经细胞这样的兴奋性神经细胞的标记物vGLUT的兔单克隆抗体(SYNAPTICSYSTEMS)作为一次抗体而对细胞进行荧光标识，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图8所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达vGLUT。

(实施例8)

与实施例1同样地使iPS细胞感染可表达NGN2-Puro mRNA的仙台病毒，使用对于运动神经细胞的标记物chAT的小鼠单克隆抗体(Millipore)作为一次抗体而对细胞进行荧光标识，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图9所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达chAT。

(实施例9)

与实施例1同样地使iPS细胞感染可表达NGN2-Puro mRNA的仙台病毒，使用对于运动神经细胞的标记物HB9的小鼠单克隆抗体(Thermo)作为一次抗体而对细胞进行荧光标识，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图10所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达HB9。

(实施例10)

与实施例1同样地使iPS细胞感染可表达NGN2-Puro mRNA的仙台病毒，使用对于多巴胺能神经细胞的标记物TH的绵羊单克隆抗体(Pel Freez)作为一次抗体而对细胞进行荧光标识，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图11所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达TH。

(实施例11)

除了使用可表达ASCL1-MYT1L-Puro mRNA和DLX2-Blast mRNA的仙台病毒以外，与实施例1同样地使iPS细胞感染仙台病毒。将感染仙台病毒后第2天、第5天、第11天、及第21天的细胞的显微镜照片示于图12的(a)。将感染仙台病毒后第24天的细胞的显微镜照片示于图12的(b)。如图12的(a)及图12的(b)所示，从形态上确认了在感染仙台病毒后，细胞被诱导为神经系统细胞。

在感染仙台病毒后第28天，使用对于一般的神经细胞的标记物TUJ1的小鼠单克隆抗体(Biolegend)作为一次抗体而对细胞进行荧光标识，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图12的(c)所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达TUJ1。

(实施例12)

与实施例11同样地使iPS细胞感染可表达ASCL1-MYT1L-Puro mRNA和DLX2-BlastmRNA的仙台病毒，使用对于神经细胞的标记物BRN2的山羊单克隆抗体(Santa CruzBiotechnology)作为一次抗体而对细胞进行荧光标识，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图13所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达BRN2。

(实施例13)

与实施例11同样地使iPS细胞感染可表达ASCL1-MYT1L-Puro mRNA和DLX2-BlastmRNA的仙台病毒，使用对于抑制性(GABA能)神经细胞的标记物GAD65/67的小鼠单克隆抗体(Millipore)作为一次抗体而对细胞进行荧光标识，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图14所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达GAD65/67。

(实施例14)

与实施例11同样地使iPS细胞感染可表达ASCL1-MYT1L-Puro mRNA和DLX2-BlastmRNA的仙台病毒，使用对于神经细胞的标记物MAP2的小鼠单克隆抗体(Sigma Aldrich)作为一次抗体而对细胞进行荧光标识，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图15所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达MAP2。

(实施例15)

与实施例11同样地使iPS细胞感染可表达ASCL1-MYT1L-Puro mRNA和DLX2-BlastmRNA的仙台病毒，使用对于抑制性神经细胞的标记物vGAT的兔单克隆抗体(SYNAPTICSYSTEMS)作为一次抗体而对细胞进行荧光标识，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图16所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达vGAT。

(实施例16)

除了使用可表达ASCL1-MYT1L-Puro mRNA的仙台病毒以外，与实施例1同样地使iPS细胞感染仙台病毒。在感染仙台病毒后第21天，使用对于一般的神经细胞的标记物TUJ1的小鼠单克隆抗体(Biolegend)作为一次抗体而对细胞进行荧光标识，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图17所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达TUJ1。

(实施例17)

与实施例22同样地使iPS细胞感染可表达配ASCL1-MYT1L-Puro mRNA的仙台病毒，使用对于神经细胞的标记物MAP2的小鼠单克隆抗体(Sigma Aldrich)作为一次抗体而对细胞进行荧光标识，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图18所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达MAP2。

(实施例18)

与实施例22同样地使iPS细胞感染可表达ASCL1-MYT1L-Puro mRNA的仙台病毒，使用对于神经细胞的标记物BRN2的山羊单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)作为一次抗体而对细胞进行荧光标识，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图19所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达BRN2。

(实施例19)

与实施例22同样地使iPS细胞感染可表达ASCL1-MYT1L-Puro mRNA的仙台病毒，使用对于抑制性神经细胞的标记物vGAT的兔单克隆抗体(SYNAPTIC SYSTEMS)作为一次抗体而对细胞进行荧光标识，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图20所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达vGAT。

(实施例20)

与实施例22同样地使iPS细胞感染可表达ASCL1-MYT1L-Puro mRNA的仙台病毒，使用对于抑制性神经细胞(GABA能神经细胞)的标记物GAD65/67的小鼠单克隆抗体(Millipore)作为一次抗体而对细胞进行荧光标识，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图21所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达GAD65/67。

(实施例21)

与实施例22同样地使iPS细胞感染可表达ASCL1-MYT1L-Puro mRNA的仙台病毒，使用对于多巴胺能神经细胞的标记物TH的绵羊单克隆抗体(Pel Freez)作为一次抗体而对细胞进行荧光标识，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图22所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达TH。

(实施例22)

与实施例22同样地使iPS细胞感染可表达ASCL1-MYT1L-Puro mRNA的仙台病毒，使用对于胆碱能神经细胞的标记物chAT的山羊单克隆抗体(Millipore)作为一次抗体而对细胞进行荧光标识，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图23所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达chAT。

(实施例23)

与实施例22同样地使iPS细胞感染可表达ASCL1-MYT1L-Puro mRNA的仙台病毒，使用对于兴奋性神经(谷氨酸能神经细胞)的标记物vGLUT的兔单克隆抗体(SYNAPTICSYSTEMS)作为一次抗体而对细胞进行荧光标识，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图24所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达vGLUT。

(实施例24)

与实施例22同样地使iPS细胞感染可表达ASCL1-MYT1L-Puro mRNA的仙台病毒，使用对于脑神经细胞的标记物SATB2的小鼠单克隆抗体(Abcam)作为一次抗体而对细胞进行荧光标识，用荧光显微镜进行观察。其结果，如图25所示那样，确认所诱导的神经系统细胞表达SATB2。

(实施例25)

针对实施例1中所准备的未感染可表达NGN2-Puro mRNA的仙台病毒的对照细胞，用流式细胞术进行分析，结果如图26的(a)所示那样，神经细胞的标记物PSA-NCAM为阴性。针对实施例1中所准备的感染了可表达NGN2-Puro mRNA的仙台病毒的细胞，在感染后第7天用流式细胞术进行分析，结果如图26的(b)所示，神经细胞的标记物PSA-NCAM为阳性。另外，在感染后第4天用流式细胞术进行分析，也是神经细胞的标记物PSA-NCAM为阳性。

针对实施例11中所准备的感染了可表达ASCL1-MYT1L-Puro mRNA和DLX2-BlastmRNA的仙台病毒的细胞，在感染后第7天用流式细胞术进行分析，结果如图26的(c)所示，神经细胞的标记物PSA-NCAM为阳性。另外，在感染后第4天用流式细胞术进行分析，也是神经细胞的标记物PSA-NCAM为阳性。针对实施例22中所准备的感染了可表达ASCL1-MYT1L-PuromRNA的仙台病毒的细胞，在感染后第7天用流式细胞术进行分析，结果如图26的(d)所示，神经细胞的标记物PSA-NCAM为阳性。另外，在感染后第4天用流式细胞术进行分析，也是神经细胞的标记物PSA-NCAM为阳性。

序列表

<110>爱平世股份有限公司

<120>神经系统细胞的制作方法

<130> XT374AJP0007-WO

<150> US 62/592,629

<151> 2017-11-30

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5.1

<210> 1

<211> 2244

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导因子

<400> 1

gcagccactg aaccacaagc agctcggctt taactggagt gccttggagt cgcgtgccag 60

cagccacacg gccagggact gactgacaga caaccacgca cgagaacgac aacacacgag 120

actcgggcga gctgccgcgg tcgtccgggc tcttggcaaa gtcgcccagc cgagaggccc 180

ccccgcggag gtgcgcctag gaagcgccaa gcccgcggcg cggaggacac cgtgctcggt 240

tccgggctgc ggggacattc ccggacacac accggagcag cagctgcgcc gcgacacatc 300

tggagccgcg taggatgttc gtcaaatctg agactctgga gttgaaggag gaagaggagg 360

tactgatgct gctgggctcg gcttccccgg cctcggcgac cctgaccccg atgtcctcca 420

gcgcggacga ggaggaggac gaggagctgc gccggccggg ctccgcgcgt gggcagcgtg 480

gagcggaagc cgggcagggg gtgcagggca gtccggcgtc gggtgccggg ggttgccggc 540

cagggcggct gctgggcctg atgcacgagt gcaagcgtcg cccgtcgcgc tcacgggccg 600

tctcccgagg tgccaagacg gcggagacgg tgcagcgcat caagaagacc cgcaggctca 660

aggccaacaa ccgcgagcgc aaccgcatgc acaacctaaa cgccgcgctg gacgcgctgc 720

gcgaggtgct gcccaccttc cccgaggatg ccaagctcac gaagatcgag acgctgcgct 780

tcgcccacaa ttacatctgg gcgctcaccg agactctgcg cctggcggac cactgcgccg 840

gcgccggtgg cctccagggg gcgctcttca cggaggcggt gctcctgagc ccgggagctg 900

cgctcggcgc cagcggggac agcccttctc caccttcctc ctggagctgc accaacagcc 960

cggcgtcatc ctccaactcc acgtccccat acagctgcac tttatcgccc gctagccccg 1020

ggtcagacgt ggactactgg cagcccccac ctccggagaa gcatcgttat gcgcctcacc 1080

tgcccctcgc cagggactgt atctagagct gcgggtctcc ctctctcgtc ctctacccgg 1140

ccctcttccc atccttctcc cgcccctcac cctccacgcc ccggactcca cttcacagag 1200

cagaggtggc ccttgcaatc ccctcggcgg ctggtgcatt cgggggtgga gaccagctct 1260

ggtttattga agatgtgagg atttatggtc aaagaggact atggcgtgtg ggagtggggg 1320

ctggcgtggg gaacctcgta agactgtaaa agacactgag aaaaagtacc ataactaacg 1380

agtgtgcaga gcagactgac gctcctcccc tctctcagag ctgctggagg agaactccgg 1440

gcaggcagtt cgtgtgaatc tctcagaggg aatgcaactg gtccctgtga tcttttcacc 1500

ttcgtttcta catagagatg ttaatgtcag tcgaaagaaa tgtattttag catctgaatg 1560

aatttactgg taataatatt atccacacat ttgcaatggc tggcatctgc tctattccca 1620

ttgctgtctg caggctgtgg gaatttcacc tgtcaaacca aactttccct ctctgatgtg 1680

cactttgttt ttttcccaga ttcgtcacaa tgcctattgt cccgcccttc tttttgcttt 1740

ttttctccat tttgccatct gtctcttatg atttataagg gggaaaaact tgttttgtta 1800

gagggccagg ttagaagtca ttgtataatt tgtaggcttt tgtaagggtt gaatgcaagc 1860

gtggaaattt aggctgaatt ctctatcaaa agaaaaaatg tgaaggaaaa aggaaaaatc 1920

aggagggagg attgcttcat gcattattta tctcgacctt ttaggggaga aggaactccc 1980

ccatcctttc aagagattaa aaataaatca acagtctgaa aacctaagca gacacggggc 2040

attgccagga tcagccacac acgtgtttcc ttctatttat tttgaagaaa aatttcatgg 2100

gaaagtatgt atttttttgt atattctaca gagtttattc tagtatgtat ttacatcccg 2160

aagaataaga aaattgtttt gtgattaagc tataaataaa gtatctaatt ttcataaaaa 2220

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2244

<210> 2

<211> 2370

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导因子

<400> 2

cgcagccact gaaccacaag cagcttcgcg ttaactggag tgcctgggag tcgcgtgcca 60

ggagccgcac ggccagggac tgactgacag acagacacgc accaccacca caacacacga 120

gacccgggcg ggccgccgcc gccgccgccg gggctcttgg caaactcgcc ggtcgcagag 180

gtcccccgcg gagctgcgcc acagtagcgc cgggcttgca gctttcacgc cgggcgaagg 240

acccggcgct gcgctcgcag ctgcgcggag attcccggca caggccaaag tcacagcaac 300

gctgaggcac agttagagcc aactaagatg ttcgtcaaat ccgagacctt ggagttgaag 360

gaggaagagg acgtgttagt gctgctcgga tcggcctccc ccgccttggc ggccctgacc 420

ccgctgtcat ccagcgccga cgaagaagag gaggaggagc cgggcgcgtc aggcggggcg 480

cgtcggcagc gcggggctga ggccgggcag ggggcgcggg gcggcgtggc tgcgggtgcg 540

gagggctgcc ggcccgcacg gctgctgggt ctggtacacg attgcaaacg gcgcccttcc 600

cgggcgcggg ccgtctcccg aggcgccaag acggccgaga cggtgcagcg catcaagaag 660

acccgtagac tgaaggccaa caaccgcgag cgaaaccgca tgcacaacct caacgcggca 720

ctggacgcgc tgcgcgaggt gctccccacg ttccccgagg acgccaagct caccaagatc 780

gagaccctgc gcttcgccca caactacatc tgggcactca ccgagaccct gcgcctggcg 840

gatcactgcg ggggcggcgg cgggggcctg ccgggggcgc tcttctccga ggcagtgttg 900

ctgagcccgg gaggagccag cgccgccctg agcagcagcg gagacagccc ctcgcccgcc 960

tccacgtgga gttgcaccaa cagccccgcg ccgtcctcct ccgtgtcctc caattccacc 1020

tccccctaca gctgcacttt atcgcccgcc agcccggccg ggtcagacat ggactattgg 1080

cagcccccac ctcccgacaa gcaccgctat gcacctcacc tccccatagc cagggattgt 1140

atctagagct gccatttctg ctacccacgc caggccttag tgggttccct ttcctgtccc 1200

cagtcgagcc ctcctccctt cccctgcccc tcctttccac gccctggaaa ccatctcact 1260

tcacagggca ggtgtagcct ttctgattcc tcggttgttt cttgcatttc ttggctttgg 1320

gtatccttca ttcagacggg ctctgattta ctgaaggtgt gatggagctt attgtcaaag 1380

ccaagggtgg cgttttgggg gcgcttcttg agacgaaaaa gaccctggga agagatgatg 1440

gtggcatatc taaagagttt gcagagcgga ctgacgctcc tcccctttct ctttaacgcc 1500

gaaggacttg gtgcagttcg tgtgaatctc acagggggaa tgcaactggt tcctgtgatc 1560

tcttcacctt tgcttctaca tagagatgtt aatgtcgagt agaaagaaat gtatcttagc 1620

atctgaatga ttttgctggt aataatatta tccacagatt tgcaatggct ggcatctgct 1680

ttattcccat tgctgtctgc aggctgtggg aatttcacct gtcaaaccaa acttccctct 1740

ctgatgtgca ctttgttctg tttcccagat tcgtcacaat gcctattgtc ctgtccttct 1800

ctttcctttt tcttccccat tttgccatct gtctcttatg atttataagg ggaaaaaaac 1860

ttgttttgtt agaggggcag gttagaagtc attgtataat ttgtaggctt tgtaatgatt 1920

gaatgcaagc gtggaaattt aggctgaact ctctatcaaa aggaaaaatg tggaggaaaa 1980

gggaaaaatc aggagggagg attgcctcat gtattattta tttcgacctt ttaggggaga 2040

aggaactccc ccattctttc aagagattaa aaataaatca acagtctgaa aacctaagca 2100

gacacggagc attatccgga tcagccacac acgtgttccc ttctatttat tataaagaaa 2160

tttttcatgg gaaaatatgt attttttgta tattctacag agtttattct agtatgtatt 2220

tacatcttga agaacaagaa agttgttctt gtgattaaac tataaataaa ctatctaatt 2280

ttcataaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2370

<210> 3

<211> 2259

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导因子

<400> 3

agcagtctct cacttctggc cagggaacgt ggaaggcgta ccggctggga gccggttagg 60

gagggcgaat tggggggaac gagagagcaa ttagaaagaa agggggttca accaaataat 120

cccagaagca ggctcaagcc caggctggag caagggagag cgggcgcaag aaagcgcagc 180

cccggagcag ctccacctgg cagagtgcgc tcggcactga cttttgcggc tgctttcctt 240

ttccctttcc tcttttaaaa ccgagaaggc gccggcggcg gccgcacacg cgagcgccac 300

gcgaggctcc cgaagccaac cgcggcggga ggaggggagg gaggaggcgg cgcagaggga 360

agacgatcgc ccaggcacct tcctccgctg cagcctgaca actctgcctc cttctgcgcg 420

tttcttcccc tttaactttc ctccggggct cgtttctccc ctctcctttt tcttcgtccc 480

cctttgatcg tgcttcgcag ccccgcttcc ttcaagggct ctgcgcaccc tgcgtcccca 540

actcgttctc ccccgcgaca gtttggcccg gcatggagag ctctggcaag atggagagtg 600

gagccggcca gcagccgcag cccccgcagc ccttcctgcc tcccgcagcc tgcttctttg 660

cgaccgcggc ggcggcggca gcggcggcgg ccgcggcagc tcagagcgcg cagcagcaac 720

agccgcaggc gccgccgcag caggcgccgc agctgagccc ggtggccgac agccagccct 780

cagggggcgg tcacaagtca gcggccaagc aggtcaagcg ccagcgctcg tcctctccgg 840

aactgatgcg ctgcaaacgc cggctcaact tcagcggctt cggctacagc ctgccacagc 900

agcagccggc cgccgtggcg cgccgcaacg agcgcgagcg caaccgggtc aagttggtca 960

acctgggttt tgccaccctc cgggagcatg tccccaacgg cgcggccaac aagaagatga 1020

gcaaggtgga gacgctgcgc tcggcggtcg agtacatccg cgcgctgcag cagctgctgg 1080

acgagcacga cgcggtgagc gctgcctttc aggcgggcgt cctgtcgccc accatctccc 1140

ccaactactc caacgacttg aactctatgg cgggttctcc ggtctcgtcc tactcctccg 1200

acgagggatc ctacgaccct cttagcccag aggaacaaga gctgctggac tttaccaact 1260

ggttctgagg acctgccagg ctctcctggg aatggacttt ggaagcagga tggcagcaga 1320

tcctgcatct ttagtgtttc tcgccaacga cgtcaaatgg ggaggcagaa aaacaagggg 1380

aaaaaagaag aagaaatgaa acaaacaaac cagacagcca acctacaggg gcaccttcac 1440

taagatgcaa tgttctcagc aaacaggggt gggctccaac agtgtctctg cattccaaca 1500

tcatttccag acacgagaag agtgactggt gtctgaacct aagcccgaat cacagatggg 1560

ttcctttcct ggagcaagag cgtcacacac acacacacac acacagacag acactatatt 1620

aactcccaac cactaacagg cagggctgga agcgcgcatg tgcaagtgcc ttcacctccc 1680

actctctgtc agagctgtct tagccccctg aaactgggtt gatgtctttc ctcagtcacc 1740

cccattccag cgatctatgg acatttgcct ccattgaagc aacgtcagtt ctcggacagc 1800

ctttccctct cctggtggcc tcctccccaa accccacatc gccctcccac ggtctttgct 1860

tctgttttct tcatagaatg cttccaatct ttgtgaattt ttttattata agaaaaaaat 1920

ctatttgtat ctatcctaac cagtttgggg atatattaag atatttttgt acataagaaa 1980

aagagagaga aaaaatttat agaagttttg tacaaatggt ttaaaaatgt gtatatcttg 2040

atactttaac atgtaatgag attacctctg cgtactttag atatgtagtt catcttacaa 2100

ctgccatccc cacccccatc cccagtgtgg ttttggaaag aactctcctc ataggtgaga 2160

tctaaatgcc accagaatga cttcagcacc aatgtgtctt acttcacaga aacgtggtta 2220

atgtattaat gatgttatta aaaaaaactg ttcaagaag 2259

<210> 4

<211> 2490

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导因子

<400> 4

agcactctct cacttctggc cagggaacgt ggaaggcgca ccgacaggga tccggccagg 60

gagggcgagt gaaagaagga aatcagaaag gaagggagtt aacaaaataa taaaaacagc 120

ctgagccacg gctggagaga ccgagacccg gcgcaagaga gcgcagcctt agtaggagag 180

gaacgcgaga cgcggcagag cgcgttcagc actgactttt gctgctgctt ctgctttttt 240

ttttcttaga aacaagaagg cgccagcggc agcctcacac gcgagcgcca cgcgaggctc 300

ccgaagccaa cccgcgaagg gaggagggga gggaggagga ggcggcgtgc agggaggaga 360

aaaagcattt tcactttttt tgctcccact ctaagaagtc tcccggggat tttgtatata 420

ttttttaact tccgtcaggg ctcccgcttc atatttcctt ttctttccct ctctgttcct 480

gcacccaagt tctctctgtg tccccctcgc gggccccgca cctcgcgtcc cggatcgctc 540

tgattccgcg actccttggc cgccgctgcg catggaaagc tctgccaaga tggagagcgg 600

cggcgccggc cagcagcccc agccgcagcc ccagcagccc ttcctgccgc ccgcagcctg 660

tttctttgcc acggccgcag ccgcggcggc cgcagccgcc gcagcggcag cgcagagcgc 720

gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcaggcg ccgcagctga gaccggcggc 780

cgacggccag ccctcagggg gcggtcacaa gtcagcgccc aagcaagtca agcgacagcg 840

ctcgtcttcg cccgaactga tgcgctgcaa acgccggctc aacttcagcg gctttggcta 900

cagcctgccg cagcagcagc cggccgccgt ggcgcgccgc aacgagcgcg agcgcaaccg 960

cgtcaagttg gtcaacctgg gctttgccac ccttcgggag cacgtcccca acggcgcggc 1020

caacaagaag atgagtaagg tggagacact gcgctcggcg gtcgagtaca tccgcgcgct 1080

gcagcagctg ctggacgagc atgacgcggt gagcgccgcc ttccaggcag gcgtcctgtc 1140

gcccaccatc tcccccaact actccaacga cttgaactcc atggccggct cgccggtctc 1200

atcctactcg tcggacgagg gctcttacga cccgctcagc cccgaggagc aggagcttct 1260

cgacttcacc aactggttct gaggggctcg gcctggtcag gccctggtgc gaatggactt 1320

tggaagcagg gtgatcgcac aacctgcatc tttagtgctt tcttgtcagt ggcgttggga 1380

gggggagaaa aggaaaagaa aaaaaaaaga agaagaagaa gaaaagagaa gaagaaaaaa 1440

acgaaaacag tcaaccaacc ccatcgccaa ctaagcgagg catgcctgag agacatggct 1500

ttcagaaaac gggaagcgct cagaacagta tctttgcact ccaatcattc acggagatat 1560

gaagagcaac tgggacctga gtcaatgcgc aaaatgcagc ttgtgtgcaa aagcagtggg 1620

ctcctggcag aagggagcag cacacgcgtt atagtaactc ccatcacctc taacacgcac 1680

agctgaaagt tcttgctcgg gtcccttcac ctcctcgccc tttcttaaag tgcagttctt 1740

agccctctag aaacgagttg gtgtctttcg tctcagtagc ccccacccca ataagctgta 1800

gacattggtt tacagtgaaa ctatgctatt ctcagccctt tgaaactctg cttctcctcc 1860

agggcccgat tcccaaaccc catggcttcc ctcacactgt cttttctacc attttcatta 1920

tagaatgctt ccaatctttt gtgaattttt tattataaaa aatctatttg tatctatcct 1980

aaccagttcg gggatatatt aagatatttt tgtacataag agagaaagag agagaaaaat 2040

ttatagaagt tttgtacaaa tggtttaaaa tgtgtatatc ttgatacttt aacatgtaat 2100

gctattacct ctgcatattt tagatgtgta gttcacctta caactgcaat tttccctatg 2160

tggttttgta aagaactctc ctcataggtg agatcaagag gccaccagtt gtacttcagc 2220

accaatgtgt cttactttat agaaatgttg ttaatgtatt aatgatgtta ttaaatactg 2280

ttcaagaaga acaaagttta tgcagctact gtccaaactc aaagtggcag ccagttggtt 2340

ttgataggtt gccttttgga gatttctatt actgcctttt tttttcttac tgttttatta 2400

caaacttaca aaaatatgta taaccctgtt ttatacaaac tagtttcgta ataaaacttt 2460

ttcctttttt taaaatgaaa ataaaaaaaa 2490

<210> 5

<211> 7198

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导因子

<400> 5

gtggagctgc gtgcattagg ggctggctgt ggaggtaaag cagatctctt aggcccgcta 60

gcctctcctg ctgcatgtgt cattcctgcc cgcgcgacat tttcccccta agctactgca 120

cacaaaacag agcgagaaag cttctccctg cagtcttctt ggaggcctcc tggtttctca 180

cccattgttg gtgggtgtat ttcaattttt tgattccctg gactgtgggt tatgaaatca 240

atgctgctga agacaaaagc aaccttccct gcctctcggt gctatgcgtg gtcctcctcg 300

gcctcccact tgtgggggaa agggttttct ctttctttct gtgtgttttg agccagcaca 360

gttaccaaaa ttgaacttgc cgtcacttgt gagcggtgtg gtcatggtgt gaggggtccc 420

acagaggctg cagctgaggt ctgggtgtgt gcaattctca gctgggcttt gccctaccca 480

ggttgacgac tgaagaatca cagagtgtgg aaaagaacac aaggagaaat tggtgagaac 540

atctgcctag catctccaag tcctgtggag ggagccagca gtgctggtcc aaagaggacc 600

cagagagtga actcagagtg accacatctg atagaagagg ggaagatgta gtttctgagt 660

ccagtccagt gtttgtgtct ctcacattgt caacaaaaga aaggctccag ctgtccccac 720

agacatatgg atattccagg agccacgtaa agatggagaa atggaggcac agagaaatta 780

agtgacttgg ccacagtcac aagctgggga ggaccaggga aagcctagag agagctggct 840

ctgggcctgc atcctgccca cggagtcacc ctgcctccgt cctcaggaga gaaggcttcc 900

tacaagatgg acgtggactc tgaggagaag cgccatcgca cacggtccaa aggggttcga 960

gttcctgtgg agccagccat acaagagctg ttcagctgtc ccactccagg ctgcgacggc 1020

agtggtcacg tcagtggcaa atatgcacga cacagaagtg tatatggttg tcccttggct 1080

aaaaaaagaa aaacgcaaga taaacagccc caagaacctg ctcccaagcg aaaaccattt 1140

gcagtaaaag cagatagttc ctcagtagac gaatgttatg agagtgatgg tactgaagac 1200

atggatgata aggaggaaga tgatgatgag gagttctctg aagacaatga tgagcaaggg 1260

gatgatgacg acgaagatga ggtggatcgg gaagacgagg aggagatcga ggaggaagat 1320

gatgaagaag atgatgatga tgaagatggt gacgatgtag aagaggaaga agaggatgat 1380

gatgaagagg aggaagaaga ggaagaggaa gaagaaaatg aagaccatca aatgagttgt 1440

actcgaataa tgcaggacac agacaaggat gataacaaca atgatgagta tgataactat 1500

gatgaactgg tagctaagtc gctattaaat cttggcaaaa ttgctgagga tgcagcatac 1560

cgagccagga ctgaatcaga gatgaacagc aatacctcca atagtctgga ggacgatagt 1620

gacaaaaacg aaaacctcgg tcggaaaagc gaactgagtc tagacttaga cagtgatgtt 1680

gttagagaaa cagtggactc ccttaagctg ttagcacaag gacatggtgt tgtgctatca 1740

gagaatatca gtgacagaag ttatgctgag gggatgtcac agcaggacag tagaaatatg 1800

aactatgtca tgctagggaa gcccatgaac aatggactca tggagaagat ggtggaggag 1860

agtgatgagg aagtgtgtct aagtagtcta gagtgcctga ggaaccagtg ctttgacctg 1920

gccaggaaac tcagcgagac caacccacag gacaggagtc agccacccaa catgagtgtg 1980

cgccaacatg tccggcaaga ggacgacttc cctgggagga cgccagacag gagctactcg 2040

gatatgatga accttatgcg gctggaggag cagctcagtc ccaggtctag aacgttctcc 2100

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agaagggata acctgagatc ctatgaggac cagtctccaa gacagctggc tggggaagac 2340

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agaacagaaa agagagagag caagtgtcca acccccgggt gtgatggaac cggccacgta 2460

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cctcacatgg atccaatcaa tgaacaaaat tttgatgctt acgtgactac tttgacggaa 4380

atgtatacaa atcaagatcg ttatcagagt ccagaaaata aagccctact ggaaaatata 4440

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ttaaatgttt tagtattttg aactgaaatg gacaaaaaaa gaaaaaggaa aaaaaaagca 4860

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tttgtcgata ccttcgaaat ttgatggttt catcccaaat gactgcacta tatgtatgca 5880

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tcatgtaacg gtggtacata atatcaaatc aaaagttatc tgtgactata tatagggatc 6840

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catatttatt ataacttatt gttcatattc atttctaagt taatttaagt aatcatttat 6960

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<210> 6

<211> 7104

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导因子

<400> 6

gtctgctgcc tgctgatgga ggctgcgccg catccaccag gcagggctct gcacgcatgc 60

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agcagctcag tcccaggtct agaacgttct ccagctgtgc caaggaggat gggtgtcatg 2040

agagggatga tgacaccacc tcagtgaact cagacaggtc tgaggaagtg tttgacatga 2100

ccaagggcaa cctgactctg ctagagaaag ccattgcctt ggagacagag agagccaagg 2160

ccatgcggga gaagatggcc atggatgctg ggagaaggga taacctgaga tcctatgagg 2220

accagtctcc aagacagctg gctggggaag acagaaaatc caaatccagt gacagccatg 2280

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ccgggtgtga tggaaccggc cacgtaactg ggctttaccc gcatcaccgc agtctgtctg 2400

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aggagccaat caggtgtccg gtacctggct gtgacggtca gggacacatc actgggaagt 3720

atgcatccca ccgcagcgcc tccgggtgtc ccttggcagc caagaggcag aaagatgggt 3780

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accacaatct agcttaccta gcagccgttg attgtttttt ttccatctga gcaaacaggt 5340

aatttaagca tttatctccc ctttcacttt caaaaagaat catcattgat tattcttgtt 5400

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tctgccctcg ctgggtccag ctgactctag cgtctgcaca gccttgtgtg actcgtggtg 5640

acctaacctg agaaagagtg caatcagatg ttaaagtaac taaatagact gcggcacttt 5700

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ccaaatgact gcactatatg tatgcatacg gccacttttg attgctgcgc cccttctgag 5820

tagtctttga caatgtgttg tgttccccga tgtcgacttg atttcctttt agtagcatct 5880

ctctcttcca tgtcttgatg ttatgcagga agtacaaaag tactttaaaa ttttgttatg 5940

aaataaaaaa aaaaaggatg ggttttgtaa aaataataaa aaaaatattt ttagcagaac 6000

aggacttaca gggtcattgt ccccacaatg tgccagtcgg ctctttgcac tcgccttgtc 6060

ctatatatcc gtacggaggt gtgcaatcct gtgtcagtcg ccttgtgaca ctgaagtgga 6120

tgagttatag aggaggccct cgaggctgac ccaatacggt tactaaggga gactacaggg 6180

atctcacgac aaacattctg atacaatact caacctcggt atatatatat atatatatat 6240

atatatacat atatatatat gtataaatat aagaatatcc cagcggcact ttatactgtt 6300

cactgtacaa aagcttacag ttttccacaa ggactttaat aactagctgg ggaaaagatt 6360

atgtaattac ttggggctct gcaggacctt ctctgtccag cgcccccttt ctgttgtgcg 6420

attagttgta gctgccatgc tcagaattgc cttttgagag ctgaagcaag gtgcttactg 6480

tcacctgatg ccatacacat ggtcccaggc ccacacccgg ggggcctctg ttcatagcgg 6540

cacatgcatt tccccaccgc gtcttgtctg cagcttcttg gccaatgtag taatgctttt 6600

agtagagtaa taggtagtat cagtttggat tcttattgtt atcacctatg tacaatggag 6660

aggggttcta agcacaaatc tgctgctcat gtaacggtgg tacataatat caaatcaaaa 6720

gttatctgtg actatatata gggatcacaa agtgtcacat gttagaatgc tgaccttcca 6780

catggggtta ttgtgagtca tcagagcata tttattataa cttattgttc atattcattt 6840

ctaagttaat ttaagtaatc atttattaag acagaatttt gtataaacta tttattgtgc 6900

tctctgtgga actgaagttt gatttatttt tgtactacac ggcatgggtt tgttgacact 6960

ttaattttgc tataaatgtg tggaatcaca agttgctgtg atacttcatt tttaaattgt 7020

gaactttgta caaactttgt catgctgatg tgaacacatc ttactctgaa taaaaaggtg 7080

ttgccacgtt tgtagcacga agga 7104

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导因子

<400> 7

gtggagctgc gtgcattagg ggctggctgt ggaggtaaag cagatctctt aggcccgcta 60

gcctctcctg ctgcatgtgt cattcctgcc cgcgcgacat tttcccccta agctactgca 120

cacaaaacag agcgagaaag cttctccctg cagtcttctt ggaggcctcc tggtttctca 180

cccattgttg gtgggtgtat ttcaattttt tgattccctg gactgtgggt tatgaaatca 240

atgctgctga agacaaaagc aaccttccct gcctctcggt gctatgcgtg gtcctcctcg 300

gcctcccact tgtgggggaa agggttttct ctttctttct gtgtgttttg agccagcaca 360

gttaccaaaa ttgaacttgc cgtcacttgt gagcggtgtg gtcatggtgt gaggggtccc 420

acagaggctg cagctgaggt ctgggtgtgt gcaattctca gctgggcttt gccctaccca 480

ggttgacgac tgaagaatca cagagtgtgg aaaagaacac aaggagaaat tggtgagaac 540

atctgcctag catctccaag tcctgtggag ggagccagca gtgctggtcc aaagaggacc 600

cagagagtga actcagagtg accacatctg atagaagagg ggaagatgta gtttctgagt 660

ccagtccagt gtttgtgtct ctcacattgt caacaaaaga aaggctccag ctgtccccac 720

agacatatgg atattccagg agccacgtaa agatggagaa atggaggcac agagaaatta 780

agtgacttgg ccacagtcac aagctgggga ggaccaggga aagcctagag agagctggct 840

ctgggcctgc atcctgccca cggagtcacc ctgcctccgt cctcaggaga gaaggcttcc 900

tacaagatgg acgtggactc tgaggagaag cgccatcgca cacggtccaa aggggttcga 960

gttcctgtgg agccagccat acaagagctg ttcagctgtc ccactccagg ctgcgacggc 1020

agtggtcacg tcagtggcaa atatgcacga cacagaagtg tatatggttg tcccttggct 1080

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gatgaagaag atgatgatga tgaagatggt gacgatgtag aagaggaaga agaggatgat 1380

gatgaagagg aggaagaaga ggaagaggaa gaagaaaatg accatcaaat gagttgtact 1440

cgaataatgc aggacacaga caaggatgat aacaacaatg atgagtatga taactatgat 1500

gaactggtag ctaagtcgct attaaatctt ggcaaaattg ctgaggatgc agcataccga 1560

gccaggactg aatcagagat gaacagcaat acctccaata gtctggagga cgatagtgac 1620

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tataacttat tgttcatatt catttctaag ttaatttaag taatcattta ttaagacaga 6960

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acatcttact ctgaataaaa aggtgttgcc acgtttgtag cacgaagga 7189

<210> 8

<211> 7152

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导因子

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aactagctgg gaaaagacga tgtaattatt tcggggctct gcggaacctt ctctgtacag 6420

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attgttatca cctatgtaca atggaaaggg attttaagca caaacctgct gctcatctaa 6720

cgttggtaca taatctcaaa tcaaaagtta tctgtgacta ttatataggg atcacaaaag 6780

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gagacttgag aactgagaca ccgtgttctt cagcacgcgt cctgtagcta gaggctcgaa 1440

cctaccagcc cgcgaccgcc acccacccag cggtattgga agtggcgacc aggggtgacc 1500

cgtcgtggag ccacttctcg cactgccacg gagcagccgg aaacaaggag gcctcgtggg 1560

atcctttagt gccaagcctg gcgtccctgg cctcaattcc gacctgagcc ccggccactt 1620

ttaggccatc ctcggacttg tcgccccttc ccagccccct cagcgtgatc ctcagggtcc 1680

ttggtctctt caggccctga gcggggtcag gcactgggac gccttccccg ccctcgaggc 1740

ttcccggctc tcagaggctc cttttttctc tcctgctcca ggcctcagct ccagtccgct 1800

tcggttattg acctcctggg tcctactcca ccctatcacc tacccccgtg acccccggga 1860

tcccgccggt tttttcccct cctgggggct catgggggag aattcccagc tctcccaact 1920

cttcccgcct cccactttcc ccaggaacac tcccgtagct ccttcatcca ttgccagtgg 1980

agggttttta tttttatttt tttaaaagtt taggtgcctt tgcggatgac ctcattttga 2040

tgttaaaaaa aaactgattt ttttaatatg tggacgctgc aaaaaatgtg tttaaattat 2100

cttttttaag atgaattaag gactattagc tcgaacttcg atgcagagtt tgtaaataag 2160

ggtgtctgtg cagatttccc cacatttatt tgtataaaaa tttctcatct tttcagactt 2220

ttttgtaaac cgcccccgag ttgtgaaagc tgcgacgtag cagtgacctc agcagtccct 2280

atgttttccc cctttgaaaa tttttctcag ttaaattaag ctactgattt gaatttgttt 2340

ttatcttgtc ctaaagtctt tgttcttgaa atgcaaggta tttgggggtt atttattatg 2400

aaagcaacat actcttaatg ttgattttac aatatgaaga gattatttaa aataaattat 2460

tgttttcatt ggaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 2492

<210> 10

<211> 2308

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导因子

<400> 10

aagaggatgc gaccagaggc agctgtcccg agcagcgcac ggtgatcgcc tcccccggag 60

gaggaggcgc ctagacggtt gcctcctttc ttgtttcccc accaccaccc ccgtaattac 120

attggctgct ggaggggacc gggagagaca gaggaggcgc ctggcttccc ccgcacgccc 180

gccacctctg ctctttcccg tctcgggcca ggatgactgg agtctttgac agtctagtgg 240

ctgatatgca ctcgacccag atcgccgcct ccagcacgta ccaccagcac cagcagcccc 300

cgagcggcgg cggcgccggc ccgggtggca acagcagcag cagcagcagc ctccacaagc 360

cccaggagtc gcccaccctt ccggtgtcca ccgccaccga cagcagctac tacaccaacc 420

agcagcaccc ggcgggcggc ggcggcggcg ggggctcgcc ctacgcgcac atgggttcct 480

accagtacca agccagcggc ctcaacaacg tcccttactc cgccaagagc agctatgacc 540

tgggctacac cgccgcctac acctcctacg ctccctatgg aaccagttcg tccccagcca 600

acaacgagcc tgagaaggag gaccttgagc ctgaaattcg gatagtgaac gggaagccaa 660

agaaagtccg gaaaccccgc accatctact ccagtttcca gctggcggct cttcagcggc 720

gtttccaaaa gactcaatac ttggccttgc cggagcgagc cgagctggcg gcctctctgg 780

gcctcaccca gactcaggtc aaaatctggt tccagaaccg ccggtccaag ttcaagaaga 840

tgtggaaaag tggtgagatc ccctcggagc agcaccctgg ggccagcgct tctccacctt 900

gtgcttcgcc gccagtctca gcgccggcct cctgggactt tggtgtgccg cagcggatgg 960

cgggcggcgg tggtccgggc agtggcggca gcggcgccgg cagctcgggc tccagcccga 1020

gcagcgcggc ctcggctttt ctgggcaact acccctggta ccaccagacc tcgggatccg 1080

cctcacacct gcaggccacg gcgccgctgc tgcaccccac tcagaccccg cagccgcatc 1140

accaccacca ccatcacggc ggcgggggcg ccccggtgag cgcggggacg attttctaac 1200

cccagggaga actcgccaga gactgagagc agagaccact tatcctcatt gcttaccccg 1260

agccggggtt ccctcctccc ggcccgctgc cgccacccac ctctcctgca ggctgcgacc 1320

tgcagtggcc cgtctcaggc cctgctcact cccggggcca ccaaacgggc ccctctctcg 1380

ggggaaccgg acagcagctt ggcaaaggcc tccctaaaag gccgcatttc tgacctgagc 1440

cccgggtctc ggctgtttcg agccccgcct cggacttgcc ttccctcccc tccgggtgag 1500

cctgtctggc gccttcctcg ccccgggctg agagctgggt cccgggagat ggaagcctcc 1560

caggcgcgcg aggcttcccg ggcgctctga ggcttctttc tcctcgcccg ctcccctggg 1620

ctcagctcgg acgctgcagt tattgacctc ccggtcccgc ctgcccgccc tcccccacgt 1680

ggccccttga cccgggcggc cccgccgctt ctttccttcc tgcagttccc agccctcgga 1740

gcccccatcc cttatcttac ccccaccgcg ctcccccagg agcgctccct cagctctctc 1800

ctcatccatc accagtggag tttttttatt tgttattttt ttaaaagttt aggtgccttt 1860

gcggatgacc tcattttgac gttgaaaaaa tgatttttta atatgtgaac actgcaaaaa 1920

tgtgtttaaa ttatcttttt taaaacctat tcaggattat tagcctggac ttggacacag 1980

agtttgtaaa taaaggtgtc tgtgcagatt ttcccactga tttatttgta taaaaatact 2040

catcttttca gacttttttg taaaccccca gttgtgaaaa ctgcagttta gcagtgacct 2100

cagcaacccc tcctttttat tttttccttt aaaaacattt cagttaaatt aagctactga 2160

tttggatttg ttttatcgta tcctaaagtc tttgttgttg aaatgaaagg tattttgggg 2220

ttatttatta tgaaaacaac atgctcttaa tgttgatttt acaatatgaa gagattattt 2280

aaataaatta ttgttttcat tggaaaaa 2308

Claims (12)

1.一种神经系统细胞的制作方法，其包括：

准备干细胞的步骤；

通过感染将仙台病毒导入至所述干细胞，在所述干细胞内表达在所述仙台病毒中合成诱导因子的mRNA，从而将所述干细胞诱导为神经系统细胞的步骤。

2.根据权利要求1所述的神经系统细胞的制作方法，其中，所述干细胞为诱导性多能干细胞。

3.根据权利要求1所述的神经系统细胞的制作方法，其中，所述干细胞为胚胎干细胞。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的神经系统细胞的制作方法，其中，所述诱导因子包含神经原素(NGN)。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的神经系统细胞的制作方法，其中，所述诱导因子包含无刚毛鳞甲同源物(ASCL)。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的神经系统细胞的制作方法，其中，所述诱导因子包含髓鞘转录因子(MYT)。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的神经系统细胞的制作方法，其中，所述诱导因子包含无远端同源框(DLX)。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的神经系统细胞的制作方法，其中，所述神经细胞是选自由兴奋性神经细胞、抑制性神经细胞、多巴胺能神经细胞、运动神经细胞及脑神经细胞所组成的群组的至少一种。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的神经系统细胞的制作方法，其中，所述神经系统细胞是选自由TH阳性、TUJ1阳性、BRN2阳性、NGN阳性、β-III微管蛋白阳性、MAP2阳性、PSA-NCAM阳性、vGLUT阳性、SATB2阳性、chAT阳性、HB9阳性、MUNC13阳性、HOMER1阳性、vGAT阳性、及GAD65/67阳性所组成的群的至少一种。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的神经系统细胞的制作方法，其中，所述仙台病毒在所述干细胞内表达耐药性基因的mRNA。

11.根据权利要求10所述的神经系统细胞的制作方法，其中，所述耐药性基因可以是选自耐嘌呤霉素性基因、耐杀稻瘟菌素性基因、耐潮霉素性基因、及耐新霉素性基因所组成的群的至少一种。

12.根据权利要求10或11所述的神经系统细胞的制作方法，其包括：在使所述干细胞感染了所述仙台病毒之后，选择显示出耐药性的细胞的步骤。

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