CN111979184A

CN111979184A - Kdm3b基因在间充质干细胞骨向/牙向分化、增殖及迁移趋化中的应用

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Publication number: CN111979184A
Application number: CN202010618971.8A
Authority: CN
Inventors: 张建鹏; 张琛; 刁树; 范志朋; 杨昊清
Original assignee: Beijing Stomatological Hospital
Current assignee: Beijing Stomatological Hospital
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2040-06-30
Also published as: CN111979184B

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及KDM3B基因在间充质干细胞骨向/牙向分化、增殖及迁移趋化过程中的应用。发现KDM3B基因具有正向调控间充质干细胞功能的作用，提供了KDM3B在促进间充质干细胞骨向/牙向分化及增殖、迁移趋化过程中应用的依据，并且基于KEGG数据库丰富了介导差异表达基因功能的显著改变的通路，共鉴定出14个与差异基因表达相关的显著通路，这些通路在KDM3B的功能调控中发挥关键作用。通过信号网络分析构建了一个基于显著调节的GOs和途径的相互作用库，以根据基因相互作用的程度识别12个核心基因，为研究牙根再生种子细胞的改建及调控机制奠定了重要的理论基础。

Description

KDM3B基因在间充质干细胞骨向/牙向分化、增殖及迁移趋化中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及KDM3B基因在间充质干细胞骨向/牙向分化、增殖及迁移趋化过程中的应用。

背景技术

龋病、畸形、外伤等原因可导致年轻恒牙出现不可逆的牙髓炎症，进而导致牙髓全部坏死，严重者可引发根尖周炎症，最终影响牙根的正常发育。尚未发育完全的年轻恒牙牙根短小、根尖孔开放呈喇叭口状、根管壁薄弱。这类患牙临床治疗难度大，极易发生根折或松动脱落，失牙率高，而且这类患者年龄低，过早失牙会导致全口咬合功能的紊乱、影响发音及面容形态、甚至影响全身的发育，因此治疗并保留这类患牙意义重大。目前主要的治疗方法有根尖诱导成形术、根尖屏障术和血运重建术，但均存在各种不足。因此，我们迫切需要新的治疗技术来改善牙根再发育的问题。近年来间充质干细胞联合组织工程学技术促进组织再生的应用成为前沿且重要的科学问题，这也为这类患牙的牙根再生带来了希望。但其亟待解决的技术关键是如何获得充足的种子细胞以及定向调控间充质干细胞的分化。

牙源性间充质干细胞主要包括根尖牙乳头干细胞(SCAPs)、牙周膜干细胞(PDLSCs)、牙髓干细胞(DPSCs)、脱落的乳牙干细胞等(DFSCs)。其中SCAPs是由Sonoyama等分离未发育完全的人牙根尖牙乳头组织中获得。动物实验研究发现，SCAPs可形成典型的牙髓牙本质样结构，与牙髓细胞相比具有更强的增殖和矿化能力。目前有研究发现SCAPs在牙髓坏死和根尖周炎等情况下，是最主要的牙根再发育的前成牙本质细胞，具有强大的增殖能力和成牙本质能力。因此，SCAPs是一种较好的牙齿组织工程种子细胞，具有良好且广阔的临床应用前景。但其来源有限，且定向分化的分子机制仍不清楚。

从属于表观遗传修饰范畴的组蛋白甲基化在调控间充质干细胞定向分化过程中起着重要的作用。组蛋白甲基化过程受甲基化转移酶和去甲基化酶的共同调节，参与一系列生物学过程。其中组蛋白去甲基化酶能通过改变组蛋白甲基化修饰状态参与基因表达的调控。组蛋白去甲基化酶最大的家族包含Jumonji C(JmjC)结构域酶，包括KDM2-7亚家族；这些组蛋白去甲基化酶被认为具有以维持细胞命运和基因组稳定性的作用。目前已知KDM2A通过下调H3K26me2/3甲基化水平的抑制SCAP骨向/牙向的分化能力，却促进了其增殖能力。同样KDM2B抑制SCAP的骨、牙本质分化和软骨分化潜能。KDM4B和 KDM6B促进人骨髓间充质干细胞的成骨分化，并且KDM4B受DLX5激活，促进SCAP 的骨向/牙向分化潜能。而KDM5A调控BMP2达到对骨髓间充质干细胞的骨向分化的抑制作用。KDM3B又称JMJD1B，其基因位于人类5q31染色体区，促进肝脏组细胞的细胞周期蛋白CyclinD1和增殖因子CDC123的表达。并且KDM3B的缺失导致细胞的快速死亡和基因表达的紊乱。敲除KDM3B损害对造血干细胞分化和发育重要基因的激活。然而 KDM3家族对牙源性间充质干细胞的功能调控作用还未被挖掘。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了KDM3B基因在间充质干细胞骨向/牙向分化、增殖及迁移趋化过程中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了KDM3B在制备促进间充质干细胞的定向分化和/或组织再生功能的增强剂中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述定向分化包括成骨/成牙。

在本发明的一些具体实施方案中，所述间充质干细胞包括牙源性间充质干细胞。

在本发明的一些具体实施方案中，所述牙源性间充质干细胞包括根尖牙乳头干细胞 (SCAPs)、牙周膜干细胞(PDLSCs)、牙髓干细胞(DPSCs)、脱落的乳牙干细胞(DFSCs) 中的一种或多种。

在本发明的一些具体实施方案中，KDM3B促进碱性磷酸酶活性和/或矿化能力。

在本发明的一些具体实施方案中，KDM3B增强成骨/成牙相关的转录因子OSX和/或RUX2的表达。

在本发明的一些具体实施方案中，KDM3B增强成骨/成牙关键指标OCN和/或DSPP的表达。

在本发明的一些具体实施方案中，KDM3B促进间充质干细胞的增殖和/或迁移趋化。

在本发明的一些具体实施方案中，KDM3B有关的通路包括TGF-beta信号通路、焦点附着力、ECM与受体的相互作用、细胞粘附分子(CAMs)、补体和凝血级联、Toll样受体信号通路、Jak-STAT信号通路、造血细胞系、肌动蛋白细胞骨架的调节作用、癌症的途径、胰腺癌、黑色素瘤、小细胞肺癌、原发性免疫缺陷。

在本发明的一些具体实施方案中，KDM3B的相关基因包括CCND1、CLDN1、CLDN11、DDX58、FGF5、ISG15、MET、MYD88、PLAT、PLAU或SERPINE1中的一种或多种。

KDM3B是一种去甲基化酶，在SCAP分化过程中，具有促进碱性磷酸酶活性及矿化能力的作用，能够增强成骨/成牙相关转录因子OSX和RUX2以及成骨/成牙关键指标OCN 及DSPP的表达，这表明KDM3B可能具有控制SCAP成骨/成牙分化潜能的功能，可能是间充质干细胞成骨/成牙分化过程中一个关键的增强剂；众所周知，间充质干细胞的应用需要有充足的种子细胞来源，而且在分化成适当的功能表型之前，干细胞能够具有良好的归巢于受损区域的能力才能发挥其重要的作用。通过细胞增殖实验及迁移趋化实验表明 KDM3B能够促进SCAP增殖及迁移趋化的能力。此外，本实验通过基因芯片的筛查并基于KEGG数据库丰富了介导差异表达基因功能的显著改变的通路，共鉴定出14个与差异基因表达相关的显著通路，这些通路可能在KDM3B的功能调控中发挥关键作用。通过信号网络分析(信号网络)构建了一个基于显著调节的GOs和途径的相互作用库，以根据基因相互作用的程度(中间性中心性)识别12个核心基因，包括CCND1、CLDN1、CLDN11、 DDX58、FGF5、ISG15、MET、MYD88、PLAT、PLAU、SERPINE1)。因此，KDM3B可能成为促进MSCs的定向分化和组织再生功能研究的候选靶点并应用于组织再生工程中。

总之，本发明发现了一个关键的成骨成牙分化增强剂——KDM3B，KDM3B过表达能够增强根尖牙乳头干细胞的成骨/成牙分化潜能和迁移趋化能力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明实施例提供的KDM3B的低表达抑制SCAP的成骨/成牙向分化的能力及KDM3B的过表达增强SCAP的成骨/成牙向分化的能力示意图；其中，图1A示用Western blot检测KDM3B在SCAPs中的敲除效率；图1B示KDM3B敲除后显著降低了SCAPs的ALP活性；图1C-1D示茜素红染色(C)和钙离子定量分析(D)显示KDM3B敲除后SCAPs的矿化能力较对照组降低；图1E-1F示实时RT-PCR证实，KDM3B敲除可降低SCAPs中OSX(E)和RUNX2(F) 的表达量；图1G示Western blot结果显示，敲除KDM3B的降低DSPP和OCN的表达；组蛋白 H3作为内参；图1H示用Western blot检测KDM3B的过表达效率；图1I示过表达KDM3B显著增强了SCAPs的ALP活性；图1J-1K示茜素红染色(J)和钙离子定量分析(K)结果显示，过表达KDM3B组较对照组增强了SCAPs的矿化能力；图1L-1M示实时RT-PCR显示， KDM3B过表达可增加SCAPs中OSX(L)和RUNX2(M)的表达；图1N示Western blot结果显示，过表达KDM3B促进OCN和DSPP的表达；组蛋白H3作为内参；

图2示本发明实施例提供的KDM3B的低表达可抑制SCAP增殖能力的示意图及KDM3B的过表达增强SCAP增殖能力示意图；

其中，图2A示CFSE检测显示，KDM3B敲除后3天SCAPs细胞数量较对照组减少；图 2B示KDM3B敲除后SCAPs细胞增殖指数明显降低；图2C示流式细胞周期分析显示，和对照组相比，KDM3B敲除后G0/G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少，G2/M期细胞比例无明显变化。；图2D示KDM3B基因敲除组与对照组细胞周期分布比较；图2E示KDM3B基因敲除组中，PI指数较对照组明显下降。；图2F示CFSE检测显示，过表达KDM3B后3天SCAPs 细胞数量较对照组增多；图2G示KDM3B过表达增加了SCAPs的增殖指数；图2H示流式细胞周期分析显示，和对照组相比，KDM3B过表达降低了G0/G1期细胞的比例，增加了S期细胞的比例，G2/M期细胞的比例无明显变化；图2I示KDM3B过表达组与对照组细胞周期分布比较；图2J示KDM3B过表达组中，PI指数较对照组明显增加；

图3示本发明实施例提供的KDM3B的KDM3B的低表达抑制SCAP的迁移趋化能力及过表达增强SCAP的迁移趋化能力示意图；其中，图3A示划痕迁移试验结果表明，敲除 KDM3B导致SCAPs的迁移能力在24h和48h时显著下降；图3B示和对照组相比，KDM3B 敲除组在24h和48h时划痕模拟迁移试验的相对宽度显著扩大；图3C示小室趋化实验结果显示，和对照组相比，敲除KDM3B导致SCAPs在24h和48h的趋化能力下降；图3D示和对照组相比，敲除KDM3B组的转移细胞数量明显减少；图3E示划痕迁移试验表明，和对照组相比，过表达KDM3B导致SCAPs在24h和48h的迁移能力显著增加；图3F示和对照组相比，过表达KDM3B组在24h和48h的划痕模拟迁移试验的相对宽度显著缩小；图3G示小室趋化实验结果显示，和对照组相比，过表达组KDM3B导致SCAPs在24h和48h的趋化能力增强；图3H示和对照组相比，过表达KDM3B组的转移细胞数显著增加；

图4示与对照组相比，KDM3B过表达SCAPs中差异表达基因的重要基因本体(GO)分析；图4A示KDM3B过表达过程中上调基因的显著GO功能；图4B示KDM3B过表达过程中下调基因的显著GO功能；y轴为GO类别，x轴为p值的负对数(-LgP)；较大的-LgP表示差异的p值较小；

图5示KDM3B过表达组与对照组相比，重要通路的交互网络(Path-net)分析；Path-Net 有助于找到网络中最上游和下游的信号通路，并了解这些通路之间的关系；Path-Net有助于找到网络中最上游和下游的信号通路，并通过了解这些通路之间的关系来明确KDM3B 调控干细胞的机制；度数高的通路意味着它在信号网络中起到了至关重要的作用；红色表示上调通路；蓝色表示下调通路；黄色表示上调和下调通路；圆形节点代表一条通路，线条表示两条通路之间的相互作用；

图6示KDM3B过表达组与对照组的差异表达基因的交互网络(Signal-net)分析；在Signal-net中，基因的中间中心性代表了基因的特征；红色代表一个重要的上调基因，基因之间的相互作用程度用圆圈大小表示，相互作用用线表示；

图7示酶切位点；

图8示克隆载体的多克隆位点。

具体实施方式

本发明公开了KDM3B基因在间充质干细胞骨向/牙向分化、增殖及迁移趋化过程中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

实施方案如下：

步骤一，细胞培养：牙根未发育完全的智齿拔除后立即用大量PBS溶液冲洗，小心取下根尖周牙乳头组织，剪碎，置于含I型胶原酶(3mg/mL)和Dispase(4mg/mL)1：1混合的消化液中37℃消化45min，过筛并离心收集细胞。用α-MEM培养液(含15％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，2mmol/l谷氨酰胺)重悬细胞并接种于培养皿中37℃、5％CO₂条件下培养，每3d换液1次。倒置显微镜下观察细胞生长至80％汇合状态时，使用0.25％胰蛋白酶按1：3消化传代，加入MSCM培养基中培养并鉴定。2-4 代的干细胞被用于之后的实验。

步骤二，质粒构建与病毒包装收集：敲减质粒与过表达质粒的构建均依据标准方法进行。

敲减质粒构建如下：短发夹RNA(shRNA)有针对性地插入KDM3B互补序列到pLKO.1慢病毒载体中。最终构建成KDM3B shRNA的质粒，选择Scramsh空载体作为对照。敲除序列为5′-AGGCACATTACATTTAGTC-3′。慢病毒shRNA(Scramsh)载体购买于Addgene 公司。

过表达质粒构建如下：将HA标记与KDM3B全长序列结合，通过BamH1和AgeI限制性位点插入pQCXIN逆转录病毒载体。最红构建出HA-KDM3B的质粒，选择Vector空载体作为对照。过表达质粒的构建方法如实施例1所示。逆转录病毒Vector载体购买于 Addgene公司。病毒包装按照厂家说明书(Addgene)进行，病毒质粒及包装质粒在293T 细胞进行转染，转染48h后，进行病毒包装、收集，病毒滴度鉴定，分装后保存在-80℃冰箱；

步骤三，病毒转染：敲减组(步骤二构建得到的敲减质粒)及其对照组(Scramsh空载体)的慢病毒在6μg/ml聚凝胺作用下转染SCAP12h，转染后48h，用1ug/ml的嘌呤霉素筛选3天后，得到稳定转染的细胞。用Western Blotting在蛋白水平检测KDM3B的敲减效率，得到稳定转染的敲减组(KDM3Bsh)及对照组(Scramsh)细胞株。过表达组(步骤二构建得到的过表达质粒)及其对照组(Vector空载体)的慢转录病毒在6μg/ml聚凝胺作用下转染SCAP12h，转染后48h用1ug/ml嘌呤霉素筛选7天得到稳定转染细胞，用real-time RT-PCR及Western Blotting在mRNA水平及蛋白水平检测KDM3B的表达，得到KDM3B 稳定转染的过表达(HA-KDM3B)及对照组(Vector)细胞株；

步骤四，碱性磷酸酶、茜素红染色和RT-PCR：碱磷酶活性测定是用矿化诱导液诱导SCAP3天，碱性磷酸酶活性检测根据碱性磷酸酶活性检测试剂盒说明进行分析；茜素红染色是为检测细胞体外矿化能力，SCAP细胞诱导2周后，用70％乙醇固定，2％茜素红染色；定量测定钙离子浓度，用10％的氯化十六烷吡啶溶于磷酸钠在室温下使茜素红退色 30min，通过测量562nm的吸光度测得钙离子浓度，并用标准曲线换算；RT-PCR实验是用Trizol提取细胞总RNA，逆转录得到cDNA，通过Real-timePCR定量测量成骨/成牙相关转录因子OSX、RUX2的表达。

步骤五，蛋白质印迹分析：RIPA裂解液溶解细胞，Bradford法测定蛋白浓度，样本用 10％SDS聚丙烯酰胺凝胶分离并利用半干转移膜装置转移到聚偏二氟乙烯上(PVDF)膜，将转印后的PVDF膜用5％脱脂奶粉封闭1h并置于摇床上震荡，孵育一抗并于4℃摇床过夜。将滤膜置于5％脱脂奶粉稀释的二抗中，免疫复合物与兔或小鼠免疫球蛋白G抗体一同孵育并用化学发光底物试剂使其可视化，BIO-RAD化学发生成像系统中成像。测定成骨 /成牙相关指标OCN、DSPP的表达。

步骤六，CFSE增殖实验及流式细胞术：CFSE增殖实验需取对数生长期的SCAP，胰蛋白酶消化计数后用PBS将细胞密度调整为1×10⁶个/mL，每mL细胞悬液中加入1μL CFSE工作液(1μM)，37℃避光孵育20min。然后用5倍体积的普通培养基37℃孵育5min，以去除溶液中多余的染料。PBS离心洗涤后，加入普通培养基重悬，按1×10⁵个/孔的密度接种于6孔板，每组3个孔，将6孔板分别置于低氧细胞培养箱和普通二氧化碳细胞培养箱中培养3天后，0.25％胰蛋白酶消化，PBS离心洗涤，弃上清后加入1％多聚甲醛300μL固定，4℃避光，上流式细胞仪进一步检测过表达组及敲除组SCAP增殖能力的的变化。流式细胞术也需取对数生长期的SCAP，胰酶消化后分别收集细胞个数1×10⁶。用冷5ml4℃ PBS洗涤细胞离心后弃上清。加入70％乙醇细胞固定液，4℃过夜。取出固定的细胞悬液， 1200rpm离心5～8min，弃去乙醇固定液。4ml PBS吹打洗涤细胞2次。加入500μl PBS重悬细胞，并将细胞悬液移入1.5mlEP管中，按100μg/ml的终浓度加入RNA酶(10mg/mlRNA 酶，需加入0.5ul/500μl)37℃孵浴30min。加入10mg/ml PI染液5μl，4℃避光20～30min，上机检测，结果用Modifit LT软件分析，得出G0/1、S及G2/M期细胞的比值，计算得出 PI(增殖指数)数值。即：PI＝(S+G2/M)/(Go/G1+S+G2M)。

步骤七，细胞迁移能力实验：细胞划痕实验是在0h，24h，48h时在显微镜下相同位置拍摄照片，统计细胞的迁移距离并做统计学分析。具体步骤为在六孔板中加入约5.0×10⁵个SCAP，待细胞长满用枪头比着直尺垂直划出痕迹，用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基，放入37℃、5％CO₂培养箱培养。0h，24h，48h在显微镜下拍照，并用软件分析24h、48h细胞的迁移距离。Transwell小室实验是在小室下方放置血清进行趋化诱导，统计24h，48h时穿过小室的细胞个数。具体步骤为将2.0×10⁶个SCAP接种在加入500μl无血清培养基的小室上方，小室下方放置500μl含10％血清的培养基。放入37℃、 5％CO₂培养。24h，48h后用结晶紫对小室进行染色并在显微镜下拍照，统计24h，48h穿过小室的细胞个数。

步骤八，使用人类基因1.0ST芯片(Affymetrix,USA)，由Genminix InformaticsLtd.公司对基因表达谱并进行分析。使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)提取总RNA。合成双链互补 DNA(cDNA)，标记，杂交，并添加到基因芯片载玻片。数据分析使用AffymetrixGeneChip 操作软件(Affymetrix，美国)。差异表达mRNA的阈值设置为>1.5的倍数变化，p值<0.05。根据这个阈值确定差异表达基因。

本发明实施例通过一系列试验发现KDM3B基因在间充质干细胞成骨/成牙向分化及增殖、迁移趋化过程中具有调控作用，能够促进SCAP细胞成骨/成牙向分化，能够增强SCAP增殖及迁移趋化的能力。该项研究为KDM3B在牙根组织再生中的应用提供理论依据。本发明涉及KDM3B在SCAP成骨/成牙向分化过程中的调控作用，涉及KDM3B基因在SCAP增殖过程中的调控作用，涉及KDM3B基因在SCAP迁移趋化过程中的调控作用，涉及KDM3B可能在牙根再生过程中具有促进作用。为明确KDM3B引起SCAPs功能变化的机制，本实验通过基因芯片的筛查并基于KEGG数据库丰富了介导差异表达基因功能的显著改变的通路，共鉴定出14个与差异基因表达相关的显著通路，这些通路可能在KDM3B 的功能调控中发挥关键作用。通过信号网络分析(信号网络)构建了一个基于显著调节的 GOs和途径的相互作用库，以根据基因相互作用的程度(中间性中心性)识别12个核心基因，包括CCND1、CLDN1、CLDN11、DDX58、FGF5、ISG15、MET、MYD88、PLAT、 PLAU、SERPINE1)。

干细胞的分离、培养及鉴定：

干细胞的使用获得首都医科大学附属北京口腔医院伦理委员会的审核批准，所有志愿者均在术前签署了知情同意书。牙根未发育完全的智齿拔除后立即放入无菌装有PBS的离心管中，在24h之内分离并培养SCAP。取出新鲜拔除的智齿，用大量PBS溶液冲洗，小心取下根尖周牙乳头组织，剪碎，置于含I型胶原酶(3mg/mL)和Dispase(4mg/mL)1： 1混合的消化液中37℃消化45min，过筛并离心收集细胞。用α-MEM培养液(含15％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，2mmol/l谷氨酰胺)重悬细胞并接种于培养皿中37℃、5％CO₂条件下培养，每3d换液1次。倒置显微镜下观察细胞生长至80％汇合状态时，使用0.25％胰蛋白酶按1：3消化传代，加入MSCM培养基中培养并鉴定。检测干细胞表面的标志物CD90、CD149、STRO-1等，2-4代的干细胞被用于之后的实验。

质粒构建与病毒包装收集：敲减质粒与过表达质粒的构建均依据标准方法进行。敲减质粒构建如下：短发夹RNA(shRNA)有针对性地插入KDM3B互补序列到pLKO.1慢病毒载体中。最终构建成KDM3B shRNA的质粒，选择Scramsh空载体作为对照。敲除序列为5′-AGGCACATTACATTTAGTC-3′。慢病毒shRNA(Scramsh)载体购买于Addgene公司。过表达质粒构建如下：将HA标记与KDM3B全长序列结合，通过BamH1和AgeI限制性位点插入pQCXIN逆转录病毒载体。最红构建出HA-KDM3B的质粒，选择Vector空载体作为对照。过表达质粒序列见表1。逆转录病毒Vector载体购买于Addgene公司。病毒包装按照厂家说明书(Addgene)进行，病毒质粒及包装质粒在293T细胞进行转染，转染48h 后，进行病毒包装、收集，病毒滴度鉴定，分装后保存在-80度冰箱；

病毒转染：对照组及敲减组的慢病毒在6μg/ml聚凝胺作用下转染SCAP 12h,转染后 48h，用1ug/ml的嘌呤霉素筛选3天后，用Western Blotting检测KDM3B在蛋白水平的敲减效率，如图1A所示，敲减组(KDM3Bsh)KDM3B蛋白水平的表达量明显低于对照组(KDM3BScramsh)，得到稳定转染的敲减组细胞株；对照组及过表达KDM3B组的慢转录病毒在6μg/ml聚凝胺作用下转染SCAP 12h，转染后48h用1ug/ml嘌呤霉素筛选7天得到稳定转染细胞，用Western Blotting检测KDM3B在蛋白水平的过表达效率，如图1H 所示，过表达组(HA-KDM3B)KDM3B蛋白水平的表达量明显高于对照组 (KDM3BVector)，得到稳定转染的过表达组细胞株。

KDM3过表达质粒的构建：

1.在基因翻译起始密码子(atg)之前加上kozak序列(gccacc，加粗部分)和表面标签 (HAtag)，并删掉基因自身的翻译起始密码子(atg)。

gccaccatgtacccatacgatgttcctgactatgcg

gcggacg cggcggcctc cccggtgggcaagcggctgc

241 tgctgctgtt cgcggacact gcggcctcag cctcggcctc ggctcccgcg gcggcagcgg

301 cgagcggaga tccggggcct gcgctgcgca ctcgagcctg gcgggccggc acggtgcggg

361 ccatgagcgg ggcggtgccc caggacctag cgatctttgt agaatttgat ggctgtaact

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1921 ttcttggaac agacactaag ccaggctcta aggctggcag ctctgtggac cggaaagtgc

1981 ctgcagagtc catgcccacc ctcactccag ccttcccacg gagcctccta aatgcccgta

2041 ccccagagaa tcatgaaaat ctatttttac agccccccaa attgtcccga gaagagcctt

2101 ctaatccttt cctggcattt gtggagaaag ttgaacacag ccctttcagt agttttgcat

2161 ctcaggcatc aggtagctcc tcttctgcta ccactgtcac ctccaaggtg gcacccagct

2221 ggcccgagtc tcactcctct gcagattcgg catctttagc aaagaagaaa cccctcttca

2281 ttacaactga ctcctccaag ctagtatctg gtgttctggg ctcagctctt accagtgggg

2341 gcccaagcct ctctgccatg gggaatggcc gctccagctc gcccaccagc agcctcactc

2401 agcccattga gatgccaact ctctcctcta gccccacaga ggagaggcca actgtggggc

2461 ctgggcagca ggacaatccc ctcctcaaaa cctttagtaa cgtctttggc aggcactcag

2521 gcggctttct gtcctccccg gcagattttt cacaggagaa caaagctcct tttgaagctg

2581 tgaaaaggtt ctcactggat gaacgaagct tggcttgcag acaagactcg gactccagca

2641 ccaacagtga cctgtcagat ttgagtgact ctgaggagca gctgcaggct aagacaggcc

2701 tgaagggaat tccagagcac ctgatgggga agctgggccc caatggggag cgcagtgctg

2761 agctgttgct gggcaaaagc aaagggaagc aggcccccaa gggccggcct cggactgccc

2821 ccctgaaagt tggccagtca gtgctgaaag atgtaagcaa agtgaagaag ctgaagcaat

2881 ctggagagcc cttcctgcag gatgggtcat gcatcaatgt ggcacctcat ctgcacaagt

2941 gtcgtgaatg ccgcctggag cggtaccgga agtttaagga acaggagcaa gatgattcta

3001 ctgtagcctg ccgtttcttt cacttccgga ggttgatctt cactcgaaaa ggggtactcc

3061 gtgtggaggg gtttttaagc ccccagcaaa gtgaccctga tgccatgaac ctgtggattc

3121 cctcttcctc cctagcagaa gggatagatc tagagacctc aaaatacatc ctggccaatg

3181 ttggggacca gttctgccag ctcgtaatgt ctgagaagga ggccatgatg atggtggagc

3241 cacaccagaa agtggcatgg aagcgagctg tgcgtggtgt acgggagatg tgtgatgtgt

3301 gtgaaacaac tctcttcaac atccactggg tttgtcgcaa atgtggattt ggggtctgcc

3361 ttgactgtta ccggctcagg aaaagccggc cacgcagtga gacagaagag atgggtgatg

3421 aagaagtttt ctcctggttg aagtgtgcaa agggacagtc ccacgaacca gagaatctca

3481 tgcccacaca aattattcct ggcacagctc tttacaatat tggagacatg gtacatgctg

3541 cccggggcaa gtggggaatt aaagcaaact gcccttgtat cagtcgacag aacaaatctg

3601 tattgagacc tgccgtcacc aatgggatgt cacagcttcc tagcataaac cctagtgcct

3661 cttctggaaa cgaaactacc ttctctggtg gaggaggacc ggcaccagta acaactccag

3721 agccggacca tgttcccaaa gccgacagca ctgacatcag atctgaagag cctctgaaaa

3781 cagacagttc ggcatcaaat agcaatagtg aactgaaagc catcaggcct ccttgccctg

3841 acacggcccc accctcctcc gccctgcact ggttggcaga tttagcaact cagaaggcta

3901 aagaagaaac aaaagaagca gggtccctga ggtcggtgct caataaagag tctcattcac

3961 cctttgggct ggactcgttc aactccactg caaaggtctc tccgctgact ccaaagcttt

4021 ttaacagtct gttgctgggt cccactgcct ccaacaacaa aaccgaaggg tctagccttc

4081 gagacctcct tcactccggg ccgggaaaac ttcctcaaac ccccttggac acaggcatac

4141 cctttccccc ggtcttctct acatcctcag caggagtgaa gagcaaggcc agcctaccca

4201 actttcttga ccacatcatt gcctcagtgg tagaaaataa gaaaacctca gatgcttcaa

4261 agcgggcctg caacttgact gatacccaga aggaagtgaa ggagatggtg atggggttaa

4321 atgtgctaga tccccatact tctcactcct ggctttgtga tgggaggctt ctgtgtctcc

4381 atgaccccag caacaaaaac aattggaaga tcttccggga gtgttggaag caaggtcagc

4441 cagtgctggt ttcgggggta cataaaaagc tcaagtctga gctctggaag ccagaagcct

4501 ttagccagga atttggagac caggatgtag acttggtgaa ctgcaggaac tgtgctataa

4561 tttccgatgt gaaagttcgg gatttctggg atggtttcga gatcatatgc aaacgactac

4621 ggtcagaaga tgggcagcca atggtgctca aactcaagga ctggcctcct ggggaagatt

4681 ttcgagacat gatgccaacc aggtttgaag atctgatgga gaaccttcct ctgccagaat

4741 ataccaaacg agatggcagg ctcaatctgg cctctaggct acctagctac tttgtaaggc

4801 ctgatctggg ccccaagatg tacaacgcct atgggttgat aacagcagaa gatagaagag

4861 ttggtacaac aaatcttcac ttagatgtgt ctgatgctgt taatgtgatg gtgtatgttg

4921 ggattcccat cggggagggt gctcatgatg aagaggtact caagacaatt gacgagggag

4981 atgccgatga ggtgacgaag cagaggattc atgatggaaa agagaagcca ggtgctttat

5041 ggcacatcta tgcagccaag gatgcagaga agatccggga gctgctccga aaggttggag

5101 aagaacaagg ccaagagaac ccccctgatc atgacccaat tcatgaccaa agttggtacc

5161 tggaccagac cctccgtaag cgactctatg aggagtatgg cgtgcaaggc tgggctattg

5221 tgcagttcct aggtgatgct gttttcatac ctgctggagc cccacaccag gttcacaatc

5281 tatacagttg cataaaagta gcagaagact ttgtatctcc agaacatgta aagcactgtt

5341 tccgcctgac tcaggaattc aggcatctct ctaacactca tacaaatcat gaggataaac

5401 tgcaggtgaa gaacatcatt taccatgcag tgaaagatgc ggttggcacc ctcaaggctc

5461 aatccaa actggcaagg tcctag

2.找到不能切开的酶Age1和BamHI，如图7所示。

3.分析克隆载体的多克隆位点，例如pQCXIN，如图8所示。

4.结合不能切开所需基因序列的限制性内切酶位点和克隆载体的多克隆位点找到基因克隆所需5’端及3’端的酶切位点。例如5’端用限制性内切酶Age1；3’端用限制性内切酶BamH1；

5.在基因5’端及3’端加上所选的限制性内切酶序列，5’端加上Age1序列(accggt)。 3’端加上BamH1序列(ggatcc)。

accggtgccaccatgtacccatacgatgttcctgactatgcggcggacg cggcggcctccccggtgggc aagcggctgc

241 tgctgctgtt cgcggacact gcggcctcag cctcggcctc ggctcccgcg gcggcagcgg

301 cgagcggaga tccggggcct gcgctgcgca ctcgagcctg gcgggccggc acggtgcggg

361 ccatgagcgg ggcggtgccc caggacctag cgatctttgt agaatttgat ggctgtaact

421 ggaagcaaca ctcctgggta aaagttcatg ctgaggaagt tatcgtgctt ctgctggaag

481 ggtctcttgt atgggcgccc cgtgaggacc cagtccttct ccagggcatt cgagtctcca

541 ttgcacaatg gccagccctg acttttactc cccttgtaga taaactgggt ttgggttctg

601 tggttccagt ggaatatctt ctggatcgag agcttcggtt cctgtcagat gccaatgggt

661 tgcatctgtt tcagatggga acagatagcc aaaaccagat tcttttggaa catgctgcac

721 tgagagaaac agttaatgct ttgatcagtg accaaaagct acaagagata ttcagccgag

781 gtccctacag tgttcaaggt cacagggtca aaatatatca gccagagggg gaagaagggt

841 ggctctatgg tgttgtgagc catcaggact ccatcactcg tcttatggag gtgtctgtaa

901 ctgagagtgg tgagatcaag tcggtagatc ccagactaat ccatgtgatg ctgatggata

961 attcaacgcc tcaaagcgag gggggtacgt taaaagcagt aaaatcttcc aaaggaaaga

1021 agaagagaga aagcatagag gggaaagatg gccggaggag gaaaagtgct tcggactctg

1081 ggtgtgaccc tgcatcaaag aaattaaaag gagacagggg tgaagtagac agtaatggga

1141 gcgatggagg tgaggcaagc cgagggccct ggaaaggagg gaatgccagt ggagagccag

1201 ggctggatca gagagccaag cagccaccgt ctacatttgt cccccagata aaccgcaaca

1261 ttcgctttgc cacttacacc aaagaaaacg gcaggactct ggtggtgcag gatgagcctg

1321 taggtgggga cacacctgca tctttcactc catattctac agccacaggt cagacacctt

1381 tggccccaga ggtgggtgga gccgaaaaca aagaggcagg aaaaacactg gaacaagttg

1441 gccagggcat agtggcttcc gcagctgtgg tcactaccgc cagctccacc ccaaacacag

1501 tgaggatctc agacactggc cttgcagcag ggactgtgcc agaaaaacag aaaggcagcc

1561 ggtcgcaggc ctcgggagag aattcaagaa attctattct ggcctcttct ggatttggag

1621 cacctctccc tagttcatcg caacctttga cttttggaag tggaaggagc cagtccaatg

1681 gtgttctagc cacagagaac aaacctttgg gcttctcttt tggctgtagc tctgcacaag

1741 aggcacagaa agacactgat ctctccaaaa acttgttttt tcaatgcatg tcccaaactt

1801 tacctaccag taactacttc actactgttt cagagagttt ggctgatgat tcttctagtc

1861 gggactcatt caaacaaagc cttgagagcc tgagctcagg cctgtgtaaa ggcagatccg

1921 ttcttggaac agacactaag ccaggctcta aggctggcag ctctgtggac cggaaagtgc

1981 ctgcagagtc catgcccacc ctcactccag ccttcccacg gagcctccta aatgcccgta

2041 ccccagagaa tcatgaaaat ctatttttac agccccccaa attgtcccga gaagagcctt

2101 ctaatccttt cctggcattt gtggagaaag ttgaacacag ccctttcagt agttttgcat

2161 ctcaggcatc aggtagctcc tcttctgcta ccactgtcac ctccaaggtg gcacccagct

2221 ggcccgagtc tcactcctct gcagattcgg catctttagc aaagaagaaa cccctcttca

2281 ttacaactga ctcctccaag ctagtatctg gtgttctggg ctcagctctt accagtgggg

2341 gcccaagcct ctctgccatg gggaatggcc gctccagctc gcccaccagc agcctcactc

2401 agcccattga gatgccaact ctctcctcta gccccacaga ggagaggcca actgtggggc

2461 ctgggcagca ggacaatccc ctcctcaaaa cctttagtaa cgtctttggc aggcactcag

2521 gcggctttct gtcctccccg gcagattttt cacaggagaa caaagctcct tttgaagctg

2581 tgaaaaggtt ctcactggat gaacgaagct tggcttgcag acaagactcg gactccagca

2641 ccaacagtga cctgtcagat ttgagtgact ctgaggagca gctgcaggct aagacaggcc

2701 tgaagggaat tccagagcac ctgatgggga agctgggccc caatggggag cgcagtgctg

2761 agctgttgct gggcaaaagc aaagggaagc aggcccccaa gggccggcct cggactgccc

2821 ccctgaaagt tggccagtca gtgctgaaag atgtaagcaa agtgaagaag ctgaagcaat

2881 ctggagagcc cttcctgcag gatgggtcat gcatcaatgt ggcacctcat ctgcacaagt

2941 gtcgtgaatg ccgcctggag cggtaccgga agtttaagga acaggagcaa gatgattcta

3001 ctgtagcctg ccgtttcttt cacttccgga ggttgatctt cactcgaaaa ggggtactcc

3061 gtgtggaggg gtttttaagc ccccagcaaa gtgaccctga tgccatgaac ctgtggattc

3121 cctcttcctc cctagcagaa gggatagatc tagagacctc aaaatacatc ctggccaatg

3181 ttggggacca gttctgccag ctcgtaatgt ctgagaagga ggccatgatg atggtggagc

3241 cacaccagaa agtggcatgg aagcgagctg tgcgtggtgt acgggagatg tgtgatgtgt

3301 gtgaaacaac tctcttcaac atccactggg tttgtcgcaa atgtggattt ggggtctgcc

3361 ttgactgtta ccggctcagg aaaagccggc cacgcagtga gacagaagag atgggtgatg

3421 aagaagtttt ctcctggttg aagtgtgcaa agggacagtc ccacgaacca gagaatctca

3481 tgcccacaca aattattcct ggcacagctc tttacaatat tggagacatg gtacatgctg

3541 cccggggcaa gtggggaatt aaagcaaact gcccttgtat cagtcgacag aacaaatctg

3601 tattgagacc tgccgtcacc aatgggatgt cacagcttcc tagcataaac cctagtgcct

3661 cttctggaaa cgaaactacc ttctctggtg gaggaggacc ggcaccagta acaactccag

3721 agccggacca tgttcccaaa gccgacagca ctgacatcag atctgaagag cctctgaaaa

3781 cagacagttc ggcatcaaat agcaatagtg aactgaaagc catcaggcct ccttgccctg

3841 acacggcccc accctcctcc gccctgcact ggttggcaga tttagcaact cagaaggcta

3901 aagaagaaac aaaagaagca gggtccctga ggtcggtgct caataaagag tctcattcac

3961 cctttgggct ggactcgttc aactccactg caaaggtctc tccgctgact ccaaagcttt

4021 ttaacagtct gttgctgggt cccactgcct ccaacaacaa aaccgaaggg tctagccttc

4081 gagacctcct tcactccggg ccgggaaaac ttcctcaaac ccccttggac acaggcatac

4141 cctttccccc ggtcttctct acatcctcag caggagtgaa gagcaaggcc agcctaccca

4201 actttcttga ccacatcatt gcctcagtgg tagaaaataa gaaaacctca gatgcttcaa

4261 agcgggcctg caacttgact gatacccaga aggaagtgaa ggagatggtg atggggttaa

4321 atgtgctaga tccccatact tctcactcct ggctttgtga tgggaggctt ctgtgtctcc

4381 atgaccccag caacaaaaac aattggaaga tcttccggga gtgttggaag caaggtcagc

4441 cagtgctggt ttcgggggta cataaaaagc tcaagtctga gctctggaag ccagaagcct

4501 ttagccagga atttggagac caggatgtag acttggtgaa ctgcaggaac tgtgctataa

4561 tttccgatgt gaaagttcgg gatttctggg atggtttcga gatcatatgc aaacgactac

4621 ggtcagaaga tgggcagcca atggtgctca aactcaagga ctggcctcct ggggaagatt

4681 ttcgagacat gatgccaacc aggtttgaag atctgatgga gaaccttcct ctgccagaat

4741 ataccaaacg agatggcagg ctcaatctgg cctctaggct acctagctac tttgtaaggc

4801 ctgatctggg ccccaagatg tacaacgcct atgggttgat aacagcagaa gatagaagag

4861 ttggtacaac aaatcttcac ttagatgtgt ctgatgctgt taatgtgatg gtgtatgttg

4921 ggattcccat cggggagggt gctcatgatg aagaggtact caagacaatt gacgagggag

4981 atgccgatga ggtgacgaag cagaggattc atgatggaaa agagaagcca ggtgctttat

5041 ggcacatcta tgcagccaag gatgcagaga agatccggga gctgctccga aaggttggag

5101 aagaacaagg ccaagagaac ccccctgatc atgacccaat tcatgaccaa agttggtacc

5161 tggaccagac cctccgtaag cgactctatg aggagtatgg cgtgcaaggc tgggctattg

5221 tgcagttcct aggtgatgct gttttcatac ctgctggagc cccacaccag gttcacaatc

5281 tatacagttg cataaaagta gcagaagact ttgtatctcc agaacatgta aagcactgtt

5341 tccgcctgac tcaggaattc aggcatctct ctaacactca tacaaatcat gaggataaac

5401 tgcaggtgaa gaacatcatt taccatgcag tgaaagatgc ggttggcacc ctcaaggctc

5461 aatccaa actggcaagg tcctagggatcc

本发明提供的KDM3B基因在间充质干细胞骨向/牙向分化、增殖及迁移趋化过程中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 KDM3B对SCAP成骨/成牙向分化能力的影响

1.碱性磷酸酶活性测定：

取对数生长期的KDM3Bsh，Scramsh，HA-KDM3B及Vector细胞进行消化制成单细胞悬液，以2×10⁵个/孔的浓度接种于6孔板中，放入培养箱中过夜，倒置显微镜下观察细胞生长至80％后，替换原培养基为商品化的成骨诱导培养基STEMPRO(Invitrogen,美国) 进行成骨诱导3天后应用碱性磷酸酶活性试剂盒检测。

操作步骤如下：

(1)配制碱性磷酸酶裂解液

表1

(2)配制Stock substrate Sol金片+银片加入5ml纯水

(3)配制终止液：0.5N NaOH

(4)用标准品制作标准曲线；

(5)吸净培养基，PBS轻柔漂洗2次；

(6)6孔板中加入500μl裂解液，37℃摇床，15min；

(7)将细胞轻轻刮下，移至1.5mlEP管(置于冰上)，14000rpm，4℃离心10min；

(8)取上清，移至另一EP管；

(9)96孔板中加入50μl ALP缓冲液和50μl stock substrate Sol.，充分混匀；

(10)每孔中加入10μl样本上清液，混匀，37℃孵育15min；

(11)加入110μl 0.5N NaOH终止反应；

(12)酶标仪上读取405nm波长吸光度值(A405)，以X表示；

(13)Brandford比色法测定样品蛋白浓度：96孔板中加入200μl考马斯亮蓝和1μl样本上清液混匀，去净气泡，酶标仪上读取595nm波长吸光度值(A595)，计算蛋白浓度，公式为：蛋白量＝(A595+0.0061)/0.0002×上样量

本实验所用标准曲线换算公式：Y＝18.904X-0.2817

Y：碱性磷酸酶ALP sigma unit/孵育时间(min)/蛋白量(mg)

X:405nmOD吸光度值，要求OD>0.015

2.茜素红染色：

(1)吸净培养基，PBS轻柔漂洗2次；

(2)70％乙醇放入六孔板，4℃细胞1h；

(3)双蒸水漂洗2次；

(4)六孔板中加入1ml 40mM茜素红溶液(pH4.2)，室温染色1min，肉眼观察着色情况；

(5)双蒸水漂洗5次，PBS摇动洗15min，减少非特异性染色，吸净六孔板内液体，干燥2h，描仪透射模式采集图像。

3.钙离子浓度测定：

(1)茜素红染色后，六孔板中每孔加入1ml 10％w/vCPC液，室温放置30min；

(2)六孔板中溶解液混匀，取50μl溶液加入450μl纯水稀释10倍，酶标仪读取562nm波长吸光度值(OD)，以X表示；

(3)用AR-S标准曲线计算Ca²⁺的相对浓度，Ca²⁺相对浓度的计算公式： Y＝0.685X+0.0503(Y：Ca²⁺相对浓度，X：OD值)

4.real time RT-PCR检测成骨相关转录因子OSX及RUX2 mRNA的表达变化：

(1)RT-PCR引物序列

表2

基因名称	SEQ ID No.	引物序列(5’-3’)
			GAPDH-F	1	CGGACCAATACGACCAAATCCG
GAPDH-R	2	AGCCACATCGCTCAGACACC
			RUNX2-F	3	TCTTAGAACAAATTCTGCCCTTT
RUNX2-R	4	TGCTTTGGTCTTGAAATCACA
			OSX-F	5	CCTCCTCAGCTCACCTTCTC
OSX-R	6	GTTGGGAGCCCAAATAGAAA

(2)细胞总RNA的提取

按

试剂说明书进行操作，具体操作如下：

1)培养细胞取出后弃去培养基，用PBS漂洗两遍，吸干后培养皿或6孔板中加入700μl 或500μl Trizol，反复吹打混匀，液体由粘稠状变为澄清后转移至DEPC处理的1.5ml EP管中，室温静置5min；

2)加入1/5体积的氯仿，vertex剧烈混匀15s，室温静置10min待其分层；

3)4℃，12000rpm离心15min；

4)吸取上层水相(一般为300-500μl)至另一DEPC处理过的1.5ml EP管中；

5)加入等体积异丙醇，轻柔混匀后静置，室温孵育10min；

6)4℃，14000rpm离心10min；

7)弃上清，可见白色沉淀，加入75％乙醇(DEPC水配制)1ml，vertex混匀；

8)9000rpm，15min；

9)弃上清，室温干燥20min；

10)加入DEPC水(20-40μl)溶解RNA，混匀，-80℃保存备用；

11)紫外分光光度计测定260nm和280nm吸光度值，A260/A280比值在1.8～2.0之间，说明所提取的RNA样品纯度较高；

(3)逆转录为cDNA

1)Microtube管中配制下列混合液，总体积为12μl

表3

2)将上述混合物混匀离心后放入逆转录仪，65℃，5min，拿出迅速放置冰上，至少1min；

3)离心数秒使Microtube内容物聚集于管底部；

4)在上述Microtube管中加入下列反转录反应液7μl/管，放入逆转录仪，37℃，5min

5)逆转录反应的液配制

表4

6)加入1μl M-MLV逆转录酶，吹打混匀，离心3～5s；

7)放入逆转录仪，37℃持续50min，之后70℃持续15min，4℃保温，样本加ddH₂O 适量稀释，保存于-20℃备用；

(4)Real-time PCR

配置Real-time PCR反应体系如下：

表5

1)将30μl上述混合液加入八联管中，再加入逆转录的cDNA 30μl，混匀后离心备用；

2)排枪将混匀的上述液体均匀分至3个副孔，每孔18.5μl，离心；

3)置于PCR仪中，real-time PCR反应体系步骤见下表：

表6

4.Western Blot法实验步骤如下：

(1)细胞总蛋白的提取

1)吸净培养基，用4℃预冷的5ml PBS漂洗细胞两次，再次将PBS吸净，加入 400μl裂解液(400μl RIPA+4μl PMSF+4μl PIC)，用刮刀刮取贴壁生长的细胞，将混有细胞的裂解液混合物吸入1.5ml EP管中，超声处理3次，冰上15min，每2～3min混悬一次；

2)4℃，14000rpm离心15min，收集上清液于新EP管中，-80℃保存备用；

(2)Bradford法测定蛋白浓度

1)按说明用双蒸水依次稀释BSA蛋白标准品至终浓度分别为1000μg/ml， 750μg/ml，500μg/ml，250μg/ml，125μg/ml，62.5μg/ml，0μg/ml；

2)计算所需在96孔板中孔洞的数量，每孔加200ul 1X考马斯亮蓝液，取1μl样品和标准品加入96孔板中，室温孵育5min，设副孔和空白孔；

3)去净气泡，测定595nm波长的OD值，根据标准曲线计算蛋白浓度；

4)根据蛋白浓度计算上样体积，每组蛋白的上样量为25μg；

(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳

1)准备预成胶；

2)变性：每孔25μg蛋白量上样,用蒸馏水将待测样本体积稀释至20μl，每样本加入5μl loading buffer(溴酚蓝)，100℃金属浴10min，置于冰上10min，-20℃保存备用；

3)上样，以80V电压电泳至溴酚蓝电泳至分离胶，将电压调到100V，直至溴酚蓝到达分离胶底部，终止电泳；

(4)转膜

1)准备预成膜；

2)将电泳胶转移至预成膜中，使用BioRad半干转进行转膜；

3)取出PVDF(Polyvinylidene difluoride,PVDF,聚偏二氟乙烯膜)膜，用TBST漂洗 5min，重复3次；

(5)Western blot滤膜杂交

1)将转印后的PVDF膜用5％脱脂奶粉封闭1h并置于摇床上震荡；

2)TBST漂洗10min，重复三次；

3)取出滤膜，置于5％脱脂奶粉稀释的一抗中，4℃摇床过夜；

4)TBST洗膜10min，重复3次；

5)将滤膜置于5％脱脂奶粉稀释的二抗中，室温摇床孵育1h；

6)TBST洗膜10min，重复3次；

(6)显色

将PVDF膜胶面朝上置于保鲜膜上，加入显影液，BIO-RAD化学发生成像系统中成像。

通过早期成骨/成牙分化指标碱磷酶、晚期成骨/成牙分化指标茜素红染色、钙离子浓度测定以及检测mRNA水平的分化指标OSX、RUX2和蛋白水平的分化指标OCN及DSPP 观察KDM3B对SCAP成骨/成牙分化能力的影响。图1B、I为成骨诱导3天后碱磷酶活性检测结果，结果显示敲减组KDM3Bsh的碱磷酶活性显著低于对照组Scramsh；过表达组 HA-KDM3B的碱磷酶活性显著高于对照组Vector。图1G、N为成骨诱导2周后茜素红染色结果，结果显示敲减组KDM3Bsh的茜素红染色显著弱于对照组Scramsh；过表达组 HA-KDM3B的茜素红染色显著强于对照组Vector。图1D、K为成骨诱导2周后钙离子浓度的测定结果，结果显示敲减组KDM3Bsh的钙离子浓度显著低于对照组Scramsh；过表达组HA-KDM3B的钙离子浓度显著高于对照组Vector。图1E、F、M、L为成骨诱导2 周后成骨/成牙相关转录因子OSX及RUX2在mRNA水平的检测结果，结果显示敲减组 KDM3Bsh的OSX及RUX2的表达量显著低于对照组Scramsh；而在过表达组HA-KDM3B 中的表达量显著高于对照组Vector。图1G、N为成骨诱导2周后成骨/成牙相关指标OCN 及DSPP在蛋白水平的检测结果，结果显示敲减组KDM3Bsh的OCN及DSPP的表达量显著低于对照组Scramsh；而在过表达组HA-KDM3B中的表达量显著高于对照组Vector。

以上实验结果均表明KDM3B基因具有促进SCAP成骨/成牙向分化的能力。

实施例2 KDM3B对SCAP增殖能力的影响

1.CFSE增殖实验：

(1)取对数生长期的KDM3Bsh，Scramsh,HA-KDM3B及Vector细胞胰蛋白酶消化计数后用PBS将细胞密度调整为1×10⁶个/mL；

(2)每mL细胞悬液中加入1μL CFSE工作液(1μM)，37℃避光孵育20min。

(3)用5倍体积的普通培养基37℃孵育5min，去除溶液中多余的染料。

(4)PBS离心洗涤后，加入普通培养基重悬，按1×10⁵个/孔的密度接种于6孔板，每组3个孔，置于培养箱中培养3天；

(5)0.25％胰蛋白酶消化，PBS离心洗涤，弃上清后加入1％多聚甲醛300μL固定，4℃ 避光；

(6)上流式细胞仪进一步检测过表达组及敲除组SCAP增殖能力的的变化。

2.流式细胞术测定细胞周期变化：

(1)取对数生长期的KDM3Bsh，Scramsh,HA-KDM3B及Vector细胞，胰酶消化后分别收集细胞个数1×10⁶；

(2)1200rpm离心5-8min，弃去培养基；

(3)用冷5ml 4℃PBS洗涤细胞2次，1200rpm离心5～8min，弃上清

(4)固定：加入4ml 4℃70％乙醇细胞固定液固定细胞，4℃过夜，或在-20℃保存(最长不可超过60天)；

(5)取出固定的细胞悬液，1200rpm离心5～8min，弃去乙醇固定液，。加入4ml PBS吹打洗涤细胞，离心，弃上清，重复2次。

(6)加入500μl PBS重悬细胞，并将细胞悬液移入1.5ml EP管中，按100μg/ml的终浓度加入RNA酶(10mg/mlRNA酶，需加入0.5ul/500ul)37℃孵浴30min。

(7)加入10mg/ml PI染液，5μl，4℃避光20～30min，上机检测，结果用ModifitLT软件分析，得出G0/1、S及G2/M期细胞的比值，计算得出PI(增殖指数)数值。即：PI＝ (S+G2/M)/(Go/G1+S+G2M)。

通过CFSE增殖实验、流式细胞术测定细胞周期及计算PI指数多种方法检测敲减及过表达KDM3B基因对SCAP细胞增殖能力的影响，图2A所示，CFSE实验中敲减组 KDM3Bsh较对照组Scramsh增殖能力明显下降。图2B所示，对CFSE实验计算所得的PI 指数进行统计学分析显示敲减组KDM3Bsh明显低于对照Scramsh；图2C、D所示，流式细胞仪细胞周期分析显示敲减KDM3Bsh较对照组Scramsh G0/G1期细胞比例明显升高，S 期期细胞比例明显下降。图2E所示，对流式细胞术检测细胞周期计算所得的PI指数进行统计学分析显示敲减组KDM3Bsh明显低于对照Scramsh。以上结果均表明敲减KDM3B 能够抑制SCAP增殖的能力。图2F所示，CFSE实验中过表达组HA-KDM3B较对照组Vector 增殖能力明显增加。图2G所示，对CFSE实验计算所得的PI指数进行统计学分析显示过表达组HA-KDM3B明显低于对照较Vector；图2H,I所示，流式细胞仪细胞周期分析显示过表达组HA-KDM3B较对照组VectorG0/G1期细胞比例明显升高，S期期细胞比例明显下降。图2J所示，对流式细胞术检测细胞周期计算所得的PI指数进行统计学分析显示过表达组HA-KDM3B明显高于对照Vector。以上结果均表明过表达KDM3B能够增强SCAPs 增殖的能力。

因此多个检测增殖能力的实验结果一致显示KDM3B基因具有促进SCAPs增殖能力的作用。

实施例3 KDM3B对SCAP迁移趋化能力的影响

1.划痕实验：

(1)将KDM3Bsh，Scramsh,HA-KDM3B及Vector细胞均以4×10⁵个细胞/孔的密度接种于6孔板中，培养基中培养达90％～95％融合；

(2)用1000μl移液枪头比着直尺在皿底划出划痕；

(3)PBS洗涤两次，去掉划下的细胞，加入不加FBS及双抗的DMEM新鲜培养基中培养；

(4)显微镜下记录0h、24h、48h同一位置损伤诱导后的图像，测量创面闭合程度；

(5)采用Image Pro 1.49软件分析数值，计算空洞面积(VA)和高度(H)，得到相对宽度(RW)，公式RW＝VA/H。

2.Transwell小室实验：

(1)取生长状态良好、融合度达90％的KDM3Bsh，Scramsh,HA-KDM3B及Vector细胞，提前更换未加FBS的a-MEM基础液乏营养处理4～6h；

(2)PBS洗涤2次，胰酶消化并收集细胞，1100rpm离心6min，用a-MEM基础液重悬并计数；

(3)24孔板内加入约含15％FBS的DMEM 600μl/孔，按2×10⁴个/小室的接种密度接种细胞入Transwell小室，上室内所加体系为100ul，摇匀细胞后继续培养24～48h；

(4)结果观察：

1)另取一24孔板，向孔内加入预热PBS备用；

2)用镊子小心取出拟处理小室放入预热的PBS内，向小室内加入适量预热PBS，荡洗2～3次；

3)向24孔内加入500μl4％多聚甲醛，将小室置入并向小室内加入适量4％多聚甲醛， 4℃固定1h；

4)PBS轻荡洗2～3次，弃去PBS，每孔内加500μl吉姆萨工作染液，将小室置入并向其内加入适量染液，静置40min；

5)PBS轻荡洗2～3次，吸净，棉捻轻拭去上室内的着色细胞；保持小室湿润状态，20×物镜下观察是否存在蓝染细胞，将小室轻晾干，沿小室底边缘将PVDF膜割下，注意底面向上放置在载玻片上，中性加盖玻片封片，晾干采相。

通过划痕实验、Transwell小室实验检测敲减及过表达KDM3B基因对SCAP细胞迁移趋化能力的影响。图3A、B所示划痕实验敲减组KDM3Bsh较对照组Scramsh迁移能力明显下降。图3C、D所示划痕实验过表达组HA-KDM3B较对照组Vector迁移能力明显增强。图3E、F所示Transwell小室实验敲减组KDM3Bsh较对照组Scramsh趋化能力明显下降，图3G、H所示Transwell小室实验过表达组HA-KDM3B较对照组Vector趋化能力明显增强。综合上述结果显示KDM3B基因具有促进SCAP迁移趋化能力的作用。

实施例4基因芯片筛查KDM3B过表达后SCAPs中基因表达的差异情况

胰酶消化生长状态良好的对数生长期的HA-KDM3B及细胞，制成单细胞悬液，进行细胞计数，以5×10⁵个/皿的密度接种于10cm培养皿中，细胞汇合度达80％时，弃培养基，PBS漂洗2遍，使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)提取总RNA，合成双链互补DNA(cDNA) 标记杂交，并添加到基因芯片载玻片上。应用人类基因1.0ST芯片(Affymetrix,USA)，由GenminixInformatics Ltd.公司对基因表达谱并进行分析。数据分析使用Affymetrix GeneChip操作软件(Affymetrix，美国)。差异表达mRNA的阈值设置为>1.5的倍数变化，p 值<0.05。根据这个阈值确定差异表达基因。

应用基因芯片技术来确认HA-KDM3B和对照组之间的差异基因。如表7所示，出现变化的差异基因有155个，其中101个上调基因，54个下调基因。为了确定影响KDM3B 调控SCAPs功能的关键因素，我们进行了基因本体(GO)分析和路径分析。首先，对 HA-KDM3B组的差异表达基因进行GO分析，以丰富其重要功能。图4A结果显示一些重要的调节功能可能与骨/牙本质的分化、增殖和迁移有关，包括细胞迁移的正向调控、细胞运动的正向调控、对外部刺激的反应、细胞运动的组成成分；图4B所示，一些重要的下调GO功能与TOR信号的负调控、细胞迁移的负调控有关。然后，我们利用KEGG数据库对差异表达基因的显著改变途径进行了富集，并确定了与差异表达基因相关的显著变化途径，这些变化可能在KDM3B的功能调控中发挥重要作用，见表8。在本研究中，分析与功能相关的变化基因通路，发现了与上调基因相关的Toll样受体和Jak-STAT信号通路，以及与下调基因相关的Focaladhesion、TGF-beta信号通路，见图5；表9。

为了进一步研究全局网络，我们计算了网络中每个基因的连通性，并通过Signal-net 分析确定连通性最高的节点。通过对显著调控的GOs和通路的分析，根据基因相互作用的程度，我们发现12个核心基因，包括CCND1、CLDN1、CLDN11、DDX58、FGF5、ISG15、 MET、MYD88、PLAT、PLAU、SERPINE1，见图6；表10。

表7和对照组相比，过表达KDM3B的SCAPs中的差异表达基因。

表8过表达KDM3B组SCAPs中上调和下调的通路

表9过表达KDM3B组SCAPs的重要路径-网络富集情况

表10信号网富集的12个核心基因在过表达KDM3B组的SCAPs中的情况

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 首都医科大学附属北京口腔医院

<120> KDM3B基因在间充质干细胞骨向/牙向分化、增殖及迁移趋化中的应用

<130> MP2009943

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cggaccaata cgaccaaatc cg 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agccacatcg ctcagacacc 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcttagaaca aattctgccc ttt 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgctttggtc ttgaaatcac a 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctcctcagc tcaccttctc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gttgggagcc caaatagaaa 20

Claims

1.KDM3B在制备促进间充质干细胞的定向分化和/或组织再生功能的增强剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述定向分化包括成骨/成牙。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞包括牙源性间充质干细胞。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述牙源性间充质干细胞包括根尖牙乳头干细胞(SCAPs)、牙周膜干细胞(PDLSCs)、牙髓干细胞(DPSCs)、脱落的乳牙干细胞(DFSCs)中的一种或多种。

5.如权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于，KDM3B促进碱性磷酸酶活性和/或矿化能力。

6.如权利要求1至5任一项所述的应用，其特征在于，KDM3B增强成骨/成牙相关的转录因子OSX和/或RUX2的表达。

7.如权利要求1至6任一项所述的应用，其特征在于，KDM3B增强成骨/成牙关键指标OCN和/或DSPP的表达。

8.如权利要求1至7任一项所述的应用，其特征在于，KDM3B促进间充质干细胞的增殖和/或迁移趋化。

9.如权利要求1至8任一项所述的应用，其特征在于，KDM3B有关的通路包括TGF-beta信号通路、焦点附着力、ECM与受体的相互作用、细胞粘附分子(CAMs)、补体和凝血级联、Toll样受体信号通路、Jak-STAT信号通路、造血细胞系、肌动蛋白细胞骨架的调节作用、癌症的途径、胰腺癌、黑色素瘤、小细胞肺癌、原发性免疫缺陷。

10.如权利要求2至9任一项所述的应用，其特征在于，KDM3B的相关基因包括CCND1、CLDN1、CLDN11、DDX58、FGF5、ISG15、MET、MYD88、PLAT、PLAU或SERPINE1中的一种或多种。