JP2016521543A - Hdac阻害剤治療を必要とする可能性がある患者における診断および予後用途のための遺伝子発現バイオマーカーおよびそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、HDAC阻害剤治療のためのバイオマーカーとしてZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される1つ以上の遺伝子の利用に関する。上記の遺伝子の発現および/または変化は、好ましくは、上記の遺伝子によって発現される各対応するmRNAまたは1つ以上のタンパク質によって決定する。【選択図】なし
Description
本発明は、HDAC阻害剤治療と結び付けて使用されてよい特定の特異バイオマーカー、上記バイオマーカーが適用される方法および上記方法において使用するためのキットに向けられる。
基礎にあるDNA配列における変化以外の機構によって誘発される表現型(外観)もしくは遺伝子発現における遺伝的変化の研究は、エピジェネティクスと呼ばれている。そのような変化は残りの細胞寿命にわたって細胞分割を通して残存することが見込まれ、数世代にわたり存在する場合がある。上記の非遺伝的因子は、生体の遺伝子が異なった挙動をする、または異なった自己発現をすることを誘発する(Special report:“What genes remember”by Philip Hunter,Prospect Magazine May 2008 issue 146)。
近年のエピジェネティクスの研究は、環境因子が生体の特性に影響を及ぼし、時には子孫に継代される場合があることを証明している。現在までに、どの分子構造が関係するのかが科学的に実証されている:重要な因子は、規則正しい省スペース法でDNAを保存するための、染色体の構造成分であり、DNAのための1種類のパッケージング材料であるヒストンである。ヒストンが有する化学基および対応する修飾に依存して、例えばヒストンがアセチル化、リン酸化もしくはメチル化されていると、ヒストンは永久的に遺伝子を活性化または不活性化する。
まとめると、原核細胞、植物および動物を含む広範囲の生体において100例を超える継代エピジェネティック遺伝現象の例が報告されている(Jablonka,Eva;Gal Raz,2009,The Quarterly Review of Biology 84(2):131−176)。
エピジェネティック機構の分子的基礎は、複雑で不均一であり、特定の遺伝子の活性化状態の修飾を含むが、DNAの基本構造および配列を包含していない。さらに、DNAと関連するクロマチンタンパク質は、様々なタンパク質修飾によって誘導された活性化もしくは不活性化状態にある可能性がある。上述のように、例えばクロマチンへのそのようなエピジェネティック変化もまた、細胞の分割時に保存される。これらの修飾に基づいて、DNAがヒストンの周囲で包み込まれる方法が変化し、この構造修飾を原因として遺伝子発現も同様に変化する。そのようなクロマチンのリモデリング機構は、幾つかの機構を通して達成される可能性がある。
1つの重要な過程は、ヒストンタンパク質を作り上げる、例えばアセチル化、メチル化および/またはリン酸化として発生する可能性があるアミノ酸の翻訳後修飾を含む。アミノ酸が修飾されると、ヒストンタンパク質の全体形状が変化させられる場合がある。同様に、DNAは複製中に完全には巻き戻しされないので、このためそのような修飾ヒストンがDNAの各新規コピー内に運ばれることが起こり得ると思われる。これらの修飾ヒストンは、次に修飾方法において同様に成形された周囲の新規ヒストンを有する鋳型構造として機能する可能性がある。
ヒストンの非構造化N末端(「ヒストン尾部」とも呼ばれる)は特に高度に修飾されるが、ヒストン修飾は配列全体にわたって発生する可能性がある。これらの修飾には、アセチル化、メチル化、ユビキチン化、リン酸化およびSUMO化が含まれる。例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素(HATs)によるヒストンH3の尾部のK14およびK9リシンのアセチル化は、一般に転写能力と相関している。したがって脱アセチル化は転写サイレンシングと相関しており、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)活性を有する酵素によって果たされる。
「能動的」転写と関連しているアセチル化の傾向は、本来は生物物理学的であると思われる。リシン残基は通常その末端に正荷電窒素を有するので、このためDNA骨格の負荷電リン酸塩と結び付く可能性がある。これとは対照的に、アセチル化事象がリシン側鎖上のこの正荷電アミノ基を変化させると、正荷電アミノ基は中性アミド結合に変換され、結果としてヒストンからのDNAの解放を生じさせる。これが発生すると、転写因子および転写複合体はより容易にDNAに結合して転写過程の発生を可能にする。これは、ヒストン尾部への変化がDNA自体に直接作用を及ぼすエピジェネティック機構の「cis」モデルであると呼ぶことができる。エピジェネティック機構のまた別のモデルである「trans」モデルでは、ヒストン尾部への変化はDNAへ間接的に作用する。例えば、リシンのアセチル化はクロマチン修飾酵素(および同様に基底転写機構)のための結合部位を作成することができ、これは次にクロマチン状態への変化を誘発する。実際に、アセチル−リシンに特異的に結合するタンパク質断片(ドメイン)である保存されたブロモドメインは、(タンパク質ポリブロモ上の)SWI/SNF複合体を含む転写を活性化するのに役立つ多数の酵素内で見いだされる。これらをまとめると、アセチル化は、転写活性化を修飾するために「cis」および「trans」モデルのどちらにおいても作用すると思われる。
様々なシストン修飾は様々な方法で機能すると考えられる:1つの位置でのアセチル化は別の位置ではアセチル化とは異なる機能を果たす可能性が高い。同様に、複数の修飾が発生することがあり、これらの修飾はヌクレオソーム構造(DNA+ヒストン)の挙動を変化させるために一緒に働く可能性がある。これらのヒストンの基礎にある複数の動的修飾は体系的で再現可能な方法で遺伝子転写を調節し、ヒストンコードと呼ばれている。
エピジェネティック機構の調節は、様々な潜在的な医学的用途を期待できる。先天的遺伝子病は明確に理解されているが、エピジェネティクスが重要であることは、例えばアンジェルマン症候群およびプレイダー・ウィリー症候群の症例におけるように明白である。これらは遺伝子欠失もしくは遺伝子の不活性化によって誘発される通常の遺伝子病であるが、罹患者がゲノミック・インプリンティングのために本質的にヘミ接合性であるために極めて一般的であり、このため大多数の症例は両方のコピーがノックアウトされることを必要とするであろうが、この疾患を誘発するには単一遺伝子ノックアウトだけで十分である(インターネット上の‘Mendelian Inheritance in Man’,OMIM,www.ncbi.nlm.nih.gov/omimを参照されたい)。
多細胞生体におけるエピジェネティック機構は一般に分化に伴って生じると考えられてきたが、様々な種において継代エピジェネティック遺伝についての幾つかの観察さえなされてきた。これらの数世代にわたるエピジェネティック形質の大多数は数世代をかけて経ると次第に失われる可能性があるが、数世代にわたるエピジェネティクスが進化および順応にもう一つの側面を加えられるという可能性も依然としてある。DNAの1領域に関連するエピジェネティック特徴の修飾は、生体が数世代にわたる時間尺度で特定遺伝子を発現する表現型と抑制する表現型との間で切り替わることを可能にする(O.J.Rando and K.J.Verstrepen,2007,Cell 128(4):655−668)。その領域のDNA配列が突然変異していない場合、その変化は可逆性であり、順応過程に柔軟性を提供する。
最近の研究は、エピジェネティック医薬品が、例えば放射線療法や化学療法などの現在容認されている治療にとって推定上の代償療法もしくは補助療法であること、またはこれらの最新治療の作用を強化できたことを証明している(Wang,LG;Chiao,JW,2010,Int.J.Oncolo.3(37):533−9)。例えばヒストン内の構造変化による原型癌遺伝子領域および腫瘍サプレッサー配列のエピジェネティック制御は、癌の形成および進行に直接的な影響を及ぼすことが証明された(Iglesias−Linares et al.,2010,Oral Oncology 5(46):323−9)。
エピジェネティック的に作用する薬物を用いたそのような新規な治療選択肢は、他の抗癌治療が提供しない特徴である可逆性の機会をさらに提供できるであろう(Li,LC;Carroll,PR;Dahiya,R,2005.JNCI 2(97):103−15)。現在までに、エピジェネティック新薬開発は、新規なHDAC阻害製薬品であるボリノスタットおよびロミデプシンの市場への導入を含む、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)およびヒストンデアセチラーゼ(deactylas)(HDAC)に主として集中してきた(Spannhoff,A;Sippl,W;Jung,M(2009),International Journal of Biochemistry&Cell Biology 1(41):4−11)。HDAC酵素は特に、口腔扁平上皮癌の進行において肝要な役割を果たすことが証明されている(Iglesias−Linares et al.,(2010),Oral Oncology 5(46):323−9)。選択されたHDACイソ酵素の過剰発現は近年、様々な癌のタイプ、例えば肝細胞癌などにおけるHDAC−1およびHDAC−2(Lee TK,Poh YP et al.,2011:The Journal of Clinical Investigation,published online February 2011,www.jci.org)または結腸直腸腫瘍におけるHDAC−2(Zhu P,Martin E,Mengwasser J,Schlag P,Janssen KP,Goettlicher M.,2004,Cancer Cell.2004 May;5(5):455−63)における予後の悪化と結び付けられてきた。上述のように、異所性HDAC酵素の発現もしくは活性は、周知の腫瘍サプレッサー遺伝子の抑制を誘発して悪性腫瘍進行にとって重要な他の因子の活性を修飾する数多くのヒト悪性腫瘍と関連があることが見いだされた。そこでヒストンデアセチラーゼの阻害は、抗癌薬開発における前途有望な治療概念を表す。
現在、遺伝子構造、すなわちDNAの直接塩基配列および/または個人の遺伝子の突然変異が様々な疾患、特に癌の病因に寄与するだけではなく、さらに、例えばクロム化へのエピジェネティック二次パッケージングに影響を及ぼす環境シグナルの影響もまた発癌性の一因となる病原事象に影響を及ぼす、または誘発する可能性があることが実際に明確に認められている。
上述のエピジェネティック変化は、一細胞世代から他の細胞世代へ前方に継代されさえする、または一般に子孫に継代されさえする可能性があるので、そこで個人に遺伝子構造およびさらにエピジェネティック構造の両方を提供する。
このため、遺伝子構造または遺伝子における突然変異だけではなく、さらに個人の全体的エピジェネティック構造もまた疾患の発生に寄与する可能性があり、そのようなエピジェネティック機構に影響を及ぼす薬物への身体の応答に寄与する可能性がある。このように、エピジェネティック機構に大きな影響を及ぼす薬物によって誘発される身体のいずれかの細胞内での個人のエピジェネティック構造における変化の観察は、個人の治療への応答を予測するための妥当な方法を表す可能性がある。そのような個人の罹患組織は、そのような薬物作用を測定できる非罹患組織と同一もしくは少なくとも類似の方法でエピジェネティックレベルへの影響を有する薬物に応答する可能性が高い。
そのような薬物は、例えばヒストンデアクチラーゼ活性を有する酵素の阻害剤によって代表される、またはむしろ現在では一般にタンパク質デアセチラーゼと呼ばれるが、これはそれらの脱アセチル化活性がクライアントタンパク質としてのヒストンに限定されないことが多く、原型癌遺伝子および腫瘍サプレッサータンパク質機能により広域で直接的もしくは間接的に強度の影響を及ぼす可能性があるからである。
様々なHDAC阻害剤は現在、血液学的悪性腫瘍および充実性腫瘍の両方を含む広範囲の腫瘍実体において臨床試験中であり、1クラスのエピジェネティック的に活性で、強力な抗増殖性の分化誘導性およびプロアポトーシス性作用物質を表す。ヒストンデアクチラーゼ阻害剤ファミリーの2つのメンバー(ボリノスタットおよびロミデプシン)は、難治性皮膚T細胞リンパ腫の治療のために既に承認されており、これらの患者における単剤療法薬として相当に大きな臨床的有用性を有することが証明されている。
現在は、パノビノスタット、エンチノスタット、ベリノスタット、ギビノスタットおよびレスミノスタットを含む、多数のさらなるHDAC阻害剤が様々な段階で臨床開発中である(Marks,PA and Wu,W−s,2009,J.Cell.Biochem.;107(4):600−608)(Ellis,L and Pili,R,2010,Pharmaceuticals(Basel);3(8);2411−2469)。
しかし、当技術分野では、治療意図で、または治療過程においてできる限り早期にHDAC阻害剤の作用を決定することが必要とされる。
C2H2型のジンクフィンガータンパク質(ZFP)ファミリーの転写因子であるZFP64は、発生、分化、腫瘍発生および免疫応答を含む多数の細胞機能において重要な役割を果たす。ZFP64は、NF−κB活性化およびその後の侵襲性病原体への炎症性反応を伴うTLRシグナル伝達における正の調節因子である(Wang et al.,J Biol Chem 2013,published online July 15,2013)。しかし、その生物学的機能は大部分が不明のままである。
IHC染色実験(http://www.proteinatlas.org/ENSG00000020256/tissue/staining+overviewを参照)に基づくと、ZFP64タンパク質は好ましくは特定の組織/器官内で発現し、主として核内で見いだされる。正常な組織/器官内のZFP64タンパク質は、好ましくは:肝臓、膵臓および消化管ならびに精巣および皮膚内で発現する。癌組織内のZFP64タンパク質は、好ましくは以下のタイプ:肝臓、リンパ腫、膵臓、甲状腺および腎臓の癌内で発現する。ZFP64は、CRC患者における原発腫瘍に比較して肝転移においてはアップレギュレートされる(Li et al.,Hepatobiliary Pancreat Dis Int.2010;9:149−53)。
ZFP64は、Notch1の共活性化によって間葉細胞の分化を調節すると同定されている。ZFP64はNotch1の細胞内ドメイン(NICD)と関連すると報告されており、Notch標的遺伝子であるHes1およびHey1のプロモーターに動員され、それらをトランス活性化し、Notch1の共活性化による間葉細胞の分化に関係している(Sakamoto et al.,J Cell Sci.2008 May 15;121(Pt 10):1613−23.doi:10.1242/jcs.023119)。
前臨床試験および臨床試験では、HDAC阻害剤の使用が特異的遺伝子発現パターンの再現性調節を生じさせることが確認された。HDAC阻害剤が、(i)インビトロでHDAC阻害剤により治療された様々な異なる癌細胞型ならびに(ii)臨床試験の状況においてHDAC阻害剤により治療された癌患者の末梢血細胞の両方、および(iii)エックスビボでHDAC阻害剤により治療された健常ドナーのPBMCs中において同一方法でこれらの遺伝子発現を調節することを証明できた。
このため、所定の患者の癌細胞および末梢血細胞の全体的エピジェネティック構造が特定の薬理学的物質、例えばHDAC阻害剤の影響への感受性に関して匹敵する、およびこのためどちらの細胞型も同一もしくは類似の遺伝子発現調節を経験することになると推論することができる。このため、患者の末梢血細胞中のエピジェネティック的に誘導された特定の特異的遺伝子における遺伝子発現変化を使用すると、潜在的に同一患者の腫瘍細胞への薬物活性を決定することができる。
さらに、HDAC阻害剤を用いた患者の治療中の遺伝子発現プロファイルにおけるこれらのエピジェネティック的に誘導された変化の減少もしくは増加は、患者にとっての治療的有用性の減少もしくは増加を指示するので、このため疾患予後と相関する可能性がある。
1つの態様では、本発明は、癌患者の癌細胞系およびPBMCsならびに末梢血細胞中のHDAC阻害剤への曝露後に再現性で変化させられる特定の選択遺伝子の遺伝子発現の調節に関する。
本明細書ではバイオマーカーとも呼ぶこれらの遺伝子発現調節は、様々な有用性を有すると予測されている。
遺伝子発現調節は、適用されたHDAC阻害剤の薬力学的活性のマーカーとして機能する可能性がある。
遺伝子発現調節は、患者をHDAC阻害剤により治療すべきかどうか、およびHDAC阻害剤により治療すべき患者において臨床的有用性を期待できるか否かについての予測を可能にする、HDAC阻害剤による治療に取り組む前の予測バイオマーカーとして(もしくは層別化のために)役立つ可能性がある。
遺伝子発現調節は、所定の患者について疾患が治療とは無関係にどのように進行するのかについての予測を可能にする、HDAC阻害剤による治療に取り組む前の予後バイオマーカーとして役立つ可能性がある。
遺伝子発現調節は、患者がHDAC阻害剤による治療からどの位の期間にわたり利益を得られるかを予測するために、および一般にHDAC阻害剤治療の進行を監視するために、HDAC阻害剤による治療中のバイオマーカーとして役立つ可能性がある。
さらに、これらのバイオマーカーは疾患進行に因果的に関係する可能性もあるので、このためそれら自体が治療標的構造を表す場合がある。このためそれらの活性は、例えばsiRNA干渉によりそれらのmRNA発現パターンに影響を及ぼす、それらの存在を増加させるための遺伝子療法を介して、それらのタンパク質機能を調節するための抗体テクノロジー、またはそのようなバイオマーカー実体の機能的効力を変化させる低分子バインダーによってなど様々な手段を利用する治療的介入にとっての主題である可能性がある。さらにワクチン接種工程も可能であろう。
このため、本発明の主題は、HDAC阻害剤治療に関連する診断方法および予後診断方法における、および患者を層別化するための、少なくとも1つの遺伝子、上記少なくとも1つの遺伝子のDNA配列、上記少なくとも1つの遺伝子または少なくとも150ヌクレオチド長、好ましくは180ヌクレオチド長のそれらの断片によってコードされたRNA配列、または上記少なくとも1つの遺伝子によってコードされた少なくとも1つのタンパク質もしくは上記タンパク質の1つのドメインの使用であって、このとき上記少なくとも1つの遺伝子はZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群の1つ以上のメンバーから選択される使用である。本発明のさらなる実施形態は、治療的介入のための標的としての、上記の少なくとも1つの遺伝子、DNA配列、RNA配列もしくはタンパク質各々の使用である。
本発明は、HDAC阻害剤治療を監視するため、および上記治療を必要とする可能性がある患者を応答者もしくは非応答者に層別化するための、本発明によるバイオマーカーの適用、ヌクレオチド配列、タンパク質、キット、方法および使用を含んでいる。
本発明のために選択した遺伝子の同定を表1に示した。
本発明の1つの主題は、本発明による1つ以上の遺伝子の遺伝子発現を、HDAC阻害剤による治療を開始する前または治療の経過中のいずれかに罹患組織もしくは末梢血細胞のいずれかのサンプル中で直接的に測定することである。さらに、本発明のまた別の主題は、治療の開始前の遺伝子発現を治療中に観察される遺伝子発現と比較して、本発明において選択された1つ以上の遺伝子のこれらの発現プロファイルにおける変化を測定することである。さらに、本発明のまた別の主題は、治療を受けている患者の様々な部分母集団間の遺伝子発現を比較して、本発明において選択された1つ以上の遺伝子のこれらの発現プロファイルにおける差を測定することである。
本発明の特定の実施形態を以下に列挙する。
1.HDAC阻害剤治療の作用を決定する方法であって、以下の:
a)上記HDAC阻害剤治療を受けている患者のサンプルを提供する工程、
b)上記サンプル中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現および/または遺伝子発現の変化を決定する工程、
c)上記少なくとも1つの遺伝子の決定された遺伝子発現および/または遺伝子発現の変化を上記患者における上記HDAC阻害剤治療の作用と相関させる工程を含む方法。
1.HDAC阻害剤治療の作用を決定する方法であって、以下の:
a)上記HDAC阻害剤治療を受けている患者のサンプルを提供する工程、
b)上記サンプル中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現および/または遺伝子発現の変化を決定する工程、
c)上記少なくとも1つの遺伝子の決定された遺伝子発現および/または遺伝子発現の変化を上記患者における上記HDAC阻害剤治療の作用と相関させる工程を含む方法。
本発明の特定の実施形態では、上記少なくとも1つの遺伝子の決定された遺伝子発現および/または遺伝子発現の変化と患者におけるHDAC阻害剤治療との相関は、上記決定された遺伝子発現および/または遺伝子発現の変化を他の患者から獲得された以前のデータと比較することによって決定できるが、このとき上記少なくとも1つの遺伝子の特定の遺伝子発現および/または遺伝子発現の変化は既に上記HDAC阻害剤治療の作用に向けられている。そのようなデータは、例えば、表または機械読取り可能データバンクの形態で提供されてよい。
2.HDAC阻害剤治療を監視する方法であって、以下の:
a)上記HDAC阻害剤治療を受けている患者のサンプルを提供する工程、
b)上記サンプル中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現および/または遺伝子発現の変化を決定する工程、
c)上記の工程aおよびbを少なくとも1回、好ましくは2回以上繰り返す工程、および
d)工程a)〜c)において決定された上記遺伝子発現を使用して上記HDAC阻害剤治療への上記患者の応答の時間プロファイルを生成する工程を含む方法。
a)上記HDAC阻害剤治療を受けている患者のサンプルを提供する工程、
b)上記サンプル中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現および/または遺伝子発現の変化を決定する工程、
c)上記の工程aおよびbを少なくとも1回、好ましくは2回以上繰り返す工程、および
d)工程a)〜c)において決定された上記遺伝子発現を使用して上記HDAC阻害剤治療への上記患者の応答の時間プロファイルを生成する工程を含む方法。
本発明によるHDAC阻害剤治療を監視する方法は、上記少なくとも1つの遺伝子の決定された遺伝子発現および/または遺伝子発現の変化を上記患者における上記HDAC阻害剤治療の作用と相関させる工程を含んでいてよい。
3.上記少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現および/または遺伝子発現の変化は、さらにHDAC阻害剤治療の前向きもしくは後ろ向きの転帰の確率と相関させられる、上記の項目1または2のいずれかに記載の方法。
4.HDAC阻害剤治療を必要とする可能性がある患者を層別化する方法であって、以下の:
a)上記患者のサンプルを提供する工程、
b)上記サンプル中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現を決定する工程、
c)上記少なくとも1つの遺伝子の決定された遺伝子発現をHDAC阻害剤治療が上記患者への有益な作用を有する確率と相関させる工程、および
d)工程cにおいて決定された確率に基づいて、上記患者を上記HDAC阻害剤治療への応答者または非応答者であると分類する工程を含む方法。
a)上記患者のサンプルを提供する工程、
b)上記サンプル中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現を決定する工程、
c)上記少なくとも1つの遺伝子の決定された遺伝子発現をHDAC阻害剤治療が上記患者への有益な作用を有する確率と相関させる工程、および
d)工程cにおいて決定された確率に基づいて、上記患者を上記HDAC阻害剤治療への応答者または非応答者であると分類する工程を含む方法。
5.工程a)において提供された上記サンプルはHDAC阻害剤が上記患者に投与される前に提供され、
工程a)の後に、上記サンプル中のHDACを阻害するためにHDAC阻害剤がエックスビボで上記サンプルに加えられ、および
工程b)において、少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現が上記HDAC阻害剤を含む上記サンプル中で決定される、上記の項目4に記載の方法。
工程a)の後に、上記サンプル中のHDACを阻害するためにHDAC阻害剤がエックスビボで上記サンプルに加えられ、および
工程b)において、少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現が上記HDAC阻害剤を含む上記サンプル中で決定される、上記の項目4に記載の方法。
特に、上記の項目5では、「工程a)において提供されるサンプルはHDAC阻害剤が上記患者に投与される前に提供される」との表現は、工程a)において提供される上記サンプルが、上記患者にHDAC阻害剤が最初に投与される前に提供されることを意味する。または、上記の項目5では、「工程a)において提供されるサンプルはHDAC阻害剤が上記患者に投与される前に提供される」との表現は、工程a)において提供される上記サンプルがHDAC阻害剤治療のために上記患者に投与されることが意図される特定のHDAC阻害剤(例えば、レスミノスタット)が上記患者に最初に投与される前に提供されることを意味する。
1つの実施形態では、患者は上記患者のサンプル中のCCDC43の遺伝子発現が健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較して25%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは75%以上、いっそうより好ましくは100%以上異なる場合に応答者であると分類できる。1つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における増加である。1つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における減少である。
1つの実施形態では、患者は上記患者のサンプル中のDPP3の遺伝子発現が健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較して25%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは75%以上、いっそうより好ましくは100%以上異なる場合に応答者であると分類できる。1つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における増加である。1つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における減少である。
1つの実施形態では、患者は上記患者のサンプル中のHIST2H4A/Bの遺伝子発現が健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較して25%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは75%以上、いっそうより好ましくは100%以上異なる場合に応答者であると分類できる。1つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における増加である。1つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における減少である。
1つの実施形態では、患者は上記患者のサンプル中のKDELC2の遺伝子発現が健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較して25%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは75%以上、いっそうより好ましくは100%以上異なる場合に応答者であると分類できる。1つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における増加である。1つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における減少である。
1つの実施形態では、患者は上記患者のサンプル中のMICALL1の遺伝子発現が健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較して25%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは75%以上、いっそうより好ましくは100%以上異なる場合に応答者であると分類できる。1つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における増加である。1つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における減少である。
1つの実施形態では、患者は上記患者のサンプル中のZFP64の遺伝子発現が健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較して25%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは75%以上、いっそうより好ましくは100%以上異なる場合に応答者であると分類できる。1つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における増加である。1つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における減少である。
6.上記HDAC阻害剤治療を受けている患者にとってのHDAC阻害剤治療の前向きの転帰の確率を予測する方法であって、以下の:
a)上記患者のサンプルを提供する工程、
b)上記サンプル中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現を決定する工程、
c)上記遺伝子発現を、工程a)の前に上記患者から提供されたサンプル中の上記少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現と比較する工程、および
d)工程a)において提供された上記サンプル中と工程a)の前に提供された上記サンプル中との上記少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現の差を上記患者にとってのHDAC阻害剤治療の前向きの転帰の確率と相関させる工程とを含む方法。
a)上記患者のサンプルを提供する工程、
b)上記サンプル中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現を決定する工程、
c)上記遺伝子発現を、工程a)の前に上記患者から提供されたサンプル中の上記少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現と比較する工程、および
d)工程a)において提供された上記サンプル中と工程a)の前に提供された上記サンプル中との上記少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現の差を上記患者にとってのHDAC阻害剤治療の前向きの転帰の確率と相関させる工程とを含む方法。
7.工程a)の前に提供される上記サンプルは上記患者にHDAC阻害剤が投与される前に上記患者から提供される、および
工程a)において提供される上記サンプルは上記患者にHDAC阻害剤が投与された後に、好ましくはHDAC阻害剤が上記患者に初めて投与された後に提供されるが、このとき好ましくは「HDAC阻害剤が投与される前」は、上記HDAC阻害剤が投与される1秒間〜1日前、より好ましくは投与される1秒間〜1時間前を意味する、上記の項目6に記載の方法。
工程a)において提供される上記サンプルは上記患者にHDAC阻害剤が投与された後に、好ましくはHDAC阻害剤が上記患者に初めて投与された後に提供されるが、このとき好ましくは「HDAC阻害剤が投与される前」は、上記HDAC阻害剤が投与される1秒間〜1日前、より好ましくは投与される1秒間〜1時間前を意味する、上記の項目6に記載の方法。
1つの実施形態では、所定の患者にとってのHDAC阻害剤治療の前向きの転帰の確率は、HDAC阻害剤の投与2時間後に決定されたCCDC43の遺伝子発現が、HDAC阻害剤が上記患者に投与される前に上記患者由来のサンプル中で決定された上記遺伝子の遺伝子発現と比較して25%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは75%以上、いっそうより好ましくは100%以上、さらにいっそうより好ましくは150%以上変化した場合は、75%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、いっそうより好ましくは95%以上である。1つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における増加である。1つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における減少である。
1つの実施形態では、所定の患者にとってのHDAC阻害剤治療の前向きの転帰の確率は、HDAC阻害剤の投与2時間後に決定されたDPP3の遺伝子発現が、HDAC阻害剤が上記患者に投与される前に上記患者由来のサンプル中で決定された上記遺伝子の遺伝子発現と比較して25%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは75%以上、いっそうより好ましくは100%以上、さらにいっそうより好ましくは150%以上変化した場合は、75%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、いっそうより好ましくは95%以上である。1つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における増加である。1つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における減少である。
1つの実施形態では、所定の患者にとってのHDAC阻害剤治療の前向きの転帰の確率は、HDAC阻害剤の投与2時間後に決定されたHIST2H4A/Bの遺伝子発現が、HDAC阻害剤が上記患者に投与される前に上記患者由来のサンプル中で決定された上記遺伝子の遺伝子発現と比較して25%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは75%以上、いっそうより好ましくは100%以上、さらにいっそうより好ましくは150%以上変化した場合は、75%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、いっそうより好ましくは95%以上である。1つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における増加である。1つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における減少である。
1つの実施形態では、所定の患者にとってのHDAC阻害剤治療の前向きの転帰の確率は、HDAC阻害剤の投与2時間後に決定されたKDELC2の遺伝子発現が、HDAC阻害剤が上記患者に投与される前に上記患者由来のサンプル中で決定された上記遺伝子の遺伝子発現と比較して25%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは75%以上、いっそうより好ましくは100%以上、さらにいっそうより好ましくは150%以上変化した場合は、75%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、いっそうより好ましくは95%以上である。1つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における増加である。1つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における減少である。
1つの実施形態では、所定の患者にとってのHDAC阻害剤治療の前向きの転帰の確率は、HDAC阻害剤の投与2時間後に決定されたMICALL1の遺伝子発現が、HDAC阻害剤が上記患者に投与される前に上記患者由来のサンプル中で決定された上記遺伝子の遺伝子発現と比較して25%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは75%以上、いっそうより好ましくは100%以上、さらにいっそうより好ましくは150%以上変化した場合は、75%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、いっそうより好ましくは95%以上である。1つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における増加である。1つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における減少である。
1つの実施形態では、所定の患者にとってのHDAC阻害剤治療の前向きの転帰の確率は、HDAC阻害剤の投与2時間後に決定されたZFP64の遺伝子発現が、HDAC阻害剤が上記患者に投与される前に上記患者由来のサンプル中で決定された上記遺伝子の遺伝子発現と比較して25%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは75%以上、いっそうより好ましくは100%以上、さらにいっそうより好ましくは150%以上変化した場合は、75%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、いっそうより好ましくは95%以上である。1つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における増加である。1つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における減少である。
8.HDAC阻害剤治療を必要とする患者における薬力学マーカーとしての少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現を決定する方法であって、以下の:
a)上記患者のサンプルを提供する工程、
b)上記サンプル中の遺伝子発現および/またはZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を決定する工程、
c)上記少なくとも1つの遺伝子の決定された遺伝子発現および/または遺伝子発現の変化をHDAC阻害剤によるHDACの相対的阻害と相関させる工程を含む方法。
a)上記患者のサンプルを提供する工程、
b)上記サンプル中の遺伝子発現および/またはZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を決定する工程、
c)上記少なくとも1つの遺伝子の決定された遺伝子発現および/または遺伝子発現の変化をHDAC阻害剤によるHDACの相対的阻害と相関させる工程を含む方法。
9.上記少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現は、上記サンプル中の上記少なくとも1つの遺伝子または少なくとも150ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも180ヌクレオチド長のその断片によってコードされる少なくとも1つのmRNAのレベルを測定することによって決定される、上記の項目1〜8のいずれかに記載の方法。
10.上記少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現は上記サンプル中の上記少なくとも1つの遺伝子によってコードされる少なくとも1つのタンパク質または上記タンパク質のドメインのレベルを測定することによって決定される、上記の項目1〜8のいずれかに記載の方法。
11.上記少なくとも1つのタンパク質もしくはそのドメインのレベルおよび/またはレベルの変化は、抗体または抗体を含むプローブの結合によって決定され、上記抗体は上記少なくとも1つのタンパク質もしくはそのドメインに特異的に結合する、上記の項目10に記載の方法。
12.サンプルはHDAC阻害剤治療を開始する前またはHDAC阻害剤治療中のいずれかに採取される、上記の項目4〜11のいずれかに記載の方法。
13.上記サンプルは体液のサンプル、好ましくは全血、血清もしくは血漿を含む群から選択される血液サンプル、より好ましくは全血、血清もしくは血漿を含む群から選択される末梢血サンプルである、上記の項目1〜12のいずれかに記載の方法。
14.サンプルは組織サンプル、好ましくは罹患組織のサンプル、より好ましくは癌組織からの生検標本である、上記の項目1〜12のいずれかに記載の方法。
15.工程a〜cまたは工程a〜bは少なくとも1回、好ましくは2回以上繰り返される、上記の項目1〜14のいずれかに記載の方法。
工程a〜cまたは工程a〜bが繰り返される本発明の方法では、典型的には、上記工程はHCAD阻害剤の各投与後に、または各治療サイクル後に繰り返される。または、工程a〜cまたは工程a〜bは、例えばHCAD阻害剤の各第2回、第3回、第4回投与などの後、または各第2、第3、第4治療サイクルなどの後に低頻度の間隔で繰り返されてもよい。この方法を使用すると、治療の経過および患者の健康状態を監視できる。
16.HDAC阻害剤は、ボリノスタット、ロミデプシン、バルプロ酸、パノビノスタット、エンチノスタット、ベリノスタット、モセチノスタット、ギビノスタットおよびレスミノスタットまたはそれらの医薬上許容される塩、好ましくは遊離形にある(E)−3−(1−(4−((ジメチルアミノ)メチル)フェニルスルホニル)−1H−ピロール−3−イル)−N−ヒドロキシアクリルアミドまたはそれらの塩酸塩もしくはメシル酸塩を含む群から選択される、上記の項目1〜15のいずれかに記載の方法。
17.上記少なくとも1つの遺伝子は、上記HDAC阻害剤治療を必要とする患者のためのHDAC阻害剤治療における薬力学マーカーとしてのZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される、少なくとも1つの遺伝子の使用または上記少なくとも1つの遺伝子によってコードされたタンパク質の使用。
18.上記少なくとも1つの遺伝子は、上記HDAC阻害剤治療を必要とする患者にとってのHDAC阻害剤治療の転帰を予測するためのZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される、少なくとも1つの遺伝子の使用または上記少なくとも1つの遺伝子によってコードされたタンパク質の使用。
19.上記少なくとも1つの遺伝子は、HDAC活性を決定するための代理マーカーとしてのZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される、少なくとも1つの遺伝子の使用または上記少なくとも1つの遺伝子によってコードされたタンパク質の使用。
20.上記少なくとも1つの遺伝子は、応答者または非応答者としてHDAC阻害剤治療を必要とする可能性がある患者を層別化するためのZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される、少なくとも1つの遺伝子の使用または上記少なくとも1つの遺伝子によってコードされたタンパク質の使用。
21.上記サンプル中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現を決定するためのキットであって、
上記少なくとも1つの遺伝子または少なくとも150ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも180ヌクレオチド長のその断片によってコードされる少なくとも1つのmRNAに特異的に結合するプローブを含み、および
任意選択的に、培地、培地成分、バッファー、バッファー成分、RNA精製カラム、DNA精製カラム、染料、dNTPミックスを含む核酸、ポリメラーゼを含む酵素および塩を含む群から選択される1つ以上のさらなる成分を含むキット。
上記少なくとも1つの遺伝子または少なくとも150ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも180ヌクレオチド長のその断片によってコードされる少なくとも1つのmRNAに特異的に結合するプローブを含み、および
任意選択的に、培地、培地成分、バッファー、バッファー成分、RNA精製カラム、DNA精製カラム、染料、dNTPミックスを含む核酸、ポリメラーゼを含む酵素および塩を含む群から選択される1つ以上のさらなる成分を含むキット。
22.サンプル中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される1つの遺伝子によってコードされた少なくとも1つのタンパク質のレベルを決定するためのキットであって:
上記少なくとも1つの遺伝子もしくは上記タンパク質の1つのドメインによってコードされた少なくとも1つのタンパク質に特異的に結合するプローブを含み、および
任意選択的に、培地、培地成分、バッファー、バッファー成分、膜、ELISAプレート酵素基質、染料、ポリメラーゼを含む酵素および塩を含む群から選択される1つ以上のさらなる成分を含むキット。
上記少なくとも1つの遺伝子もしくは上記タンパク質の1つのドメインによってコードされた少なくとも1つのタンパク質に特異的に結合するプローブを含み、および
任意選択的に、培地、培地成分、バッファー、バッファー成分、膜、ELISAプレート酵素基質、染料、ポリメラーゼを含む酵素および塩を含む群から選択される1つ以上のさらなる成分を含むキット。
23.サンプル中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現を決定するための上記の項目21または22に記載のキットの使用。
24.上記決定された遺伝子発現は上記サンプル中のHDAC活性と相関させられる、上記の項目23に記載の使用。
25.上記サンプルはHDAC阻害剤治療を必要とする可能性がある患者から提供される、上記の項目23または24に記載の使用。
26.上記の項目1〜16のいずれかに記載の方法における上記の項目21または22に記載のキットの使用。
27.HDAC阻害剤治療を必要とする可能性がある患者の治療において使用するためのHDAC阻害剤であって、上記治療の前および/または上記治療中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子、上記少なくとも1つの遺伝子に対応する少なくとも1つのmRNA、または上記少なくとも1つの遺伝子によってコードされた少なくとも1つのタンパク質が上記患者へのHDAC阻害剤治療の作用の確率を決定するため、または上記患者がHDAC阻害剤治療への応答者であるかどうかを決定するために使用されるHDAC阻害剤。
28.HDAC阻害剤治療を必要とする可能性がある患者を治療する方法であって、患者にHDAC阻害剤を投与する工程を含み、上記方法の前および/または上記方法中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子、上記少なくとも1つの遺伝子に対応する少なくとも1つのmRNA、または上記少なくとも1つの遺伝子によってコードされた少なくとも1つのタンパク質が上記患者へのHDAC阻害剤治療の作用の確率を決定するため、または上記患者がHDAC阻害剤治療への応答者であるかどうかを決定するために使用される方法。
29.HDAC阻害剤は、ボリノスタット、ロミデプシン、バルプロ酸、パノビノスタット、エンチノスタット、ベリノスタット、モセチノスタット、ギビノスタットおよびレスミノスタットまたはそれらの医薬上許容される塩、好ましくは遊離形にある(E)−3−(1−(4−((ジメチルアミノ)メチル)フェニルスルホニル)−1H−ピロール−3−イル)−N−ヒドロキシアクリルアミドまたはそれらの塩酸塩もしくはメシル酸塩を含む群から選択される、上記の項目27に記載のHDAC阻害剤治療を必要とする可能性がある患者の治療において使用するためのHDAC阻害剤または上記の項目28に記載の方法。
本発明の特に好ましい実施形態は、上述のHDAC阻害剤治療を必要とする可能性がある患者の治療における方法、使用、キットおよびHDAC阻害剤各々に関しており、このときZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される遺伝子はZFP64である。
より好ましいのは、HDAC阻害剤治療を受けている患者にとってのHDAC阻害剤治療の前向きの転帰の確率を予測する、HDAC阻害剤治療の特定の作用の確率を決定する、HDAC阻害剤治療を監視する、および/または上述したHDAC阻害剤治療を必要とする可能性がある患者の層別化のための方法であって、このとき ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される遺伝子はZFP64およびDPP3を含む群から選択される方法。
いっそうより好ましいのは、上記HDAC阻害剤治療を受けている患者にとってのHDAC阻害剤治療の前向きの転帰の確率を予測する方法であって、以下の:
a)上記患者のサンプルを提供する工程、
b)上記サンプル中のZFP64の遺伝子発現を決定する工程、
c)上記遺伝子発現を、工程a)の前に上記患者から提供されるサンプル中のZFP64の遺伝子発現と比較する工程を含み、および
工程a)において提供される上記サンプル中と工程a)の前に提供される上記サンプル中とのZFP64の遺伝子発現の差を上記患者のためのHDAC阻害剤治療の前向きの転帰の確率と相関させる工程とを含む方法である。本発明のいっそうより特に好ましい実施形態は、上記HDAC阻害剤治療を受けている患者のためのHDAC阻害剤治療の前向きの転帰の確率を予測する好ましい方法であって、上記遺伝子はZFP64である方法に関する。
a)上記患者のサンプルを提供する工程、
b)上記サンプル中のZFP64の遺伝子発現を決定する工程、
c)上記遺伝子発現を、工程a)の前に上記患者から提供されるサンプル中のZFP64の遺伝子発現と比較する工程を含み、および
工程a)において提供される上記サンプル中と工程a)の前に提供される上記サンプル中とのZFP64の遺伝子発現の差を上記患者のためのHDAC阻害剤治療の前向きの転帰の確率と相関させる工程とを含む方法である。本発明のいっそうより特に好ましい実施形態は、上記HDAC阻害剤治療を受けている患者のためのHDAC阻害剤治療の前向きの転帰の確率を予測する好ましい方法であって、上記遺伝子はZFP64である方法に関する。
さらにいっそうより好ましいのは、上記HDAC阻害剤治療を受けている患者にとってのHDAC阻害剤治療の前向きの転帰の確率を予測する方法であって、以下の:
d)上記患者のサンプルを提供する工程、
e)上記サンプル中のDPP3の遺伝子発現を決定する工程、
f)上記遺伝子発現を、工程a)の前に上記患者から提供されるサンプル中のDPP3の遺伝子発現と比較する工程を含み、および
工程a)において提供された上記サンプル中と工程a)の前に提供された上記サンプル中とのDPP3の遺伝子発現の差を上記患者のためのHDAC阻害剤治療の前向きの転帰の確率と相関させる工程とを含む方法である。本発明のいっそうより特に好ましい実施形態は、上記HDAC阻害剤治療を受けている患者のためのHDAC阻害剤治療の前向きの転帰の確率を予測する好ましい方法であって、上記遺伝子はDPP3である方法に関する。
d)上記患者のサンプルを提供する工程、
e)上記サンプル中のDPP3の遺伝子発現を決定する工程、
f)上記遺伝子発現を、工程a)の前に上記患者から提供されるサンプル中のDPP3の遺伝子発現と比較する工程を含み、および
工程a)において提供された上記サンプル中と工程a)の前に提供された上記サンプル中とのDPP3の遺伝子発現の差を上記患者のためのHDAC阻害剤治療の前向きの転帰の確率と相関させる工程とを含む方法である。本発明のいっそうより特に好ましい実施形態は、上記HDAC阻害剤治療を受けている患者のためのHDAC阻害剤治療の前向きの転帰の確率を予測する好ましい方法であって、上記遺伝子はDPP3である方法に関する。
本発明の実施形態、例えば本発明による使用、方法、キットおよびHDAC阻害剤では、適切な場合は、患者は好ましくは癌、特に血液癌、より特別にはホジキンリンパ腫に罹患しており、および適切な場合は、サンプルは好ましくは癌、特に血液癌、より特別にはホジキンリンパ腫に罹患している患者から入手される。
本発明の他の実施形態、例えば本発明による使用、方法、キットおよびHDAC阻害剤では、適切な場合は、患者は好ましくはCRCもしくはHCC、より好ましくはHCCに罹患しており、および適切な場合は、サンプルは好ましくはCRCもしくはHCC、より好ましくはHCCに罹患している患者から入手される。
本発明の1つの特定実施形態では、本発明による1つ以上のバイオマーカーの遺伝子発現は、患者にHDAC阻害剤の投与後の複数の時点に測定される。この方法でバイオマーカーの遺伝子発現の変化の時間プロファイルを決定することができ、これはバイオマーカーの妥当性を増加させる可能性がある。一般に、本発明による1つ以上のバイオマーカーは、患者にHDAC阻害剤の投与後の複数の時点に測定される。好ましくは、本発明による1つ以上のバイオマーカーは、患者にHDAC阻害剤の投与後に少なくとも3回、または少なくとも4回、または少なくとも5回または少なくとも6回の時点に測定される。
本発明による方法では、上記1つ以上の遺伝子の遺伝子発現は、好ましくはHDAC阻害剤によるHDACの阻害についての指標である。
本発明による方法では、上記1つ以上の遺伝子の遺伝子発現は、好ましくはHDAC阻害剤治療の転帰と相関させられる。
本発明による方法の特定の実施形態では、サンプルは、各方法において適切に、HDAC阻害剤治療の出発前、またはHDAC阻害剤治療中のいずれかに採取される。
好ましくは本発明によるキットは、HDAC阻害剤治療を必要とする患者のサンプル中の本発明による少なくとも1つの遺伝子または本発明による少なくとも1つの遺伝子によってコードされた少なくとも1つのタンパク質のレベルを決定するために使用される。
本明細書で使用する用語「HDAC」もしくはヒストンデアセチラーゼは、ヒストンの脱アセチル化を促進する、および例えば転写因子、受容体などの他のタンパク質の脱アセチル化をさらに促進する可能性がある酵素を規定する。HDACタンパク質のファミリーには、それらのNCI遺伝子IDsによって規定される以下のヒト遺伝子、ならびに他の哺乳動物種内のそれらの対応物:HDAC1、ID:3065;HDAC2、ID:3066;HDAC3、ID:8841;HDAC4、ID:9759;HDAC5、ID:10014;HDAC6、ID:10013;HDAC7、ID:51564;HDAC8、ID:55869;HDAC9、ID:51564;HDAC10、ID:83933;HDAC11、ID:79885;SIRT1、ID:23411;SIRT2、ID:22933;SIRT3、ID:23410;SIRT4、ID:23409;SIRT5、ID:23408;SIRT6、ID:51548;SIRT7、ID:51547が含まれる。
Entrez IDおよび公式遺伝子記号(NCBI)により規定された遺伝子配列はヒト遺伝子に関する。しかし本発明はさらに、患者が非ヒト動物である用途のための他の哺乳動物種における対応する遺伝子も含む。
本明細書で使用する用語「ヒドロキサメート型のHDAC阻害剤」は、HDACの活性部位に位置する亜鉛イオンをキレート化できるヒドロキサメート基を含むHDAC阻害剤を規定する。
方法、使用、使用のための化合物、キットなど全部を含む本発明の全ての実施形態では、HDAC阻害剤は、特にレスミノスタットである(例えば、その場合のHDAC阻害剤治療は、特に「レスミノスタット治療」である)。
方法、使用、使用のための化合物、キットなど全部を含む本発明の全ての実施形態では、ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される遺伝子は、特にZFP64である。
本明細書で使用する用語「阻害」は、阻害されるべき実体の活性が減少させられる、例えば酵素、例えばHDACの場合には、例えば酵素による基質変換の代謝回転率が減少させられる。
本明細書で使用する、HDAC阻害剤によるHDAC阻害の状況における用語「相対的阻害」は、投与前HDAC活性レベル、すなわちHDAC阻害剤の投与前に比較したHDAC活性の阻害を意味する。
本明細書で使用する用語「HDACの阻害のレベル」または「HDAC阻害のレベル」は、HDAC活性が阻害剤の投与後に減少させられる比率に関する。HDACの阻害の高レベルは、各場合において阻害剤の投与前のHDAC活性と比較して、HDAC活性が強度に減少していることを意味するであろうが、他方HDAC活性の阻害の低レベルはHDAC活性がほんのわずかにしか減少していないことを意味するであろう。
本明細書で使用する用語「遺伝子発現」は、細胞内での遺伝子の発現産物の量に関する。発現産物には、遺伝子の転写産物、例えばmRNAおよび対応する翻訳産物、すなわちタンパク質が含まれる。遺伝子発現は相対的発現レベル、すなわち1つ以上のハウスキーピング遺伝子の発現に比較した、および/または通常は薬物を投与する前、例えば薬物を最初に投与する前、または所定の治療サイクルにおいて初めて薬物を投与する前の時点である既定の様々な時点での上記標的遺伝子の発現に比較した所定の時点での標的遺伝子の発現であると指示されることが多い。遺伝子発現は、特定のサンプル内の標的遺伝子の相対存在度を規定する。このため「遺伝子発現」にはさらに、所定の遺伝子の発現の非存在が含まれることがある。遺伝子発現についての絶対値は、通常は「Ct」値(本明細書の下記を参照)と表現され、各遺伝子について、発現が決定される特定方法、特に使用されたポリメラーゼに依存して変動してよい。
本明細書で使用する「(例えば、項目x、項目yおよび項目z)を含む群から選択される」などの表現は、好ましくは「(例えば、項目x、項目yおよび項目z)から選択される」と同等である(このとき、用語「および」は上記の項目−例えば、項目x、項目yおよび項目z−の全部が選択されると理解すべきではなく、むしろ上記の群の1つ(または特定の状況に依存してそれ以上)の項目が選択されると理解すべきである)。特定の実施形態では、これはさらに「(例えば、項目x、項目yおよび項目z)からなる群から選択される」を含んでいる。
表2では、上述のように、本発明による遺伝子の発現についての離散性発現範囲を規定するデータが提示されている。本明細書では、HDAC阻害剤治療の転帰との相関は確かな信頼性を伴って範囲2および3において確定することができ、好ましくは、HDAC阻害剤治療の転帰との相関は範囲1および4においてより高度の信頼性で確定することができる。
表2aでは、上述のように、本発明によるZFP64遺伝子の発現についての離散性発現範囲を特に規定するデータが提示されている。本明細書では、HDAC阻害剤治療の転帰との相関は確かな信頼性を伴って範囲2において確定することができ、好ましくは、HDAC阻害剤治療の転帰との相関は範囲1および3においてより高度の信頼性で確定することができる。
本明細書で使用する用語「ベースライン遺伝子発現」は、個人の集団内で決定された平均もしくは基準レベルに相当する遺伝子、RNAもしくはタンパク質の発現レベルを規定するが、このとき上記個人はHDAC阻害剤の影響下にはない。上記集団は、母集団全体または特定部分母集団の人口統計学的構成を反映する可能性があるが、このとき部分母集団は個人が特定疾患、例えば癌もしくは特定の癌タイプに罹患しているかどうか、疾患の特定の重症度を有する、もしくは健常であるかなどを含む医学的状態;性別;民族;肥満度指数;以前の医学状態歴;年齢;個人のライフスタイルにおける特定の因子、例えば飲酒もしくは薬物使用、喫煙、投薬、食物を含む群から選択される1つ以上の因子に関して選択される個人を含む。
本明細書で使用する用語「遺伝子発現の変化」は、異なる時点での上記遺伝子の遺伝子発現に比較した、好ましくはより早期の時点での上記遺伝子の遺伝子発現に比較した所定の時点での遺伝子の遺伝子発現の変化に関する。これは例えば、ベースライン遺伝子発現(上記に比較する)、投与前遺伝子発現(すなわち、HDAC阻害剤の投与前の同一個人についての遺伝子発現)または治療前、治療後もしくは治療中のある時点に測定された遺伝子発現に関する遺伝子発現における変化を意味する場合がある。特定の場合には、遺伝子の遺伝子発現の変化はゼロ(すなわち、遺伝子発現は変化しない)または検出不能の場合がある;しかしそのような場合は遺伝子発現の変化に関連する実施形態であって、遺伝子発現の変化を決定する結果は遺伝子発現が変化しないままであるという結果もまた含まれている。
例えば、遺伝子発現の変化は、(i)HDAC阻害剤による治療の開始前に所定の遺伝子の遺伝子発現をHDAC阻害剤治療中の上記遺伝子の遺伝子発現と比較する工程;(ii)HDAC阻害剤治療中の1つの時点での所定の遺伝子の遺伝子発現をHDAC阻害剤治療中のまた別の時点での上記遺伝子の遺伝子発現と比較する工程;および/または(iii)所定の遺伝子の遺伝子発現を健常者、罹患患者、未治療患者および/または治療患者の集団から決定された上記遺伝子のベースライン遺伝子発現と比較する工程によって決定されてよい。
遺伝子発現の上記変化は、遺伝子発現の増加もしくは減少、すなわち遺伝子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションに関連する場合がある。さらに、本発明による遺伝子は、相互から独立してアップレギュレートもしくはダウンレギュレートされてよい、例えば上記遺伝子の1つ以上はアップレギュレートされてよいが、他方他の遺伝子はダウンレギュレートされてよく、他方他の遺伝子の遺伝子発現は未変化のままであってよい。
本明細書で使用する用語「バイオマーカー」は、1つの分子種、例えばポリペプチド、例えばタンパク質もしくはポリ核酸、例えば正常生物学的過程、病理的過程、または治療的介入への薬理反応の指標として検出および評価できるmRNAを規定する。したがって、バイオマーカーは、生理的、薬理学的または疾患過程もしくは疾患状態を反映する測定可能な特徴である。
他に特に規定されない限り、例えば「バイオマーカー」もしくは「1つのバイオマーカー」などの用語には、2つ以上のバイオマーカーの組み合わせが含まれる。これは、特定の場合には2つ以上のバイオマーカーについて収集された結合データがHDAC阻害剤治療の特定の作用についての指標である可能性があることを意味する。さらに、本発明による1つ以上のバイオマーカーについて収集されたデータの予測値もしくは予後値は、さらなるバイオマーカー、例えばベースラインHDAC活性もしくはヒストンもしくはタンパク質アセチル化のベースラインレベルまたは医学において一般に使用される例えば肥満度指数、疾患歴、年齢などの他のバイオマーカーを入手することによって強化されてよい。
本明細書で使用する診断バイオマーカーは、特定疾患状態の存在、重症度もしくは非存在を同定するために使用される上述したバイオマーカーである。
本明細書で使用する予後バイオマーカーは、患者の生存確率を決定するために使用される上述したバイオマーカーである。
本明細書で使用する用語「薬力学バイオマーカー」もしくは「薬力学マーカー」は、薬物、例えばHDAC阻害剤の投与後のレベルの変化によって患者におけるその薬物の存在および/または作用を指示する上述したバイオマーカーを規定する。薬物は、患者の全身系中または患者の特定薬理学的領域内、例えば患者の血液、体液、肝臓、脂肪組織もしくは他の組織中などに存在する場合がある。薬力学バイオマーカーは、新規薬物を試験する際に上記薬物がインビボの標的に的中するかどうか、つまりインビボで何らかのHDAC阻害が存在するかどうかを決定するために使用されてよい。
さらに、薬力学バイオマーカーは、薬物動態/薬力学的モデリング(PK/PDモデリング)のため、すなわち薬物動態挙動を、例えば前臨床第I相臨床試験においてHDAC阻害剤の投与された用量とインビボでの阻害のレベルとの相関に関連する薬力学的挙動と相関させるために使用されてよい。さらに、薬力学バイオマーカーは、インビボでの、例えば第I相臨床試験のための前臨床モデル試験における用量設定のために、または第II相臨床試験における用量設定のために第I相臨床試験で収集されたデータを使用することによって使用されてもよい。
本明細書で使用する予測バイオマーカーは、特定の治療からどの患者が利益を得られる可能性が高いか、または利益を得られる可能性がないかを同定する、例えば応答者を非応答者から識別するために使用される上述したバイオマーカーである。予測バイオマーカーは、薬物投与前に患者を層別化するため、または治療監視中に使用できるが、このとき監視データは治療の後の転帰を予測するために使用される。予測バイオマーカーは、代理エンドポイントとして、すなわち治療を継続すべきかどうかを決定するためにも役立つ場合がある。
本明細書で使用する「層別化」もしくは「層別化する工程」は、患者の投与前バイオマーカーレベル、すなわちHDAC阻害剤の投与前の本発明による1つ以上のバイオマーカーのレベルに依存した本発明によるバイオマーカーの使用であって、それにより特定の患者がHDAC阻害剤治療から利益を得られる確率を決定する使用に関する。
本明細書で使用する用語「ハウスキーピング遺伝子」は、典型的には使用した技術によって良好に検出可能な発現、例えば本発明では少なくとも100ngの全RNAの量を備えるqPCR法において<25のCt値を示す1つ以上の構成遺伝子を規定する。類似の考察は、当然ながら発現がタンパク質レベル上で決定される場合にも当てはまる。さらに、ハウスキーピング遺伝子は、同等の治療レジメンを受けている特定患者群の全サンプル中において、薬物の投与後の遺伝子発現においてゼロから最小の変化を示す。1つ以上のハウスキーピング遺伝子の発現は、各サンプルにおける個別の差、例えば異なる細胞数によって、および/または技術的態様、例えばピペット操作の誤差によって誘発される、決定された結果における偏差を標準化するために使用される。
本明細書で使用する用語「標的遺伝子」は、特定の治療による発現および調節についてこの試験系において調査される当該の遺伝子を規定する。
本明細書で使用する用語「HDAC阻害剤治療」は、本発明を実施するための形態において詳細に説明するように、それを必要とする患者が上記患者における医学的状態(例えば、疾患)を治療するためにHDAC阻害剤の1回以上の投与を含む治療レジメンを受けることを意味する。本明細書に規定したHDAC阻害剤治療は、医学的状態の診断から始まり、治療のレジメンを含み、最終フォローアップ検査、すなわち、患者がそれ以上の医療を受けないが、患者の健康状態および治療の状態が制御されるまでの期間を含んでいてよい。特定の場合には、フォローアップは、所定の患者へのHDAC阻害剤の最終投与の数カ月後もしくは数年後にさえ存在する可能性があるHDAC阻害剤の投与の長期作用の決定を含んでいてよい。
これに関連して「治療サイクル」は、その間にHDAC阻害剤が患者に確実な特定時間間隔で投与される、およびHDAC阻害剤が患者に全く投与されず、結果としてHDAC阻害剤が上記患者から完全に排出される特定の期間を含んでいてよい期間を意味する。例えば、治療サイクルは14日間を含んでいてよいが、このときHDAC阻害剤は第1〜5日に1日2回投与され、第6〜14日にはHDAC阻害剤は投与されない。治療サイクルは、通常はHDAC阻害剤治療中に少なくとも1回、好ましくは2回以上繰り返されるが、しかしこれは多数の因子、例えばHDAC阻害剤の投与への患者の応答、HDAC阻害剤の望ましくない副作用の発生、患者の全身健康状態などに依存する可能性がある。
本明細書で使用する「のHDAC阻害剤治療の作用」もしくは「そのHDAC阻害剤治療の作用」に関連する用語「作用」には、本明細書で下記に規定するHDAC阻害剤治療の薬力学的作用および/または前向きもしくは後ろ向きの転帰が含まれる。そのような作用の例は、a)HDAC活性の減少、ヒストンのアセチル化または例えば転写因子もしくは受容体などの他のタンパク質のアセチル化の誘導、遺伝子転写の調節、タンパク質発現の調節およびシグナル伝達経路の調節された活性を含む群から選択される作用を含む、薬力学的作用、すなわち分子レベルへの作用;b)腫瘍サイズ、代謝活性、細胞生存性、腫瘍の血液供給、すなわち血管新生、腫瘍の組成、例えば腫瘍を含む細胞、例えば腫瘍細胞、免疫細胞、線維芽細胞および内皮細胞の関係における変化を含む罹患組織もしくは細胞への作用;およびc)臨床状態における変化、健康状態、疾患の進行もしくは安定化、無増悪生存(PFS)の減少もしくは増加した期間、疾患の治癒、強化もしくは短縮された全生存期間、疾患進行の遅延および症状の軽減もしくは悪化を含む患者の医学的状態への作用である。本発明の好ましい実施形態では、作用は薬力学的作用である。
本明細書で使用する用語「HDAC阻害剤治療の前向きの転帰」は、HDAC阻害剤治療が患者にとって有益な作用を生じさせることを意味する。これには、臨床的有益性、健康の改善、疾患の安定化、無増悪生存期間の増加、疾患の治癒、強化された全生存ならびに疾患進行の遅延および症状の軽減が含まれる。
本明細書で使用する用語「HDAC阻害剤治療の後ろ向きの転帰」は、HDAC阻害剤治療が患者にとっての有益な作用を生じさせないこと、またはその転帰が上述の前向きの転帰の反対、例えば健康の減退であることを意味する。
本明細書で使用する「応答者」は、上記に規定したHDAC阻害剤治療が原因で前向きの転帰を示す患者である。
本明細書で使用する「非応答者」は、上記に規定したHDAC阻害剤治療が原因で後ろ向きの転帰を示す患者である。
本明細書で使用する用語「身体の液体もしくは体液」は、末梢血を含む血液、血清、血漿、尿、間質液、髄液、房水および硝子体液、胆汁、乳汁、脳脊髄液、内リンパ液、外リンパ液、射精液、胃液、粘液、腹水、胸膜液、唾液、汗、涙および膣分泌液を含むがそれらに限定されない患者の身体から排出もしくは分泌される液体を含む、患者の身体を起源とする液体もしくは液体の一部を規定する。本発明の状況において好ましい体液は、末梢血、血清、血漿および尿である。上記の体液自体が疾患および/または非罹患細胞を含む場合がある、または含まない場合がある。
本明細書で使用する用語「組織サンプル」は、患者の身体を起源とする非液体材料もしくは固体を規定する。組織サンプルには、骨材料、骨髄、皮膚、毛包、粘膜、脳、軟骨、筋肉、肺、腎臓、胃、腸、膀胱および肝臓が含まれるがそれらに限定されない。上記組織サンプル自体は罹患細胞を含む、もしくは含まない場合がある、および例えば患者の身体の疾患領域から採取されたサンプル、例えば腫瘍の生検標本であってよい。好ましくは、組織サンプルは、皮膚、毛包もしくは口腔粘膜から選択される。
本発明の実施形態では、医学分野の当業者には一般に公知である任意の方法および/または手段によって患者から入手される、例えば好ましくは静脈穿刺によって採取される血液サンプルである。
本明細書で使用する用語「末梢血」は、心臓から遠隔の循環から得られる血液、すなわち、例えば末端部からの血液のような全身循環中の血液を規定する。
本明細書で使用する用語「全血」は、例えば患者などの上記血液のドナーから得られる、細胞および液体を含む未修飾血液を規定する。
本明細書で使用する用語「患者」は、HDAC阻害剤治療を受けることが予定される被験者を規定する。患者は罹患している可能性があり、罹患被験者および健常被験者、例えばHDAC阻害剤の安全性、毒性および血液力学的挙動を決定するための第I相臨床試験における健常志願者を含んでいてよい。好ましくは、患者は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。さらに好ましい実施形態では、患者は癌に罹患している。
本明細書で使用する用語「HDAC阻害剤治療を必要とする可能性がある患者」は、疾患もしくは障害を有する、好ましくはそれに対してHDAC阻害剤治療が有益であると期待される、および/またはHDAC阻害剤治療に応答性である疾患もしくは障害を有すると疑われる被験者を規定する。これに関連して、「を必要とする可能性がある患者」はさらに「を必要とする患者」も含み、特定の実施形態では「を必要とする患者」を意味する。
本発明による遺伝子の発現は、これらの遺伝子の転写過程に由来するmRNAを定量するための最新技術による検出方法、例えば定量的リアルタイムPCR(qPCR)アプローチを使用して測定できる。さらに、これらの遺伝子発現は、問題の遺伝子によってコードされたタンパク質の発現を分析することによって測定できる。それらの測定全ては、エックスビボまたはインビトロで実施されてよい。
RNAを検出もしくは測定するための方法は特に限定されず、RNAの検出もしくは測定は、当業者には公知の任意の適切な方法によって実施されてよい。そのような方法の例は、定量的PCR(リアルタイムPCRとしても公知である)、mRNAの定量的シーケンシング(ディープシーケンシングとしても公知である)、ノーザンブロット法もしくはドットブロット法である。上記の方法は、プライマー対を含む、および/またはDNA分子を含む確実な特定プローブの使用を必要とする場合がある。そのようなプライマー対は、典型的には例えば約20塩基長の、当該の同一ポリ核酸分子(典型的には特定のmRNA分子のcDNAコピー)の異なる領域に特異的に結合する、および上記ポリ核酸の増幅に使用できる場合がある短鎖非相補的一本鎖DNA分子である。DNA分子を含む上記の分子プローブは、当該のポリ核酸分子に特異的に結合する一本鎖DNA分子および検出を促進するための1つ以上の標識(「タグ」としても公知である)を含む分子構築物である。任意選択的に、上記プローブは、1つ以上のリンカー部分をさらに含んでいてよい。上述の標識は、例えば、一本鎖DNA分子の結合後に色強度の変化を示す色標識、蛍光標識、例えば蛍光タンパク質もしくは蛍光染料、酵素標識、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、放射標識または分子生物学において一般に適用される一本鎖DNA分子の結合を検出することを可能にする他の標識から選択されてよい。
本発明の状況では、「抗体を含むプローブ」は、エピトープに結合するための特異的抗体および検出を促進するための1つ以上の標識(「タグ」としても公知である)を含む分子構築物である。任意選択的に、上記プローブは、1つ以上のリンカー部分をさらに含んでいてよい。上述の標識は、例えば、色強度および/または変化に基づいて抗体の結合を指示する色標識、蛍光標識、例えば蛍光タンパク質もしくは蛍光染料、酵素標識、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、放射標識または分子生物学において一般に適用される抗体結合を検出することを可能にする他の標識から選択されてよい。特異的抗体のその標的エピトープへの結合を検出する他の可能性には間接的技術が含まれるが、このとき特異的抗体を検出するためには二次抗体が使用され、二次抗体は上記に規定されている標識を有し、および二次抗体は上記の特異的抗体に特異的に結合する。そのような間接的技術には、分子生物学の分野において一般に公知である方法、例えばELISA、タンパク質を検出するためのHPLC法、ウェスタンブロット法、逆相タンパク質検出法もしくはドットブロット法が含まれる。上記の「間接的技術」は、さらにまた直接的設定において実施されてもよく、このとき上記のプローブは標的エピトープに結合し、直接的に検出される。特定の実施形態では、特異的抗体は、例えばシート材料、ビーズ、ストリップなどの上に固定化されてよい。1つの実施形態では、検出は溶液中で、または溶液中に懸濁させたビーズを用いて促進されるが、上記ビーズは本明細書で言及した固定化プローブを含む。
本明細書で使用する用語「プローブ」は、さらにまた「1つのプローブ」すなわち単一プローブもまた意味する。
さらなる実施形態では、タンパク質の検出および/または定量は、質量分析法もしくはLC結合質量分析法によって促進される場合がある。
本発明において使用するための典型的な方法は、“Short Protocols in Molecular Biology”,5th Edition,2 Volume Set;Frederick M.Ausubel(Editor),Roger Brent(Editor),Robert E.Kingston(Editor),David D.Moore(Editor),J.G.Seidman(Editor),John A.Smith(Editor),Kevin Struhl(Editor);Wiley;ISBN:978−0−471−25092−0に詳細に記載されている。
本明細書に規定したように、特異的に結合する抗体、プライマー対もしくはDNA分子は、好ましくは他の構造に比較して少なくとも1,000倍の標的構造への結合親和性を有する。本明細書の「構造」は、タンパク質エピトープおよびポリ核酸配列を含む分子実体に関する。本明細書では、「エピトープ」は、抗体によって認識されるタンパク質の部分である。
本発明において使用するための抗体は、当業者には公知の任意の方法によって得られてよい。上記抗体のタイプは特に限定されず、原則的には、遺伝子の発現産物検出するために適する、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む任意の抗体タイプを適用することができる。
本発明による方法、使用およびキットは、HDACの阻害に応答性である疾患もしくは障害の、準備およびフォローアップを含むHDAC阻害剤治療において適用できる。そのような疾患および障害には、異所性細胞増殖および/または生存および/または分化におけるブロックを提示する細胞によって規定される細胞腫瘍形成が含まれる。用語の腫瘍形成には、侵攻性転移性腫瘍をインビボで形成できない細胞の過増殖に関する「良性腫瘍形成」および例えば遠隔器官における腫瘍転移を形成する全身性疾患を形成できる多発性細胞および生化学的異常を備える細胞に関する「悪性腫瘍形成」が含まれる。悪性腫瘍形成の例には、充実性および血液学的腫瘍が含まれる。充実性腫瘍の例は、乳腺、膀胱、骨、脳、中枢神経系および末梢神経系、結腸、内分泌腺(例えば、甲状腺および副腎皮質)、食道、子宮内膜、生殖細胞、頭頸部、腎臓、肝臓、肺、喉頭および下咽頭、中皮腫、卵巣、膵臓、前立腺、直腸、腎、小腸、軟部組織、精巣、胃、皮膚、尿管、膣および外陰部の腫瘍である。悪性腫瘍形成には、例えば網膜芽細胞腫およびウィルムス腫瘍を例とする遺伝性癌が含まれる。さらに、悪性腫瘍形成には、上記器官における原発腫瘍および遠隔器官における対応する二次性腫瘍(「腫瘍転移」)が含まれる。血液学的腫瘍の例は、侵攻性および不活性形の白血病およびリンパ腫、つまり非ホジキン病、慢性および急性骨髄性白血病(CML/AML)、慢性および急性リンパ球性白血病(CLL/ALL)、ホジキン病、多発性骨髄腫およびT細胞リンパ腫である。さらに含まれるのは、骨髄異形成症候群、形質細胞腫、腫瘍随伴症候群、原発部位不明の癌ならびにAIDS関連性悪性腫瘍である。
本発明の特に好ましい実施形態は、HCCおよび肝臓癌転移を含む肝臓、膵臓、結腸および結腸直腸(CRC)を含む消化管、甲状腺、腎臓(すなわち、腎臓癌)、皮膚、精巣およびホジキンリンパ腫を含むリンパ腫からなる群から選択される癌に関する。そのような特に好ましい実施形態では、本発明による患者は、好ましくは癌患者、より好ましくはHCCおよび肝臓癌転移を含む肝臓、膵臓、結腸および結腸直腸(CRC)を含む消化管、甲状腺、腎臓(すなわち、腎臓癌)、皮膚、精巣およびホジキンリンパ腫を含むリンパ腫からなる群から選択される癌に罹患している患者である。
さらに、HDACの阻害に応答性である疾患もしくは障害には:
(i)例えば関節リウマチ、変形性関節症、痛風、多発性関節炎および乾癬性関節炎などの関節症および骨病理学的状態;
(ii)全身性エリテマトーデス;
(iii)血管増殖性障害、動脈硬化症および再狭窄を含む平滑筋細胞増殖;
(iv)炎症状態および皮膚状態、例えば潰瘍性大腸炎、クローン病、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、嚢胞性線維症、慢性気管支炎および喘息;
(v)子宮内膜症、子宮筋腫、子宮内膜増殖症および良性前立腺肥大;
(vi)心機能異常;
(vii)HIV感染症のような阻害性免疫抑制性状態;
(viii)パーキンソン病、アルツハイマー病もしくはポリグルタミン関連性障害のような神経病理学的障害;および
(ix)内因性遺伝子発現を強化する、ならびに遺伝子療法におけるトランス遺伝子発現を増強することにより治療の影響を受けやすい病理学的状態を含む群から選択される非悪性疾患が含まれる。
(i)例えば関節リウマチ、変形性関節症、痛風、多発性関節炎および乾癬性関節炎などの関節症および骨病理学的状態;
(ii)全身性エリテマトーデス;
(iii)血管増殖性障害、動脈硬化症および再狭窄を含む平滑筋細胞増殖;
(iv)炎症状態および皮膚状態、例えば潰瘍性大腸炎、クローン病、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、嚢胞性線維症、慢性気管支炎および喘息;
(v)子宮内膜症、子宮筋腫、子宮内膜増殖症および良性前立腺肥大;
(vi)心機能異常;
(vii)HIV感染症のような阻害性免疫抑制性状態;
(viii)パーキンソン病、アルツハイマー病もしくはポリグルタミン関連性障害のような神経病理学的障害;および
(ix)内因性遺伝子発現を強化する、ならびに遺伝子療法におけるトランス遺伝子発現を増強することにより治療の影響を受けやすい病理学的状態を含む群から選択される非悪性疾患が含まれる。
本発明の特定の実施形態では、遺伝子発現が決定される場合は、これは上記遺伝子から転写されたmRNAのcDNAコピーのqPCRによって実施されるが、このとき上記cDNAは上記遺伝子から転写されたmRNAの完全もしくは部分コピーであってよく、上記mRNAは典型的にはZFP64の転写変異体について本明細書で説明したZFP64の場合における上記遺伝子の2つ以上のエキソンを含んでいる。上記qPCRでは、上記cDNAの完全もしくは部分コピーは(qPCRプライマーの各結合部位に依存して)生成されてよいが、このとき典型的には、そのようなコピーは、50〜90、特別には60〜80、より特別には65〜75、いっそうより特別には73塩基対を含む。特定の場合には、上記遺伝子のエキソンの異なる組み合わせに基づく上記遺伝子の2つ以上の転写変異体(すなわち、異なるmRNAs)がサンプル中に存在してよい;この場合には、1つ以上の上記転写変異体のcDNAコピーが生成される可能性があるが、それらの1つ以上は次にqPCR(1つ以上の増幅産物を生成する)によって処理されてよい;遺伝子発現を決定するための読み出しは、次にさらに上記増副産物の1つ以上に基づいていてもよい。
本発明の他の特定の実施形態では、ZFP64の遺伝子発現が決定される場合、これはTaqman(登録商標)アッセイID:Hs00217022_m1または配列(配列番号1)5’CACCTCGGAGACCCAGACAATCACAGTTTCAGCTCCAGAATTTGTTTTTGAACATGGCTATCAAACTTACCTG3’を有するZFP64(ZFP64 mRNAイントロンが除外されている)から転写されたmRNAのcDNAコピー内の標的配列に特異的に結合するオリゴヌクレオチド対によって実施される。使用できるオリゴヌクレオチド対は、下記、またはペア1のフォワードプライマーとペア2のリバースプライマーまたはペア2のフォワードプライマーとペア1のリバースプライマーの組み合わせを含む、またはそのようなプライマーはこれらより短くても長くてもよいが、特別には17〜26塩基長までであってよい:
ペア1:フォワードプライマー(配列番号2)5’CACCTCGGAGACCCAGACAA3’(20塩基)、リバースプライマー(配列番号3)5’CAGGTAAGTTTGATAGCCATGTTCA3’(25塩基)
ペア2:フォワードプライマー(配列番号4)5’CACCTCGGAGACCCAGACA3’(19塩基)、リバースプライマー(配列番号5)5’CAGGTAAGTTTGATAGCCATGTTC3’(24塩基)
ペア1:フォワードプライマー(配列番号2)5’CACCTCGGAGACCCAGACAA3’(20塩基)、リバースプライマー(配列番号3)5’CAGGTAAGTTTGATAGCCATGTTCA3’(25塩基)
ペア2:フォワードプライマー(配列番号4)5’CACCTCGGAGACCCAGACA3’(19塩基)、リバースプライマー(配列番号5)5’CAGGTAAGTTTGATAGCCATGTTC3’(24塩基)
qPCR法によってZFP64の遺伝子発現を決定するための上述したプライマーに加えて、ZFP64のcDNA配列を特異的に増幅させるためのプライマーを使用できる。一般に、それらのプローブ/プライマーは、ZFP64の1つ以上の転写変異体に特異的に結合する短鎖DNAである。それらのプライマー対の長さは、17〜25、特別には19〜23、より特別には20〜22ヌクレオチド塩基を含むことができ、RNAサンプル中に存在する可能性があるゲノムDNAの増幅を回避するためにイントロンを挟むように(すなわち、2つの別個のエキソンに結合しているプライマー対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーが少なくとも1つのイントロンによって分離されるように)設計されなければならない。この方法で得られるPCR産物は、50〜400塩基対長、特別には70〜300塩基対長、より特別には80〜200塩基対長、より特別には123もしくは198塩基対長であってよい。RNAサンプル中に残留するゲノムDNAから生じるPCR産物は、理論的には増幅cDNAと一緒に生成させることができる。しかしゲノムDNAのそのようなコピーは増幅cDNAよりはるかに長く、さらにポリメラーゼ媒介性PCR法の伸張工程のための制限された時間枠は、長い産物の伸張を防止する(高速ポリメラーゼさえ1,000塩基に対して15秒間を必要とすることに留意されたい)。そこで、当業者であれば、遺伝子DNAの過剰コピーの形成を回避するための増幅工程の適切な持続時間を容易に決定することができる。
本発明においてZFP64から転写されたmRNAのcDNAコピーを増幅させるために使用するための特定のプライマー対の例は下記である。
上記のプライマーは全部が、58℃のアニーリング温度を有する。
NCBIデータベース内の参照番号によるZFP64の転写変異体(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/55734)
NM_199427.2;転写変異体4、mRNA
NM_018197.2;転写変異体1、mRNA
NM_199426.1;転写変異体3、mRNA
NM_022088.4;転写変異体2、mRNA
NM_199427.2;転写変異体4、mRNA
NM_018197.2;転写変異体1、mRNA
NM_199426.1;転写変異体3、mRNA
NM_022088.4;転写変異体2、mRNA
さらに、ZFP64 mRNAレベルは、RNAシーケンシングによって同様に決定できる。これは、少なくとも2種の異なる方法、mRNAの直接シーケンシングおよび、逆転写mRNAであるcDNAコピーのシーケンシングによって実施できる。これらのシーケンシング法の用法は、当技術分野において周知である。
本発明の特定の実施形態では、遺伝子発現が決定される場合、これはRNAシーケンシングによって実施される。「全トランスクリプトーム・ショットガン・シークエンス(「WTSS」)」とも呼ばれるRNAシーケンシング(RD.Morin,et al.(2008),BioTechniques 45(1):81−94)は、時間内の所定の瞬間にゲノムからの特異的RNAの存在および量を解明することを可能にする(Chu Y,Corey DR(2012).Nucleic Acid Ther 22(4):271−4)。シーケンシングに基づくRNA分析は、サンプル中の所定の配列の数値頻度を記録する。本発明による遺伝子、特にZFP64のmRNA/cDNAのレベルは、(他の遺伝子の他に)、細胞の全トランスクリプトームを挟んでいるプライマーのプールを用いて細胞の全cDNAをシーケンシングすることによって検出される。
本発明の特定の実施形態では、遺伝子発現が決定される場合、これはウェスタンブロットによって(タンパク質レベル上で)実施される。ウェスタンブロット(時々はタンパク質免疫ブロットと呼ばれる)は、サンプル中の特異的タンパク質を検出するために使用される、広範に使用される分析方法である。ウェスタンブロットは、ゲル電気泳動法を使用して天然タンパク質を3−D構造によって、または変性タンパク質をポリペプチドの長さによって分離する。タンパク質は、次に膜(典型的にはニトロセルロースもしくはPVDF)へ移され、そこでタンパク質は標的タンパク質に特異的な抗体を用いて染色される。ゲル電気泳動法工程は、抗体の交差反応性の問題を解決するためにウェスタンブロット分析に含まれている。改良された免疫ブロット法であるZestern分析法(Zhang,iandi;Wang,Dan.、米国特許第8293487号明細書)は、電気泳動法工程を使用せずにこの問題に対応することができるので、このためタンパク質分析の効率を有意に改善する。ウェスタンブロット分析と比較して、Zestern分析法は、検出工程の前に追加される溶出工程を加える。膜上で形成される免疫複合体は、過剰量の競合分子を含有する溶液に接近させられる。競合分子は、合成抗原もしくは部分抗原、または1つの分子内の抗原もしくは部分抗原の複数リピートであってよい。競合は、抗原−抗体相互作用の可逆性に起因して発生する。抗体は、膜から溶出液中への競合分子によって遊離させられる。レポーターアッセイを通しての溶出液中の抗体の量の定量は、タンパク質サンプル中の抗原量の信頼性のある指示を生じさせる。このため、エピトープへの標識抗体の特異的結合は、競合抗原を添加することによって定量できる。その他の関連技術には、ドットブロット分析、抗体が免疫染色および酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)による組織および細胞中のタンパク質を検出するために使用される免疫組織化学法が含まれる。ZFP64についての特定の特異的抗体は、例えば:Abcam ab66658;ZFP64へのウサギポリクローナル;イムノゲン:ヒトZFP64のC末端アミノ酸633〜682に対応する合成ペプチドDGGQNIAVATTAPPVFSSSSQQELPKQTYSIIQGAAHPALLCPADSIPD(配列番号10)内の1領域;Sigma HPA035112;ウサギポリクローナル;イムノゲン配列SFDTKQPSNLSKHMKKFHGDMVKTEALERKDTGRQSSRQVAKLDAKKSFHCDICDASFMREDSLRSHKRQHSEYSESKNSDVTVLQFQIEPS(配列番号11);ThermoScientific PA5−28546、ウサギポリクローナル;イムノゲン:ヒトZFP64のアミノ酸394〜681内の1領域に対応する組換えフラグメントである。
本発明の特定の実施形態では、遺伝子発現が決定される場合、これはluminex法によって(タンパク質レベル上で)実施される。Luminex法は、抗体依存法で様々な基質中での所定のタンパク質の発現を決定するためのビーズベースの技術である。このため、どちらも当該のタンパク質に特異的に結合するが、必ずしも異なる非重複エピトープには結合しない1組の捕捉抗体および検出抗体。捕捉抗体はビーズにコーティングされ、検出抗体は直接的(フィコエリトリン(PE)結合)もしくは間接的(ビオチン化−その後のストレプトアビジン−PE結合によるこの抗体の検出)のいずれかで(例えば本明細書に記載した標識を用いて)標識される、または標識した種特異的抗体(例えば、Zfp64エピトープ特異的ウサギ抗体に対する標識抗ウサギ抗体)によって検出できる。
本発明の特定の実施形態では、遺伝子発現が決定される場合、これはELISAによって(タンパク質レベル上で)実施される。酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)および酵素イムノアッセイは、抗体依存法で様々なサンプルタイプ(例えば、血漿、血清、細胞溶解物など)中の所定のタンパク質の発現を決定するための技術である。このため、どちらも当該のタンパク質には特異的に、しかし様々な非重複エピトープには必然的に結合する捕捉抗体および検出抗体を含む1セットが必要とされる。捕捉抗体は、固相、例えばプラスチック表面上に固定化され、検出抗体は、(例えば本明細書に記載した標識を用いて)、(例えばTMB、DAB、ABTSのような発色性基質を変換させるホースラディッシュペルオキシダーゼのような基質を検出可能なシグナルに変換させる酵素を用いて)直接的に、または間接的にのいずれかで標識される。(ビオチン化−その後のストレプトアビジン酵素もしくはストレプトアビジン蛍光標識結合によるこの抗体の検出)または標識種特異的抗体(例えばZfp64エピトープ特異的ウサギ抗体に対する標識抗ウサギ抗体)によって検出できる。
本発明の特定の実施形態では、遺伝子発現が決定される場合は、これは1回以上の特定時点に、例えば患者へのHDAC阻害剤の投与直前にある1回以上の時点(0時間後とも呼ぶ)、および患者へのHDAC阻害剤の投与の1〜10時間後、特別には1〜6時間後、より特別には2〜5時間後の時点に実施される。本発明の特定の実施形態では、ZFP64遺伝子発現が決定される場合は、これは臨床試験(SAPHIRE、SHELTER、SHORE)の説明と関連して本明細書で記載した1回以上の特定時点に、すなわち患者へのHDAC阻害剤の投与直前、患者へのHDAC阻害剤の投与の約2および/または5時間後に実施されてよい。
典型的には、遺伝子発現がHDAC阻害剤治療の作用を決定するため、HDAC阻害剤治療を監視するため、患者を層別化するため、または前向きの転帰の確率を予測するために測定される場合、これは患者へのHDAC阻害剤の投与の前に、特定の実施形態では直前に実施される。患者を層別化するため、または前向きの転帰の確率を予測するためには、これは典型的にはHDAC阻害剤治療の開始前に(すなわち、上記患者に初回HDAC阻害剤用量が投与される前に)実施され、この後には後の時点、例えば臨床試験の説明との関連で上述したように、特に治療サイクルの開始直前の1回以上の時点にさらなる測定が付随してよい。HDAC阻害剤治療の作用を決定するため、またはHDAC阻害剤治療を監視するためには、これはHDAC阻害剤治療の開始前に実施されてよく、典型的には例えば臨床試験の説明との関連で上述したように、治療サイクルの開始直前の1回以上に実施される。
本発明の特定の実施形態では、ZFP64遺伝子発現が決定される場合、これはサンプルを抗体と、特にAbcam ab66658;Sigma HPA035112およびThermoScientific PA5−28546(本明細書でさらに説明する)と接触させる工程およびZFP64によって発現したタンパク質と上記抗体との間の結合を測定する工程によって実施される。特に、上記結合は、本明細書で記載した方法、例えばELISA、Luminexなどを使用して測定される。
本発明の特定の実施形態は、HDAC阻害剤を用いてそれを必要とする患者を治療する方法であって、以下の:
a)上記患者のサンプルを提供する工程であって、上記患者は既にHDAC阻害剤治療を受けていた工程、
b)上記サンプル中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子、特にZFP64の遺伝子発現および/または遺伝子発現の変化を決定する工程、
c)上記少なくとも1つの遺伝子の決定された遺伝子発現および/または遺伝子発現の変化を上記患者における工程a)の上記HDAC阻害剤治療の作用と相関させる工程、および
d)上記患者に工程c)の相関に基づいて決定されるHDAC阻害剤の用量および/または投与スケジュールを使用してHDAC阻害剤を投与する工程を含む方法に関する。
a)上記患者のサンプルを提供する工程であって、上記患者は既にHDAC阻害剤治療を受けていた工程、
b)上記サンプル中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子、特にZFP64の遺伝子発現および/または遺伝子発現の変化を決定する工程、
c)上記少なくとも1つの遺伝子の決定された遺伝子発現および/または遺伝子発現の変化を上記患者における工程a)の上記HDAC阻害剤治療の作用と相関させる工程、および
d)上記患者に工程c)の相関に基づいて決定されるHDAC阻害剤の用量および/または投与スケジュールを使用してHDAC阻害剤を投与する工程を含む方法に関する。
本発明のさらなる特定の実施形態は、HDAC阻害剤を用いてそれを必要とする患者を治療する方法であって、以下の:
a)上記患者のサンプルを提供する工程、
b)上記サンプル中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子、特にZFP64の遺伝子発現を決定する工程、
c)上記少なくとも1つの遺伝子の決定された遺伝子発現をHDAC阻害剤治療が上記患者への有益な作用を有する確率と相関させる工程、および
d)工程c)において決定された確率に基づいて、上記患者を上記HDAC阻害剤治療への応答者であると分類する工程、および
e)上記患者の応答者であるとの分類に基づいて、上記患者にHDAC阻害剤を投与する工程を含む方法に関する。
a)上記患者のサンプルを提供する工程、
b)上記サンプル中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子、特にZFP64の遺伝子発現を決定する工程、
c)上記少なくとも1つの遺伝子の決定された遺伝子発現をHDAC阻害剤治療が上記患者への有益な作用を有する確率と相関させる工程、および
d)工程c)において決定された確率に基づいて、上記患者を上記HDAC阻害剤治療への応答者であると分類する工程、および
e)上記患者の応答者であるとの分類に基づいて、上記患者にHDAC阻害剤を投与する工程を含む方法に関する。
本発明のさらなる特定の実施形態は、HDAC阻害剤治療を必要とする可能性がある患者を層別化する方法であって、以下の:
a)上記患者のサンプルを提供する工程であって、上記患者は癌、特に肝細胞癌(HCC)、ホジキンリンパ腫(HL)、もしくは結腸直腸癌(CRC)、より特別には肝細胞癌(HCC)であると診断された工程、
b)ZFP64について決定されたCt値から1つ以上のハウスキーピング遺伝子のCt値の平均値を減じることによってZFP64の遺伝子発現のレベルについてのdCt値を入手する工程、および
c)工程b)においてZFP64について入手したdCt値が11.15より低い、特に10.02より低い場合に、上記患者を応答者であると分類する工程を含む方法に関する。
a)上記患者のサンプルを提供する工程であって、上記患者は癌、特に肝細胞癌(HCC)、ホジキンリンパ腫(HL)、もしくは結腸直腸癌(CRC)、より特別には肝細胞癌(HCC)であると診断された工程、
b)ZFP64について決定されたCt値から1つ以上のハウスキーピング遺伝子のCt値の平均値を減じることによってZFP64の遺伝子発現のレベルについてのdCt値を入手する工程、および
c)工程b)においてZFP64について入手したdCt値が11.15より低い、特に10.02より低い場合に、上記患者を応答者であると分類する工程を含む方法に関する。
本発明のさらなる特定の実施形態は、HDAC阻害剤治療を必要とする可能性がある患者を層別化する方法であって、以下の:
a)上記患者のサンプルを提供する工程であって、上記患者は癌、特に肝細胞癌(HCC)、ホジキンリンパ腫(HL)、もしくは結腸直腸癌(CRC)、より特別には肝細胞癌(HCC)であると診断された工程、
b)ZFP64について決定されたCt値から1つ以上のハウスキーピング遺伝子のCt値の平均値を減じることによってZFP64の遺伝子発現のレベルについてのdCt値を入手する工程、および
c)工程b)においてZFP64について入手したdCt値が11.15より低い、特に10.02より低い場合に、上記患者がHDAC阻害剤治療のために適格であると分類する工程を含む方法に関する。
a)上記患者のサンプルを提供する工程であって、上記患者は癌、特に肝細胞癌(HCC)、ホジキンリンパ腫(HL)、もしくは結腸直腸癌(CRC)、より特別には肝細胞癌(HCC)であると診断された工程、
b)ZFP64について決定されたCt値から1つ以上のハウスキーピング遺伝子のCt値の平均値を減じることによってZFP64の遺伝子発現のレベルについてのdCt値を入手する工程、および
c)工程b)においてZFP64について入手したdCt値が11.15より低い、特に10.02より低い場合に、上記患者がHDAC阻害剤治療のために適格であると分類する工程を含む方法に関する。
本発明の方法の特定実施形態では、ZFP64の遺伝子発現についての上記dCT値は、ZFP64について決定されたCt値からハウスキーピング遺伝子18sRNA、TBPおよびGAPDHのCt値の平均値を減じることによって得られる。
本発明の方法の特定の実施形態では、Ct値は、上記遺伝子によって発現した、特にZFP64によって発現したmRNAのcDNAコピーのqPCR増幅によって決定できる。
本発明の特定の実施形態は、サンプル中にZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子、特にZFP64の遺伝子発現を決定するためのキットであって、上記遺伝子によって発現するmRNAのcDNAコピーに結合する、および2つのエキソンの部分に相補的であるヌクレオチドプローブ(例えば、PCRプライマー対)、特に上記遺伝子、より特別にはZFP64から転写されたmRNAのcDNAコピーのqPCRにおいて使用するために本明細書で記載したプライマー対から選択されるプライマー対を含む、および
任意選択的に、培地、培地成分、バッファー、バッファー成分、RNA精製カラム、DNA精製カラム、染料、dNTPミックスを含む核酸、ポリメラーゼを含む酵素および塩を含む群から選択される1つ以上のさらなる成分を含むキットである。
任意選択的に、培地、培地成分、バッファー、バッファー成分、RNA精製カラム、DNA精製カラム、染料、dNTPミックスを含む核酸、ポリメラーゼを含む酵素および塩を含む群から選択される1つ以上のさらなる成分を含むキットである。
本発明のまた別の特定実施形態は、サンプル中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される1つの遺伝子、特にZFP64によってコードされた少なくとも1つのタンパク質のレベルを決定するためのキットであって、
上記キットは上記遺伝子によってコードされた少なくとも1つのタンパク質もしくは上記タンパク質の1つのドメインに特異的に結合するプローブを含み、上記プローブは特に本明細書に記載した標識を含む、および/または上記プローブはZFP64に対する特定の特異的抗体として本明細書に記載した抗体である、および/または上記プローブは、例えばELISAもしくはLuminexの関連において本明細書に記載したように固定化され、上記キットは任意選択的に、培地、培地成分、バッファー、バッファー成分、膜、ELISAプレート酵素基質、染料、ポリメラーゼを含む酵素および塩を含む群から選択される1つ以上のさらなる成分を含むキットである。
上記キットは上記遺伝子によってコードされた少なくとも1つのタンパク質もしくは上記タンパク質の1つのドメインに特異的に結合するプローブを含み、上記プローブは特に本明細書に記載した標識を含む、および/または上記プローブはZFP64に対する特定の特異的抗体として本明細書に記載した抗体である、および/または上記プローブは、例えばELISAもしくはLuminexの関連において本明細書に記載したように固定化され、上記キットは任意選択的に、培地、培地成分、バッファー、バッファー成分、膜、ELISAプレート酵素基質、染料、ポリメラーゼを含む酵素および塩を含む群から選択される1つ以上のさらなる成分を含むキットである。
本発明の実施形態では、ZFP64によって発現されたタンパク質に特異的に結合する抗体もしくはプローブが適用される場合、上記プローブもしくは抗体は、特別には本明細書で上述したようにZFP64のための特定の特異的抗体から選択される。
(E)−3−(1−(4−((ジメチルアミノ)メチル)フェニルスルホニル)−1H−ピロール−3−イル)−N−ヒドロキシアクリルアミド(INN:レスミノスタット)は、近年開発されたヒドロキサメートクラスのHDAC阻害剤である。ヒト被験者へのレスミノスタットの経口投与を調査し、本発明による一連のバイオマーカーを用いてその薬理学的挙動および有効性を決定した。
実施例1:HDACの阻害
サンプルを入手し、本明細書で以下に記載する方法を用いて遺伝子発現を決定した。全血は、蛍光HDAC基質Boc−K(Ac)−AMCとともに37℃で2時間にわたりインキュベートした。赤血球を溶解させた後、残留している細胞は−80℃で保存した。HDAC活性はFLUOstar OPTIMAプレートリーダーを使用して蛍光分析により決定したが、このとき細胞は、細胞溶解および脱アセチル化基質からの蛍光体の生成をもたらす既定の顕色剤試薬(トリプシンおよび溶解バッファを含有する)とともにインキュベートした。最後に、投与前レベルと比較してHDAC活性の阻害率を計算した。結果は図1に示した。
サンプルを入手し、本明細書で以下に記載する方法を用いて遺伝子発現を決定した。全血は、蛍光HDAC基質Boc−K(Ac)−AMCとともに37℃で2時間にわたりインキュベートした。赤血球を溶解させた後、残留している細胞は−80℃で保存した。HDAC活性はFLUOstar OPTIMAプレートリーダーを使用して蛍光分析により決定したが、このとき細胞は、細胞溶解および脱アセチル化基質からの蛍光体の生成をもたらす既定の顕色剤試薬(トリプシンおよび溶解バッファを含有する)とともにインキュベートした。最後に、投与前レベルと比較してHDAC活性の阻害率を計算した。結果は図1に示した。
HDAC酵素活性の阻害は一過性および時間依存性であり、レスミノスタットの1.0時間〜1.5時間後のメジアンピーク血漿レベルに対応して投与2時間後に最大阻害を示した。HDAC酵素活性は、両方の投与群において投与2時間後に93%のメジアン値まで阻害できた。
実施例2:末梢血細胞および癌細胞における遺伝子発現間の相関
サンプルを入手し、本明細書で以下に記載する方法を用いて遺伝子発現を決定した。結果は、下記の表3ならびに図2および3に示した。
サンプルを入手し、本明細書で以下に記載する方法を用いて遺伝子発現を決定した。結果は、下記の表3ならびに図2および3に示した。
図2および3に要約した結果は、バイオマーカーが健常ドナーの血液細胞中およびレスミノスタットで処置された癌細胞系において同一方法で調節されることを証明している。上記の数値は、それらの各々に対して3つの技術的複製物が調製された2つの生物学的複製物に基づいて決定された平均値を表す。結果は再現性であることが証明された。これは、末梢血中の上記遺伝子の遺伝子発現が罹患組織中の遺伝子発現に対応することを指示している。末梢血サンプル中で決定された遺伝子発現のレベルは、罹患細胞中のHDACの活性の特定のレベルと、例えば各特定疾患および/または患者群について決定されてよい、適切な変換因子もしくは変換表を適用することによって相関させることができる。
図4bは、HDAC阻害剤であるレスミノスタットは癌患者におけるZFP64発現をダウンレギュレートするが、ソラフェニブの追加の投与はZFP64発現に影響を及ぼさないことを証明している。
ZFP64への同一のダウンレギュレーティング作用は、レスミノスタットの投与0、2、5および24時間後のZFP64の発現レベルが示されている図4cにおいて数種の癌細胞系について見ることができるが。さらに図4dでは、ZFP64の調節が倍率変化に関して提示されており、癌細胞系および同一健常ドナーからの全血およびPBMCが相互に比較され、さらにHepG2細胞系内でのZFP64のsiRNAノックダウンと比較されている。全サンプルについてダウンレギュレーションの同一傾向を観察できる。siRNAサンプルの一過性アップレギュレーションは、siRNAの発現がレスミノスタット投与を用いたサンプルに匹敵するという事実に起因する。典型的には、siRNAによる標的遺伝子のダウンレギュレーションは、低分子阻害剤に比して遅延させられる。
実施例3:癌患者から入手したサンプル中での遺伝子発現の分析
HDAC酵素活性、H4ヒストンのアセチル化および1群の遺伝子の遺伝子発現を100mg、200mg、400mg、600mgおよび800mgの用量群において測定した。各群は、様々なタイプの腫瘍を有する患者3例から構成した。最高用量群は、この群における最初の患者3例中1例において用量制限毒性[DLT](疲労および悪心グレード3)が見られたために患者6例から構成した。治療サイクルは、本明細書で以下に記載するSAPHIRE、SHELTERおよびSHORE臨床試験について説明した通りであった。
HDAC酵素活性、H4ヒストンのアセチル化および1群の遺伝子の遺伝子発現を100mg、200mg、400mg、600mgおよび800mgの用量群において測定した。各群は、様々なタイプの腫瘍を有する患者3例から構成した。最高用量群は、この群における最初の患者3例中1例において用量制限毒性[DLT](疲労および悪心グレード3)が見られたために患者6例から構成した。治療サイクルは、本明細書で以下に記載するSAPHIRE、SHELTERおよびSHORE臨床試験について説明した通りであった。
薬物血漿中濃度(PKデータ)は、薬剤用量漸増中のHDAC酵素阻害と相関させた。分析は、200mg用量群から始まる長期薬物作用を証明した。これらの結果の結論として、800mg用量群については追加の時点をSAPHIRE臨床試験における第8日に修正した。HDAC酵素活性は、この用量群において41%まで阻害されることを証明できたが、個別阻害値は広範囲であった。
ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1に対応するmRNAsは、Human Chip U133 v2.0(Affymetrix社、米国サンタクララ州)を用いる遺伝子チップマイクロアレイ分析によって54.675プローブセットおよびその後のqPCRから抽出した。これらの実験の目的は、臨床的応答に結び付いた可能性のあるヒトPBMCsの転写へHDAC阻害剤が及ぼす作用を監視するためのmRNAバイオマーカーを同定することであった。追加の選択基準は、HDAC阻害剤に対する高振幅および安定性発現シグナルを伴う当該の遺伝子のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションであった。
標準化のためのハウスキーピング遺伝子として3つの遺伝子、つまり18sRNA、TBPおよびGAPDH(Entrez遺伝子IDについては下記で説明する)を選択した。
臨床試験についての説明
本明細書の臨床データは、(E)−3−(1−(4−((ジメチルアミノ)メチル)フェニルスルホニル)−1H−ピロール−3−イル)−N−ヒドロキシアクリルアミド(INN:レスミノスタット)メシレート塩を用いた臨床試験中に、つまり4SC AG(独国)によるSAPHIRE臨床試験(詳細な参考文献については:http://clinicaltrials.gov/show/NCT01037478を参照されたい)、4SC AG(独国)によるSHELTER臨床試験(詳細な参考文献については:http://clinicaltrials.gov/show/NCT00943449を参照されたい)、および4SC AG(独国)によるSHORE臨床試験(詳細な参考文献については:http://clinicaltrials.gov/show/NCT01277406を参照されたい)中に獲得した。以下では各試験手順についての短い説明を記載する。
本明細書の臨床データは、(E)−3−(1−(4−((ジメチルアミノ)メチル)フェニルスルホニル)−1H−ピロール−3−イル)−N−ヒドロキシアクリルアミド(INN:レスミノスタット)メシレート塩を用いた臨床試験中に、つまり4SC AG(独国)によるSAPHIRE臨床試験(詳細な参考文献については:http://clinicaltrials.gov/show/NCT01037478を参照されたい)、4SC AG(独国)によるSHELTER臨床試験(詳細な参考文献については:http://clinicaltrials.gov/show/NCT00943449を参照されたい)、および4SC AG(独国)によるSHORE臨床試験(詳細な参考文献については:http://clinicaltrials.gov/show/NCT01277406を参照されたい)中に獲得した。以下では各試験手順についての短い説明を記載する。
オープンラベル単一治療群SAPHIRE臨床試験は、以前に治療を受けた後に進行していた、または治療に難治性であったホジキンリンパ腫の患者を含んでいた。レスミノスタットは、1日1回600mgもしくは800mgで投与された。患者は、14日間で1サイクルを構成する、連続5日間の治療、その後に9日間の無治療期間が続くサイクル(5+9のスケジュール)で治療された。患者は、PET/CTによって疾患状態の評価を受けた。試験の一次エンドポイントは全客観的奏効率(ORR)であり、二次エンドポイントは、第1および第3治療サイクル中の投与6時間後までの両方の用量の有効性、安全性および忍容性ならびに薬物動態の分析を含んでいた。同一時点に、例えばHDAC酵素阻害および選択された標的遺伝子の遺伝子発現における変化などの薬物動態マーカーに様々な用量のレスミノスタットが及ぼす作用を末梢血細胞中で決定した。
SHELTER試験は、ソラフェニブに難治性であった肝細胞癌(HCC)を有する患者におけるレスミノスタットの治療への安全性、PKおよび有効性を評価するために設計された。レスミノスタットは、単剤療法として、およびソラフェニブと併用して調査された。進行性HCC(BCLCの病期B/C)を有する患者が多施設共同2治療群試験に含まれた。試験参加前の中央判定(RECIST)によって、ソラフェニブ一次療法下での放射線学的進行が確証されなければならなかった。ソラフェニブ(400もしくは800mg)と組み合わされたレスミノスタット(範囲:200〜600mg)の用量漸増が実施された。A治療群は薬物併用(レスミノスタット+ソラフェニブ)を調査し、B治療群はレスミノスタット(600mg)の単剤療法を調査した。第1の目的は、12週間(w)後の無増悪生存率(PFSR)であった。第2の目的は、安全性、忍容性、腫瘍応答、PFS、TTP、OSならびにPKおよびHDAC酵素阻害、ヒストンのアセチル化および末梢血中での遺伝子発現を含むバイオマーカー(BM)の分析を含んでいた。
SHORE臨床試験(4SC−201−3−2010)は、k−ras突然変異進行性結腸直腸癌(CRC)を有する患者のための確立された第二次化学療法レジメン(FOLFIRI)と組み合わされたレスミノスタットの安全性、忍容性、薬物動態および有効性を評価するための第I/II相試験として設計された。
主要包含基準は、≧18歳の年齢、組織学的もしくは細胞学的に確証された進行性もしくは転移性k−ras突然変異結腸直腸癌を含んでいた。患者は、以前に5−FUを用いた治療を受けていなければならず、FOLFIRIを用いた第二次治療にとって適格でなければならない。第I相部分のためには、k−rasの野生型状態およびその後の治療ラインもまた包含することが許容された。
第I相部分の第1の目的は、上記併用の安全性、忍容性および薬物動態を調査することによってFOLFIRIと併用したレスミノスタットのMTD(最大耐用量)を決定することであった。第2の目的は、8週間後(4サイクル)にPFSRおよびその後の8週間毎にPFS、TTP、客観的奏効症例数、OS(全生存期間)およびDOR(奏効持続期間)を評価することであった。さらに、HDAC酵素阻害、ヒストンのアセチル化、遺伝子発現分析、タンパク質バイオマーカーおよび腫瘍マーカー、例えばCA19〜9およびCEAを含むバイオマーカーが調査された。本出願の出願日現在、第I相試験後には患者は募集されておらず、本試験は「実施中、http://clinicaltrials.gov.上で募集していない」と表示された。
第I相部分中、患者3〜6例の群は、併用のMTDが決定されるまでFOLFIRI治療の標準レジメンと併用して1日当たり200〜800mgのレスミノスタットを用量を漸増しながら摂取した。各14日間の治療サイクルにおいて、患者には連続5日間(第1日〜第5日)にわたりレスミノスタットが投与され、その後には9日間の休薬期間(第6日〜第14日)が続いた。第3日および第4日には、FOLFIRIレジメンの化合物が投与された。
本出願の出願日現在、患者17例が第I相部分に登録されていた:3例は200mg、400mgおよび600mg各用量レベルのレスミノスタット+FOLFIRIを摂取し、患者8例は400mgの用量レベルのレスミノスタットBID(1日2回)+FOLFIRIを摂取した。
材料および方法
サンプル
患者からの全血2.5mLを、赤血球を溶解させてRNasesによる分解からRNAを安定化させ、遺伝子発現におけるエックスビボ変化を最小限に抑えるための化学薬品を含有するPAXgene(商標)チューブ(BD Biosciences)中に収集した。サンプルを20℃〜25℃で2時間インキュベートし、次に全RNAの精製時まで−20℃で冷凍した。
サンプル
患者からの全血2.5mLを、赤血球を溶解させてRNasesによる分解からRNAを安定化させ、遺伝子発現におけるエックスビボ変化を最小限に抑えるための化学薬品を含有するPAXgene(商標)チューブ(BD Biosciences)中に収集した。サンプルを20℃〜25℃で2時間インキュベートし、次に全RNAの精製時まで−20℃で冷凍した。
サンプル収集についての好ましい手順について下記で説明する:
全手技は氷上で実施した。下記の工程を実施した:
静脈血サンプル(2mL)をラベル付きK−EDTA真空容器(例えば、monovettes(登録商標))中に採取する。時点「0時間後」は、投与直前の時点を意味する(投与前サンプル)。
サイクル1、第1日:0時間後(投与前);2時間後;5時間後
サイクル1、第5日:0時間後(投与前);2時間後;5時間後
サイクル1、第8日:0時間後(投与前)
サイクル3、第5日:0時間後(投与前);2時間後;5時間後
許容時間偏差は、他に特に規定されない限り:+/−10分間である。
全手技は氷上で実施した。下記の工程を実施した:
静脈血サンプル(2mL)をラベル付きK−EDTA真空容器(例えば、monovettes(登録商標))中に採取する。時点「0時間後」は、投与直前の時点を意味する(投与前サンプル)。
サイクル1、第1日:0時間後(投与前);2時間後;5時間後
サイクル1、第5日:0時間後(投与前);2時間後;5時間後
サイクル1、第8日:0時間後(投与前)
サイクル3、第5日:0時間後(投与前);2時間後;5時間後
許容時間偏差は、他に特に規定されない限り:+/−10分間である。
PBMCの単離:
必要な材料
・ ラベル付きLeucosep(商標)チューブ(Greiner bio−one)(使用時までは+4〜+8℃および暗所で保管し、使用前にRTへ加温する)
・ ラベル付き15mLチューブ(例えば、PPチューブ、例えばFalcon(登録商標)チューブ)
・ ラベル付き2mLチューブ(例えば、PPチューブ)
・ 赤血球溶解バッファー(Qiagen 79217)(使用時まではRTで保管する)
・ PBS(リン酸緩衝生理食塩液)(使用時まではRTで保管する)
・ RIPA(放射性免疫沈降検定)バッファー(Thermo Scientific 89900)(使用時までは4℃で保管する)
・ プロテアーゼ阻害剤カクテルストック、10μLアリコートとして提供される(Thermo Scientific 87785)(使用時までは−80℃で保管する)
必要な材料
・ ラベル付きLeucosep(商標)チューブ(Greiner bio−one)(使用時までは+4〜+8℃および暗所で保管し、使用前にRTへ加温する)
・ ラベル付き15mLチューブ(例えば、PPチューブ、例えばFalcon(登録商標)チューブ)
・ ラベル付き2mLチューブ(例えば、PPチューブ)
・ 赤血球溶解バッファー(Qiagen 79217)(使用時まではRTで保管する)
・ PBS(リン酸緩衝生理食塩液)(使用時まではRTで保管する)
・ RIPA(放射性免疫沈降検定)バッファー(Thermo Scientific 89900)(使用時までは4℃で保管する)
・ プロテアーゼ阻害剤カクテルストック、10μLアリコートとして提供される(Thermo Scientific 87785)(使用時までは−80℃で保管する)
サンプルの処理
1)治療用の7mLのクエン酸加血(凝固を防止するために一般に公知の手技によってクエン酸塩で処理された血液サンプル)を使用準備済みのLeucosep(商標)チューブへ移す。
2)RTで停止させることなく800gで15分間遠心する。
3)PBMC層間の上方に5mmまで残して、およそ2mLの血漿上清(血小板を含有する)を取り除く。
4)遠心分離のために適切なラベル付き15mLPP(例えば、Falcon(登録商標)チューブへ上清の残り全部をピペット操作によって多孔質障壁の上方に移す。
5)10mLのPBS(RT)を加えて混合する。
6)RTで停止させることなく400gで7分間遠心する。
7)およそ0.5mLのPBSの残留容量を除く上清を取り出し、細胞を懸濁させる。
8)1.5mLのErylysis(赤血球溶解)バッファー(Qiagen 79217)を加え、溶解のためにRTで4分間インキュベートする。
9)Erylysis(赤血球溶解)を停止させるために10mLのPBSを加える。
10)RT、400gで7分間遠心する。
11)上清を取り出し、細胞を14mLのPBS中に再懸濁させる。
12)RT、400gで7分間遠心する。
13)上清を取り出し、細胞を4.5mLのPBS中に再懸濁させる。
14)細胞懸濁液から3つの等量のアリコート(3×1.5mL)をラベル付き2mLチューブ中に移す。
15)RT、400gで7分間遠心する。
16)以下の手法にしたがって上清を完全に取り除く:細胞ペレットを上向きにしてチューブを45度傾斜させ、ゲルローダーチップを使用して細胞ペレットの反対側の液体を除去する。氷上に置く。
17)1,000μLの低温RIPAバッファーを1本のチューブのプロテアーゼ阻害剤カクテルストックに移して混合する。
18)50μLのこのプロテアーゼ阻害剤カクテル溶液を3つの等分した細胞ペレット各々に移し、短時間混合する。
19)ペレットは直ちに−80℃で保存する。
1)治療用の7mLのクエン酸加血(凝固を防止するために一般に公知の手技によってクエン酸塩で処理された血液サンプル)を使用準備済みのLeucosep(商標)チューブへ移す。
2)RTで停止させることなく800gで15分間遠心する。
3)PBMC層間の上方に5mmまで残して、およそ2mLの血漿上清(血小板を含有する)を取り除く。
4)遠心分離のために適切なラベル付き15mLPP(例えば、Falcon(登録商標)チューブへ上清の残り全部をピペット操作によって多孔質障壁の上方に移す。
5)10mLのPBS(RT)を加えて混合する。
6)RTで停止させることなく400gで7分間遠心する。
7)およそ0.5mLのPBSの残留容量を除く上清を取り出し、細胞を懸濁させる。
8)1.5mLのErylysis(赤血球溶解)バッファー(Qiagen 79217)を加え、溶解のためにRTで4分間インキュベートする。
9)Erylysis(赤血球溶解)を停止させるために10mLのPBSを加える。
10)RT、400gで7分間遠心する。
11)上清を取り出し、細胞を14mLのPBS中に再懸濁させる。
12)RT、400gで7分間遠心する。
13)上清を取り出し、細胞を4.5mLのPBS中に再懸濁させる。
14)細胞懸濁液から3つの等量のアリコート(3×1.5mL)をラベル付き2mLチューブ中に移す。
15)RT、400gで7分間遠心する。
16)以下の手法にしたがって上清を完全に取り除く:細胞ペレットを上向きにしてチューブを45度傾斜させ、ゲルローダーチップを使用して細胞ペレットの反対側の液体を除去する。氷上に置く。
17)1,000μLの低温RIPAバッファーを1本のチューブのプロテアーゼ阻害剤カクテルストックに移して混合する。
18)50μLのこのプロテアーゼ阻害剤カクテル溶液を3つの等分した細胞ペレット各々に移し、短時間混合する。
19)ペレットは直ちに−80℃で保存する。
細胞HDAC酵素活性アッセイの手順
必要な材料
・ ラベル付き15mLチューブ(例えば、PPチューブ、例えばFalcon(登録商標)チューブ)
・ ラベル付き2mLチューブ(例えば、PPチューブ)
・ 赤血球溶解バッファー(Qiagen 79217)(使用時まではRTで保管した)
・ DMSO中の40mMのBoc−K(Ac)AMCストック(Bachem:I−1875)(使用時まで−80℃で保存した)
必要な材料
・ ラベル付き15mLチューブ(例えば、PPチューブ、例えばFalcon(登録商標)チューブ)
・ ラベル付き2mLチューブ(例えば、PPチューブ)
・ 赤血球溶解バッファー(Qiagen 79217)(使用時まではRTで保管した)
・ DMSO中の40mMのBoc−K(Ac)AMCストック(Bachem:I−1875)(使用時まで−80℃で保存した)
サンプルの処理
1)1mLのクエン酸加血液を15mLのラベル付きチューブに加える。
2)5μLの40mMのBoc−K(Ac)AMCを1mLのクエン酸加血液に加える(最終濃度:200μMのBoc−K(Ac)AMC)。
3)インキュベーター(37℃)内で2時間インキュベートする。
4)5倍容積(5mL)の4℃の低温赤血球溶解バッファー(ELバッファー、Qiagen 79217)を加える。
5)攪拌器上で短時間混合する。
6)少なくとも15分間、氷上でインキュベートする;その間に2回、プレート攪拌器上で混合する。
7)7mLの4℃のELバッファーを加える。
8)10分間にわたり4℃、400gで遠心分離し、上清を除去する。
9)2倍容積(2mL)の4℃のELバッファーを加え、短時間混合する。
10)10分間にわたり4℃、400gで遠心分離し、上清を除去する。
11)2倍容積(2mL)の4℃のELバッファーを加え、短時間混合する。
12)サンプリングの正確な時点がラベル表示された2mLチューブを取り出す。
13)チューブラベル上に患者番号を記入する。
14)2つの1mLアリコートを調製する(アリコート操作の前にピペットを用いて再度混合する)。
15)10分間にわたり400g、+4℃で遠心分離し、以下の手法にしたがって上清を完全に取り除く:細胞ペレットを備えるチューブを上向きに45度傾斜させ、ゲルローダーチップを使用して細胞ペレットの反対側の液体を除去する。
16)−80℃でサンプルを冷凍する。
1)1mLのクエン酸加血液を15mLのラベル付きチューブに加える。
2)5μLの40mMのBoc−K(Ac)AMCを1mLのクエン酸加血液に加える(最終濃度:200μMのBoc−K(Ac)AMC)。
3)インキュベーター(37℃)内で2時間インキュベートする。
4)5倍容積(5mL)の4℃の低温赤血球溶解バッファー(ELバッファー、Qiagen 79217)を加える。
5)攪拌器上で短時間混合する。
6)少なくとも15分間、氷上でインキュベートする;その間に2回、プレート攪拌器上で混合する。
7)7mLの4℃のELバッファーを加える。
8)10分間にわたり4℃、400gで遠心分離し、上清を除去する。
9)2倍容積(2mL)の4℃のELバッファーを加え、短時間混合する。
10)10分間にわたり4℃、400gで遠心分離し、上清を除去する。
11)2倍容積(2mL)の4℃のELバッファーを加え、短時間混合する。
12)サンプリングの正確な時点がラベル表示された2mLチューブを取り出す。
13)チューブラベル上に患者番号を記入する。
14)2つの1mLアリコートを調製する(アリコート操作の前にピペットを用いて再度混合する)。
15)10分間にわたり400g、+4℃で遠心分離し、以下の手法にしたがって上清を完全に取り除く:細胞ペレットを備えるチューブを上向きに45度傾斜させ、ゲルローダーチップを使用して細胞ペレットの反対側の液体を除去する。
16)−80℃でサンプルを冷凍する。
細胞系およびPBMCからのRNAの単離
サンプル、例えば細胞は、RNAを入手するために、機械的に(例えば、超音波処理)または化学的に(例えば洗剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム、イソチオシアン酸グアニジン)崩壊させる。RNA、DNA、タンパク質およびその他の実体を含有する細胞溶解液からRNAを抽出するためには、例えば有機物(例えば、フェノール/クロロホルム)を使用する抽出法、フィルターベースのスピンバスケットフォーマット(例えば、ガラス繊維、誘導体化シリカまたはそれに核酸が結合するイオン交換膜)、磁気粒子法(常磁性コアおよびシリカのような核酸に結合するように修飾された周囲のシェルを備える粒子)および直接溶解法(例えば、サンプルを崩壊させて核酸を安定化する溶解バッファー調製物を用いる)などの様々な方法を使用できる。
サンプル、例えば細胞は、RNAを入手するために、機械的に(例えば、超音波処理)または化学的に(例えば洗剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム、イソチオシアン酸グアニジン)崩壊させる。RNA、DNA、タンパク質およびその他の実体を含有する細胞溶解液からRNAを抽出するためには、例えば有機物(例えば、フェノール/クロロホルム)を使用する抽出法、フィルターベースのスピンバスケットフォーマット(例えば、ガラス繊維、誘導体化シリカまたはそれに核酸が結合するイオン交換膜)、磁気粒子法(常磁性コアおよびシリカのような核酸に結合するように修飾された周囲のシェルを備える粒子)および直接溶解法(例えば、サンプルを崩壊させて核酸を安定化する溶解バッファー調製物を用いる)などの様々な方法を使用できる。
様々な癌細胞系およびPBMC中のZFP64のRNA発現レベルを決定するために、細胞膜は、細胞を溶解させてシリカ膜へのRNAの結合を支持するイソチオシアン酸グアニジンを含有するバッファーを用いて化学的に崩壊させ、フィルターベースのスピンカラムによってRNAを抽出した。
PaxGeneの手順
1)2本のラベル付きPaxGene(登録商標)チューブ(Qiagen 79217)(使用時までRTで保管する)を時点および患者毎に取り出す。
2)2mLの血液を添加した後に、チューブを10回反転させることによって混合する。
3)血液を充填したチューブをRTで2時間にわたりインキュベートする
4)チューブを−20℃のフリーザーへ移す
5)血液を含有するチューブは輸送前に少なくとも24時間にわたり−20℃で保管する。
1)2本のラベル付きPaxGene(登録商標)チューブ(Qiagen 79217)(使用時までRTで保管する)を時点および患者毎に取り出す。
2)2mLの血液を添加した後に、チューブを10回反転させることによって混合する。
3)血液を充填したチューブをRTで2時間にわたりインキュベートする
4)チューブを−20℃のフリーザーへ移す
5)血液を含有するチューブは輸送前に少なくとも24時間にわたり−20℃で保管する。
本明細書で使用するように、RTは、典型的には21〜25℃の範囲内にある室温を意味する。
バイオマーカー測定の好ましい方法は、欧州特許出願第12179187.5号明細書に記載されている。
全血サンプルからのRNAの単離
全RNAは、全血サンプルのために適切なスピンカラムベースの技術(例えば、Qiagen製のPAXgene(商標)Blood miRNAキットまたはPAXgene(商標)Blood RNAキット)を製造業者の説明書にしたがって使用してPAXgene(商標)バッファー中で安定化させた全血液サンプルから単離した。精製は、(PAXgene(商標)Blood RNA)チューブ内で核酸をペレット化するための遠心分離工程で開始した。再懸濁させたペレットは、バッファー中でインキュベートし、タンパク質消化を引き起こすためにプロテイナーゼKと一緒にRNA安定性を維持するために最適化した。PAXgene(商標)Shredderスピンカラムを通しての追加の遠心分離は、細胞溶解液を均質化して残留細胞破片を除去するために実施し、フロースルー画分の上清を新鮮微小遠心チューブに移した。結合条件を調整するためにエタノールを加え、溶解物をPAXgene(商標)RNAスピンカラムに適用した。短時間の遠心分離中、RNAは汚染物質が通過するにしたがってPAXgene(商標)シリカ膜に選択的に結合した。残留している汚染物質は、数回の効率的洗浄工程において取り除いた。第1および第2洗浄工程の間に、膜は、微量の結合DNAを除去するために、下記の1.3で記載するようにDNaseIを用いて処理した。洗浄工程後、RNAをヌクレアーゼフリー水中に溶出させ、熱変性させた。
全RNAは、全血サンプルのために適切なスピンカラムベースの技術(例えば、Qiagen製のPAXgene(商標)Blood miRNAキットまたはPAXgene(商標)Blood RNAキット)を製造業者の説明書にしたがって使用してPAXgene(商標)バッファー中で安定化させた全血液サンプルから単離した。精製は、(PAXgene(商標)Blood RNA)チューブ内で核酸をペレット化するための遠心分離工程で開始した。再懸濁させたペレットは、バッファー中でインキュベートし、タンパク質消化を引き起こすためにプロテイナーゼKと一緒にRNA安定性を維持するために最適化した。PAXgene(商標)Shredderスピンカラムを通しての追加の遠心分離は、細胞溶解液を均質化して残留細胞破片を除去するために実施し、フロースルー画分の上清を新鮮微小遠心チューブに移した。結合条件を調整するためにエタノールを加え、溶解物をPAXgene(商標)RNAスピンカラムに適用した。短時間の遠心分離中、RNAは汚染物質が通過するにしたがってPAXgene(商標)シリカ膜に選択的に結合した。残留している汚染物質は、数回の効率的洗浄工程において取り除いた。第1および第2洗浄工程の間に、膜は、微量の結合DNAを除去するために、下記の1.3で記載するようにDNaseIを用いて処理した。洗浄工程後、RNAをヌクレアーゼフリー水中に溶出させ、熱変性させた。
追加のDNase消化およびクリーンアップ
RNAの純度を強化するため、RNaseフリーDNase Set(Qiagen)を用いて追加の溶液中DNase消化を実施した。手短には、溶出したRNAは10分間、室温で6.81Kunitz単位のRNaseフリーDNaseIとともにインキュベートした。Kunitz単位は、基質としての高度に重合化したDNAを用いて、25℃、pH5.0で1分間当たり1ml当たり0.001のA260中での増加を引き起こすDNaseIの量として規定されたDNaseIを測定するために一般に使用される単位である(Kunitz,M.[1950]J.Gen.Physiol.33,349 and 363)。サンプルは、次にスピンカラムベースの技術(RNeasy(登録商標)Mini Kit、Qiagen製)を使用して精製した。
RNAの純度を強化するため、RNaseフリーDNase Set(Qiagen)を用いて追加の溶液中DNase消化を実施した。手短には、溶出したRNAは10分間、室温で6.81Kunitz単位のRNaseフリーDNaseIとともにインキュベートした。Kunitz単位は、基質としての高度に重合化したDNAを用いて、25℃、pH5.0で1分間当たり1ml当たり0.001のA260中での増加を引き起こすDNaseIの量として規定されたDNaseIを測定するために一般に使用される単位である(Kunitz,M.[1950]J.Gen.Physiol.33,349 and 363)。サンプルは、次にスピンカラムベースの技術(RNeasy(登録商標)Mini Kit、Qiagen製)を使用して精製した。
RNAの濃度および純度の決定
各全RNAサンプルのアリコートを使用して、分光光度計(NanoDrop(登録商標)ND−1000分光光度計(peqlab))上でRNAの濃度および純度を決定した。
各全RNAサンプルのアリコートを使用して、分光光度計(NanoDrop(登録商標)ND−1000分光光度計(peqlab))上でRNAの濃度および純度を決定した。
RNAの完全性の制御
RNA完全性を試験したが、所定のサンプルについてはRNAの品質はサンプル中で測定した全部のRNAsにわたって匹敵しているので、あらゆる潜在的異常が平均化されるために必須ではない。全サンプルは、全RNA濃度に依存して、2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)上でRNA 6000 NanoもしくはRNA 6000 Pico LabChipキット(Agilent Technologies)を使用して分析した。
RNA完全性を試験したが、所定のサンプルについてはRNAの品質はサンプル中で測定した全部のRNAsにわたって匹敵しているので、あらゆる潜在的異常が平均化されるために必須ではない。全サンプルは、全RNA濃度に依存して、2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)上でRNA 6000 NanoもしくはRNA 6000 Pico LabChipキット(Agilent Technologies)を使用して分析した。
2100 Bioanalyzerは、キャピラリー電気泳動法による全RNAサンプルの分析を許容する。RNAは断片サイズにしたがって分離され、結果は電気泳動図およびバーチャルゲル画像として報告された。
RNAの品質についての指標、いわゆるRIN(RNA完全性番号)は、電気泳動プロファイルから導き出される。RINスケールは、1〜10に及ぶ。10のRINは素晴らしいRNA品質を意味するが、他方1のRINは大規模な分解を指示する。RIN計算のために、アルゴリズムは、28S/18S−rRNA比単独には頼らず、全電気泳動プロファイル(例えば、短鎖変性RNA種の画分、例えば約20核酸塩基長)を考慮に入れる(Schroeder et al.,2006,BMC Molecular Biology 7:3)。
逆転写
高能力cDNA逆転写キット(Applied Biosystems)を使用して、製造業者の説明書にしたがってランダムヘキサマープライマーを用いて全RNAを一本鎖cDNAへ逆転写した。手短には、反応ミックスのためには全RNAを過剰のランダムプライマー、4mMのdNTPミックス、2.5U/反応、逆トランスクリプターゼおよびヌクレアーゼフリー水と混合した。逆転写はサーマルサイクラー内において以下の条件下で発生した:25℃で10分間、37℃で120分間、85℃で5分間、その後に反応液を冷却するために4℃。逆転写は、原則的には他の逆トランスクリプターゼ、プライマーおよび温度手順を用いて同様に実施できる。可能な場合は常に、250ngの全RNAを逆転写させ、入手できない場合はより少ない量を使用した。
高能力cDNA逆転写キット(Applied Biosystems)を使用して、製造業者の説明書にしたがってランダムヘキサマープライマーを用いて全RNAを一本鎖cDNAへ逆転写した。手短には、反応ミックスのためには全RNAを過剰のランダムプライマー、4mMのdNTPミックス、2.5U/反応、逆トランスクリプターゼおよびヌクレアーゼフリー水と混合した。逆転写はサーマルサイクラー内において以下の条件下で発生した:25℃で10分間、37℃で120分間、85℃で5分間、その後に反応液を冷却するために4℃。逆転写は、原則的には他の逆トランスクリプターゼ、プライマーおよび温度手順を用いて同様に実施できる。可能な場合は常に、250ngの全RNAを逆転写させ、入手できない場合はより少ない量を使用した。
Custom TaqMan(登録商標)アレイ上での定量的リアルタイムPCR
Format 16でのCustom TaqMan(登録商標)アレイは、表4に略述したように本発明のバイオマーカーおよびハウスキーピング遺伝子の遺伝子発現分析のために設計された。これらのアレイは、カード1枚当たり8サンプルのqPCR分析を可能にする。当然ながら、全反応は特異的プライマーを用いる従来型qPCR分析によって同様に実施できる。
Format 16でのCustom TaqMan(登録商標)アレイは、表4に略述したように本発明のバイオマーカーおよびハウスキーピング遺伝子の遺伝子発現分析のために設計された。これらのアレイは、カード1枚当たり8サンプルのqPCR分析を可能にする。当然ながら、全反応は特異的プライマーを用いる従来型qPCR分析によって同様に実施できる。
マイクロ流体カードにTaqMan(登録商標)遺伝子発現マスターミックス(Applied Biosystems)および1ポートに付き200ng、またはそれ以上入手できない場合はそれより少ないcDNAを装填した。
反応ミックスは、各々330gおよび4℃で1分間にわたり2回遠心することによって反応チャンバー内へ移した。密封後、マイクロ流体カードはAB7900HT機器(Applied Biosystems)上でランさせた。機器の制御、データ収集および生データ分析のためにはソフトウエアSDS 2.4(Applied Biosystems)を使用した。プレートは相対定量(ΔΔCt)モードでランし、下記の温度プロファイルを使用した:
40サイクルにわたり、50℃/2:00分−94.5℃/10:00分−[97℃/0:30分−59.7℃/1:00分]。
40サイクルにわたり、50℃/2:00分−94.5℃/10:00分−[97℃/0:30分−59.7℃/1:00分]。
各タンパク質抽出およびウェスタンブロット分析
HepG2 肝細胞癌細胞
75cm2の細胞培養フラスコ Greiner Bio−one、製品番号658170
核抽出キット Abnova、製品番号KA1346、ロット番号0448735
NP−40代替物(10%) タンパク質等級洗剤、Calbiochem、製品番号492018
Criterion(商標)Precastゲル 12%のBis−Tris、18 Well Comb、30μL、Bio−RAD Laboratories、製品番号345−0118
トリシンサンプルバッファー Bio−RAD Laboratories、製品番号161−0739(使用前に5μLのβ−メルカプトエタノールを250μLのサンプルバッファーに加える)Precision Plus Protein(商標)Dual Color Standards Bio−RAD Laboratories、製品番号161−0374
ビオチン化Protein Ladder Cell Signaling、製品番号7727
XT MOPS(20×)バッファー Bio−RAD Laboratories、製品番号1161−0788
Tris/CAPSバッファー(10×) Bio−RAD Laboratories、製品番号161−0778
Immun−Blot PVDF膜(0.2μm) Bio−RAD Laboratories、製品番号162−0177
濾紙基準サイズ Bio−RAD Laboratories、製品番号1703967
SuperBlock T20(PBS)ブロッキングバッファー Thermo Scientific、製品番号37516
検出試薬1過酸化物溶液 Thermo Scientific、製品番号1859701
検出試薬2ルミノール強化剤溶液 Thermo Scientific、製品番号1859698
ブロッティングバッファー 50mLの10×のTris/Capsバッファー+2.5mLの20%のSDSに500mLのH2Oを加える
洗浄バッファー(PBS+0.05%のTween20) 25mL PBS+PBS中の25mLの0.1%のTween20
Gel Doc 2000 Bio−RAD Laboratories
HepG2 肝細胞癌細胞
75cm2の細胞培養フラスコ Greiner Bio−one、製品番号658170
核抽出キット Abnova、製品番号KA1346、ロット番号0448735
NP−40代替物(10%) タンパク質等級洗剤、Calbiochem、製品番号492018
Criterion(商標)Precastゲル 12%のBis−Tris、18 Well Comb、30μL、Bio−RAD Laboratories、製品番号345−0118
トリシンサンプルバッファー Bio−RAD Laboratories、製品番号161−0739(使用前に5μLのβ−メルカプトエタノールを250μLのサンプルバッファーに加える)Precision Plus Protein(商標)Dual Color Standards Bio−RAD Laboratories、製品番号161−0374
ビオチン化Protein Ladder Cell Signaling、製品番号7727
XT MOPS(20×)バッファー Bio−RAD Laboratories、製品番号1161−0788
Tris/CAPSバッファー(10×) Bio−RAD Laboratories、製品番号161−0778
Immun−Blot PVDF膜(0.2μm) Bio−RAD Laboratories、製品番号162−0177
濾紙基準サイズ Bio−RAD Laboratories、製品番号1703967
SuperBlock T20(PBS)ブロッキングバッファー Thermo Scientific、製品番号37516
検出試薬1過酸化物溶液 Thermo Scientific、製品番号1859701
検出試薬2ルミノール強化剤溶液 Thermo Scientific、製品番号1859698
ブロッティングバッファー 50mLの10×のTris/Capsバッファー+2.5mLの20%のSDSに500mLのH2Oを加える
洗浄バッファー(PBS+0.05%のTween20) 25mL PBS+PBS中の25mLの0.1%のTween20
Gel Doc 2000 Bio−RAD Laboratories
播種の4時間後、HepG2細胞を0.1%のDMSOまたは5μMのレスミノスタットのどちらかで処理した。
レスミノスタット処理24時間後、細胞をスクレーピングおよび低温PBS中での採取前にPBSで1回洗浄し、予備冷却した15mLのファルコンチューブ中に移した。
細胞質抽出物および核抽出物を調製するために、低張性バッファー中に再懸濁させることによって初回細胞膨潤を誘発する。その後に、細胞膜を破断して、それにより細胞質画分への接近を許容する洗剤(例えばNonident P−40)を加える。細胞分別は、遠心分離および細胞質抽出物の除去によって実施する。引き続いて、核抽出バッファーを使用して核を溶解させる。
細胞質抽出バッファー:10mMのHEPES、60mMのKCl、1mMのEDTA、1mMのDTT、1mMのPMSF、pH7.6へ調整;洗剤:0.075%(v/v)のNP−40;核抽出バッファー:20mMのTris Cl、420mMのNaCl、1.5mMのMgCl2、0.2mMのEDTA、1mMのPSMF、25%(v/v)のグリセロール、pH8.0へ調整。
Abnova各抽出キットを使用したバッファーの調製:
核抽出は、製造業者によって記載されたように(Abnova、製品番号KA1346)以下のように実施した:
− 300×g、5分間、4℃での懸濁細胞の遠心分離
− 上清を廃棄し、3mLの氷冷PBS/ホスファターゼ阻害剤溶液中でのペレットの再懸濁
− 300×g、5分間、4℃での遠心分離
− 上清を廃棄し、3mLの氷冷PBS/ホスファターゼ阻害剤溶液中でのペレットの再懸濁
− 300×g、5分間、4℃での遠心分離
− 上清を廃棄し、250μLの氷冷低張性バッファーを加え、混合し、再懸濁させたペレットを予備冷却した1.5mLチューブ内へ移す
− 氷上での15分間にわたるインキュベーション
− 50μLの10%のNonident P−40を加え、ピペット操作により穏やかに混合する
− 30秒間、4℃での遠心分離
− 上清(サイトゾル画分を含有する)を新規なチューブへ移す
− 50μLの氷冷核抽出バッファー中にペレットを再懸濁させ、15秒間ボルテックスミキサーにかけ、15分間にわたり氷上で揺動させ、30秒間ボルテックスミキサーにかけ、15分間にわたり氷上で揺動させる
− 14,000×g、10分間、4℃での遠心分離
− 上清(核画分を含有する)を新規なチューブへ移す
− 細胞質および核サンプルを−80℃で保管した。
− 300×g、5分間、4℃での懸濁細胞の遠心分離
− 上清を廃棄し、3mLの氷冷PBS/ホスファターゼ阻害剤溶液中でのペレットの再懸濁
− 300×g、5分間、4℃での遠心分離
− 上清を廃棄し、3mLの氷冷PBS/ホスファターゼ阻害剤溶液中でのペレットの再懸濁
− 300×g、5分間、4℃での遠心分離
− 上清を廃棄し、250μLの氷冷低張性バッファーを加え、混合し、再懸濁させたペレットを予備冷却した1.5mLチューブ内へ移す
− 氷上での15分間にわたるインキュベーション
− 50μLの10%のNonident P−40を加え、ピペット操作により穏やかに混合する
− 30秒間、4℃での遠心分離
− 上清(サイトゾル画分を含有する)を新規なチューブへ移す
− 50μLの氷冷核抽出バッファー中にペレットを再懸濁させ、15秒間ボルテックスミキサーにかけ、15分間にわたり氷上で揺動させ、30秒間ボルテックスミキサーにかけ、15分間にわたり氷上で揺動させる
− 14,000×g、10分間、4℃での遠心分離
− 上清(核画分を含有する)を新規なチューブへ移す
− 細胞質および核サンプルを−80℃で保管した。
各核サンプルから4.4μgのタンパク質(BCAタンパク質アッセイによって測定)を同一量のトリシンバッファー(β−メルカプトエタノールを補給した)に加え、95℃で5分間加熱し、次に氷上に配置した。サンプル−トリシンバッファーミックスをプレキャスト12%のBis−Trisゲルのウエル中に適用した。ゲルを80〜110Vでランした。
吸い取り紙およびPVDF膜(メタノール中で短時間活性化された)をブロッティングバッファー中に浸漬させ、ブロッティング装置内に積み重ねた。ゲルは、45分間にわたり一定の180mAを用いて膜上にブロットした。その後、膜をSuperBlock T20(PBS)ブロッティングバッファーを含有するプラスチック製箱内に配置し、2時間にわたり室温で振とうしながらインキュベートした。膜を適切なサイズに切断した後、これらの膜片は、抗体表に記載したように希釈した各一次抗体を含有する10mLの1/10に希釈したSuperBlock T20ブロッキングバッファー中において4℃で一晩インキュベートした。
翌日、洗浄バッファーを用いて4回洗浄した後、膜は1時間にわたり対応する1/50.000の希釈率のホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgG二次抗体および1/1.000の希釈率(10mLの1/10に希釈したSuperBlock T20ブロッキングバッファー中で希釈した)の抗ビオチンとインキュベートした。洗浄バッファーを用いて4回洗浄した後、強化化学発光を用いてHRPシグナルを検出してX線フィルムに露光させた。引き続いて、フィルムはGel Doc 2000を使用してスキャンし、対応するシグナルは「Quantity One」ソフトウエア(BioRad)を用いて定量した。
データの分析
分析設定
下流分析のために、384ウエルマイクロ流体カードのリアルタイムPCRランをソフトウエアRQ Manager 1.2.1(Applied Biosystems)内に装填した。試験した患者各々については別個の試験(*.sdm files)を生成した。
分析設定
下流分析のために、384ウエルマイクロ流体カードのリアルタイムPCRランをソフトウエアRQ Manager 1.2.1(Applied Biosystems)内に装填した。試験した患者各々については別個の試験(*.sdm files)を生成した。
各ウエルについて、Ct値(サイクル閾値)、すなわち増幅曲線が明白にバックグラウンドを超え、指数曲線が線形位相にあるサイクル数をソフトウエアRQ Manager 1.2.1において計算した。可能な場合は常に、機器の設定「Automatic Ct」を使用し、全ての手動設定は増幅プロットの検査に基づいて規定した。結果として生じるCt値は、次にCt Avg値を生成するために各サンプル/アッセイの組み合わせの3回の測定値内で平均化した。関連する変化(Ct Avgの平均値の標準誤差に等価のCt SD)は、ソフトウエアRQ Manager 1.2.1のアルゴリズムを使用して計算された。
品質フィルタリング(技術的一様性)
各ウエルの生シグナル、つまり6−FAM(6−カルボキシフルオレセイン)シグナルおよびROX(6−カルボキシル−X−ローダミン)シグナル(マスターミックス中に含有された受動的参照染料)を厳密に検査した。不規則性(例えば、曲線内の予想外の折れもしくはシフト)が観察された場合は常に、プロセスシグナルへの作用および結果として生じた増幅プロットをチェックした。必要な場合は、下流分析から不規則な生シグナルを備えるウエルを除外した。
各ウエルの生シグナル、つまり6−FAM(6−カルボキシフルオレセイン)シグナルおよびROX(6−カルボキシル−X−ローダミン)シグナル(マスターミックス中に含有された受動的参照染料)を厳密に検査した。不規則性(例えば、曲線内の予想外の折れもしくはシフト)が観察された場合は常に、プロセスシグナルへの作用および結果として生じた増幅プロットをチェックした。必要な場合は、下流分析から不規則な生シグナルを備えるウエルを除外した。
さらに、各サンプル/アッセイの組み合わせの3回の測定値の一様性は、Ct SD値に基づいて評価した。Ct SD値が>0.25であることが見いだされた場合は必ず、3つのウエルの増幅プロットが厳密に検査されたことを意味する品質フィルターCt SD≦0.25を適用した。外れ値ウエル、つまり他の複製物に比較してdCt>1が見いだされた場合は必ず、その後の分析から除外した。そのような外れ値は反応チャンバーの不十分な充填、PCR中の不規則な工程、例えば小さな気泡の破裂または製造業者によって誘発される工場過失によって誘発される可能性がある。
標的遺伝子発現が低く(例えば、Ct>32)、分子の出発数が極めて限定されている(分子およびqPCRアッセイに依存して、1,000〜10,000コピー)場合は、確率論的作用はPCR増幅工程に優勢な影響を及ぼし、結果として可変性Ct値を生じさせる。特に>32のCt値については、技術的反復測定の低い再現性が観察される。この理由から、高Ct値および>0.25のCt SDを備える3つのウエルを分析から除外しなかった。しかし、それらの結果は注意を払って解釈しなければならない。
Ct値が<32であるが、Ct SD値は>0.25であって明白な外れ値を同定できなかった場合には、下流計算のために全3つのデータポイントを使用した。
相対的発現レベルの計算
標的(バイオマーカー)転写産物の相対的発現レベルを計算するために、ΔΔCt法を適用した。この方法は、1つ以上のハウスキーピング遺伝子の発現への標的遺伝子の遺伝子発現を標準化し、次にそれをキャリブレーター(参照)サンプルもしくは群における標的およびハウスキーピング遺伝子の遺伝子発現に関連付ける。
標的(バイオマーカー)転写産物の相対的発現レベルを計算するために、ΔΔCt法を適用した。この方法は、1つ以上のハウスキーピング遺伝子の発現への標的遺伝子の遺伝子発現を標準化し、次にそれをキャリブレーター(参照)サンプルもしくは群における標的およびハウスキーピング遺伝子の遺伝子発現に関連付ける。
ΔΔCt法の基本概念:
第1工程では、Avg Ct値を作り出すためにサンプルA中の遺伝子の測定3回のCt値を平均化した。標的遺伝子のAvg Ct値とハウスキーピング遺伝子のAvg Ct値との差を計算する(ΔCt値)。引き続いてサンプルAのΔCt値とキャリブレーターサンプルのΔCt値との差(ΔΔCt値)を計算する。
第1工程では、Avg Ct値を作り出すためにサンプルA中の遺伝子の測定3回のCt値を平均化した。標的遺伝子のAvg Ct値とハウスキーピング遺伝子のAvg Ct値との差を計算する(ΔCt値)。引き続いてサンプルAのΔCt値とキャリブレーターサンプルのΔCt値との差(ΔΔCt値)を計算する。
方程式2-ΔΔCtに基づいて、キャリブレーターサンプルに比較してサンプルA中の標的遺伝子の相対的発現を指示するRQ(相対量)値を決定する。キャリブレーターサンプルは、全標的遺伝子に対して1.000のRQ値を入手する。RQ値は、X倍の変化値と同等である。
基礎のΔΔCt計算は、RQ Managerソフトウエアを使用して実施した。様々な相対定量試験の結果は、ハウスキーピング遺伝子としての18Sおよびキャリブレーターサンプルとしての各患者の第1サンプル(サイクル1、第1日、0時間後)を使用して計算した。
数種のハウスキーピング遺伝子を実行するためのΔΔCt法の修飾:
R/BioconductorパッケージddCt(v1.5.0,http://www.bioconductor.org/packages/bioc/htmL/ddCt.htmL;Authors:Jitao David Zhang,Rudolf Biczok and Markus Ruschhaupt)は、相対的発現レベルの先進的計算のために実行した。このツールは、数種のハウスキーピング遺伝子を結合するため(およびさらに必要であれば、キャリブレーター(参照)群に数種のサンプルを統合するため)のアプローチを提供する。
R/BioconductorパッケージddCt(v1.5.0,http://www.bioconductor.org/packages/bioc/htmL/ddCt.htmL;Authors:Jitao David Zhang,Rudolf Biczok and Markus Ruschhaupt)は、相対的発現レベルの先進的計算のために実行した。このツールは、数種のハウスキーピング遺伝子を結合するため(およびさらに必要であれば、キャリブレーター(参照)群に数種のサンプルを統合するため)のアプローチを提供する。
下記の計算工程は、ddCtスクリプトによって実施する:
各遺伝子−サンプルの組み合わせについての技術的複製物の平均値を計算し、MeanCtと呼ぶ。(ddCtからのオリジナルの出力表では、このカラムは単純に「Ct」と呼ぶ。個々の技術的複製物のCt値からより明確に識別するために、ddCt分析後には「MeanCt」と改名した)。
各サンプルについて全ハウスキーピング遺伝子のMeanCt値の平均値を計算する。
全ハウスキーピング遺伝子のMeanC値の平均値は遺伝子Gene1の対応するMeanCt値から減じる。生じた値をdCtと呼ぶ。
遺伝子Gene1に対して、全参照サンプルのdCt値の平均値を(妥当な場合は)計算する。
結果として生じる全参照サンプルの平均dCt値をサンプルA中のGene1の対応するdCt値から減じる。生じた値をddCtと呼ぶ。
各ddCt値に変換係数x→2-xを適用する。生じた値をexprsと呼ぶ。この数値は、相対的発現レベルもしくはX倍変化と等価である。
各数値に対して、平均値の標準誤差に基づく誤差を計算する。
この分析は、各患者に対して個別に実施した。第1サンプル(サイクル1、第1日、0時間後)を参照サンプルとして使用した。「exprs」値は、個別サンプルについての相対的発現レベル(倍率変化値)を指示する。
各遺伝子−サンプルの組み合わせについての技術的複製物の平均値を計算し、MeanCtと呼ぶ。(ddCtからのオリジナルの出力表では、このカラムは単純に「Ct」と呼ぶ。個々の技術的複製物のCt値からより明確に識別するために、ddCt分析後には「MeanCt」と改名した)。
各サンプルについて全ハウスキーピング遺伝子のMeanCt値の平均値を計算する。
全ハウスキーピング遺伝子のMeanC値の平均値は遺伝子Gene1の対応するMeanCt値から減じる。生じた値をdCtと呼ぶ。
遺伝子Gene1に対して、全参照サンプルのdCt値の平均値を(妥当な場合は)計算する。
結果として生じる全参照サンプルの平均dCt値をサンプルA中のGene1の対応するdCt値から減じる。生じた値をddCtと呼ぶ。
各ddCt値に変換係数x→2-xを適用する。生じた値をexprsと呼ぶ。この数値は、相対的発現レベルもしくはX倍変化と等価である。
各数値に対して、平均値の標準誤差に基づく誤差を計算する。
この分析は、各患者に対して個別に実施した。第1サンプル(サイクル1、第1日、0時間後)を参照サンプルとして使用した。「exprs」値は、個別サンプルについての相対的発現レベル(倍率変化値)を指示する。
メジアン/平均遺伝子発現値
データ分布に依存して、メジアン値もしくは平均値のいずれかを使用するのが好ましい場合がある。患者全体にわたる発現レベルの分布が正常ではない場合には、本発明の実施例におけるように、メジアン値の方が平均値より好ましいので、可能性のある傾斜データ分布の原因となる。遺伝子発現の反復挙動を証明するために、治療期間にわたる発現レベルを示すための実施例を提示する。[図4]
データ分布に依存して、メジアン値もしくは平均値のいずれかを使用するのが好ましい場合がある。患者全体にわたる発現レベルの分布が正常ではない場合には、本発明の実施例におけるように、メジアン値の方が平均値より好ましいので、可能性のある傾斜データ分布の原因となる。遺伝子発現の反復挙動を証明するために、治療期間にわたる発現レベルを示すための実施例を提示する。[図4]
表5は、下記のように600mgまたは800mgの1日量でレスミノスタットメシレート塩が投与された治療第5日(サイクル1、第5日、0、2および5時間後)についてのメジアン発現レベル値を含有している。
実施例3a:SD/PDと相関させたZFP64遺伝子発現
予後マーカーとしてのZFP64
統計学的解析は、統計学的ソフトウエアR(R_Core_Team,2012.R:Alanguage and environment for statistical computing.[オンライン]入手先:http://www.R−project.org)を使用して実施した。
予後マーカーとしてのZFP64
統計学的解析は、統計学的ソフトウエアR(R_Core_Team,2012.R:Alanguage and environment for statistical computing.[オンライン]入手先:http://www.R−project.org)を使用して実施した。
遺伝子ZFP64のベースライン発現の統計学的分析(サイクル1、第1日、0時間後)は、ZFP64のベースライン時遺伝子発現に基づくと、患者を2つの群に、つまりa)本明細書に記載したようにHDAC阻害剤治療の前向きの転帰を示すことが予想される患者、およびb)本明細書に記載したようにHDAC阻害剤治療の前向きの転帰を示さないと予想される患者に分離できることを明らかにした。ZFP64遺伝子発現についてのベースライン時の差は、発現レベルではなくdCt値を使用することによって検出可能である(2つの間の数学的関係については、上記の「ΔΔCt法の基本概念」を参照されたい)。図5は、SAPHIRE臨床試験からの2つの患者群のボックスプロット値を彼らの各メジアン値、四分位数値範囲(25〜75パーセンタイル)およびデータ範囲とともに示している。Welchの2標本t検定によると、2群間の差についてのp値は0.03である。
したがって、図6および7では、各プロットはSHELTER(p値=0.04)およびSHORE(p値=0.06)臨床試験について示されており、ZFP64のレスミノスタット治療下のマーカーとしての適用可能性を指示している。さらに、健常ドナーからの血液サンプルを採取し、臨床試験について上述したようにmRNA発現を測定した。健常ドナーからのdCt値は臨床サンプルの発現範囲内にあり、安定性疾患(SD)を有する患者の各メジアン値は健常ドナーのメジアン値により近接近していた。これは、全個別試験についての図8および全試験の組み合わせとしての図9におけるボックスプロット図として示した。
バイオマーカーとしてのZFP64の予後値を考察すると、dCt値のパーセンタイルランキングに基づいた予後診断力の3群への分離が可能である(図10を参照)。71パーセンタイル以上を含む範囲内のdCt値は、0.78(9例中7例)の精度でHDAC阻害剤治療が前向きの転帰を生じさせないことを指示する。51パーセンタイル以下を含む範囲内のdCt値は、0.69(16例中11例)の精度でHDAC阻害剤治療の前向きの転帰を指示する。51〜71パーセンタイルの間の範囲内にあるが51および71パーセンタイルを含まないdCt値は、決定的な予後的指示を生じさせない。上述したようなdCt値のパーセンタイル範囲はHDAC阻害剤治療を受けている全患者にわたる遺伝子発現の全分布に関する。
実施例3b:OS/PFSと相関させたZFP64遺伝子発現
分割方法
実施例3aにおける分析で見られた結果および指示に基づいて、遺伝子発現群間の分割を決定するためにベースライン時のZFP64のdCt値を本明細書に記載した方法で処理した。データは下記のように処理した:当該の遺伝子の遺伝子発現データは、特定時点、例えば治療開始前のベースライン時についてのハウスキーピング遺伝子の発現に比較してリアルタイムPCRdCt値として収集した。患者群は、相互に比較して低値および高値の2つの群に当該の遺伝子についてdCt値の既定パーセンタイル(総計すると25パーセンタイル〜85パーセンタイルまで、5パーセンタイルずつ)で段階的に分割した。上記の2つの群は次に、OS、PFSについての患者の確率を分離する統計的有意差を同定するために、OS、PFSに対するカプラン・マイヤー分析において比較した。
分割方法
実施例3aにおける分析で見られた結果および指示に基づいて、遺伝子発現群間の分割を決定するためにベースライン時のZFP64のdCt値を本明細書に記載した方法で処理した。データは下記のように処理した:当該の遺伝子の遺伝子発現データは、特定時点、例えば治療開始前のベースライン時についてのハウスキーピング遺伝子の発現に比較してリアルタイムPCRdCt値として収集した。患者群は、相互に比較して低値および高値の2つの群に当該の遺伝子についてdCt値の既定パーセンタイル(総計すると25パーセンタイル〜85パーセンタイルまで、5パーセンタイルずつ)で段階的に分割した。上記の2つの群は次に、OS、PFSについての患者の確率を分離する統計的有意差を同定するために、OS、PFSに対するカプラン・マイヤー分析において比較した。
図10におけるデータおよびパーセンタイルランキングならびに上述の分割方法に基づいて、図11および11bにおいて図示して説明したように低値群および高値群を規定する。
上記分割をSHELTER試験からのデータを例示している図11における全生存(OS)および図11bにおける無増悪生存(PFS)を提示しているボックスプロット図に適用する。この分析は、高値群と低値群との間の統計的差を示しており、OSとの相関についてのp値は0.06であり、PFSとの相関についてのp値は0.03であった。
図12および12bに見られる上記データのカプラン・マイヤー分析は、図11および11bからの結果を反映している。図12では、SHELTER試験からの利用可能な全患者がOSに関する分析に含まれている。分割は図11における分割に匹敵しており、高発現群の患者の60%および低発現群の40%が含まれ、対数順位検定を使用してp値が0.04であると統計学的に決定された。メジアンOS(高ZFP64発現)は8カ月後(95%CI(信頼区間):5.6〜NA)であるが、メジアンOS(低ZFP64発現)は3.9カ月後(95%CI:2.6〜9.9)である。
図12bでは、SHELTER試験からの患者だけが分析に含まれているが、彼らはレスミノスタット(600mg)またはレスミノスタット(600mg)およびソラフェニブ(400mg)の組み合わせのどちらかで治療された。分割に対するパーセンタイルは、各群についてのメジアン値と同様に、図12とは相違している。メジアンOS(高ZFP64発現)は9.4カ月後(95%CI:7.0〜20.6)およびメジアンOS(低ZFP64発現)は5.1カ月後(95%CI:3.3〜NA)であり、p値は対数順位検定によって0.02であると決定された。
図10と同様に、図12および12bは、同一傾向を示している。51%〜71%の図10における中心部分は、図12および12bにおける分割のために使用された2つのパーセンタイル(各々60パーセンタイルおよび75パーセンタイル)と同一範囲内にある。より高いdCt ZFP64ベースライン値はより低いZFP64 mRNA発現を意味し、レスミノスタットを用いた治療後のHCC患者における発達中の進行性疾患(PD)の指標であり、他方より低いdCt ZFP64ベースライン値(すなわち、より高いZFP64 mRNA発現)は発達中の安定性疾患(SD)の指標であることを留意されたい。
図13では、レスミノスタット(600mg)を摂取しているSHELTER試験からの評価可能な患者(臨床試験に参加している一部の患者は、データが欠如している、または低品質サンプルであるためにこの分析に包含することができなかった)のベースライン発現が分析されている。図示された分割は75パーセンタイルであり、結果として低ZFP64発現については0.9カ月のメジアンOS(95%CI:1.9〜NA)を生じさせ、高ZFP64発現については7.0カ月のメジアンOS(95%CI:3.3〜NA)を生じさせ、対数順位検定によりp値は0.05であると決定された。2群についての全メジアンOSは、断続線によって表示された3.7カ月である。
図14では、レスミノスタット(600mg)+ソラフェニブ(400mg)の併用を摂取していたSHELTER試験からの評価可能な患者(上記参照)のベースライン発現が分析されている。図示された分割は75パーセンタイルであり、結果として低ZFP64発現については6.1カ月のメジアンOS(95%CI:0.6〜NA)を生じさせ、高ZFP64発現については11.1カ月のメジアンOS(95%CI:8.0〜NA)を生じさせ、対数順位検定によりp値は0.07であると決定された。2群についての全メジアンOSは、断続線によって表示された8.3カ月である。
図15は、各々レスミノスタットまたはレスミノスタットおよびソラフェニブの組み合わせを一緒に摂取しているSHELTER試験からの評価可能な患者(上記参照)を示している。分割は、本明細書に記載した方法によって計算され、(図11から明らかなように)全試験集団に基づいている。これら2つのグラフは、図13および図14各々に見られる傾向を本質的に反映しており、2つの群に分割するために使用された数値が異なるという事実を原因とする差しか提示していない。パーセンタイル(図13および14については75ならびに図15については60)は、明確な転帰予測可能性の領域および根拠のある予測可能性が提示されていない領域が規定されている図10において見られるパーセンタイルと匹敵しているので、マーカーとしてのZFP64の適用可能性が確証された。
図16および17は、SHELTERデータ分析についてこのセクションにおいて記載した方法と同一方法に基づいて、SAPHIREデータについての分析を表している。図16におけるボックスプロット図は、高および低ZFP64発現への65パーセンタイルでの分割に関して全生存率(OS)データを提示しており、これは2群間の統計的差を示し、対数順位検定によるp値は0.04である。図17は、65パーセンタイルでのZFP64発現の分割を示すOSのカプラン・マイヤー分析を示している。対数順位検定によるp値は0.04である。
図18は、SHORE試験データについての各カプラン・マイヤー分析である。データは最終試験報告の前に収集されたが一部の打ち切られた患者(〇)は生存ラインの0.5比より上であるので、このため各群におけるOSについてのメジアン値は全患者データの最終評価後にある程度相違する可能性があった。それでも、CRCにおいてもHCCおよびHLと同様の類似の傾向がみられ、相対的に低いZFP64発現群はより短いOSを示し、相対的に高いZFP64発現群はより長いOSを示した。
予後マーカーとしてのDPP3
遺伝子DPP3のベースライン発現の統計学的分析(サイクル1、第1日、0時間後)は、DPP3のベースライン時遺伝子発現に基づくと、患者を2つの群に、つまりa)本明細書に記載したようにHDAC阻害剤治療の前向きの転帰を示すことが予想される患者、およびb)本明細書に記載したようにHDAC阻害剤治療の前向きの転帰を示さないと予想される患者に分離できることを明らかにした。DPP3ベースライン遺伝子発現での差はdCt値を使用すると検出できるが、発現レベルは検出できない。図19が図示している各メジアン値、四分位間範囲(25〜75パーセンタイル)およびデータ範囲を含む2つの患者群のボックスプロット値を示している。差についての両側p値は、Welchの2標本t検定によると0.03である。バイオマーカーとしてのDPP3の予後値を考察すると、dCt値のパーセンタイルランキングに基づいて予後診断力の3群への分離を実施する(図20を参照)。
遺伝子DPP3のベースライン発現の統計学的分析(サイクル1、第1日、0時間後)は、DPP3のベースライン時遺伝子発現に基づくと、患者を2つの群に、つまりa)本明細書に記載したようにHDAC阻害剤治療の前向きの転帰を示すことが予想される患者、およびb)本明細書に記載したようにHDAC阻害剤治療の前向きの転帰を示さないと予想される患者に分離できることを明らかにした。DPP3ベースライン遺伝子発現での差はdCt値を使用すると検出できるが、発現レベルは検出できない。図19が図示している各メジアン値、四分位間範囲(25〜75パーセンタイル)およびデータ範囲を含む2つの患者群のボックスプロット値を示している。差についての両側p値は、Welchの2標本t検定によると0.03である。バイオマーカーとしてのDPP3の予後値を考察すると、dCt値のパーセンタイルランキングに基づいて予後診断力の3群への分離を実施する(図20を参照)。
59パーセンタイル以上を含む範囲内のdCt値は、0.69(13例中9例)の精度でHDAC阻害剤治療が前向きの転帰を生じさせないことを指示する。52パーセンタイル以下を含む範囲内のdCt値は、0.64(17例中11例)の精度でHDAC阻害剤治療の前向きの転帰を指示する。52〜59パーセンタイルの間の範囲内にあるが52および59パーセンタイルを含まないdCt値は、決定的な予後的指示を生じさせない。上述したようなdCt値のパーセンタイル範囲はHDAC阻害剤治療を受けている全患者にわたる遺伝子発現の全分布に関する。
レスミノスタットの投与が癌細胞系、健常ドナーPBMCsおよび全血細胞ならびにSHELTER、SAPHIREおよびSHORE臨床試験における患者から採取された全血細胞におけるZFP64遺伝子発現のダウンレギュレーションを導くことが証明されている。臨床試験におけるベースライン時の相対遺伝子発現(サイクル1、第1日、0時間後)は、レスミノスタット治療下にある患者にとっての臨床転帰、つまり進行性疾患(PD)もしくは少なくとも安定性疾患または均一応答性疾患(SD)の評価の指標である。癌患者においてベースライン時(治療開始前)に測定されたより高いZFP64発現レベルは、レスミノスタットを用いた治療後のより大きな臨床的有益性(PD対SD、PFSおよびOS時間の増加)の指標である。さらに、およびより適切には、ベースライン時の上記相対遺伝子発現はさらにまた、既定の相対的に高いおよび相対的に低い発現群間の統計的に重要な差を示しているレスミノスタット治療下の患者の無増悪生存率(PFS)および/または全生存(OS)についての指標である。
細胞および全血実験は、レスミノスタットの遺伝子調節作用がソラフェニブによる影響を受けないことを証明している。レスミノスタットおよびソラフェニブの組み合わせは、レスミノスタット単独についてのダウンレギュレーションに比較してZFP64遺伝子発現のダウンレギュレーションの匹敵する数値を示している。
ZFP64は、レスミノスタット活性についての薬力学マーカーである。
ZFP64は、レスミノスタット応答についての予後ならびに予測バイオマーカーを表した。さらに、ZFP64は患者層別化のための比較診断を開発する機会を提供する。
図についての生データ(表の番号は各図の番号と同等である)。
Claims (29)
- HDAC阻害剤治療の作用を決定する方法であって、以下の:
a)前記HDAC阻害剤治療を受けている患者のサンプルを提供する工程、
b)前記サンプル中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現および/または前記遺伝子発現の変化を決定する工程、
c)前記少なくとも1つの遺伝子の前記決定された遺伝子発現および/または前記遺伝子発現の変化を前記患者における前記HDAC阻害剤治療の作用と相関させる工程を含む方法。 - HDAC阻害剤治療を監視する方法であって、以下の:
a)前記HDAC阻害剤治療を受けている患者のサンプルを提供する工程、
b)前記サンプル中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現および/または前記遺伝子発現の変化を決定する工程、
c)上記の工程aおよびbを少なくとも1回、好ましくは2回以上繰り返す工程、および
d)前記HDAC阻害剤治療への前記患者の応答の時間プロファイルを生成するために工程a)〜c)において決定された前記遺伝子発現を使用する工程を含む方法。 - 前記少なくとも1つの遺伝子の前記遺伝子発現および/または前記遺伝子発現の変化は、さらにHDAC阻害剤治療の前向きもしくは後ろ向きの転帰の確率と相関させられる、請求項1または2のいずれかに記載の方法。
- HDAC阻害剤治療を必要とする可能性がある患者を層別化する方法であって、以下の:
a)前記患者のサンプルを提供する工程、
b)前記サンプル中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現を決定する工程、
c)前記少なくとも1つの遺伝子の前記決定された遺伝子発現をHDAC阻害剤治療が前記患者への有益な作用を有する確率と相関させる工程、および
d)工程cにおいて決定された確率に基づいて、前記患者を前記HDAC阻害剤治療への応答者または非応答者であると分類する工程を含む方法。 - 工程a)において提供された前記サンプルはHDAC阻害剤が前記患者に投与される前に提供され、
工程a)の後に、前記サンプル中のHDACを阻害するためにHDAC阻害剤がエックスビボで前記サンプルに加えられ、および
工程b)において、少なくとも1つの遺伝子の前記遺伝子発現が前記HDAC阻害剤を含む前記サンプル中で決定される、請求項4に記載の方法。 - HDAC阻害剤治療を受けている患者にとっての前記HDAC阻害剤治療の前向きの転帰の確率を予測する方法であって、以下の:
a)前記患者のサンプルを提供する工程、
b)前記サンプル中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現を決定する工程、
c)前記遺伝子発現を、工程a)の前に前記患者から提供されたサンプル中の前記少なくとも1つの遺伝子の前記遺伝子発現と比較する工程、および
d)工程a)において提供された前記サンプル中と工程a)の前に提供された前記サンプル中との前記少なくとも1つの遺伝子の前記遺伝子発現の差を前記患者にとっての前記HDAC阻害剤治療の前向きの転帰の確率と相関させる工程を含む方法。 - 工程a)の前に提供される前記サンプルは前記患者にHDAC阻害剤が投与される前に前記患者から提供される、および
工程a)で提供される前記サンプルはHDAC阻害剤が前記患者に投与された後に、好ましくはHDAC阻害剤が前記患者に初めて投与された後に提供される、請求項6に記載の方法。 - HDAC阻害剤治療を必要とする患者における薬力学マーカーとしての少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現を決定する方法であって、以下の:
a)前記患者のサンプルを提供する工程、
b)前記サンプル中の前記遺伝子発現および/またはZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を決定する工程、
c)前記少なくとも1つの遺伝子の前記決定された遺伝子発現および/または前記遺伝子発現の変化をHDAC阻害剤によるHDACの相対的阻害と相関させる工程を含む方法。 - 請求項1〜8のいずれかに記載の方法であって、前記少なくとも1つの遺伝子の前記遺伝子発現は、前記サンプル中の前記少なくとも1つの遺伝子または少なくとも150ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも180ヌクレオチド長のその断片によってコードされる少なくとも1つのmRNAのレベルを測定することによって決定される方法。
- 前記少なくとも1つの遺伝子の前記遺伝子発現は前記サンプル中の前記少なくとも1つの遺伝子によってコードされる少なくとも1つのタンパク質または前記タンパク質のドメインのレベルを測定することによって決定される、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記少なくとも1つのタンパク質もしくはそのドメインのレベルおよび/またはレベルの変化は、抗体または抗体を含むプローブの結合によって決定され、前記抗体は前記少なくとも1つのタンパク質もしくはそのドメインに特異的に結合する、請求項10に記載の方法。
- 前記サンプルは、前記HDAC阻害剤治療を開始する前または前記HDAC阻害剤治療中のいずれかに採取される、請求項4〜11のいずれかに記載の方法。
- 前記サンプルは、体液のサンプル、好ましくは全血、血清もしくは血漿を含む群から選択される血液サンプル、より好ましくは全血、血清もしくは血漿を含む群から選択される末梢血サンプルである、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 前記サンプルは、組織サンプル、好ましくは罹患組織のサンプル、より好ましくは癌組織からの生検標本である、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 工程a〜cまたは工程a〜bは少なくとも1回、好ましくは2回以上繰り返される、請求項1〜14のいずれかに記載の方法。
- 前記HDAC阻害剤は、ボリノスタット、ロミデプシン、バルプロ酸、パノビノスタット、エンチノスタット、ベリノスタット、モセチノスタット、ギビノスタットおよびレスミノスタットまたはそれらの医薬上許容される塩、好ましくは遊離形にある(E)−3−(1−(4−((ジメチルアミノ)メチル)フェニルスルホニル)−1H−ピロール−3−イル)−N−ヒドロキシアクリルアミドまたはそれらの塩酸塩もしくはメシル酸塩を含む群から選択される、先行する請求項1〜15のいずれかに記載の方法。
- 前記少なくとも1つの遺伝子は、前記HDAC阻害剤治療を必要とする患者のためのHDAC阻害剤治療における薬力学マーカーとしてのZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される、少なくとも1つの遺伝子の使用または前記少なくとも1つの遺伝子によってコードされたタンパク質の使用。
- 前記少なくとも1つの遺伝子は、前記HDAC阻害剤治療を必要とする患者にとってのHDAC阻害剤治療の転帰を予測するためのZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される、少なくとも1つの遺伝子の使用または前記少なくとも1つの遺伝子によってコードされたタンパク質の使用。
- 前記少なくとも1つの遺伝子は、HDAC活性を決定するための代理マーカーとしてのZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される、少なくとも1つの遺伝子の使用または前記少なくとも1つの遺伝子によってコードされたタンパク質の使用。
- 前記少なくとも1つの遺伝子は、応答者または非応答者としてHDAC阻害剤治療を必要とする可能性がある患者を層別化するためのZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される、少なくとも1つの遺伝子の使用または前記少なくとも1つの遺伝子によってコードされたタンパク質の使用。
- サンプル中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現を決定するためのキットであって、
前記キットは、前記少なくとも1つの遺伝子または少なくとも150ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも180ヌクレオチド長のその断片によってコードされる少なくとも1つのmRNAに特異的に結合するプローブを含み、および
前記キットは、任意選択的に、培地、培地成分、バッファー、バッファー成分、RNA精製カラム、DNA精製カラム、染料、dNTPミックスを含む核酸、ポリメラーゼを含む酵素および塩を含む群から選択される1つ以上のさらなる成分を含むキット。 - サンプル中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される1つの遺伝子によってコードされた少なくとも1つのタンパク質のレベルを決定するためのキットであって:
前記少なくとも1つの遺伝子もしくは前記タンパク質の1つのドメインによってコードされた少なくとも1つのタンパク質に特異的に結合するプローブを含み、および
任意選択的に、培地、培地成分、バッファー、バッファー成分、膜、ELISAプレート酵素基質、染料、ポリメラーゼを含む酵素および塩を含む群から選択される1つ以上のさらなる成分を含むキット。 - サンプル中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子の前記遺伝子発現を決定するための請求項21または22に記載のキットの使用。
- 前記決定された遺伝子発現は前記サンプル中のHDAC活性と相関させられる、請求項23に記載の使用。
- 前記サンプルは、HDAC阻害剤治療を必要とする可能性がある患者から提供される、請求項23または24に記載の使用。
- 請求項1〜16のいずれかに記載の方法における請求項21または22に記載のキットの使用。
- HDAC阻害剤治療を必要とする可能性がある患者の治療において使用するためのHDAC阻害剤であって、前記治療の前および/または前記治療中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子、前記少なくとも1つの遺伝子に対応する少なくとも1つのmRNA、または前記少なくとも1つの遺伝子によってコードされた少なくとも1つのタンパク質が前記患者への前記HDAC阻害剤治療の作用の確率を決定するため、または前記患者が前記HDAC阻害剤治療への応答者であるかどうかを決定するために使用されるHDAC阻害剤。
- HDAC阻害剤治療を必要とする可能性がある患者を治療する方法であって、前記患者にHDAC阻害剤を投与する工程を含み、前記方法の前および/または前記方法中のZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2およびMICALL1を含む群から選択される少なくとも1つの遺伝子、前記少なくとも1つの遺伝子に対応する少なくとも1つのmRNA、または前記少なくとも1つの遺伝子によってコードされた少なくとも1つのタンパク質が前記患者への前記HDAC阻害剤治療の作用の確率を決定するため、または前記患者が前記HDAC阻害剤治療への応答者であるかどうかを決定するために使用される方法。
- 前記HDAC阻害剤は、ボリノスタット、ロミデプシン、バルプロ酸、パノビノスタット、エンチノスタット、ベリノスタット、モセチノスタット、ギビノスタットおよびレスミノスタットまたはそれらの医薬上許容される塩、好ましくは遊離形にある(E)−3−(1−(4−((ジメチルアミノ)メチル)フェニルスルホニル)−1H−ピロール−3−イル)−N−ヒドロキシアクリルアミドまたはそれらの塩酸塩もしくはメシル酸塩を含む群から選択される、請求項27に記載のHDAC阻害剤治療を必要とする可能性がある患者の治療において使用するためのHDAC阻害剤または請求項28に記載の方法。
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