CN114689857A - 一种人自身免疫性肝病检测试剂盒 - Google Patents

一种人自身免疫性肝病检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本申请涉及医学检测的技术领域，具体公开了一种人自身免疫性肝病检测试剂盒。所述试剂盒包括：由LKM‑1抗原、LC‑1抗原、SLA抗原、AMA‑M2抗原、Sp100抗原、Gp210抗原、ASMA抗原分别包被的荧光编码磁性微球的混合液；利用荧光素标记的二抗溶液；样本稀释液；微球清洗液；所述LC‑1抗原包括抗原A和抗原B。本申请提供的试剂盒能够同时对LKM‑1抗体、LC‑1抗体、SLA抗体、AMA‑M2抗体、Sp100抗体、Gp210抗体、ASMA抗体进行定性和定量检测，且准确率较高。

Description

一种人自身免疫性肝病检测试剂盒
技术领域
本申请涉及医学检测的技术领域，更具体地涉及一种人自身免疫性肝病检测试剂盒。
背景技术
自身免疫性肝病是一种特殊的慢性肝疾病，由于机体免疫机能失调而导致肝细胞或肝内外胆管的损伤。该疾病包括自身免疫性肝炎(AIH)、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)及重叠综合征等。不同类型的自身免疫性肝疾病的发病机制以及临床表现均不同。
其中，抗肝-肾微粒体1型(LKM-1)抗体、抗肝细胞溶质抗原I型(LC-1)抗体是II型AIH的血清学指标。抗平滑肌(ASMA)抗体是I型AIH的血清学指标。抗可溶性肝抗原(SLA/LP)抗体对AIH具有高度特异性，正常人群及其他疾病人群体内还未发现有此抗体，若其阳性，则几乎可诊断为AIH。抗线粒体M2体(AMA-M2)抗体、抗Sp100(Sp100)抗体和抗Gp210(Gp210)抗体是PBC的血清学指标，对PBC具有良好的敏感度和特异性。
目前，对于上述自身抗体的检测大多为单一自身抗体的单独检测。然而，由于自身免疫性肝病的发病机制与免疫机能密切相关，且病症种类较多，还可能同时存在多种病症。故仅针对单一自身抗体的检测结果不能准确定位自身免疫性肝病的病症。由于上述自身抗体的检测为单独检测，要想获得多种自身抗体的检测结果，需要分别检测，故会花费较长的周期。
发明内容
本申请提供一种人自身免疫性肝病检测试剂盒，能够同时对LKM-1抗体、LC-1抗体、SLA抗体、AMA-M2抗体、Sp100抗体、Gp210抗体、ASMA抗体进行定性和定量检测，且准确率较高。
本申请提供的一种人自身免疫性肝病检测试剂盒，采用如下的技术方案：
一种人自身免疫性肝病检测试剂盒，所述试剂盒包括：
由LKM-1抗原、LC-1抗原、SLA抗原、AMA-M2抗原、Sp100抗原、Gp210抗原、ASMA抗原分别包被的荧光编码磁性微球的混合液；
利用荧光素标记的二抗溶液；
样本稀释液；
微球清洗液；
所述LC-1抗原包括抗原A和抗原B。
本申请的试剂盒主要包括混合液和二抗溶液。混合液中包含由LKM-1抗原、LC-1抗原、SLA抗原、AMA-M2抗原、Sp100抗原、Gp210抗原、ASMA抗原分别包被的荧光编码磁性微球；在进行抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体定量联合检测的过程中，先将待测样本与混合液反应，通过混合液中的LKM-1抗原、LC-1抗原、SLA抗原、AMA-M2抗原、Sp100抗原、Gp210抗原、ASMA抗原分别与待测样本中的待测抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体的识别和结合，从而使得待测样本中的待测抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体间接与荧光编码磁性微球结合。
利用荧光素标记的二抗溶液中包含抗人IgG抗体。在待测样本中的待测抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体间接与荧光编码磁性微球结合后，再利用荧光素标记抗人IgG抗体与待测样本中的待测抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体识别和结合，从而完成对待测样本中的待测抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体的荧光标记。再利用流式细胞仪对待测样本中的待测抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体进行检测，获得待测样本中的待测抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体各自对应的荧光信号强度，再根据利用校准品制备的标准曲线中抗体相对浓度与荧光信号强度的关系，以检测获得的待测样本中的待测抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体各自对应的荧光信号强度为基础，找到与之对应的抗体相对浓度，从而获得待测样本中的待测抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体各自对应的浓度，完成对待测样本中抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体的相对浓度检测。
试剂盒中除了包括混合液和二抗溶液外，还包括校准品和缓冲液。校准品为含有抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体的标准浓度溶液，通过利用上述试剂盒检测不同浓度的标准溶液的荧光信号强度，从而获得抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体与荧光信号强度的标准曲线。因此，利用本申请的试剂盒，可同时检测获得待测样本中抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体的相对浓度。
所述样本稀释液为包含1％的BSA的1xPBS。
所述微球清洗液为包含1％的吐温-20的1xPBS。
优选的，所述抗原A和抗原B按照重量比为(0.5-1.2)：(2.5-4)的比例包被荧光编码磁性微球。
在一个具体的实施方式中，所述抗原A和抗原B按照重量比可以为1：2.5；1：3；1：4；0.5：3；1.2：3。
在一些具体的实施方式中，所述抗原A和抗原B按照重量比可以为(0.5-1.2)：(2.5-3)、(0.5-1.2)：(3-4)、(0.5-1)：(2.5-4)、(1-1.2)：(2.5-4)、(0.5-1)：(2.5-3)、(0.5-1)：(3-4)、(1-1.2)：(2.5-3)、(1-1.2)：(3-4)。
优选的，所述抗原A的序列如SEQ ID NO 1所示。
优选的，所述抗原B的序列如SEQ ID NO 2所示。
优选的，所述混合液中，LC-1抗原与荧光编码磁性微球的包被比例为：60-80μg的抗原包被1×107个磁性荧光编码微球。
通过采用上述技术方案，经过试验分析，制备混合液的过程中，将LC-1抗原与荧光编码磁性微球的包被比例控制在上述范围内时，相同抗原相对浓度下检测获得的荧光信号强度基本一致；当LC-1抗原与荧光编码磁性微球的包被比例小于或大于上述范围时，相同抗原相对浓度下检测获得的荧光信号强度均小于两者包被比例在上述范围内时的荧光信号强度。由此可知，将LC-1抗原与磁性荧光编码微球的包被比例控制在上述范围内时，能够获得较为稳定的荧光信号强度，故最终获得的待测样本中抗LC-1抗体的相对浓度较准确，因此，将LC-1抗原与荧光编码磁性微球的包被比例控制在：60-80μg抗原包被1×107个磁性荧光编码微球。
优选的，所述二抗溶液中，包含抗人IgG抗体，抗人IgG抗体的浓度为10-50μg/ml。
通过采用上述技术方案，经过试验分析，制备二抗溶液的过程中，将荧光素标记的抗人IgG抗体浓度控制在上述范围内，相同抗体相对浓度下检测获得的荧光信号强度的变化梯度基本一致；当荧光素标记的抗人IgG浓度为5μg/ml时，抗体相对浓度在高点值时检测获得的荧光信号强度较低，而当荧光素标记的抗人IgG的浓度为60μg/ml时，抗体相对浓度在0点值时检测获得的荧光信号强度过高。由此可知，将溶液B中荧光素标记的抗人IgG抗体浓度控制在上述范围内时，能够获得较为稳定的荧光信号强度，故最终获得的待测样本中抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体相对浓度较准确。因此，将二抗溶液中荧光素标记的抗人IgG抗体的浓度控制在10-50μg/ml的范围内。
优选的，所述荧光素包括藻红蛋白(PE)、PE-Cy7、异硫氰酸荧光素(FITC)、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物(PerCP)、别藻青蛋白(APC)、Alexa Fluo488。
通过采用上述方案，本申请中用到的荧光素如上所述，利用上述荧光素均可以对抗人IgG抗体进行荧光标记。
藻红蛋白是从红藻中分离纯化的一种荧光蛋白，是一种新型荧光标记染料，因为其具有强烈的荧光，很好的吸光性能和很高的量子产量，在可见光谱区有很宽的激发及发射范围，故在免疫荧光、免疫组化、流式细胞仪检测等抗体的荧光标记和活体成像中有着广泛的应用。PE-Cy7是一种基于藻红蛋白的偶联荧光染料。
异硫氰酸荧光素是生化试剂，也是医学诊断药品，主要用于荧光抗体技术中的荧光染料，能和各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中具有强烈的绿色荧光，用于医学、农学和畜牧等多方面，可对由细菌病毒和寄生虫等所致疾病进行快速诊断。Alexa Fluo488是一种小分子荧光染料，激发及发射波长与异硫氰酸荧光素类似，但光稳定性更强。
多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物是从横烈甲纲门中分离出来的，它具有非常高的淬灭系数、高量子能效和很大的斯托克位移。PerCP属于活体荧光成像蛋白标记染料，能产生更高、耐光性更好的荧光，相对短波长的青蓝素染料而言，活体荧光成像蛋白标记染料是青蓝素染料卓越的替代品。PerCP通常用于荧光免疫标记，另外，PerCP还用于多色彩细胞的流式细胞分析，故PerCP可以和FITC、PE和其他荧光物质一同用于多色彩分析中。
本申请提供的试剂盒的检测方法如下：
(1)利用样本稀释液对待测样本进行稀释，获得稀释样；
(2)将步骤(1)获得的稀释样与混合液混合，37℃反应20min，获得抗体-抗原-微球复合物；
(3)利用微球清洗液对步骤(2)获得的抗体-抗原-微球复合物进行清洗，并去除微球清洗液；
(4)将步骤(3)清洗后的抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液混匀，37℃反应20min，获得标记后的二抗-抗体-抗原-微球复合物；
(5)利用微球清洗液对步骤(4)获得的二抗-抗体-抗原-微球复合物进行清洗，并去除微球清洗液；
(6)利用微球清洗液对步骤(5)清洗后的二抗-抗体-抗原-微球复合物重悬，进行上样检测，并分析检测结果。
利用上述试剂盒及其检测方法，对待测样本进行检测，具体包括待测样本与混合液的反应，将待测样本中的待测抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体与荧光编码磁性微球上LKM-1抗原、LC-1抗原、SLA抗原、AMA-M2抗原、Sp100抗原、Gp210抗原、ASMA抗原结合，获得抗体-抗原-微球复合物，从而实现待测样本中的待测抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体的定位；然后将抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液反应，利用二抗溶液中荧光素标记的抗人IgG抗体与定位在荧光编码磁性微球上的待测抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体反应，进行抗原抗体结合反应，从而完成待测样本中待测抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体的荧光标记，获得二抗-抗体-抗原-微球复合物；最后，二抗-抗体-抗原-微球复合物进行定容，获得检测液，并利用流式细胞仪对检测液进行检测，获得待测样本中的待测抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体各自对应的荧光信号强度，再根据利用检测校准品获得的抗原抗体相对浓度与荧光信号强度关系的标准曲线，以检测获得的待测样本中的待测抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体各自对应的荧光信号强度为基础，找到与之对应的抗原抗体相对浓度，从而获得待测样本中的待测抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体各自对应的浓度，完成对待测样本中抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体的相对浓度检测。
待测样本与混合液的反应时间可以是10-30min。经过试验分析，待测样本与混合液的反应时间控制在上述范围内时，检测获得的抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体的荧光信号强度呈现持续增长的趋势；当待测样本与混合液反应时间小于上述范围时，检测获得的抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体的荧光信号强度小于反应时间处于上述范围内时检测获得的抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体的荧光信号强度；当待测样本与混合液的反应时间大于上述范围时，检测获得的抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体的荧光信号强度增长趋势已减缓，且基本不变。因此，为了能够获得更加准确的待测样本中抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体的信息，待测样本与混合液的反应时间选择控制在10-30min的范围内。
优选的，待测样本与混合液的反应时间为20min。
抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液的反应时间可以是10-30min。经过试验分析，抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液的反应时间控制在上述范围内时，检测获得的抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体的荧光信号强度呈现持续增长的趋势；当抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液的反应时间小于上述范围时，检测获得的抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体的荧光信号强度小于反应时间处于上述范围内时检测获得的抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体的荧光信号强度；当抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液的反应时间大于上述范围时，检测获得的抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体的荧光信号强度增长趋势已减缓，且基本不变。因此，为了能够获得更加准确的待测样本中抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体的信息，抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液的反应时间选择控制在10-30min的范围内。
优选的，抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液的反应时间为20min。
优选的，混合液与待测样本、抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液的反应温度为37±1℃。
经过试验分析，反应温度为37℃时，检测获得的抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体的荧光信号强度均大于孵育温度为室温(18-25℃)时检测获得的抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体的荧光信号强度。因为，为了能够获得更加准确的待测样本中抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体的信息，孵育温度选择控制在37±1℃的范围内。
优选的，所述待测样本为全血样本。
优选的，所述待测样本为血清或血浆样本。
优选的，待测样本与混合液的添加比例为：每1μL待测样本对应加入50-500个抗原包备的荧光编码磁性微球。
优选的，待测样本的添加量为10-100μL。优选为50μL。
通过采用上述技术方案，经过试验分析，将待测样本与混合液的添加比例控制在上述范围内，能够保证最终检测获得较为准确的荧光信号强度，从而获得较为准确的抗体相对浓度。同理，将待测样本的添加量控制在上述范围内时，能够保证最终检测获得较为准确的荧光信号强度，从而获得较为准确的抗原抗体相对浓度。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
本申请提供的试剂盒能够单次同时完成待测样本中抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体的定性和定量检测。即通过一次检测，得出7个检测指标的检测结果。相比相关技术中的线性免疫印迹法只能提供定性/半定量检测结果，酶联免疫吸附法则是只能定量检测，本申请提供的试剂盒能够同时实现定性和定量检测。
具体实施方式
本申请提供了一种人自身免疫性肝病检测试剂盒，由LKM-1抗原、LC-1抗原、SLA抗原、AMA-M2抗原、Sp100抗原、Gp210抗原、ASMA抗原分别包被的荧光编码磁性微球的混合液；利用荧光素标记的二抗溶液；样本稀释液；微球清洗液；所述LC-1抗原包括抗原A和抗原B。
其中，上述LC-1抗原中，抗原A和抗原B按照重量比为(0.5-1.2)：(2.5-4)的比例包被荧光编码磁性微球。抗原A的序列如SEQ ID NO 1所示。抗原B的序列如SEQ ID NO 2所示。上述混合液中，LC-1抗原与荧光编码磁性微球的包被比例为：60-80μg的抗原包被1×107个磁性荧光编码微球。
上述二抗溶液中，包含抗人IgG抗体，抗人IgG抗体的浓度为10-50μg/ml。上述荧光素包括藻红蛋白(PE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物(PerCP)、别藻青蛋白(APC)。上述试剂盒的待测样本为全血样本或血清、血浆样本。上述混合液与待测样本的反应时间为10-30min。上述混合液与待测样本反应后的物质与二抗溶液的反应时间为10-30min。上述待测样本与混合液的添加比例为：每1μL待测样本对应加入50-500个抗原包备的荧光编码磁性微球。上述混合液与待测样本、抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液的反应温度为37±1℃。
以下结合实施例1-18、对比例1-10以及检测试验对本申请作进一步详细说明。
制备例
制备例1
本制备例提供了一种由LKM-1抗原、LC-1抗原、SLA抗原、AMA-M2抗原、Sp100抗原、Gp210抗原、ASMA抗原分别包被的荧光编码磁性微球的混合液。该混合液制备方法具体包括以下步骤：
(1)预处理：
获取微球：分别取100μL荧光编码磁性微球悬浮液(约1×107个微球)于3个离心管中，并将7个离心管置于磁力架，进行磁性吸附，分离弃去上清液；
微球洗涤与重悬：分别向7个离心管中加入200μL微球洗涤液，涡旋10s，并将离心管置于磁力架，进行磁性吸附，分离弃去上清液；继续重复洗涤两次；分别向7个离心管中加100μL微球洗涤液重悬微球，涡旋10s以混匀微球，获得7个微球重悬液A。
(2)活化：
活化微球：分别向7个微球重悬液A中加入10μL活化剂溶液，涡旋10s后，室温下避光反应20-30min，并将7个离心管置于磁力架，进行磁性吸附，分离弃去上清液；
活化后微球的洗涤与重悬：分别向7个离心管中加入200μL微球洗涤液，涡旋10s，并将7个离心管置于磁力架，进行磁性吸附，分离弃去上清液；继续重复洗涤两次；分别向7个离心管中加入100μL微球洗涤液重悬微球，涡旋10s以混匀微球，获得7个微球重悬液B。
(3)包被：
微球包被：分别向7个微球重悬液B中加入LKM-1抗原、LC-1抗原、SLA抗原、AMA-M2抗原、Sp100抗原、Gp210抗原、ASMA抗原，加入量均为30μg；涡旋混匀后，室温下避光反应24h；将反应后的7个离心管置于磁力架，进行磁性吸附，分离弃去上清液；
包被后封闭：分别向7个离心管中加入等体积的封闭液，进行封闭反应，室温下避光封闭4h，将反应后的7个离心管置于磁力架，进行磁性吸附，分离弃去上清液；
包被后微球的洗涤与重悬：分别向7个离心管中加入200μL微球保存缓冲液，涡旋10s，将7个离心管置于磁力架，进行磁性吸附，分离弃去上清液；继续重复洗涤两次；分别向7个离心管中加入1ml微球保存缓冲液重悬微球，涡旋10s以混匀微球，获得7种荧光编码磁性微球重悬液。
(4)保存：分别将7种荧光编码磁性微球重悬液置于2-8℃避光保存；将7种荧光编码磁性微球重悬液按1：1：1：1：1：1：1的比例混合，即为混合液。
制备例2-14
制备例2-14分别提供了一种由LKM-1抗原、LC-1抗原、SLA抗原、AMA-M2抗原、Sp100抗原、Gp210抗原、ASMA抗原分别包被的荧光编码磁性微球的混合液。
制备例2-9与制备例1的不同之处在于制备方法的包被步骤中LC-1抗原的抗原A与抗原B的添加比例。
制备例3、10-14与制备例1的不同之处在于制备方法的包被步骤中LC-1抗原的添加量。
上述不同之处具体如表1所示。
表1制备例1-14中各抗原的加入量
Figure BDA0003566942010000091
Figure BDA0003566942010000101
制备例15-24
制备例15-24分别提供了一种由LC-1抗原包被的荧光编码磁性微球的混合液。制备例15-24与制备例1的不同之处在于制备方法的包被步骤中加入的抗原种类及其加入量。具体如表2所示。
其中，制备例15-19的不同之处在于制备方法的包被步骤中LC-1抗原的抗原A与抗原B的添加比例。
制备例20-24与制备例16的不同之处在于制备方法的包被步骤中LC-1抗原的添加量。
表2制备例15-22中LC-1抗原的加入量
Figure BDA0003566942010000102
Figure BDA0003566942010000111
制备例25
本制备例提供了一种利用荧光素标记的二抗溶液。该利用荧光素标记的二抗溶液的制备方法具体包括以下步骤：
1.配制PBS-TNP溶液，配方如下：
将Na2HPO4·12H2O 2.9g、KH2PO4 0.2g、NaCl 8g、KCl 0.2g、DI H2O 0.9L混合，并加入T-20 0.2ml、PC-300 0.5ml、BSA 1g；调pH至7.4，然后利用无菌水定容至1L。
2.将配制好的PBS-TNP溶液，将用荧光素标记的二抗溶液以1：10000的比例稀释，使终浓度为5ug/ml。
制备例26-29
制备例26-29分别提供了利用荧光素标记的二抗溶液。制备例26-29与制备例25的不同之处在于：利用荧光素标记的二抗溶液的终浓度。具体如表3所示。
表3制备例25-29中利用荧光素标记的二抗溶液的终浓度
制备例 终浓度(ug/ml)
25 5
26 10
27 20
28 50
29 60
实施例
实施例1-18
实施例1-18分别提供了一种人自身免疫性肝病检测试剂盒。实施例1-18的不同之处在于其中的混合液和利用荧光素标记的二抗溶液。具体如表4所示。
上述提供的人自身免疫性肝病检测试剂盒的组分如下：
由LKM-1抗原、LC-1抗原、SLA抗原、AMA-M2抗原、Sp100抗原、Gp210抗原、ASMA抗原分别包被的荧光编码磁性微球的混合液；利用荧光素标记的二抗溶液；样本稀释液；微球清洗液。
表4实施例1-18中混合液和二抗溶液的种类
Figure BDA0003566942010000121
对比例
对比例1-10
对比例1-10分别提供了一种人自身免疫性肝病检测试剂盒。对比例1-10与实施例1的不同之处在于组分中的混合液。具体如表5所示。
表5对比例1-10中混合液和二抗溶液的种类
Figure BDA0003566942010000131
检测试验一
分别利用上述实施例1-18以及对比例1-10提供的人自身免疫性肝病检测试剂盒进行待测样本的检测。
待测样本的类型分别为1-阳性+++、2-阳性++、3-阳性+、4-阴性。
上述人自身免疫性肝病检测试剂盒的检测方法如下：
(1)利用样本稀释液对待测样本进行稀释，获得稀释样；
(2)将步骤(1)获得的稀释样与混合液混合，37℃反应20min，获得抗体-抗原-微球复合物；
(3)利用微球清洗液对步骤(2)获得的抗体-抗原-微球复合物进行清洗，并去除微球清洗液；
(4)将步骤(3)清洗后的抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液混匀，37℃反应20min，获得标记后的二抗-抗体-抗原-微球复合物；
(5)利用微球清洗液对步骤(4)获得的二抗-抗体-抗原-微球复合物进行清洗，并去除微球清洗液；
(6)利用微球清洗液对步骤(5)清洗后的二抗-抗体-抗原-微球复合物重悬，进行上样检测，并分析检测结果。
检测结果如表6、表7所示。
表6利用实施例1-18提供的试剂盒的检测结果
Figure BDA0003566942010000141
结合表6，通过对比实施例1-5的检测结果可知，在保持LC-1抗原中A抗原的添加量不变的条件下，调整B抗原的添加量，由检测结果可知，当抗原A与抗原B的比例控制在1：(2.5-4)的范围内时，能够提高对LC-1抗体检测结果的准确性。尤其是当将抗原A与抗原B的比例控制在1：(3-4)的范围内时，能够进一步提高LC-1抗体检测结果的准确性。
通过对比实施例3以及实施例6-9的检测结果可知，在保持LC-1抗原中B抗原的添加量不变的条件下，调整A抗原的添加量，由检测结果可知，当抗原A与抗原B的比例控制在(0.5-1.2)：3的范围内时，能够提高对LC-1抗体检测结果的准确性。尤其是当将抗原A与抗原B的比例控制在(0.5-1.0)：3的范围内时，能够进一步提高LC-1抗体检测结果的准确性。基于上述，本申请将LC-1抗原中A抗原和B抗原的添加比例控制在(0.5-1.2)：(2.5-4)的范围内。
通过对比实施例3、10-14的检测结果可知，在保持LC-1抗原中A抗原和B抗原的添加比例不变的条件下，调整LC-1抗原整体的添加量，由检测结果可知，当LC-1抗原整体的添加量控制在60-80μg的范围内时，能够提高对LC-1抗体检测结果的准确性。尤其是当将LC-1抗原的添加量控制在60-70μg的范围内时，能够进一步提高LC-1抗体检测结果的准确性。
通过对比实施例12、15-18的检测结果可知，在保持LC-1抗原中A抗原和B抗原的添加比例不变的条件下，利用荧光素标记的二抗溶液的终浓度，由检测结果可知，当二抗溶液的终浓度控制在20-60μg的范围内时，能够提高对LC-1抗体检测结果的准确性。尤其是当二抗溶液的终浓度控制在20-50μg的范围内时，能够进一步提高LC-1抗体检测结果的准确性。尤其是，当二抗溶液的终浓度为20μg时，待测样本中LC-1抗体检测结果的准确性最佳。
表7利用对比例1-10提供的试剂盒的检测结果
Figure BDA0003566942010000151
结合表7，通过对比对比例1-3的检测结果可知，在保持LC-1抗原中B抗原的添加量不变的条件下，调整A抗原的添加量，由检测结果可知，当抗原A与抗原B的比例控制在1：1的范围内时，能够提高对LC-1抗体检测结果的准确性。通过对比对比例2以及对比例4-5的检测结果可知，在保持LC-1抗原中A抗原的添加量不变的条件下，调整B抗原的添加量，由检测结果可知，当抗原A与抗原B的比例控制在1：1的范围内时，能够提高对LC-1抗体检测结果的准确性。
通过对比对比例2、6-10的检测结果可知，在保持LC-1抗原中A抗原和B抗原的添加比例不变的条件下，调整LC-1抗原整体的添加量，由检测结果可知，当LC-1抗原整体的添加量控制在40-50μg的范围内时，能够提高对LC-1抗体检测结果的准确性。
进一步地，通过对比实施例1-14以及对比例1-10的检测结果可知，本申请将LC-1抗原中A抗原和B抗原的添加比例控制在(0.5-1.2)：(2.5-4)的范围内，LC-1抗原的整体添加量控制在60-80μg的范围内时，能够提高对LC-1抗体检测结果的准确性。
检测试验二
分别利用上述实施例12提供的人自身免疫性肝病检测试剂盒进行待测样本的检测。
检测方法与“检测试验一”的不同之处在于两次反应的条件。具体如表8所示。
表8检测试验二中两次反应的条件
Figure BDA0003566942010000161
Figure BDA0003566942010000171
待测样本的类型同“检测试验一”。检测结果如表9所示。
表9不同反应条件下的检测结果
Figure BDA0003566942010000172
结合表9，通过编号1-4检测结果的对比可知，待测样本稀释后的稀释样与混合液的反应温度、抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液的反应温度，均控制在37℃的条件下比室温条件更能够提高待测样品中LC-1抗体检测结果的准确性。
通过对比编号4-8的检测结果可知，待测样本稀释后的稀释样与混合液的反应温度为37℃、反应时间为20-40min时，能够进一步提高待测样品中LC-1抗体检测结果的准确性。通过对比编号4、9-12的检测结果可知，抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液的反应温度为37℃、反应时间为20-40min时，也能够进一步提高待测样品中LC-1抗体检测结果的准确性。
因此，本申请将待测样本稀释后的稀释样与混合液的反应温度、抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液的反应温度，均控制在37℃，且反应时间均控制在20-40min的范围内为宜。
检测试验三
分别利用上述实施例12提供的人自身免疫性肝病检测试剂盒进行待测样本的检测。
检测方法与“检测试验一”的相同。
待测样本总计20个，其中，5个来源于正常人；15个来源于自身免疫性肝病(由医院提供；包括AIH-1患者2例，AIH-2患者2例，AIH-3患者1例，PBC患者4例，PSC患者3例，重叠综合征患者3例)。
抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA抗体、抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体和抗ASMA抗体的正常参考范围均为不大于20RU/mL。
检测结果如表10所示。
表10利用实施例12提供的试剂盒对20种待测样本的检测结果
Figure BDA0003566942010000181
Figure BDA0003566942010000191
结合表10的检测结果可知，编号15-20为正常人的血清样本的检测结果，7项检测指标的检测结果均为阴性，测试结果不大于20RU/mL。
编号1-5的检测结果中，抗ASMA抗体、抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA/LP抗体表现出阳性结果。AIH是一种病因尚不明确，且由免疫介导、累及肝实质的疾病。根据血清自身抗体不同，AIH可分为2种亚型，AIH-1和AIH-2，以抗ASMA抗体、抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA/LP抗体的阳性为特征，其中抗ASMA抗体是AIH-1的高特异性的自身抗体。AIH患者血清中可具有一种或同时具有多种自身抗体。
编号8、9、11、14的检测结果中，抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体表现出阳性结果。PBC是一种慢性肝内胆汁淤积性疾病，多发于女性，以抗AMA-M2抗体、抗Sp100抗体、抗Gp210抗体的阳性为特征，上述3种自身抗体对PBC均具有较高的特异性，且抗Sp100抗体、抗Gp210抗体对抗AMA-M2抗体阴性患者的PBC确诊具有极重要的意义。通过本申请提供的试剂盒及对待测样本的检测结果可知，编号8、9、11、14符合PBC患者的临床诊断，为PBC患者的血清样本的检测结果。
编号7、10、15的检测结果中，抗Sp100抗体、抗Gp210抗体表现出阳性结果。PSC是一种以特发性肝内外胆管炎症和纤维化导致多灶性胆管狭窄为特征慢性胆汁淤积病变为主要临床表现的自身免疫性肝病，目前仍未发现该病的特有的自身抗体，但依然可在患者血清中检测到自身抗体，如抗Sp100抗体、抗Gp210抗体，自身抗体的阳性仍可提示自身免疫性肝病，但具体的分型诊断需结合其他临床表现。通过本申请提供的试剂盒及对待测样本的检测结果可知，编号7、10、15符合PSC患者的临床诊断，为PSC患者的血清样本的检测结果。
编号6、12、13的检测结果中，抗LKM-1抗体、抗SLA/LP抗体、抗AMA-M2抗体、抗Gp210抗体表现出阳性结果。OS是指患者在患病时或在病程的某一阶段，同时具有2种自身免疫性肝病的临床或实验室特点，其中以AIH-PBC OS较为常见，OS患者血清中可同时出现AIH和PBC 2种疾病的自身抗体阳性。通过本申请提供的试剂盒及对待测样本的检测结果可知，编号6、12、13符合OS患者的临床诊断，为OS患者的血清样本的检测结果。例如编号12，表现为抗LKM-1抗体(AIH)、抗Gp210抗体(PBC)、抗AMA-M2抗体阳性，符合同时拥有AIH和PBC两种自身免疫性肝病的实验室特点，故判断编号12为OS患者的血清样本。编号13同理。自身免疫性肝病是一种发病机制和临床表现极为复杂的疾病，其确诊不仅需要自身抗体的检测。虽然自身抗体的联合检测提高了诊断的敏感性及准确性，但仍同时需要结合临床表现及其他生化指标的检测。例如编号6，表现为抗SLA/LP抗体阳性，进一步结合临床表现及其他生化指标的检测结果，判断出编号6为OS患者的血清样本。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
序列表
<110> 北京胡曼智造科技有限责任公司
南京辰光医疗科技有限公司
<120> 一种人自身免疫性肝病检测试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 541
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ser Gly Leu Val Gly Cys Val Pro Ala Pro Ser Gly Gly Leu Ala
1 5 10 15
Gly Gly Val Ile Ala Ala Ile Ser Gly Ala Ile Thr Gly Thr Pro Gly
20 25 30
Cys Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Gly Pro Ser Thr Ala Ala Thr Val
35 40 45
Thr Thr Pro Val Gly Pro Pro Gly Cys Val Val Gly Gly Ala Leu Ala
50 55 60
Ala Ala Ala Val Ala Ser Ala Leu Ile Ala Met Ser Ala His Gly Gly
65 70 75 80
Gly His Pro Ala Met Gly Ala Leu Ala Val Cys Pro Pro Ile Pro Val
85 90 95
Ala Gly Val Ser Val Ala Gly Cys Val Leu Cys Ala Gly Ala Pro Gly
100 105 110
Gly Ala Leu Ala Gly Gly Leu Ala Val Pro Val Thr Leu Thr Gly Gly
115 120 125
Ala Ala Ala Met Ala Ser Ala Ala Thr Leu Pro Ala Ile Ala Ala Gly
130 135 140
Gly Thr Gly Ala Leu Pro Leu Leu Leu Gly Gly Ala Ala Thr Ala Pro
145 150 155 160
Ala Pro Gly Pro Ser Ser Pro Val Pro Ser Thr Gly Ala Thr Ala Thr
165 170 175
Gly Ala Ala Leu Pro Leu Ile Ala Pro Ala Ile Ala Leu Leu Gly Thr
180 185 190
Leu Gly Gly Ala His Ala Ile Ala Leu Ala Leu Ala Gly Gly Gly Ala
195 200 205
Gly Leu Ala Gly Pro Gly Ala Leu Leu Leu Val Gly Gly Ile Gly Thr
210 215 220
Thr Leu Ala Gly Leu Ala Leu Ala Gly Val Ser Thr Ala Leu Leu Ala
225 230 235 240
Pro Gly Val Thr Ala Leu His Thr Val Thr Gly Gly Thr Cys Ala Gly
245 250 255
Ala Gly Gly Leu Ser Leu Pro Val Val Gly Ser Gly Leu Val Gly Leu
260 265 270
Val Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Ala Ala Ala Pro Thr Cys Gly Leu
275 280 285
Gly Ala Leu Pro Ile Leu Gly Gly Gly Gly Ala Ile Ala Leu Val Val
290 295 300
Ser Ala Leu Gly Leu Ala Ser Leu Cys Pro Pro Ser Pro Leu Gly Ala
305 310 315 320
Ile Ile Gly Thr Leu Val Pro Gly Ala Gly Pro Gly Ala Gly Leu Gly
325 330 335
Ser Leu Ser Leu Ala Ala Pro Val Gly Gly Val Gly Ala Ala Ser Ala
340 345 350
Ala Pro Gly Gly Gly Ser Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Met Gly Ala
355 360 365
Ala Leu Gly Ser Met Val Gly Leu Met Thr Thr Gly Ala Ala Gly Pro
370 375 380
Gly Ser Leu Ala Thr Thr Met Ala Ala Leu Ile Pro Pro Pro Ala Gly
385 390 395 400
Ala Ser Ala Leu Leu Thr Thr Leu Val Ala Ala Ala Ala Gly Ala Pro
405 410 415
Thr Ala Thr Leu Gly Ala Met Ala Leu Pro Leu Ala Thr Pro Gly Gly
420 425 430
Leu Ala Ala Ala Thr Ala Ala Leu Gly Gly Gly Leu Ala Ala Ala Val
435 440 445
Ser Val Pro Leu Thr Leu Ala Gly Thr Val Ala Ser Leu Thr Pro Ala
450 455 460
Leu Gly Gly Leu Ala Ala Cys Gly Ala Leu Ala Cys Ala Ser Ala Leu
465 470 475 480
Gly Val Ala Ala Leu Ala Leu Gly Met Gly Val Pro Gly Ala Thr Pro
485 490 495
Ala Val Leu Ile Ala Leu Ala Ala Ile Thr Ala Gly Ala Pro Leu Ala
500 505 510
Gly Ile His His Ala Val Ser Ser Leu Leu Gly Gly Ala Leu Thr Gly
515 520 525
Ala Ala Leu Val Leu Ala Cys Leu Gly Thr Ala Gly Gly
530 535 540
<210> 2
<211> 363
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Leu Pro Leu Ile Ala Pro Ala Ile Ala Leu Leu Gly Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ala His Ala Ile Ala Leu Ala Leu Ala Gly Gly Gly Ala Gly Leu
20 25 30
Ala Gly Pro Gly Ala Leu Leu Leu Val Gly Gly Ile Gly Thr Thr Leu
35 40 45
Ala Gly Leu Ala Leu Ala Gly Val Ser Thr Ala Leu Leu Ala Pro Gly
50 55 60
Val Thr Ala Leu His Thr Val Thr Gly Gly Thr Cys Ala Gly Ala Gly
65 70 75 80
Gly Leu Ser Leu Pro Val Val Gly Ser Gly Leu Val Gly Leu Val Pro
85 90 95
Leu Leu Ala Leu Leu Ala Ala Ala Ala Pro Thr Cys Gly Leu Gly Ala
100 105 110
Leu Pro Ile Leu Gly Gly Gly Gly Ala Ile Ala Leu Val Val Ser Ala
115 120 125
Leu Gly Leu Ala Ser Leu Cys Pro Pro Ser Pro Leu Gly Ala Ile Ile
130 135 140
Gly Thr Leu Val Pro Gly Ala Gly Pro Gly Ala Gly Leu Gly Ser Leu
145 150 155 160
Ser Leu Ala Ala Pro Val Gly Gly Val Gly Ala Ala Ser Ala Ala Pro
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Met Gly Ala Ala Leu
180 185 190
Gly Ser Met Val Gly Leu Met Thr Thr Gly Ala Ala Gly Pro Gly Ser
195 200 205
Leu Ala Thr Thr Met Ala Ala Leu Ile Pro Pro Pro Ala Gly Ala Ser
210 215 220
Ala Leu Leu Thr Thr Leu Val Ala Ala Ala Ala Gly Ala Pro Thr Ala
225 230 235 240
Thr Leu Gly Ala Met Ala Leu Pro Leu Ala Thr Pro Gly Gly Leu Ala
245 250 255
Ala Ala Thr Ala Ala Leu Gly Gly Gly Leu Ala Ala Ala Val Ser Val
260 265 270
Pro Leu Thr Leu Ala Gly Thr Val Ala Ser Leu Thr Pro Ala Leu Gly
275 280 285
Gly Leu Ala Ala Cys Gly Ala Leu Ala Cys Ala Ser Ala Leu Gly Val
290 295 300
Ala Ala Leu Ala Leu Gly Met Gly Val Pro Gly Ala Thr Pro Ala Val
305 310 315 320
Leu Ile Ala Leu Ala Ala Ile Thr Ala Gly Ala Pro Leu Ala Gly Ile
325 330 335
His His Ala Val Ser Ser Leu Leu Gly Gly Ala Leu Thr Gly Ala Ala
340 345 350
Leu Val Leu Ala Cys Leu Gly Thr Ala Gly Gly
355 360

Claims (10)

1.一种人自身免疫性肝病检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
由LKM-1抗原、LC-1抗原、SLA抗原、AMA-M2抗原、Sp100抗原、Gp210抗原、ASMA抗原分别包被的荧光编码磁性微球的混合液；
利用荧光素标记的二抗溶液；
样本稀释液；
微球清洗液；
所述LC-1抗原包括抗原A和抗原B。
2.根据权利要求1所述的人自身免疫性肝病检测试剂盒，其特征在于，所述抗原A和抗原B按照重量比为（0.5-1.2）：（2.5-4）的比例包被荧光编码磁性微球。
3.根据权利要求1所述的人自身免疫性肝病检测试剂盒，其特征在于，所述抗原A的序列如SEQ ID NO 1所示。
4.根据权利要求1所述的人自身免疫性肝病检测试剂盒，其特征在于，所述抗原B的序列如SEQ ID NO 2所示。
5.根据权利要求1所述的人自身免疫性肝病检测试剂盒，其特征在于，所述混合液中，LC-1抗原与荧光编码磁性微球的包被比例为：60-80μg的抗原包被1×107个磁性荧光编码微球。
6.根据权利要求1所述的人自身免疫性肝病检测试剂盒，其特征在于，所述二抗溶液中，包含抗人IgG抗体，抗人IgG抗体的浓度为10-50μg/ml。
7.根据权利要求1所述的人自身免疫性肝病检测试剂盒，其特征在于，所述荧光素包括藻红蛋白（PE）、异硫氰酸荧光素（FITC）、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物（PerCP）、别藻青蛋白（APC）。
8.根据权利要求1所述的人自身免疫性肝病检测试剂盒，其特征在于，所述混合液与待测样本的反应时间为10-30min。
9.根据权利要求1所述的人自身免疫性肝病检测试剂盒，其特征在于，所述混合液与待测样本反应后的物质与二抗溶液的反应时间为10-30min。
10.根据权利要求1所述的人自身免疫性肝病检测试剂盒，其特征在于，所述混合液与待测样本、抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液的反应温度为37±1℃。
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