CN117347632A - 一种检测尿液中hiv1.2抗体的试纸条及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明利用乳胶法免疫层析技术检测尿液中HIV1.2抗体，属于免疫诊断技术领域。一种检测尿液中HIV1.2抗体的试纸条及其制备方法，检测试纸条主要包括PVC底板，样品垫、乳胶垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；并按照层析方向依次固定于PVC底板上，乳胶垫上包含乳胶颗粒标记的HIV I型和HIV II型抗原以及胶体金标记的鸡IgY，硝酸纤维素膜上包被羊抗鸡IgY质控线和抗人IgG单抗检测线。本发明针对尿液样本具有操作简单、使用方便、反应灵敏高且无创检测即可完成结果判定。

Description

一种检测尿液中HIV1.2抗体的试纸条及其制备方法
技术领域
本发明利用乳胶法免疫层析技术检测尿液中HIV1.2抗体，属于免疫诊断技术领域。
背景技术
人体免疫缺陷病毒(艾滋病毒)感染是全世界发病率和死亡率的主要原因之一，大多数疾病集中在撒哈拉以南非洲。由于艾滋病毒感染往往发生在经济生产力处于鼎盛时期的成年人身上，因此艾滋病毒感染极大地改变了许多国家的经济艾滋病毒包括多种病毒，包括I型艾滋病毒(HIV-1)和II型艾滋病毒。艾滋病毒-1比艾滋病毒-2更普遍，致病性更强，是造成绝大多数全球流行病的原因。
目前已有国内厂家通过酶联免疫法、荧光免疫层析法和胶体金法技术研发出人类免疫缺陷病毒尿液抗体检测试剂盒。因酶联免疫法和荧光免疫层析法需要借助相关仪器设备，且步骤复杂，限制了非专业人士的使用。胶体金法采用物理吸附的方法结合，标记抗原容易从金颗粒表面脱离，标记物不稳定，易造成灵敏度低和特异性差的情况。
目前已有的HIV尿液抗体检测试剂盒无法满足市场的需求。乳胶法以乳胶颗粒作为载体的一种凝集反应，具有显色速度快，灵敏度高的特点。因此，本发明具有一定优势的基于乳胶法检测尿液中HIV1.2抗体的试纸条。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测尿液中HIV1.2抗体试纸条，具有操作简单、使用方便，可用于家庭检测；无创检测可避免因采血困难等情况。HIV尿液乳胶检测试纸条的制备方法，适用于工业化生产，HIV尿液检测试纸条的应用方法，简单实用。
本发明利用乳胶法免疫层析技术检测尿液中HIV1.2抗体，属于免疫诊断技术领域。一种检测尿液中HIV1.2抗体的试纸条及其制备方法，检测试纸条主要包括PVC底板，样品垫、乳胶垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；并按照层析方向依次固定于PVC底板上，乳胶垫上包含乳胶颗粒标记的HIV I型和HIV II型抗原以及胶体金标记的鸡IgY，硝酸纤维素膜上包被羊抗鸡IgY质控线和抗人IgG单抗检测线。本发明针对尿液样本具有操作简单、使用方便、反应灵敏高且无创检测即可完成结果判定。
利用检测试纸条，可以检测含有HIV抗体的尿液样本。将尿液样本用试纸条进行检测，当检测线T和质控线C均出现带有颜色的条带，说明样本中含有HIV病毒(是1型或是2型中的一种，或是1型和2型)；若仅有质控线C出现紫色条带，说明样本不含HIV病毒；若质控线C没有出现紫色条带，则说明该试纸条失效。
检测试纸所运用的原理为间接法乳胶免疫层析，当样本中含有HIV病毒抗体，加样后该抗体会先与标记垫中的HIV抗原-乳胶颗粒结合，形成抗原-抗体复合物，随着层析过程的进行，该复合物会被包被在硝酸纤维素膜上的抗人IgG单克隆抗体捕获，形成抗人IgG单克隆抗体-HIV抗体-HIV抗原-乳胶颗粒，颜色呈红色，清晰可辨，且不需要任何辅助设备，操作方便。
进一步的，乳胶垫由标记用HIV I型抗原-乳胶颗粒、HIV II型抗原-乳胶颗粒、鸡IgY-胶体金偶联物的混合后，烘干后制得。
作为进一步优选，所述乳胶颗粒直径为200-400nm，此处标记后HIV I型抗原-乳胶颗粒偶联物的使用浓度应为0.15-0.4％，标记后HIV II型抗原-乳胶颗粒偶联物的使用浓度应为0.1-0.3％。所述胶体金颗粒直径为40-100nm，此处标记后的鸡IgY-胶体金偶联物的使用浓度应为OD15-OD30。
乳胶颗粒大小的不同会影响产品的性能、标记偶联物的稳定性以及标记偶联物的颜色。胶体金颗粒大小的不同也会影响产品的性能、颗粒大小＜40nm颜色偏红，灵敏度较弱；而颗粒大小＞100nm颜色偏黑，形状不均匀，及其容易沉淀，因此胶体金颗粒粒径为40-100nm最为合适。将HIV抗原用380nm乳胶颗粒标记成HIV I型抗原-乳胶颗粒偶联物和HIVII型抗原-乳胶颗粒偶联物，将鸡IgY用70nm胶体金颗粒标记成鸡IgY-胶体金偶联物，并同时按吸光度为0.1％，0.15％，0.2％，0.25,％，0.3％，0.4％，OD10，OD15，OD20，OD25，OD30的混合液处理到玻璃纤维上，置于烘箱设备中过夜(12-24小时)。用人类免疫缺陷病毒抗体试剂国家标准品进行测试，15-20分钟读数结果显示HIV I型抗原-乳胶颗粒偶联物的使用浓度0.15％-0.4％时，HIV II型抗原-乳胶颗粒偶联物的使用浓度0.1％-0.3％时，鸡IgY-胶体金颗粒偶联物的使用浓度0D15-OD30时，灵敏度和特异性效果最佳。
作为优选，所述检测线T包被的包被用抗人IgG单克隆抗体浓度为1.0-3.0mg/ml。当包被用抗人IgG单克隆抗体浓度低于1.0mg/ml时，反应过程中，样本中HIV抗体被抗人IgG单克隆抗体捕获不充分，临床上出现漏检情况。同时，当包被用抗人IgG单克隆抗体浓度高于3.0mg/ml，样本中的杂蛋白在层析过程中会被非特异性捕获，临床上会出现假阳性风险，因此检测线T包被用抗人IgG单克隆抗体使用范围在1.0-3.0mg/ml，灵敏度和特异性效果最佳。
作为优选，所述质控线C包被的羊抗鸡IgY使用浓度为1.0-2.0mg/ml。当质控线C包被用羊抗鸡IgY浓度低于1.0mg/ml，反应过程中，微球探针处理垫中的胶体金颗粒-鸡IgY抗体偶联物和羊抗鸡IgY结合不充分，临床上出现质控线偏弱的问题。当质控线包被用羊抗鸡IgY浓度高于2.0mg/ml，处理到硝酸纤维素膜上的包被用羊抗鸡IgY因溢量会出现堆积现象，影响整体美观。因此质控线C包被用包被用羊抗鸡IgY的最佳浓度范围为1.0mg/ml-2.0mg/ml，线条显色均一。
作为优选，抗人IgG单克隆抗体包被的检测线T中还含有10mg/ml海藻糖溶液、3-7％BSA封闭液。当封闭剂使用浓度低于3％时，反应过程中，封闭液与非特异性抗体结合不充分，临床上会存在假阳风险，当封闭液使用浓度高于7％时，会造成试纸条出现中空现象；当封闭液使用浓度为3％-7％时，封闭液可以与非特异性位点结合，可提高与非特异性抗体的结合，从而有效避免造成假阳的结果，可提高特异性。
作为优选，样品垫由10-20g/L Tris、5-10g/L Casein、5-10g/L PVP、5-10g/L S21表面活性剂、5-10g/L S19表面活性剂、5-10g/L EDTA、0.05-0.1mg/ml阻断剂、2-3g/L 2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱一类的聚合物和纯化水,用NaOH将pH值调至pH 9.0-10.0的样品垫处理液处理后所得。
样品垫处理液中添加S21表面活性剂可以提高蛋白的稳定性，进而增加尿液中的蛋白与标记垫表面受体蛋白的结合，从而提高灵敏度；添加S19表面活性剂可以降低与杂质蛋白的非特异性位点结合，减少尿液样本检的基质效应，提高特异性；添加Casein可以起到稳定作用，也可以吸附杂质蛋白，减少杂质蛋白非特异性结合，提高特异性；添加PVP有助于样本的均匀释放并保持均匀分布，从而提高层析的分离效果和灵敏度；2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱一类的聚合物可抑制蛋白质的非特异性吸附，也可有效避免尿液中的靶物质被吸附在玻璃纤维中，从而提高产品灵敏度。
样品垫的pH值为pH 9.0-10.0。对于尿液样本不同的pH值会影响产品的灵敏度和特异性。当pH值低于pH 9.0时，临床上容易出现假阳情况；当pH值高于pH 10.0时，临床上容易出现漏检情况，因此，样品垫的pH值在pH 9.0-10.0时，灵敏度和特异性效果最佳。
本发明还提供一种上述检测尿液中HIV1.2抗体试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1)包被液的制备和喷印检测线T、质控线C：分别将1.0-3.0mg/ml的抗人IgG单克隆抗体、10mg/ml海藻糖溶液、3％ BSA封闭液、混合得检测线T包被液；将1.0-2.0mg/ml的羊抗鸡IgY抗体、10mg/ml海藻糖溶液、混合得质控线C包被液；分别将检测线T包被液、质控线C包被液以0.8-1.2μl/cm的速度喷点于硝酸纤维素膜上分别作为检测线和质控线，烘干，制得检测线和质控线；
2)乳胶标记垫的制备：将乳胶颗粒标记的HIV I型抗原、乳胶颗粒标记的HIV II型抗原稀释到浓度分别为0.15-0.4％和0.1-0.3％，将鸡IgY抗体稀释到浓度为OD15-OD30，混合，以2.0-3.0μl/cm的速度喷点在玻璃纤维上，烘干，制得标记处理的乳胶垫；
3)样品垫处理液的配制：加入10-20g/L Tris、5-10g/L Casein、5-10g/L PVP、5-10g/LS21表面活性剂、5-10g/L S19表面活性剂、5-10g/L EDTA、0.05-0.1mg/ml阻断剂、2-3g/L 2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱一类的聚合物和纯化水,用NaOH将pH值调至pH9.0-10.0。称量10-20g/L Tris、5-10g/L Casein、5-10g/L PVP、5-10g/L S21表面活性剂、5-10g/L S19表面活性剂、5-10g/L EDTA、0.05-0.1mg/ml阻断剂、2-3g/L 2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱一类的聚合物和纯化水,用NaOH将pH值调至9.0-10.0；
4)样品垫的处理：将空白片状玻璃纤维浸泡在样品垫处理液中，取出放置烘箱设备中12-24h；
5)制备检测试纸：将吸水垫、样品垫、标记处理的乳胶垫、包被好质控线和检测线的硝酸纤维素膜及PVC底板按顺序进行连接组装。在PVC底板上先粘贴NC膜，乳胶垫安设于NC膜的一端并且使其压住NC膜1-1.5mm，并且使样品垫压住乳胶垫2mm，吸水纸安设于NC膜的另一端且使其压住NC膜2mm；在用切纸机将其裁切呈宽为不小于2.5mm的条状，保存备用。
作为优选，所述纯化的T乳胶标记液(乳胶颗粒标记的HIV I型抗原)的制备过程为：
清洗：选取羧基化的红色乳胶颗粒，并采用1.8-2.2mg/ml磷酸氢二钠和8.6-8.8mg/ml氯化钠的混合液进行清洗；
标记反应：将标记用HIV I型抗原加入到已清洗过的红色乳胶颗粒中，标记比例为1:40-1:10，同时加入0.5-1.5mg/mlEDC活化物，恒温反应12-24h后，加入1.0-1.2mg/ml终止液，离心后加入保存液并超声2-3min，得到HIV I型抗原-乳胶颗粒偶联物。
所述纯化的T乳胶标记液(乳胶颗粒标记的HIV II型抗原)的制备过程为：。
清洗：选取羧基化的红色乳胶颗粒，并采用1.8-2.2mg/ml磷酸氢二钠和8.6-8.8mg/ml氯化钠的混合液进行清洗；
标记反应：将标记用HIV II型抗原加入到已清洗过的红色乳胶颗粒中，标记比例为1:40-1:10，同时加入0.5-1.5mg/mlEDC活化物，恒温反应12-24h后，加入1.0-1.2mg/ml终止液，离心后加入保存液并超声2-3min，得到HIV II型抗原-乳胶颗粒偶联物。
红色乳胶颗粒大小一般200-400nm，采用羧基化微球，先对微球进行清洗，然后加入EDC活化物(EDC和Sulfo-NHS)进行活化，加入待标记的HIV抗原进行反应，封闭未反应的微球活性表面，最后超声，并用紫外风光光度计检测偶联物的浓度，用百分比表示。在整个反应阶段，乳胶颗粒偶联物起显色作用，且由于偶联过程中，羧基和氨基酸的结合主要是通过化学键反应。因此和胶体金比，标记更加稳定，不容出现死金、漂金或金标沉淀现象。
偶联过程中，EDC活化物的含量非常重要，其含量过多、过少都会影响最终标记物的效价，在HIV抗原和乳胶抗体的偶联物过程中，分别加入0.1％，0.5％，1％，1.5％，2％，3％EDC，偶联物最终浓度均大于0.9％，将偶联物稀释到0.2％，以2.5μl/cm的速度处理到玻璃纤维上，于电热鼓风干燥机中烘制过夜(12-24小时)，用HIV人类免疫缺陷病毒抗体试剂国家参考品进行测试，15-20分钟读数结果显示EDC的浓度范围在0.5-1.5mg/ml结果最佳。
作为进一步优选，恒温反应温度为25-28℃。反应过程中的温度控制需要非常严格，因为反应温度范围会影响检测试纸最终测试的结果准确性，活化能EDC的活化效果需要在规范的温度范围内，研究发现25-28℃条件下，EDC的活化效果最佳，乳胶颗粒和抗原的偶联也最充分。
作为进一步优选，终止液为质量分数1-1.2mol/L的乙醇胺，所述保存液为5.8-6.2mg/ml Tris及5-5.2mg/ml Casein的混合液。
作为优选，所述纯化的C金标标记液的制备过程为：
a)获得胶体金：在98-102ml沸腾的0.008-0.012％氯金酸水溶液中加入1.8-2.2ml的0.8-1.2％柠檬酸三钠水溶液，得胶体金；
b)标记胶体金：用0.18-0.22mol/L的K2CO3溶液调节上述胶体金的pH至8.4-8.6，将标记用1.0-2.0mg/ml鸡IgY抗体加入到调整pH后的胶体金中,标记20-25min；
c)纯化金标抗体：向标记胶体金溶液中加入质量分数8-12％的BSA水溶液，至BSA的终浓度为0.8-1.2％，后停止加入，继续搅拌25-30min，继续加入8-12％PEG20000至PEG20000终浓度为0.18-0.22％，继续搅拌10-15min，离心，弃上清液，即得纯化的金标抗体。
鸡IgY-胶体金偶联物制备过程中，胶体金和抗体的偶联过程尤为重要，由于该产品选择的颗粒粒径偏大，因此在偶联过程中容易出现漂金、死金现象。在反应过程中，加入复溶液可大大降低漂金、死金现象。
作为进一步优选，离心条件为：离心温度4-6℃，离心转速9900-10000rpm，离心时间30-40min。蛋白质在2-8℃条件下比较稳定，胶体金偶联物离心速度一般定于12000rpm，离心时间约为0.5小时，因此将离心速度控制在9900-10000rpm，离心时间为30-40分钟，效果最佳。
因此，本发明具有如下有益效果：
样本类型为尿液，检测HIV病毒相对血液更安全；与血浆相比，尿液的黏度很低，流过检测线T的速度显著增加，从而使抗原抗体结合的反应时间缩短，进而影响灵敏度低，本技术检测通过优化反应体系中各组分和参数，有效提高反应灵敏度；
另外，尿液中的化学物质如无机盐、蛋白质、酸碱度等可以影响免疫反应中抗原抗体的反应活性，降低反应的敏感度；通过对样品垫进行特殊处理，提高尿液样本检测的灵敏度和准确性；
特殊人群如孕妇或服用利尿剂/药物滥用等影响尿液HIV抗体的阳性检出率，本技术检测方法为乳胶法、质控体系为胶体金，具有较好的特异性。；
具体实施方式
实施例1一种检测尿液中HIV1.2试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1)包被液的制备和喷印检测线T、质控线C：分别将1.0mg/ml的抗人IgG单克隆抗体、10mg/ml海藻糖溶液、3％ BSA封闭液、混合得检测线包被液；将1.0mg/ml的羊抗鸡IgY抗体、10mg/ml海藻糖溶液、混合得质控线包被液。分别检测线T包被液、质控线C包被液以0.8μl/cm的速度喷点于硝酸纤维素膜上分别作为检测线T和质控线C，置于36℃烘干，得到检测线T和质控线C。检测线T包被的包被用抗人IgG单克隆抗体浓度分别为1.0mg/ml；质控线C包被的羊抗鸡IgY浓度为1.0mg/ml；。
2)T乳胶标记液(乳胶颗粒标记的HIV I型抗原)的制备过程：
a)清洗：选取羧基化的红色乳胶颗粒(购于Thermo Fisher)，并采用1.8mg/ml磷酸氢二钠和8.6mg/ml氯化钠的混合液进行清洗；
b)标记反应：将标记用HIV I型抗原加入到已清洗过的红色乳胶颗粒中，标记比例为1:40，同时加入0.5mg/mlEDC活化物，25℃恒温箱内恒温反应12h后，加入1mol/L乙醇胺作为终止液，离心后加入5.8mg/ml Tris及5mg/ml Casein的混合保存液中并超声2min，得到HIV I型抗原-乳胶颗粒偶联物。
T乳胶标记液(乳胶颗粒标记的HIV II型抗原)的制备过程：采用与步骤2)相同的标记方法，得到HIV II型抗原-乳胶颗粒偶联物。
3)C金标标记液的制备过程：
a)获得胶体金：在99ml沸腾的0.009％氯金酸水溶液中加入1.9ml的0.9％柠檬酸三钠水溶液，可获得直径为68nm的胶体金；
b)标记胶体金：用0.19mol/L的K2CO3溶液调节上述胶体金的pH至8.5，将浓度为1mg/ml的标记用鸡IgY抗体加入到调整pH后的胶体金中，标记21min，得到鸡IgY抗体-胶体金偶联物；
c)纯化金标抗体：向标记胶体金溶液中加入质量分数9％的BSA(牛血清白蛋白)水溶液，至BSA的终浓度为0.9％，后停止加入，继续搅拌26min，继续加入9％PEG20000至PEG20000终浓度为0.19％，继续搅拌11min，5℃、9920rpm离心32min，弃上清液，即得纯化金标抗体。
4)乳胶垫的制备：将步骤2)获得纯化的乳胶抗原标记液(HIV I型抗原-乳胶颗粒偶联物)稀释后浓度为0.15％+步骤3)获得纯化的乳胶抗原标记液(HIV II型抗原-乳胶颗粒偶联物)稀释后浓度为0.1％和步骤3)获得纯化的鸡IgY抗体-胶体金颗粒(稀释后的使用浓度为OD15)，混合，以2.0μl/cm的速度喷点在玻璃纤维上，置于电热鼓风干燥机中，制得标记处理后的乳胶垫。
5)样品垫处理液的配制：加入10g/L Tris、5g/L Casein、5g/L PVP、5g/L S21表面活性剂、5g/L S19表面活性剂、5g/L EDTA、0.05mg/ml阻断剂、2g/L 2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱一类的聚合物和纯化水,搅拌混匀后，用NaOH将pH值调至pH 9.0称量10g Tris、5gCasein、5g PVP、5g S21表面活性剂、5g S19表面活性剂、5g EDTA、0.05mg/ml阻断剂、2g 2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱一类的聚合物，加入纯化水1L，搅拌混匀后，用NaOH溶液调pH至9.0，4℃保存备用。更具体的，此处阻断剂为含有一种针对所有类型嗜异性干扰的特异性粘合剂，购于杭州傲锐生物医药科技有限公司，此处2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱一类的聚合物为Biolipidure 405。
6)样品垫的处理：将空白片状玻璃纤维浸泡在样品垫处理液中，取出后将空白片状玻璃纤维裁剪成17mm*30.1cm条状，加入2.7ml配制的样品垫处理液，放置37℃烘箱设备中12-24h，室温密封保存。
7)制备检测试纸：将吸水垫、样品垫、标记处理的乳胶垫、包被好质控线和检测线的硝酸纤维素膜及PVC底板按顺序进行连接组装。在PVC底板上先粘贴NC膜，乳胶垫安设于NC膜的一端并且使其压住NC膜1-1.5mm，并且使样品垫压住乳胶垫2mm，吸水纸安设于NC膜的另一端且使其压住NC膜2mm；在用切纸机将其裁切呈宽为3.9mm的条状，保存备用。
实施例2一种检测尿液中HIV1.2试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1)包被液的制备和喷印检测线T、质控线C：分别将1.5mg/ml的抗人IgG单克隆抗体、10mg/ml海藻糖溶液、4％ BSA封闭液、混合得检测线包被液；将1.2mg/ml的羊抗鸡IgY抗体、10mg/ml海藻糖溶液、混合得质控线包被液。将检测线T包被液、质控线C包被液分别以0.9μl/cm的速度喷点于硝酸纤维素膜上分别作为检测线T和质控线C，置于36.5℃烘干，得到检测线T和质控线C；所述检测线T包被的包被用抗人IgG单克隆抗体浓度分别为1.5mg/ml；所述质控线C包被的羊抗鸡IgY浓度为1.2mg/ml。
2)T乳胶标记液(乳胶颗粒标记的HIV I型抗原)的制备过程：
a)清洗：选取羧基化的红色乳胶颗粒(购于Thermo Fisher)，并采用1.8mg/ml磷酸氢二钠和8.6mg/ml氯化钠的混合液进行清洗；
b)标记反应：将标记用HIV I型抗原加入到已清洗过的红色乳胶颗粒中，标记比例为1:30，同时加入0.8mg/mlEDC活化物，26℃恒温箱内恒温反应16h后，加入1.2mol/L乙醇胺作为终止液，离心后加入5.9mg/ml Tris及5.05mg/ml Casein的混合保存液中并超声2.5min，得到HIV I型抗原-乳胶颗粒偶联物。
T乳胶标记液(乳胶颗粒标记的HIV II型抗原)的制备过程：采用与步骤2)相同的标记方法，得到HIV II型抗原-乳胶颗粒偶联物。
3)C金标标记液的制备过程：
a)获得胶体金：在100ml沸腾的0.01％氯金酸水溶液中加入2.0ml的1.0％柠檬酸三钠水溶液，可获得直径为70nm的胶体金；
b)标记胶体金：用0.2mol/L的K2CO3溶液调节上述胶体金的pH至8.5，将浓度为1mg/ml的标记用鸡IgY抗体加入到调整pH后的胶体金中，标记23min，得到鸡IgY抗体-胶体金偶联物；
c)纯化金标抗体：向标记胶体金溶液中加入质量分数10％的BSA(牛血清白蛋白)水溶液，至BSA的终浓度为1.0％，后停止加入，继续搅拌28min，继续加入10％PEG20000至PEG20000终浓度为0.2％，继续搅拌12min，5℃、9950rpm离心35min，弃上清液，即得纯化金标抗体。
4)纯化金标抗体：向标记胶体金溶液中加入质量分数10％的BSA(牛血清白蛋白)水溶液，至BSA的终浓度为1.0％，后停止加入，继续搅拌28min，继续加入10％PEG20000至PEG20000终浓度为0.2％，继续搅拌12min，5℃、9950rpm离心35min，弃上清液，即得纯化金标抗体。
5)样品垫处理液的配制：称量12g Tris、6g Casein、6g PVP、6g S21表面活性剂、6g S19表面活性剂、6g EDTA、0.06mg/ml阻断剂、2.2g 2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱一类的聚合物，加入纯化水1L，搅拌混匀后，用NaOH溶液调pH至9.2，4℃保存备用。加入12g/LTris、6g/L Casein、6g/L PVP、6g/L S21表面活性剂、6g/L S19表面活性剂、6g/LEDTA、0.06mg/ml阻断剂、2.2g/L 2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱一类的聚合物和纯化水,搅拌混匀后，用NaOH将pH值调至pH 9.2，4℃保存备用。
6)样品垫的处理：将空白片状玻璃纤维浸泡在样品垫处理液中，取出后放置37℃烘箱设备中12-24h，室温密封保存。将空白片状玻璃纤维裁剪成17mm*30.1cm条状，加入2.7ml配制的样品垫处理液，放置37℃烘箱设备中12-24h，室温密封保存。
7)制备检测试纸：将吸水垫、样品垫、标记处理的乳胶垫、包被好质控线和检测线的硝酸纤维素膜及PVC底板按顺序进行连接组装。在PVC底板上先粘贴NC膜，乳胶垫安设于NC膜的一端并且使其压住NC膜1-1.5mm，并且使样品垫压住乳胶垫2mm，吸水纸安设于NC膜的另一端且使其压住NC膜2mm；在用切纸机将其裁切呈宽为3.9mm的条状，保存备用。
实施例3一种检测尿液中HIV1.2试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1)包被液的制备和喷印检测线T、质控线C：分别将2.0mg/ml的抗人IgG单克隆抗体、10mg/ml海藻糖溶液、5％ BSA封闭液、混合得检测线包被液；将1.5mg/ml的羊抗鸡IgY抗体、10mg/ml海藻糖溶液、混合得质控线包被液；将检测线T包被液、质控线C包被液分别以1.0μl/cm的速度喷点于硝酸纤维素膜上分别作为检测线T和质控线C，置于37℃烘干，得到检测线T和质控线C；所述检测线T包被的包被用抗人IgG单克隆抗体浓度分别为2.0mg/ml；所述质控线C包被的羊抗鸡IgY浓度为1.5mg/ml；
2)T乳胶标记液(乳胶颗粒标记的HIV I型抗原)的制备过程：
a)清洗：选取羧基化的红色乳胶颗粒(购于Thermo Fisher)，并采用2.0mg/ml磷酸氢二钠和8.7mg/ml氯化钠的混合液进行清洗；
b)标记反应：将标记用HIV I型抗原加入到已清洗过的红色乳胶颗粒中，标记比例为1:25，同时加入1.0mg/ml EDC活化物，27℃恒温箱内恒温反应20h后，加入1.1mol/L乙醇胺作为终止液，离心后加入6.0mg/ml Tris及5.1mg/ml Casein的混合保存液中并超声2.5min，得到HIV I型抗原-乳胶颗粒偶联物。
T乳胶标记液(乳胶颗粒标记的HIV型抗原II)采用相同标记方法制备，得到HIV II型抗原-乳胶颗粒偶联物。
3)C金标标记液的制备过程：
a)获得胶体金：在100ml沸腾的0.01％氯金酸水溶液中加入2.0ml的1.0％柠檬酸三钠水溶液，可获得直径为70nm的胶体金；
b)标记胶体金：用1.2mol/L的K2CO3溶液调节上述胶体金的pH至8.5，将浓度为1mg/ml的标记用鸡IgY抗体加入到调整pH后的胶体金中，标记23min，得到鸡IgY抗体-胶体金偶联物；
c)纯化金标抗体：向标记胶体金溶液中加入质量分数10％的BSA(牛血清白蛋白)水溶液，至BSA的终浓度为1.0％，后停止加入，继续搅拌28min，继续加入10％PEG20000至PEG20000终浓度为0.20％，继续搅拌12min，5℃、9950rpm离心35min，弃上清液，即得纯化金标抗体。
4)乳胶垫的制备：将步骤2)获得的乳胶抗原(HIV I型抗原-乳胶颗粒偶联物稀释后浓度为0.25％+HIV II型抗原-乳胶颗粒偶联物稀释后浓度为0.15％，步骤3)获得的鸡IgY抗体-胶体金颗粒(稀释后的使用浓度为OD20)，混合，以2.5μl/cm的速度喷点在玻璃纤维上，置于电热鼓风干燥机中，制得标记处理的乳胶垫。
5)样品垫处理液的配制：加入15g/L Tris、7.5g/L Casein、7.5g/L PVP、7.5g/LS21表面活性剂、7.5g/L S19表面活性剂、7.5g/L EDTA、0.07mg/ml阻断剂、2.4g/L 2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱一类的聚合物和纯化水,搅拌混匀后，用NaOH将pH值调至pH 9.5，4℃保存备用。称量15g Tris、7.5g Casein、7.5g PVP、7.5g S21表面活性剂、7.5g S19表面活性剂、7.5g EDTA、0.07mg/ml阻断剂、2.4g 2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱一类的聚合物，加入纯化水1L，搅拌混匀后，用NaOH溶液调pH至9.5，4℃保存备用。
6)样品垫的处理：将空白片状玻璃纤维浸泡在样品垫处理液中，取出后放置37℃烘箱设备中12-24h，室温密封保存。
7)制备检测试纸：将吸水垫、样品垫、标记处理的乳胶垫、包被好质控线和检测线的硝酸纤维素膜及PVC底板按顺序进行连接组装。在PVC底板上先粘贴NC膜，乳胶垫安设于NC膜的一端并且使其压住NC膜1-1.5mm，并且使样品垫压住乳胶垫2mm，吸水纸安设于NC膜的另一端且使其压住NC膜2mm；在用切纸机将其裁切呈宽为3.9mm的条状，保存备用。
实施例4一种检测尿液中HIV1.2试纸条的制备方法，包括以下步骤：。
1)包被液的制备和喷印检测线T、质控线C：分别将2.5mg/ml的抗人IgG单克隆抗体、10mg/ml海藻糖溶液、6％ BSA封闭液、混合得检测线包被液；将1.8mg/ml的羊抗鸡IgY抗体、10mg/ml海藻糖溶液、混合得质控线包被液。将检测线T包被液、质控线C包被液分别以1.1μl/cm的速度喷点于硝酸纤维素膜上分别作为检测线T和质控线C，置于37.5℃烘干，得到检测线T和质控线C；所述检测线T包被的包被用抗人IgG单克隆抗体浓度分别为2.5mg/ml；所述质控线C包被的羊抗鸡IgY浓度为1.8mg/ml；
2)T乳胶标记液(乳胶颗粒标记的HIV I型抗原)的制备过程：
a)清洗：选取羧基化的红色乳胶颗粒(购于Thermo Fisher)，并采用2.2mg/ml磷酸氢二钠和8.65mg/ml氯化钠的混合液进行清洗；
b)标记反应：将标记用HIV I型抗原加入到已清洗过的红色乳胶颗粒中，标记比例为1:20，同时加入1.2mg/mlEDC活化物，27.5℃恒温箱内恒温反应22h后，加入1.15mol/L乙醇胺作为终止液，离心后加入6.1mg/ml Tris及5.15mg/ml Casein的混合保存液中并超声2.8min，得到HIV I型抗原-乳胶颗粒偶联物。
T乳胶标记液(乳胶颗粒标记的HIV型抗原II)采用相同标记方法制备，得到HIV II型抗原-乳胶颗粒偶联物。
3)C金标标记液的制备过程：
a)获得胶体金：在101ml沸腾的0.011％氯金酸水溶液中加入2.1ml的1.1％柠檬酸三钠水溶液，可获得直径为72nm的胶体金；
b)标记胶体金：用0.21mol/L的K2CO3溶液调节上述胶体金的pH至8.5，将浓度为1mg/ml的标记用鸡IgY抗体加入到调整pH后的胶体金中，标记24min，得到鸡IgY抗体-胶体金偶联物；
c)纯化金标抗体：向标记胶体金溶液中加入质量分数11％的BSA(牛血清白蛋白)水溶液，至BSA的终浓度为1.1％，后停止加入，继续搅拌29min，继续加入11％PEG20000至PEG20000终浓度为0.21％，继续搅拌14min，5.5℃、9980rpm离心38min，弃上清液，即得纯化金标抗体。
4)乳胶垫的制备：将步骤2)获得的纯化的乳胶抗原(HIV I型抗原-乳胶颗粒偶联物稀释后浓度为0.30％+HIV II型抗原-乳胶颗粒偶联物稀释后浓度为0.18％)，步骤3)获得的鸡IgY抗体-胶体金颗粒(稀释后的使用浓度为OD25)，混合，以2.8μl/cm的速度喷点在玻璃纤维上，置于电热鼓风干燥机中，制得标记处理的乳胶垫。
5)样品垫处理液的配制：加入17g/L Tris、8.5g/L Casein、8.5g/L PVP、8.5g/LS21表面活性剂、8.5g/L S19表面活性剂、8.5g/L EDTA、0.08mg/ml阻断剂、2.5g/L 2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱一类的聚合物和纯化水,搅拌混匀后，用NaOH将pH值调至pH 9.8，4℃保存备用。
6)样品垫的处理：将空白片状玻璃纤维浸泡在样品垫处理液中，取出后放置37℃烘箱设备中12-24h，室温密封保存。将空白片状玻璃纤维裁剪成17mm*30.1cm条状，加入2.7ml配制的样品垫处理液，放置37℃烘箱设备中12-24h，室温密封保存。
7)制备检测试纸：将吸水垫、样品垫、标记处理的乳胶垫、包被好质控线和检测线的硝酸纤维素膜及PVC底板按顺序进行连接组装。在PVC底板上先粘贴NC膜，乳胶垫安设于NC膜的一端并且使其压住NC膜1-1.5mm，并且使样品垫压住乳胶垫2mm，吸水纸安设于NC膜的另一端且使其压住NC膜2mm；在用切纸机将其裁切呈宽为3.9mm的条状，保存备用。
实施例5一种检测尿液中HIV1.2试纸条的制备方法，包括以下步骤：。
1)包被液的制备和喷印检测线T、质控线C：分别将3.0mg/ml的抗人IgG单克隆抗体、10mg/ml海藻糖溶液、7％ BSA封闭液、混合得检测线包被液；将2.0mg/ml的羊抗鸡IgY抗体、10mg/ml海藻糖溶液、混合得质控线包被液。将检测线T包被液、质控线C包被液分别以1.2μl/cm的速度喷点于硝酸纤维素膜上分别作为检测线T和质控线C，置于38℃烘干，得到检测线T和质控线C；所述检测线T包被的包被用抗人IgG单克隆抗体浓度分别为3.0mg/ml；所述质控线C包被的羊抗鸡IgY浓度为2.0mg/ml；
2)T乳胶标记液(乳胶颗粒标记的HIV I型抗原)的制备过程：
a)清洗：选取羧基化的红色乳胶颗粒(购于Thermo Fisher)，并采用2.2mg/ml磷酸氢二钠和8.6mg/ml氯化钠的混合液进行清洗；
b)标记反应：将标记用HIV I型抗原加入到已清洗过的红色乳胶颗粒中，标记比例为1:10，同时加入1.5mg/mlEDC活化物，28℃恒温箱内恒温反应24h后，加入1.2mol/L乙醇胺作为终止液，离心后加入6.2mg/ml Tris及5.2mg/ml Casein的混合保存液中并超声2.8min，得到HIV I型抗原-乳胶颗粒偶联物。
T乳胶标记液(乳胶颗粒标记的HIV型抗原II)采用相同标记方法制备，得到HIV II型抗原-乳胶颗粒偶联物。
3)C金标标记液的制备过程：
a)获得胶体金：在102ml沸腾的0.012％氯金酸水溶液中加入2.2ml的1.2％柠檬酸三钠水溶液，可获得直径为75nm的胶体金；
b)标记胶体金：用0.22mol/L的K2CO3溶液调节上述胶体金的pH至8.6，将浓度为1mg/ml的标记用鸡IgY抗体加入到调整pH后的胶体金中，标记25min，得到的鸡IgY抗体-胶体金偶联物；
c)纯化金标抗体：纯化金标抗体：向标记胶体金溶液中加入质量分数12％的BSA(牛血清白蛋白)水溶液，至BSA的终浓度为1.2％，后停止加入，继续搅拌30min，继续加入12％PEG20000至PEG20000终浓度为0.22％，继续搅拌15min，6℃、10000rpm离心40min，弃上清液，即得纯化金标抗体。
4)乳胶垫的制备：将步骤3)获得的纯化的乳胶抗原(HIV I型抗原-乳胶颗粒偶联物稀释后浓度为0.40％+HIV II型抗原-乳胶颗粒偶联物稀释后浓度为0.2％)，步骤3)获得的鸡IgY抗体-胶体金颗粒(稀释后的使用浓度为OD30)，混合，以3.0μl/cm的速度喷点在玻璃纤维上，置于电热鼓风干燥机中，制得标记处理的乳胶垫。
5)样品垫处理液的配制：加入20g/L Tris、10g/L Casein、10g/L PVP、10g/L S21表面活性剂、10g/L S19表面活性剂、10g/L EDTA、0.1mg/ml阻断剂、2.8g/L 2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱一类的聚合物和纯化水,搅拌混匀后，用NaOH将pH值调至pH 10.0，4℃保存备用。
6)样品垫的处理：将空白片状玻璃纤维浸泡在样品垫处理液中，取出后放置37℃烘箱设备中12-24h，室温密封保存。
7)制备检测试纸：将吸水垫、样品垫、标记处理的乳胶垫、包被好质控线和检测线的硝酸纤维素膜及PVC底板按顺序进行连接组装。在PVC底板上先粘贴NC膜，乳胶垫安设于NC膜的一端并且使其压住NC膜1-1.5mm，并且使样品垫压住乳胶垫2mm，吸水纸安设于NC膜的另一端且使其压住NC膜2mm；在用切纸机将其裁切呈宽为3.9mm的条状，保存备用。
对比例1与实施例3的区别在于，样品垫处理液中不加阻断剂。
对比例2与实施例3的区别在于，活化物EDC的使用浓度为0.1％。
对比例3与实施例3的区别在于，将标记反应过程置于20℃恒温箱过夜。
对比例4与实施例3的区别在于，终止反应后，超声30秒。
对比例5与实施例3的区别在于，包被液中不加入封闭剂。
对比例6与实施例3的区别在于，质控线系统为链霉亲和素-生物素，常用于乳胶法中的质控线系统。将1.5mg/ml的链霉亲和素、10mg/ml海藻糖溶液、混合得质控线包被液；将生物素加入到已清洗过的红色乳胶颗粒中，标记比例为1:20同时加入EDC活化物，27.5℃恒温箱内恒温反应22h后，加入1.15mol/L乙醇胺作为终止液，离心后加入保存液并超声2-3min，得到生物素-乳胶颗粒偶联物。
对比例7与实施例3的区别在于，样品垫处理液pH为8.0。
对比例8与实施例3的区别在于，在样品垫处理液中未加入基于2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱一类的聚合物。
对实施例1-5和对比例1-6的HIV1.2尿液检测试纸进行性能试验，结果如表1、表2所示。灵敏度、特异性、稳定性试验，分别用人类免疫缺陷病毒抗体试剂国家参考品进行测试，其中N1-N20为HIV抗体阴性参考品，P1-P20(其中P1-P18为HIV I型阳性参考品，P19-P20为HIV II型阳性参考品)为阳性参考品，S1-S5(其中S1为阴性参考品)为最低检出限参考品,CV为重复性参考品，滴加到本发明的试纸条加样孔进行检测，每个浓度设定重复三次，检测结果完全一致，证明本发明试纸条检测结果稳定可靠。稳定性试验采用加速稳定性试验，将同一批次的试纸条分别置于45℃和55℃烘箱，并以下表的时间段分别对标准品进行检测。
表1实施例和对比例灵敏度、特异性、稳定性结果
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表2实施例3和对比实施例6灵敏度、特异性、质控线结果
结果分析：
1)实施例1-5均能制备出检测灵敏度高、检测结果准确、使用周期长的快速诊断尿液中HIV1.2抗体检测试纸。
2)对比例1与实施例3相比较，对比例1的玻纤处理液中不添加阻断剂，尿液样本中的干扰抗体未被封闭或清除，从而临床上容易出现假阳的风险。通过添加阻断剂，可使干扰抗体优先与阻断剂结合，从而降低假阳风险。
3)对比例2与实施例3相比较，对比例1中活化物EDC的使用浓度为0.1％。过低的活化物能影响抗体和彩色乳胶的结合效果，临床上容易出现漏检风险。
4)对比例3中将反应过程置于20℃恒温箱过夜。活化物质EDC对温度比较敏感，低于25℃活化物效果不明显，影响抗体和彩色颗粒的结合效果，临床上容易出现漏检风险。
5)对比例4中乳胶标记液终止反应后，超声30秒。超声的目的是消除乳胶的凝集现象，超声时间过短，乳胶凝集消除不充分，临床上容易出现假阳性风险。
6)对比例5与实施例3相比较，包被液中不加入BSA封闭液，当抗体包被在硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜上的孔径里藏有不连续的蛋白，就会存在非特异性的信号，从而增加假阳性。封闭液中包含有大量的蛋白质，利用封闭液中的蛋白成分以吸附的方式结合于膜表面的空白间隙，从而避免非特异性结合而造成假阳性的结果。
7)对比例6与实施例3相比较，对比例6中质控线系统为链霉亲和素-生物素。生物素以游离的形式存在，外源性生物素是人体摄入生物素后存在于血液中的游离生物及其代谢产物，多余生物素主要经尿液排出。尿液样本中的生物素和标记处理垫上的生物素均会与质控线上的链霉亲和素发生反应，从而产生竞争关系，当尿液样本中的生物素越多，竞争关系越强烈，从而导致质控线变弱或者不均一的情况。实施例3中的质控线系统为羊抗鸡IgY-鸡IgY。鸡IgY属于独立的质控线系统，不激活哺乳动物的补体系统，不与类风湿因子或Fc受体相结合，可避免在反应过程中产生假阳性结果。
8)对比例7与实施例3相比较，pH值低于最优范围9-10。有研究表明尿液存贮时间延长可导致假阴性结果的产生，尿液初始pH值为4-7，存储时间长接触的空气和细菌，尿液pH值会降低，酸性样本物质在到达捕获区之前可能已经发生非特异性结合、而无法再检测线T处反应，而造成假阴，本技术方案样品垫特殊处理可有效避免。
9)对比例8与实施例3相比较，基于2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱一类的聚合物，该物质属于纯化学品物质，非生物来源，可抑制蛋白质的非特异性吸附，也可有效避免尿液中的靶物质被吸附在玻璃纤维中，从而提高产品灵敏度。在对比例8中未加入基于2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱一类的聚合物，灵敏度降低。
由实施例1-5以及对比例1-8的数据可知，只有在本发明权利要求范围内的方案，才能够在各方面均能满足上述要求，得出最优化的方案，得到最优的性能的乳胶法免疫层析检测试纸。而对于配比的改动、原料的替换/加减，或者加料顺序的改变，均会带来相应的负面影响。
临床样本验证：
1)灵敏度测试：共收集130例HIV患者尿液，分别为40例感染HIV初期患者尿液，90例感染HIV正在治疗的患者尿液，检测结果如表3。
表3临床样本验证灵敏度结果
特异性检测：共收集收集400例尿液样本，分别为200例普通人尿液样本，100例孕妇尿液样本，50例痛风患者尿液样本,50例吸毒人员尿液样本。通常情况下，孕妇尿液中的人绒毛膜促性腺激素含量和普通人不同，人绒毛膜促性腺激素是一种由胎盘的滋养层细胞分泌的糖蛋白，普通人的尿中人绒毛膜促性腺激素一般在0-5IU/ml之间，孕期时尿液样本中人绒毛膜促性腺激素值通常>150IU/ml；痛风是由尿酸高导致的，痛风患者的尿酸数值长时间处于比较高的状态之下，尿液当中的酸性物质会慢慢升高会形成尿路结石，而且一些微小的结石还会随着尿液从身体里边排出去，尿液本身是清澈的，尿酸太高就会表现出浑浊、血尿的现象，一般是成年男性为149-420μmol/L，而女性是89-357μmol/L；当一般是男性尿酸高于420μmol/L，女性尿酸高于360μmol/L时，则会引起痛风。吸毒人员吸毒之后，毒素会通过肾脏进行排泄，从而导致尿液中有毒素代谢产物。所述孕妇尿液、痛风患者尿液、吸毒人员尿液均与正常人尿液有区别，因此特异性检测孕妇尿液、痛风患者尿液、吸毒人员尿液具有一定意义。检测结果如表4。
表3临床样本验证特异性结果
利用本发明制备的乳胶法试纸条进行检测，检测结果显示，200例正常尿液样本，100例孕妇尿液样本，50例痛风患者尿液样本,50例吸毒人员尿液样本均显示阴性；40例感染HIV初期尿液样本，90例感染HIV正在治疗的患者尿液样本均显示阳性。证明本发明的试纸条结果可靠，特异性灵敏度强，操作简便、快速，而且可以不用借助任何设备就能进行临床样本的检测，检测结果显示直观、准确。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一种检测尿液中HIV1.2抗体的试纸条，其特征在于：主要包括PVC底板，样品垫、乳胶垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；在所述乳胶垫上固定有由乳胶颗粒标记的HIV I型抗原、乳胶颗粒标记的HIV II型抗原和胶体金颗粒标记的鸡IgY；在所述硝酸纤维素膜上有由抗人IgG单克隆抗体包被的检测线T及羊抗鸡IgY包被的质控线C。
2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述乳胶颗粒的直径为200-400nm，胶体金颗粒的直径为40-100nm，所述乳胶颗粒标记的HIV I型抗原使用浓度为0.15%-0.4%，所述乳胶颗粒标记的HIV II型抗原使用浓度为0.1%-0.2%，所述胶体金颗粒标记的鸡IgY使用浓度为OD15-OD30。
3.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述抗人IgG单克隆抗体包被的检测线T中抗人IgG单克隆抗体使用浓度为1.0-3.0mg/ml，所述羊抗鸡IgY包被的质控线C中羊抗鸡IgY使用浓度为1.0-2.0mg/ml。
4.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述乳胶颗粒的直径为200-400nm，胶体金颗粒的直径为40-100nm，所述乳胶颗粒标记的HIV I型抗原使用浓度为0.15%-0.4%，所述乳胶颗粒标记的HIV II型抗原使用浓度为0.1%-0.2%，所述胶体金颗粒标记的鸡IgY使用浓度为OD15-OD30。
5.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述样品垫由10-20g/L Tris、5-10g/LCasein、5-10g/L PVP、5-10g/L S21表面活性剂、5-10g/L S19表面活性剂、5-10g/L EDTA、0.05-0.1mg/ml 阻断剂、2-3g/L 2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱一类的聚合物和纯化水,用NaOH将pH值调至pH 9.0-10.0的样本垫处理液处理后所得。
6.如权利要求1-5任一所述的一种检测尿液中HIV1.2抗体的试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）喷印检测线和质控线，分别将抗人IgG单克隆抗体和羊抗鸡IgY溶液稀释后喷点于硝酸纤维素膜上分别作为检测线和质控线，烘干，制得检测线和质控线；2）乳胶标记垫的制备：将乳胶颗粒标记的HIV I型抗原、乳胶颗粒标记的HIV II型抗原稀释到浓度分别为0.15-0.4%和0.1-0.3%，将胶体金颗粒标记的鸡IgY稀释到浓度为OD15-OD30，混合、喷点在玻璃纤维上，烘干，制得标记处理的乳胶垫； 3）样品垫处理液的配制：加入10-20g/L Tris、5-10g/L Casein、5-10g/L PVP、5-10g/L S21表面活性剂、5-10g/L S19表面活性剂、5-10g/L EDTA、0.05-0.1mg/ml 阻断剂、2-3g/L 2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱一类的聚合物和纯化水,用NaOH将pH值调至pH 9.0-10.0。4）样品垫的处理：将空白片材玻璃纤维浸泡在样品垫处理液中，取出放置烘箱设备中12-24h。5）制备检测试纸：将吸水垫、样品垫、标记处理的乳胶垫、包被好质控线和检测线的硝酸纤维素膜及PVC底板按顺序进行连接组装。
7.如权利要求6所述的一种利用乳胶法检测尿液中HIV1.2抗体的试纸条的制备方法，其特征在于，所述乳胶颗粒标记的HIV I型抗原制备过程为：
清洗：选取粒径为200-400nm的聚苯乙烯颗粒，并采用1.6-2.4mg/ml磷酸氢二钠和8.4-8.6mg/ml氯化钠的混合液进行清洗；
标记反应：将标记用HIV I型抗原加入到已清洗的乳胶颗粒中，标记比例为1:40-1:10，同时加入0.5-1.5mg/mlEDC活化物，恒温反应12-24h后，加入1.0-1.2mg/ml的终止液，离心后加入保存液并超声2-3min，得到HIV I型抗原-乳胶颗粒偶联物；
所述乳胶颗粒标记的HIV II型抗原制备过程为：
清洗：选取粒径为200-400nm的聚苯乙烯颗粒，并采用1.6-2.4mg/ml磷酸氢二钠和8.4-8.6mg/ml氯化钠的混合液进行清洗；
标记反应：将标记用HIV II型抗原加入到已清洗的乳胶颗粒中，标记比例为1:40-1:10，同时加入0.5-1.5mg/mlEDC活化物，恒温反应12-24h后，加入1.0-1.2mg/ml的终止液，离心后加入保存液并超声2-3min，得到HIV II型抗原-乳胶颗粒偶联物。
8.如权利要求7所述的所述的一种检测尿液中HIV1.2抗体的试纸条的制备方法，其特征在于，所述终止液为乙醇胺，所述保存液为5.8-6.2mg/ml Tris及5-5.2mg/ml Casein的混合液。
9.如权利要求7所述的所述的一种检测尿液中HIV1.2抗体的试纸条的制备方法，其特征在于，所述恒温反应温度为25-28℃。
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