CN116643042A - 血栓调节蛋白化学发光检测试剂盒 - Google Patents

血栓调节蛋白化学发光检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及体外检测技术领域，尤其涉及血栓调节蛋白化学发光检测试剂盒。本发明具体提供了羧基磁珠的制备方法及其应用，利用该方法制备的羧基磁珠表面羧基含量高，与抗原或抗体的偶联率高。利用本发明提供的羧基磁珠制备的血栓调节蛋白化学发光检测试剂盒性质稳定、测值准确性和重复性好，能够应用于临床。

Description

血栓调节蛋白化学发光检测试剂盒
技术领域
本发明涉及体外检测技术领域，尤其涉及血栓调节蛋白化学发光检测试剂盒。
背景技术
血栓调节蛋白(Thrombomodulin,TM)是一种存在于细胞膜表面的跨膜糖蛋白，由巨核细胞和内皮细胞合成，普遍分布于血管内皮细胞表面。TM与凝血酶结合后会降低凝血酶的凝血活性，而加强其激活蛋白C的活性，由于激活的蛋白C具有抗凝作用，因此TM是重要的凝血抑制因子。正常生理状态下，TM分布于细胞质膜表面，当血管内皮细胞受到损伤后，常常引起TM表达、分泌异常和释放入血液，引起血浆中血栓调节蛋白含量的变化。临床上血液TM含量的升高见于弥散性血管内凝血、急性心肌梗死和脑血栓等疾病，因此血栓调节蛋白含量的测定对于一些疾病的诊断和治疗具有重要的意义。
目前，测定血栓调节蛋白的方法主要是酶联免疫吸附法(ELISA)和放射免疫分析法(RIA)。但二者在实际应用中都存在一些缺陷，酶联免疫吸附法操作繁琐，耗时长、测试结果不稳定、重复性差，不方便随到随测和医院急诊；放射免疫分析法具有放射性污染，测试结果不稳定，且所需仪器较昂贵。因此，开发一种操作简单、能够快速准确检测血栓调节蛋白的试剂盒十分必要。磁性纳米颗粒具有比表面积大、分离清洗速度快、重现性好、可偶联标记等优点，已经有研究者将磁微粒作为检测载体应用于临床项目检测。以磁性纳米颗粒为基础的磁微粒化学发光免疫分析法(CLIA)将具有高灵敏度的化学发光测定技术和高特异性的免疫反应相结合，具有灵敏度高、线性范围宽、特异性高、测值稳定、高自动化等特点。磁微粒化学发光法结合磁分离技术、免疫分析技术和化学发光技术完成对特定抗原的定量测定，抗原首先与包被在磁珠表面的抗体1结合，形成稳定的抗原-抗体1复合物，酶标抗体进而与抗原其他位点结合形成双抗体夹心复合物，标记在抗体上的碱性磷酸酶催化水解发光底物发出光信号。光信号值与碱性磷酸酶浓度呈正相关，通过化学发光仪检测分析实现双抗体夹心复合物(抗原)的定量测试。
现有方法制备的羧基磁珠，工艺重复性差、产品质量不稳定，且抗原或抗体偶联率、上机检测结果不佳；TM磁微粒化学发光测定试剂盒多采用链霉亲和素-生物素或放射性元素标记，检测结果易受过量标记物干扰、具有放射性危害。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种血栓调节蛋白化学发光检测试剂盒。具体提供一种核壳式超顺磁性磁微粒的制备方法，以及包被血栓调节蛋白抗体1的磁微粒悬浮液(免疫磁珠)、碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体2(酶标抗体)的制备。
本发明提供了羧基磁珠的制备方法，包括将可溶性三价铁离子盐制成纳米微粒内核，用二氧化硅包被后与羧基化硅烷反应，磁分离后得到。
具体的，所述将可溶性三价铁离子盐制成纳米微粒内核的步骤包括将可溶性三价铁离子盐、乙酸钠、高分子聚合物与乙二醇和乙二胺混合溶液反应，磁分离后得到Fe3O4纳米微粒；
所述高分子聚合物选自聚氧乙烯类、聚乳酸、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠中的任意一种，在本发明的实施例中，所述高分子聚合物为羧甲基纤维素钠；
所述反应的温度为180～300℃，反应的时间为6～12h，在本发明的实施例中，反应的温度为220℃，反应时间为8h。
具体的，所述二氧化硅包被纳米微粒内核的步骤包括将Fe3O4纳米微粒用碱液重悬后与正硅酸乙酯反应，磁分离后得到二氧化硅包被的Fe3O4纳米微粒；
所述正硅酸乙酯与Fe3O4纳米微粒的质量比为1：(10～30)；
所述Fe3O4纳米微粒重悬后的重悬液pH值为10～12，优选pH值为10.5；
所述正硅酸乙酯溶于乙醇中，所述正硅酸乙酯的浓度为10％；
所述反应的温度为25～50℃，优选为25℃，反应的时间为3～6h，优选为5h。
具体的，所述羧基化硅烷的制备方法包括将氨基硅烷与酸酐在无水溶剂中反应1～2h得到；
所述氨基硅烷与酸酐的摩尔比为1：(2～30)，优选为1:10；
所述氨基硅烷选自乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷)、(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷中的任意一种，优选为乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷)；
所述酸酐选自己酸酐、苯硫代甲酸酐、苯磺酸酐、乙丙酸酐、环己甲酸酐、乙氯乙酸酐中的任意一种，优选为乙氯乙酸酐。
在相同的摩尔比例下，氨基硅烷和酸酐的种类会影响二氧化硅包被的Fe3O4纳米微粒表面羧基修饰的数量和位点，进而影响抗体的偶联率，影响试剂盒的检测，因此本发明对不同氨基硅烷和酸酐进行了筛选，结果表明利用乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷)和乙氯乙酸酐制备的羧基磁珠偶联率最高，变异系数最小，优于其他氨基硅烷和酸酐制备的磁珠。
具体的，所述二氧化硅包被后的Fe3O4纳米微粒与羧基化硅烷反应的步骤包括将羧基硅烷溶于无水乙醇后与二氧化硅包被的Fe3O4纳米微粒反应2～6h，磁分离后得到；
所述反应的温度为25～50℃，优选为25℃，pH值为10～20，优选为11。
本发明提供了羧基磁珠，其由本发明所述制备方法获得。本发明提供的羧基磁珠表面羧基含量较高，有利于磁珠表面抗体的偶联。
利用本发明提供的羧基磁珠制备的免疫磁珠与市售磁珠制备的免疫磁珠相比，偶联率高且稳定，能够广泛应用于化学发光检测试剂盒的制备，因此本发明提供了所述羧基磁珠在制备化学发光检测试剂盒中的应用。
本发明还提供了血栓调节蛋白检测试剂盒，其包括利用本发明所述的羧基磁珠制备的免疫磁珠和酶标TM抗体；
所述免疫磁珠偶联TM抗体1；所述酶标TM抗体为碱性磷酸酶标记的TM抗体2；
具体的，所述TM抗体1和2包括单克隆抗体或具有Fab活性的改性抗体片段、抗体、抗体片段多聚体，可与人TM表面抗原决定簇特异性结合，可来源于鼠、兔、羊、犬等动物，优选为鼠源单克隆抗体；
所述TM抗体1和2为市售抗体；
所述羧基磁珠与TM抗体1的质量比为(10～200)：1，优选为50:1；
所述碱性磷酸酶与TM抗体2的质量比为(0.5～10)：1，优选为1:1。
在一些具体的实施例中，所述羧基磁珠偶联TM抗体1可通过EDC、EDC/NHS、EDC/Sulfo-NHS等活化剂偶联，优选EDC/Sulfo-NHS。偶联步骤如下：
a)将磁微粒均匀分散在活化缓冲液中；
b)使用活化缓冲液溶解活化剂，加入到磁微粒混悬液中混合均匀，于室温条件下(10～30℃)孵育30min～2h，获得活化磁珠；
c)磁分离去除残留活化剂，加入交联缓冲液重新分散磁微粒；
d)使用交联缓冲液稀释TM抗体1，加入到活化后的磁微粒混悬液中，混匀后于4～30℃孵育0.5～12h；
e)磁性分离，向免疫磁珠中加入淬灭缓冲液，4～30℃孵育0.5～3h；
f)磁分离后使用储存缓冲液分散免疫磁珠，储存备用。
所述磁珠与活化剂的质量比为0.1:1～20:1，优选为20:1。
所述封闭剂可以是乙醇胺、牛血清白蛋白、酪蛋白、氨基酸等含有游离氨基的物质中的一种或几种。
所述的活化、交联缓冲液可以是MES缓冲液、硼酸缓冲液、PBS缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液等不含氨基和羧基的缓冲液中的一种，优选MES缓冲液；
所述活化、交联缓冲液pH范围为5.5～7.0，优选为6.5。
所述储存缓冲液缓冲体系可以是MOPS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液等中的一种，优选Tris-HCl缓冲液。
所述储存缓冲液中含有牛血清白蛋白(BSA)、防腐剂NaN3；
所述储存缓冲液pH范围为6.0～9.0，优选为8.0。
在另一些具体的实施例中，所述酶标抗体可通过戊二醛法、过碘酸钠法或异双功能试剂交联法等方法制备，优选异双功能试剂(Sulfo-SMCC)交联法。制备步骤如下：
a)使用酶标缓冲液溶解/稀释碱性磷酸酶，加入一定量的Sulfo-SMCC，于4～30℃温和孵育0.5～3h，产物脱盐后备用；
b)使用酶标缓冲液溶解/稀释TM抗体2，加入一定量的Traut’s试剂，于4～30℃温和孵育0.5～3h后，加入0.5％～2.5％的甘氨酸溶液淬灭5min，产物脱盐后备用；
c)将活化后的碱性磷酸酶与巯基化后的抗体混合后，4～30℃条件下温和搅拌孵育2～30h，加入0.5～2.5％的半胱氨酸溶液封闭0.5～2h；
d)产物脱盐后置于储存缓冲液中储存备用。
所述碱性磷酸酶/抗体与Sulfo-SMCC质量比为2～30:1，优选为15:1。
所述碱性磷酸酶/抗体与Traut’s质量比为20～250:1，优选为20:1。
所述的酶标缓冲液可以是MES缓冲液、硼酸缓冲液、PBS缓冲液等不含氨基和羧基的缓冲液中的一种，优选Tris-HCl缓冲液。
所述酶标缓冲液pH为7.0～9.0，不同pH条件下抗体的空间结构不同，与碱性磷酸酶偶联的位点存在差异，制备过程中会形成具有不同立体结构的酶标抗体复合物，影响抗原的识别与结合，进而影响血栓调节蛋白的检测，pH优选为7.5。
所述储存缓冲液缓冲体系可以是MOPS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液等中的一种，优选Tris-HCl缓冲液。
所述储存缓冲液中含有牛血清白蛋白(BSA)、防腐剂NaN3；储存缓冲液pH范围为6.0～9.0，优选为8.0。
本发明还提供了检测血栓调节蛋白含量的方法，包括利用本发明所述的试剂盒。
本发明提供的方法可为诊断目的的，也可为非诊断目的的。例如，包括对人体或动物体，或者离体的来自于人体或动物体的样品进行的以诊断为目的的检测方法；也包括对环境样品或者模拟样品进行的以科研或其他非诊断目的检测方法。
本发明制备了一种产品质量稳定、抗原或抗体偶联率高的羧基磁珠，并利用羧基磁珠作为载体、以碱性磷酸酶标记抗体，使用TM配对抗体捕获血浆样本中的抗原，通过与含有AMPPD或APS-5等发色底物的全自动免疫检验系统用底物液搭配使用完成定量检测，本发明所述的核壳式超顺磁性磁微粒抗体偶联率高，试剂盒性质稳定，测值重复性好。具体表现为：本发明制备的羧基磁珠产品质量稳定、抗原或抗体偶联率高，且制备工艺简单、操作安全可靠、易于控制，免疫磁珠和酶标抗体能够快速捕获样本中的抗原，试剂盒性质稳定，测值重复性好。
说明书附图
图1示不同酶标抗体组定标曲线图。
具体实施方式
本发明提供了血栓调节蛋白化学发光检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1羧基磁珠的制备
1.1、羧基磁珠制备
将10mg可溶性铁盐FeCl3·6H2O和25mg乙酸钠溶于100mL乙二醇和乙二胺混合溶液中，加入0.1mg羧甲基纤维素钠，混匀，在220℃条件下反应8小时，反应结束后磁分离获得Fe3O4纳米微粒，即羧基磁珠的内核；
用60mL碱液重悬Fe3O4纳米微粒，调节pH为10.5，加入0.5mL溶解在乙醇中的正硅酸乙酯(10％)，混匀，在25℃条件下搅拌反应5小时，反应结束后磁分离获得具有核壳式结构的二氧化硅包被的Fe3O4纳米微粒；
将2.85g乙烯基三乙氧基硅烷(0.015mol氨基硅烷)和3.57g环己甲酸酐(0.15mol酸酐)溶解于50mL无水乙醇中，在室温条件下搅拌反应2h，制备羧基化硅烷，用于二氧化硅包被的Fe3O4纳米微粒表面羧基的修饰；
将二氧化硅包被的Fe3O4纳米微粒加入到羧基化硅烷中，在pH为11、温度为25℃条件下搅拌反应4小时，反应结束后磁分离，获得具有核壳式结构的羧基超顺磁微粒。
利用磁珠保存液将制备的磁微粒稀释至50mg/mL，保存备用。
1.2、氨基硅烷与酸酐的优化
在相同的摩尔比例下(氨基硅烷：酸酐＝0.015mol：0.015mol)，氨基硅烷和酸酐的种类会影响二氧化硅包被的Fe3O4纳米微粒表面羧基修饰的数量和位点，进而影响抗体的偶联率，影响试剂盒的检测，因此选择不同的氨基硅烷和酸酐进行考查。利用氨基硅烷乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷)和酸酐环己甲酸酐、乙氯乙酸酐进行组合，如表1所示，按照实施例1.1实验过程分别制备羧基磁珠并保存，用于抗体偶联率的测定。磁珠偶联抗体后，磁分离取偶联后的上清，利用BCA法测定上清液中的抗体浓度，根据上清的体积和抗体的投料量分别计算不同组磁珠的抗体偶联率。通过对比不同组免疫磁珠的抗体偶联率，确定制备过程中最佳的氨基硅烷和酸酐。
表1不同组羧基磁珠制备用氨基硅烷与酸酐
分组 氨基硅烷 酸酐
1 乙烯基三乙氧基硅烷 环己甲酸酐
2 乙烯基三甲氧基硅烷 环己甲酸酐
3 乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷) 环己甲酸酐
4 乙烯基三乙氧基硅烷 乙氯乙酸酐
5 乙烯基三甲氧基硅烷 乙氯乙酸酐
6 乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷) 乙氯乙酸酐
1.3、羧基含量的测定
通过酸碱化学滴定法测试羧基磁珠表面的羧基含量。称取0.2mg羧基磁珠于100mL锥形瓶中，加入10mL甲醇，超声分散2min，加入2～3滴酸碱指示剂酚酞，摇匀。利用0.01mol/L的NaOH进行滴定，直至溶液变为浅粉色且30秒内不褪色，记录滴定过程中使用的碱液体积V1。空白样品按照同样方法进行测定，滴定结束后记录滴定过程中使用的碱液体积V2。根据两组实验碱液的消耗量之差(V1-V2)和实验使用的NaOH碱液的浓度，计算羧基磁珠表面的羧基含量(nmol/mg)。
实施例2试剂盒制备
2.1、免疫磁珠制备
使用旋涡混合器充分混匀羧基磁珠，取10mg磁珠溶液于离心管中，加入活化缓冲液(0.1M MES，pH6.5)定容至1mL，混合均匀后磁分离1min，去上清。再次加入1mL活化缓冲液，混合均匀后磁分离1min，去上清，加入1mL活化缓冲液后混匀备用。
加入100μL活化剂(5mg/mL EDC&5mg/mL Sulfo-NHS，现用现配)后混合均匀，室温下旋转混合孵育30min。
磁性分离后去上清，取200μg TM抗体1，加入交联缓冲液定容至1mL，加入到活化后的磁珠中，混合均匀后于室温下旋转混合孵育4h。
磁性分离，取上清液用于免疫磁珠抗体偶联率测定；
加入1mL含1％BSA的交联缓冲液，室温下旋转混合封闭1h，磁性分离后去上清。
使用1mL储存缓冲液分散偶联后的免疫磁珠，置于2～8℃条件下储存，上机测试前使用储存缓冲液稀释到0.5mg/mL。
2.2、酶标抗体制备
使用1mL酶标缓冲液(0.1M PBS，0.15M NaCl，pH7.5)将1mg碱性磷酸酶溶解/稀释为10mg/mL的碱性磷酸酶溶液，加入16.7μL的Sulfo-SMCC(4mg/mL)，室温条件下温和孵育1h，产物脱盐后使用酶标缓冲液分散备用；
使用1mL酶标缓冲液将1mg TM抗体2稀释为10mg/mL的抗体溶液，加入5μL的Traut’s(10mg/mL)，室温条件下温和孵育1h，加入20μL(5mg/mL)甘氨酸溶液混匀后，继续孵育5min，产物脱盐后使用酶标缓冲液分散备用；
将活化的碱性磷酸酶和巯基化的TM抗体2混合均匀后，4℃条件下温和孵育24h后，加入50μL(10mg/mL)半胱氨酸混匀后，继续孵育30min，产物脱盐后用酶标储存缓冲液稀释，上机测试前使用酶标储存缓冲液稀释到0.5μg/mL。
2.3、抗体偶联率测定
分别利用不同的氨基硅烷和酸酐制备羧基磁珠，偶联抗体后测试免疫磁珠的抗体偶联率。利用BCA法测定上清中的抗体浓度，根据抗体投料量、磁分离后上清液的体积和蛋白浓度计算免疫磁珠的抗体偶联率，分别测试三批不同的磁珠，计算抗体偶联率的平均值和变异系数CV。结果如表2所示，利用乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷)和乙氯乙酸酐制备的磁珠抗体偶联率最高，变异系数CV最小，表明羧基磁珠的质量稳定，确定适用乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷)和乙氯乙酸酐制备羧基磁珠。
表2不同羧基磁珠抗体偶联率对比
分别利用本发明制备的羧基磁珠和默克的羧基磁珠偶联抗体制备免疫磁珠，抗体偶联后测定免疫磁珠的抗体偶联率，重复测试三次，计算平均值和变异系数。结果如表3所示，本发明制备的羧基磁珠抗体偶联率高且稳定，可以应用于血栓调节蛋白化学发光检测试剂盒的制备。
表3本发明羧基磁珠与默克羧基磁珠抗体偶联率对比
名称 测试1 测试2 测试3 平均值
默克羧基磁珠 80.93 74.97 76.63 77.51
本发明羧基磁珠 94.12 91.82 89.07 91.67
2.4、羧基含量的测定
利用实验优化后的方法制备羧基磁珠，并进行磁珠表面羧基含量的测定。通过化学滴定法测试羧基磁珠表面的羧基含量，如表4所示，本发明制备的羧基磁珠表面羧基含量较高，有利于磁珠表面抗体的偶联，因此抗体偶联率高。
表4本发明羧基磁珠与默克羧基磁珠羧基含量对比
2.5、定标曲线测试
酶标缓冲液的pH会影响制备的酶标抗体的立体结构，进而影响血栓调节蛋白抗原的检测。分别使用pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的酶标缓冲液制备酶标抗体，搭配制备优化后的免疫磁珠上机测试，拟合定标曲线，结果如图1所示，当pH为7.5时测得的光子量数值最高，线性关系最好，R2为0.9849，因此选择pH7.5的酶标缓冲液制备酶标抗体，用于血栓调节蛋白检测试剂盒的制备。
实施例3稳定性测试
将试剂盒存放在37℃，分别在第0、1、3、5、7、9、12天取出，将免疫磁珠、酶标抗体和样本放置在化学发光仪指定位置，按照以下流程进行测试：1)、将50μL免疫磁珠、50μL酶标抗体与10μL样本均匀混合，在37℃孵育30min；
2)、磁性分离，利用化学发光仪清洗液对复合物进行清洗；
3)、在清洗后的磁珠复合物中加入200μL的全自动免疫检验系统用底物液，在37℃条件下避光孵育5min；
4)、使用光电反应器测量反应后底物液的光子量；
5)、通过拟合的校准曲线计算样本浓度。
样本测试结果如表5所示，将后续测试结果与第0天测试结果进行比较，分别计算相对偏差，结果如表6所示，试剂盒在第1、3、5、7、9、12天测试结果与第0天测试结果的相对偏差均在±10％范围内，表明试剂盒稳定性良好。
表5、试剂盒稳定性测试结果
表6、试剂盒稳定性测试结果相对偏差分析
实施例4重复性测试
将本发明试剂盒、希森美康试剂盒与TM低值质控品、TM高值质控品分别放置在化学发光仪指定位置，上机进行测试，重复测试10次，计算测试结果的平均值和变异系数CV，结果如表7所示，本发明试剂盒测试结果的变异系数较小，表明其测值重复性较好。
表7重复性测试结果
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.羧基磁珠的制备方法，其特征在于，包括将可溶性三价铁离子盐制成纳米微粒内核，用二氧化硅包被后与羧基化硅烷反应，磁分离后得到。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将可溶性三价铁离子盐制成纳米微粒内核的步骤包括将可溶性三价铁离子盐、乙酸钠、高分子聚合物与乙二醇和乙二胺混合溶液反应，磁分离后得到Fe3O4纳米微粒；
所述高分子聚合物选自聚氧乙烯类、聚乳酸、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠中的任意一种；
所述反应的温度为180～300℃，反应的时间为6～12h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述二氧化硅包被纳米微粒内核的步骤包括将Fe3O4纳米微粒重悬后与正硅酸乙酯反应，磁分离后得到二氧化硅包被的Fe3O4纳米微粒；
所述正硅酸乙酯与Fe3O4纳米微粒的质量比为1：(10～30)；
所述Fe3O4纳米微粒重悬后的重悬液pH值为10～12；
所述正硅酸乙酯溶于乙醇中；
所述反应的温度为25～50℃，反应的时间为3～6h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述羧基化硅烷的制备方法包括将氨基硅烷与酸酐在无水溶剂中反应1～2h得到；
所述氨基硅烷与酸酐的摩尔比为1：(2～30)；
所述氨基硅烷选自乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷)、(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷中的任意一种；
所述酸酐选自己酸酐、苯硫代甲酸酐、苯磺酸酐、乙丙酸酐、环己甲酸酐、乙氯乙酸酐中的任意一种。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述氨基硅烷为乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷)，酸酐为乙氯乙酸酐。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述二氧化硅包被后的Fe3O4纳米微粒与羧基化硅烷反应的步骤包括将羧基硅烷溶于无水乙醇后与二氧化硅包被的Fe3O4纳米微粒反应2～6h，磁分离后得到；
所述反应的温度为25～50℃，pH值为10～12。
7.羧基磁珠，其特征在于，由权利要求1～6任一项所述制备方法获得。
8.血栓调节蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括利用权利要求7所述的羧基磁珠制备的免疫磁珠和酶标TM抗体；
所述免疫磁珠偶联TM抗体1；所述酶标TM抗体为碱性磷酸酶标记的TM抗体2；
所述TM抗体1和抗体2包括单克隆抗体或具有Fab活性的改性抗体片段、抗体、抗体片段多聚体。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述羧基磁珠与TM抗体1的质量比为(10～200)：1；
所述碱性磷酸酶与TM抗体2的质量比为(0.5～10)：1。
10.检测血栓调节蛋白含量的方法，其特征在于，包括利用权利要求8或9所述的试剂盒。
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