JPH0774805B2

JPH0774805B2 - タンパク質分解性劣化に対するポリペプチドフラグメントの安定化

Info

Publication number: JPH0774805B2
Application number: JP3069763A
Authority: JP
Inventors: コティビル; カンナピアー
Original assignee: マイクロジェニクスコーポレイション
Priority date: 1990-04-03
Filing date: 1991-04-02
Publication date: 1995-08-09
Anticipated expiration: 2010-08-09
Also published as: CA2039530C; ES2096623T3; DE69123073D1; DE69123073T2; AU631305B2; CA2039530A1; EP0450898A3; EP0450898B1; AU7403091A; US5212081A; JPH04222597A; EP0450898A2

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、タンパク質性試薬を安定化するために有用な
技法及び組成物に関し、そして特に詳しくは、相補性ア
ッセイに使用される酵素に由来するペプチドフラグメン
トの安定化に向けられる。

【０００２】発明の背景アッセイ混合物に存在する分析物の量を決定するために
使用される検出可能なシグナルを生成する段階として活
性酵素を形成するためにポリペプチドフラグメントの再
結合を利用する多くのイムノアッセイ及び他の結合アッ
セイが最近記載されている。これらのアッセイのいくつ
かは、相補性により形成される酵素としてβ−ガラクト
シダーゼ酵素を用いることを提案する。

【０００３】しかしながら、β−ガラクトシダーゼのフ
ラグメントに基づく試薬の安定性は所望するレベルより
も低いことが発見された。たとえば、フラグメントの貯
蔵時間が長くなるにつれて、活性酵素中に再形成するフ
ラグメントの能力の徐々ではあるが、連続的且つ有意な
損失が存在する。個々のβ−ガラクトシダーゼフラグメ
ント〔酵素−供与体又はＥＤフラグメント（２種のフラ
グメントの小さな方）、及び酵素受容体又はＥＡフラグ
メント（２種のフラグメントの大きな方）として言及さ
れる〕のサンプルとの組合せ又は接触の前での安定化
が、1987年４月６日に出願されたアメリカ特許出願第03
4,757(公開番号 0131864AZとして1985年１月23日に公開
されたヨーロッパ出願第84107889.2号に相当する）に記
載されている。十分な安定化は、そこに記載される方法
により達成され、ここで前記方法は、個々のフラグメン
トの長期間の貯蔵を可能にするために、界面活性剤の存
在下における酵素フラグメントの初期貯蔵、続く前記界
面活性剤が相補性工程を妨げないようにシクロデキスト
リンの添加を利用する。

【０００４】しかしながら、個々のフラグメントの貯蔵
安定性は、そのフラグメントがサンプルと接触される場
合、フラグメントの劣化からの種々の結果を表わす。こ
れまでの研究は、酵素供与体（ＥＤ）がタンパク質分解
性切断にひじょうに敏感であることを示した。たとえ
ば、ＥＤは、酵素受容体（ＥＡ）が存在しなければ、活
性β−ガラクトシダーゼが形成されるようにこのタンパ
ク質を発現する細菌から回収され得ない。さらに、細菌
により汚染された患者からのサンプルは、酵素相補性ア
ッセイにおいて低い値を示し、これはアッセイの間、Ｅ
Ｄ−分析物接合体に起因する。これらの患者からのサン
プルは、種々のアッセイにより細菌性プロテアーゼ活性
を有することが示される。プロテアーゼ汚染の効果は、
アッセイ媒体又は好ましくはＥＤ試薬におけるプロテア
ーゼインヒビター、たとえばアプロチニン又はPMSFの包
含により減じられ得るが、しかし排除され得ない。

【０００５】従って、細菌により汚染された血清におけ
るＥＤ破壊による酵素活性の損失は、分析者に対して所
望しない問題を提供する。アッセイ読み取りが低い場
合、タンパク質分解活性の別のアッセイが細菌汚染の可
能性を排除するために所望される。そのような追加のア
ッセイは、厄介であり、そして正確なアッセイ結果が得
られる速度を遅くする。従って、タンパク質分解性劣化
に対して酵素−供与体フラグメントを保護するための効
果的な技法が所望される。

【０００６】関連文献ポリペプチドフラグメントの再結合に基づくイムノアッ
セイシステムは、Farina and Golkey,1983年３月20日に
発行されたアメリカ特許第 4,378,428号及びGonelli な
ど., Biochem. and Biophys. Res. Commun. (1981) 10
2 : 917〜923 により記載されている。β−ガラクトシ
ダーゼα−相補性の分子性質は、Langley, UCLA,1975に
よる Ph.D.卒論に記載されている。相補性アッセイにお
ける天然の及び変性されたβ−ガラクトシダーゼポリペ
プチドに基づくアッセイシステムは、アメリカ特許第
4,708,929号及び1986年５月６日付けの国際出願日を有
するPCT出願 NO. PCT／US85／02095 に記載されてい
る。

【０００７】発明の要約本発明は、タンパク質分解性劣化に対してβ−ガラクト
シダーゼからの酵素−供与体フラグメント及び単純な構
造の他の活性ペプチドを安定化するための技法を提供す
る。タンパク質分解性劣化は、タンパク質分解がたぶん
生じるかも知れない媒体、典型的には血清を含むサンプ
ルアッセイ媒体に、二次構造を実質的に含まない線状ペ
プチドフラグメントの混合物を含むことによって回避さ
れる。プロテアーゼ活性の特異性は一般的に知られてい
ないので、線状ペプチドのランダム混合物が使用され
る。ランダムフラグメント混合物は、酵素−供与体フラ
グメントと共に血清の20分までのインキュベーションの
間、ＥＤ劣化のほとんど完全な阻止を示した。

【０００８】特定の態様の記載本発明の方法及び組成物により保護される酵素−供与体
（ＥＤ）フラグメントは、二次構造を実質的に有さない
比較的短い（典型的には60〜100 個のアミノ酸）線状ペ
プチドであり；すなわちそれは、酵素−受容体（ＥＡ）
フラグメントとの会合及び活性酵素の形成の前、ほとん
ど又はまったくα−ヘリックス、β−シート又は他の構
造的特徴を含まない。二次構造を有さないペプチドは、
切断のための必要な確認を引き受けるアミノ酸鎖と干渉
する構造体がほとんど又はまったく存在しないので、タ
ンパク質分解性切断に特に敏感である。さらに、ＥＤが
未知の起原の細菌により汚染される血清と接触される場
合、サンプルに存在するであろうタンパク質分解活性の
特異性を予測することはできない。従って、特異的イン
ヒビターは、いくつかの場合、有用であることがわかっ
ているが、分析的な設定において一般的に有用でない。

【０００９】本発明は、ＥＤのタンパク質分解性劣化
が、ランダム配列の可溶性線状ペプチドフラグメントの
ランダム混合物をその反応混合物に含むことによって実
質的に停止され得ることを発見した。これらのフラグメ
ントは、ＥＤとＥＡとの間の相補性がひじょうに特異的
であるので、その相補性アッセイを妨害しないであろ
う。しかしながら、それらは、タンパク質分解性酵素上
の結合部位のためのＥＤと競争し、それによってＥＤの
劣化が低下するであろう。

【００１０】本明細書に記載されるような発明が開発さ
れ、そしてそれは、α−相補性アッセイに使用される酵
素−供与体フラグメント、特にβ−ガラクトシダーゼ酵
素供与体フラグメントの劣化に対して保護するために特
に有用である。本発明はまた、タンパク質分解性劣化に
対して他の起原の二次構造を実質的に有さない特定の線
状ペプチドを保護するためにも一般的に適用できる。保
護され得る他のタンパク質フラグメント及び小さな未構
造ペプチドの例は、生物活性ペプチド、たとえばACTH、
エンドルフィン及びオキシトキシンを包含する。この論
議の残りは、β−ガラクトシダーゼＥＤフラグメントを
用いての一般的な技法を例示するが、しかしその技法
は、ＥＤフラグメントと他の所望するフラグメントとを
置換することによって他のフラグメントの保護に適用さ
れ得る。

【００１１】本明細書に記載される場合、二次構造を
“有さない”とは、二次構造の特徴を有さないことを意
味する（すなわち、ペプチドは、溶液中で線状の延長さ
れたコンホーメーションで存在する）。“実質的に有さ
ない”とは、ペプチドの合計配列の少なくとも分解可能
部分が、二次構造を有さず、好ましくは合計配列におけ
るアミノ酸の少なくとも25％（二次構造を有さないこれ
らのアミノ酸は好ましくは２つの末端のうち１つの端で
存在する）、より好ましくは少なくとも50％、さらによ
り好ましくは少なくとも75％を有することを意味する。
溶液においては、二次構造へのアミノ酸の一時的な会合
が生じる傾向がある。本発明の活性ペプチド分子はその
ような一時的な会合を示すけれども、それらは、前記会
合がランダムであり、そして非永久的であるので、二次
構造を“有さない”及び／又は二次構造を“実質的に有
さない”定義内に包含される。

【００１２】本発明の保護用ペプチド（以下、“保護ペ
プチド”と記する）は多くの一般的且つ特異的な特徴を
有するが、しかし１つの態様において、正確に説明する
のには困難なその性質により特徴づけられ、すなわち保
護組成物を形成するペプチドの長さ及び配列の両者が広
く変化するように意識的に選択される。正確に定義され
る種々の配列及び長さを含む混合物を調製するために自
動化されたペプチド合成技法を使用することは可能であ
るが、そのような方法はひじょうに費用がかかり、そし
て一般的に好ましくない。合成技法が使用される場合、
たとえば保護されていないアミノ酸の混合物を反応せし
めることによるペプチド混合物の真のランダム的発生
が、好ましい。二次構造を有さない線状ペプチドは又、
二次構造（及び三次構造）を有する大きなペプチド、た
とえばヒト血清タンパク質、ウシ血清アルブミン（BS
A)、免疫グロブリン及び卵白タンパク質のタンパク質分
解性切断によっても容易に得られる。これらのタンパク
質は、種々のタンパク質分解酵素、たとえばペプシン、
トリプシン、キモトリプシン、パパイン、キモパパイン
及びズブチリシンを用いてランダムに切断され得る。酸
性条件下で活性であるペプシン及び他の酵素は、酸性条
件が変性を促進するので、タンパク質の分解を促進せし
めるためには特に好ましい。

【００１３】タンパク質化学の当業者により十分に理解
されるように、酵素的分解によるペプチドフラグメント
の調製は統計学的感覚で真にランダム化され得ない。な
ぜならば、タンパク質分解のために使用される酵素は、
切断可能なアミド結合を形成する可能性ある個々のタイ
プのジペプチドに対する特定の特異性を有するであろう
からである。従って、酵素、たとえばペプシンにより処
理されたタンパク質、たとえばウシ血清アルブミンは好
ましくは、一定の位置で切断されるであろう。しかしな
がら、保護ペプチド混合物を形成するための大きなタン
パク質のタンパク質分解は完全よりかむしろ制限される
であろうから、いづれか与えられた混合物に存在するで
あろうペプチドの切断部位及び長さにおいて相当の変動
が存在する。さらに、ランダムな加水分解性切断は酸性
条件下で生じることができ、そして出発タンパク質の種
々の調製物は種々の異なった汚染性タンパク質を含むこ
とができ、その結果、たとえいくらかの規則性が切断工
程において生じたとしても、ランダムとして真に言及さ
れ得る。従って、用語“ランダム”とは、保護ペプチド
の配列及び長さの両者を説明するために本明細書におい
て使用される。

【００１４】本発明の保護ペプチド組成物が組織化され
た大きなタンパク質の加水分解により調製される場合、
加水分解は完全よりかむしろ制限され、その結果、その
得られるペプチド混合物は、個々のアミノ酸に加水分解
されるよりもむしろ種々の長さの種々のペプチドを含
む。その混合物は通常、２個〜約 200個のアミノ酸、好
ましくは30個〜90個のアミノ酸及び最っとも好ましくは
約60個〜80個のアミノ酸の長さの範囲のペプチドを含
む。これらの長さはまた、ランダム合成混合物のために
も好ましい。

【００１５】種々のタンパク質分解性酵素は異なった切
断速度を有し、そして種々のタンパク質は異なった速度
で切断されるであろうから、条件、たとえば時間、温度
及び試薬の濃度は使用される特定のタンパク質及び酵素
に従って変えられるであろう。典型的な工程は、続く例
に示される。しかしながら、タンパク質化学の当業者
は、有意な変法が、同じ結果を実質的に達成しながら、
実施され得ることを理解するであろう。たとえば、温度
は反応速度を早めるために高められ得、そしてタンパク
質分解性酵素の濃度の低下は反応速度を遅くするであろ
う。有用且つ容易に実施される、保護ペプチドの調製の
ための試験は、５〜10％、好ましくは約6.25％のトリク
ロロ酢酸（TCA)を含む溶液における可溶性ペプチドの出
現の測定である。そのような TCA溶液は典型的には大き
なタンパク質を沈殿せしめ、その結果、 TCA溶液におけ
る可溶性ペプチドの出現は、タンパク質分解性酵素によ
る親タンパク質の切断の表示である。これらの可溶性ペ
プチドは、ペプチド合成システム、たとえば 280nmでの
吸光度により測定され得る。

【００１６】保護は保護ペプチドと所望する生物活性ペ
プチドとの間の競争により生じると思われるので、いづ
れかの量の保護ペプチド混合物が所望する生物活性ペプ
チドのタンパク質分解性切断をある程度に減じるであろ
う。生物活性ペプチドに対して少なくとも10倍過剰（重
量）の保護ペプチドを使用することが好ましい。保護ペ
プチドの溶解性及び生物活性ペプチドの濃度によっての
み制限されるより高い比（たとえば10²:１, 10⁴:１, 10
⁶:１, 10⁸:１,10¹⁰:１又はそれ以上）が使用され得る。
重量比は、実際の重量計量により又はタンパク質及びペ
プチドの相対量を決定するために使用される分析的な工
程、たとえば280nmでの光吸光度又は比色アッセイ（こ
れは、より正確な結果を得るために保護ペプチド混合物
の既知希釈溶液に対して行なわれ得る）により調整され
得る。

【００１７】タンパク質分解性酵素が保護ペプチド混合
物を調製するために使用される場合、そのタンパク質分
解性酵素を不活性化し、又は得られる保護混合物がＥＤ
含有媒体と接触される前、その混合物からそれを分離す
ることが必要である。たとえば、酵素、たとえばペプシ
ンは、煮沸湯にペプシン含有組成物を20分間含浸するこ
とによって不活性化され得る。他の酵素は、それらの酵
素を不活性化することが知られている特定の条件を用い
て不活性化され得る。保護ペプチドは二次構造を有さな
いので、それらの二次及び三次構造を破壊することによ
りタンパク質分解性酵素を不活性化するために使用され
る技法は、同じ組成物に存在する保護ペプチドに悪影響
を及ぼさないであろう。サイズ分別（たとえばゲル瀘
過）がまた、所望する小さなペプチドフラグメントから
大きな活性分子を分離するためにも使用される。

【００１８】本発明により保護される酵素−供与体フラ
グメントは、上記に引用された特許出願、特許及び他の
出願に十分に説明される。従って、ＥＤ成分の十分な記
載はこの時点で必要とされない。しかしながら、手短か
な説明が、このアッセイ技法にほとんど精通していない
人々のために提供される。相補的アッセイは、両者とも
それ自体活性的でない２種の酵素フラグメントが活性酵
素を形成するために相補的段階として知られる段階で組
換えするアッセイである。従って、相補的アッセイは、
酵素がレポーター酵素として作用するアッセイの種類に
一般的に属する。すなわち、分析物の存在は、アッセイ
媒体に存在する酵素活性の量に基づいて検出され、そし
て定量化され、通常、酵素による基質の生成により測定
される。従って、酵素は、分析物の存在を増幅するため
に作用する。

【００１９】相補的アッセイに対する多くの変法が存在
する。１つの典型的なアッセイにおいては、分析物の類
似体（たとえばジゴキシン）が酵素−供与体フラグメン
トに結合される。その類似体自体は相補的工程を妨害す
るほど十分な大きさのものではない。従って、単にラベ
ルされたＥＤフラグメント及び酵素受容体（ＥＡ）フラ
グメントが存在する場合、活性酵素は相補的段階に起因
するであろう。しかしながら、抗体がＥＤフラグメント
に結合される分析物類似体に結合する場合、相補性は多
量の抗体のために生じることができない。ＥＤ／分析物
接合体、分析物に対する抗体及びＥＡのみを含むアッセ
イ媒体においては、相補性は生じないであろう。しかし
ながら、分析物の存在下で、いくつかの抗体が分析物に
結合し、それによって、ＥＡと反応し、そして活性酵素
を供給するためにＥＤ／分析物接合体を開放する。サン
プルにおける分析物のより高い濃度は、分析物が多くの
抗体と結合するにつれて、より活性的な酵素の産生を引
き起こすであろう。従って、分析物の量は、再形成され
た酵素の量により定量化され得る。

【００２０】レポーター酵素がβ−ガラクトシダーゼで
ある場合、ＥＤフラグメントは典型的には、完全なペプ
チドのアミノ−ターミナーゼからのセグメントである。
そのようなフラグメントは典型的には、約90個のアミノ
酸の長さのものであり、そして天然のβ−ガラクトシダ
ーゼの配列、又は安定性を高め、分析物の容易な結合又
はこのアッセイを分析的に使用する人々に良く知られて
いる他の目的を付与するために天然の配列からわずかに
変えられた配列と同じアミノ酸配列を使用した。多くの
変法に関しては、上記に引用された特許及び他の出版物
を参照のこと。

【００２１】本発明の目的はサンプルにおけるタンパク
質分解アッセイから生じるタンパク質分解性劣化に対し
てＥＤを保護することであるので、ＥＤ及び保護ペプチ
ドを含むアッセイ媒体の種々の成分を組合す場合に使用
され得る多くの技法が存在する。たとえば、保護ペプチ
ド混合物が、サンプルへのＥＤフラグメントの添加の前
又は同時にサンプルに添加され得る。操作を最少にする
ために、ＥＤ貯蔵組成物に保護ペプチド混合物を含むこ
ともまた可能である。さらに、補足された酵素活性の劣
化速度は、１分当たりたった約１％、タンパク質分解性
劣化（存在する場合）により減じられるので、ＥＤが媒
体と接触せしめられた後、アッセイ組成物に保護ペプチ
ド混合物を添加することもまた可能である。しかしなが
ら、保護ペプチドの前もっての添加、特にＥＤ貯蔵媒体
における保護ペプチド混合物の包含が好ましい。貯蔵劣
化に対する保護は保護ペプチド混合物により提供される
と思われるので、ＥＤ貯蔵組成物に保護ペプチド混合物
を含むことが好ましい。ある場合、十分な貯蔵安定性
が、上記に引用されるアメリカ特許出願第 034,757号に
記載されるような界面活性剤及びシクロデキストリンを
必要としないで提供される。保護の程度は特定のアッセ
イにより変化し、そしてＥＤフラグメントに結合される
分析物又は分析物類似体に依存する。しかしながら、貯
蔵媒体における保護ペプチド混合物の包含はまた、アッ
セイが行なわれる場合に実施されるべき操作段階の数も
減じ、そして保護ペプチド混合物はアッセイに対して悪
影響を及ぼさないので、貯蔵媒体における混合物の包含
は、貯蔵劣化に対する保護が付与されない場合でさえ所
望される。

【００２２】追加の操作段階は、相補的アッセイにおけ
る本発明の保護ペプチド組成物の使用のために必要とさ
れない。一般的なアッセイは下記に説明される。正確な
時間、温度及び他の反応条件を含む特定の詳細は、下記
例に示される。

【００２３】ヒト血清サンプルの典型的なアッセイにお
いては、適切なアリコートのヒト血清、相補的アッセイ
条件を最適化するために緩衝液を含む希釈溶液、ＥＤフ
ラグメントのタンパク質分解性劣化を妨ぐための保護ペ
プチド混合物及び予定された量のＥＤ／分析物接合体及
びＥＡを含む反応混合物が調製される。補足される酵素
のための基質は、初期反応混合物に存在することができ
又は後で添加され得る。ほとんどの場合、生成物におけ
る基質の転換は、生成物は吸収するが、しかし基質は吸
収しない波長で光度分析的に測定されるであろう。次
に、光度分析測定が、基質生成物の転換の速度又は特定
の時間で形成される生成物の量から行なわれる。この光
度分析測定の結果と既知量の分析物を含むサンプルに対
して行なわれた分析の結果とを比較することによって、
サンプルにおける分析物の量は測定され得る。

【００２４】本発明の実施は使用者による操作を必要と
して、そして本発明は、ペプチドの混合物が、始まって
いるが、しかしまだ完全でないタンパク質分解切断の結
果として天然に存在する情況を包含することに向けられ
ていないことが理解されるべきである。本発明は、本明
細書に記載されるようなペプチドの保護混合物を組成物
に含むことによって（組成物又は組成物の前駆体に直接
添加することによって）生物学的活性ペプチドの保護を
包含する。本発明は、さらに理解するために次の例によ
り示されるが、これは本発明を制限するものではない。

【００２５】

【実施例】例１血清タンパク質の加水分解による保護ペプチドの調製血清(Biocellからのヒト血清）５mLを脱イオン水５mLに
より希釈し、そして次に１mLのアリコートに分けた。個
々のアリコートに、0.１ＭのHCl(3.３のpHをもたらす）
400 μＬ及びペプシン(Sigmaからのブタペプシン；１mM
の HCl中、１mg／mL) 50μＬを添加した。その混合物を
種々の時間、すなわち０，５，10, 20, 30及び60分間37
Ｃでインキュベートした。インキュベーションの後、反
応混合物を0.５ＭのK₂HPO₄ 100μＬにより処理し、そし
て煮沸湯槽に20分間インキュベートし、ペプシンを不活
性化した。その混合物を冷却し、そして15分間遠心分離
し、そして中和された血清タンパク質加水分解物を含む
上清液画分を試験のために除去した。

【００２６】例２ BSAの加水分解による保護ペプチド混合物の調製ウシ血清アルブミン（BSA;Sigma 0.３ｇ）を脱イオン水
６mLに溶解し、そして次に１mLのアリコートに分けた。
個々のアリコートに、0.１ＭのHCl(3.１のpHをもたら
す)350μＬ及びペプシン（１mMの HCl中、１mg／mL) 50
μＬを添加した。この混合物を種々の時間：10, 20, 30
及び60分間37Ｃでインキュベートした。この反応混合物
を0.６ＭのK₂HPO₄ 100μＬにより処理し、そして煮沸湯
槽中で20分間インキュベートし、ペプシンを不活性化し
た。その混合物を冷却し、そして15分間遠心分離した。
中和された BSA加水分解物を含む上清液画分を下記試験
のために除いた。

【００２７】例３タンパク質加水分解の測定例１及び例２における個々の異なったインキュベーショ
ンにおけるタンパク質加水分解の程度を、 280nmでのそ
れらの吸光度により TCA−可溶性ペプチドの開放性を測
定することによって評価した。個々の加水分解物50μＬ
を脱イオン水 700μＬ及び25％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢
酸（TCA) 250μＬにより希釈した。その混合物を15分間
急冷せしめた。次に、その混合物を15分間遠心分離し、
そして上清液画分を別々の管にデカントした。別々の画
分の吸光度を、ブランクとして水750μＬ及び25％ TCA
250μＬを含む溶液を用いて、 280nmで測定した。これ
らの加水分解の結果は図１に示される。

【００２８】例４ＥＤ安定性に対するタンパク質加水分解物の効果ＥＤ安定性に対するタンパク質加水分解物の効果を、種
々のタンパク質加水分解物の存在及び不在下で血清サン
プルをＥＤと共に予備インキュベートし、次にＥＤ活性
の２段階自動化測定により測定した。

【００２９】初期インキュベーションは、ヒタチサンプ
ルカップに、ヒト血清（分析される試験血清）80μＬ、
希釈溶液（80mMのリン酸ナトリウム，10mMのEGTA，20mM
のアジ化ナトリウム, 0.１％のBSA,pH6.９）20μＬ、保
護活性について試験されるタンパク質加水分解物又はア
ッセイ緩衝液（60mMのリン酸カリウム,0.４ＭのNacl, 1
0mMのEGTA, ３mMの酢酸マグネシウム，20mMのアジ化ナ
トリウム, 0.05％のTween-20, pH7.０）80μＬを含ん
だ。アッセイ緩衝液中、ＥＤ−ジゴキシンの0.23nM溶液
20μＬを最後に添加し、そしてこの混合物を室温（約22
Ｃ）で種々の時間インキュベートした。終結時間が40秒
間隔（二重反復測定を可能にするために自動化されたヒ
タチ 704分析器のサンプリング時間の２倍）で存在する
ように、種々のインキュベーションを開始した。

【００３０】混合物をヒタチ 704分析器のサンプルロー
ター上に置き、そしてアッセイを予備インキュベーショ
ン期間の最後で開始した。アッセイ段階は、キュベット
にサンプル混合物20μＬ及びＥＡ試薬（アッセイ緩衝液
にＥＡ100 単位を含む）を添加し、混合し、そして37Ｃ
で５分間インキュベートすることによって始まった。ア
ッセイ緩衝液１mL当たりクロロフェノールレッド−μ−
Ｄ−ガラクトピラノシド（CPRG；Boehringer Mannheim
Biochemicals) 2.６mgを含む基質試薬 130μＬを添加
し、混合し、そして37Ｃでインキュベートした。 570nm
で１分当たりの吸光度の変化の速度を、基質の添加の
後、約70秒〜約 130秒間測定した。

【００３１】これらのアッセイの結果は、図２（血清タ
ンパク質加水分解物）及び図３(BSA加水分解物）に示さ
れる。ＥＤ劣化は、上記に記載され、そして図２（“ペ
プチド不在”線）に示される特定のアッセイの作りによ
り示されるように、保護タンパク質の不在下で試験血清
と共にインキュベーション後、初めの10分間は急速であ
り、そしてこの劣化は、10〜30分の間のある点で遅くな
り又は平坦になった。ＥＤ活性の損失は、インキュベー
ションにおけるヒト血清の存在により引き起こされ；血
清の不在下で、劣化は生じなかった（図２の“血清不
在”の線を参照のこと）。血清のペプシン加水分解によ
り得られた保護ペプチドは、20分及び30分の加水分解物
の両者を用いて、血清及びＥＤのインキュベーションが
始まった後、30分間までの間、ＥＤ劣化のほとんど完全
な阻害を示した。幾分高い阻害が、20分の加水分解物に
比べて30分の加水分解物を用いて得られた。

【００３２】BSAのペプシン加水分解により得られた保
護ペプチドはまた、図３に示されるようにＥＤ劣化を阻
害した。阻害は、血清加水分解物によるよりもより完全
であり、そして阻害はＥＤと共に血清の60分間までのイ
ンキュベーションの間、続いた。少々の差異が30分の加
水分解と60分の加水分解との間で見られた。

【００３３】本明細書に言及されたすべての出版物及び
特許出願は、引用により本明細書に組込まれる。前述の
発明は、明確に理解するために例示的且つ例的にいくら
か詳細に記載されているけれども、特許請求の範囲内で
修飾及び変更を行なうことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】これは、本発明において保護ペプチドとして使
用される線状ペプチドのランダム混合物を調製するため
に使用されるタンパク質加水分解の時間依存性を示すグ
ラフである。

【図２】これは、血清と共にインキュベーションした後
のＥＤ活性の損失及び同じサンプルがランダム線状ペプ
チドの存在下でインキュベーションされる場合、この損
失の低下を示すグラフである。

【図３】これは、血清と共にインキュベーションした後
のＥＤ活性の損失及びサンプルが図２に示されるペプチ
ド以外のランダム線状ペプチドの異なった混合物の存在
下でインキュベーションされる場合、この活性の損失の
低下を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】相補性アッセイにおける酵素−供与体フ
ラグメントを安定化する方法であって：前記アッセイが
行なわれるアッセイ媒体に、前記酵素−供与体フラグメ
ントのタンパク質分解性劣化を減じるのに十分な量で可
溶性のランダム−配列ペプチドの混合物を含むことを含
んで成る方法。
【請求項２】前記混合物がタンパク質加水分解物を含
んで成る請求項１記載の方法。
【請求項３】前記混合物がウシ血清アルブミンの加水
分解物を含んで成る請求項２記載の方法。
【請求項４】前記混合物がヒト血清タンパク質加水分
解物を含んで成る請求項２記載の方法。
【請求項５】前記混合物が合成ペプチドを含んで成る
請求項１記載の方法。
【請求項６】相補性アッセイにおけるタンパク質分解
性劣化に対して酵素−供与体フラグメントを安定化させ
てなる組成物であって、酵素−供与体フラグメントを含
む溶液及び前記組成物が血清サンプルに添加される場
合、タンパク質分解に対して前記フラグメントを安定化
するのに十分な量での可溶性のランダム−配列ペプチド
の混合物を含んで成る組成物。
【請求項７】前記ペプチドがヒト血清タンパク質の加
水分解物を含んで成る請求項６記載の組成物。
【請求項８】前記ペプチドがウシ血清アルブミンの加
水分解物を含んで成る請求項６記載の組成物。
【請求項９】前記ペプチド：前記フラグメントが少な
くとも10：１の重量比で存在する請求項６記載の組成
物。
【請求項10】タンパク質分解性劣化に対して実質的に
二次構造体を伴わないで生物学的活性線状ペプチドを安
定化するための方法であって：前記活性ペプチドを含
み、そして前記タンパク質分解性切断が生じる媒体に、
前記活性ペプチドのタンパク質分解を減じるのに十分な
量で可溶性ランダム−配列ペプチドの混合物を含むこと
を含んで成る方法。