JPS643477B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用を阻
害して反応を停止させるための新規方法に関す
る。 近年、β−Ｄ−ガラクトシダーゼは酵素免疫測
定法（以下、「EIA法」と略す。）における抗原ま
たは抗体の標識用酵素としての用途が飛躍的に増
大している。このEIA法においてはβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ活性の実測値が測定対象成分の存在
量に直接反映されるため、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ活性の測定にあたつては、酵素反応生成物の
検出感度が高く且つ正確な測定値を求める必要が
ある。従来このEIA法の分野で採用されているβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性（作用）の測定方法
としては、主として合成基質を用い、且つそのβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用の停止手段として反
応液のPH値をβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの至適PH
域から大きくはずれたアルカリ側に移す手法が採
用されている。しかし乍らβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ作用停止のためのこのPH移行の手法は操作的
に簡単ではあるものの、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ作用を完全に停止できる方法ではなかつた。し
たがつて、PH移行の手法によつてβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼ作用を停止後直ちに反応生成物量を実
測できない場合には残存基質へのβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼ作用が徐々に進行して、正確な反応生
成物量が把握できず、また、測定成績が大きくば
らつくことが極めて多い。殊に、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ作用時における反応温度が高ければ高
い程この測定成績のばらつき現象は一層増大す
る。 本発明者は、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用の
測定方法における上記問題点を解決すべく鋭意検
討した結果、PH値９以上のアルカリ性領域下で、
不溶化したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼと、エチレ
ンジアミン四酢酸、エチレンジアミン、しゆう酸
及びピロリン酸より成る群より選択されたキレー
ト剤とを接触せしめることにより、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ作用を完全に停止できることを見出
し、この発見に基づいて本発明を完成するに至つ
た。 この方法によれば、操作的に簡便であり、また
測定時間面での制約なしにβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ作用が把握できるので、極めて有利である。
もちろん、従来のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用
による反応生成物の測定条件、方法をそのまま利
用することができる。 本発明に使用するキレート剤は金属イオンに配
位してキレート化合物をつくる多座配位子であ
り、塩、例えば、ナトリウム、カリウム等のアル
カリ金属塩、コバルトや銅等の重金属塩の形で使
用されてもよい。その例として、エチレンジアミ
ン四酢酸（以下、「EDTA」と略記する。）、エチ
レンジアミン、しゆう酸及びピロリン酸がある。
この中で、β−Ｄ−ガラクトシダーゼへの阻害作
用が極めて強く、かつ劇毒物としての取扱いを必
要としない点で通常EDTAが好ましい。一般的
にキレート剤（試薬）は金属イオンに配位する官
能基を２個以上有しており、その主たる配位原子
である酸素、窒素および硫黄原子がＯ、Ｏ−配
位、Ｎ、Ｎ−配位、Ｓ、Ｓ−配位、Ｏ、Ｎ−配
位、Ｓ、Ｎ−配位、Ｏ、Ｓ−配位の如く配位して
キレート環を形成することが知られている。本発
明におけるキレート剤はキレート剤単独で使用す
ることも出来るが、通常は他の補助剤、例えば緩
衝液と併用するとβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用
への阻害効果をより高られる点で好ましい。この
際、本発明は、キレート剤と併用する緩衝液の構
成成分やその組成、液性に左右されることなく、
またβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの給源如何や、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用を検出用手段として
活用した測定対象物の種類如何に何ら制限される
ことなく実施することが出来る。さらに本発明の
実施にあたつてはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを不
溶化状態で使用し、またβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ作用による酵素基質からの反応生成物の測定手
段が比色分析法、分光分析法、蛍光分析法、発光
分析法等のいずれの方法によつてもよい。次に、
本発明におけるキレート剤の使用量は極めて少量
でβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用への阻害効果を
示す為に殊に使用量に特別な制限はないが、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ使用量との関係を考慮しな
がら通常は1mM以上存在させることが望ましい。 β−Ｄ−ガラクトシダーゼとキレート剤とを接
触させる条件は、酵素の至適作用PH域外のアルカ
リ性領域であるが、PH値９以上例えばPH９〜
11.5、好ましくはPH10〜10.5である。 以下、実施例により本発明を詳細に説明する。 実施例 １ 各種起源のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用に対
するEDTAの阻害効果 0.1M−Naclおよび５×10^-3M Mgcl₂を含む
0.01M−リン酸緩衝液（PH7.3）の0.3ml中に大腸
菌（Escherichia coli）由来β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼの0.2ミリユニツトを含む液〔Ａ液〕、
0.05M−グリシン緩衝液（PH3.5）の0.3ml中に黒
麹菌（Aspergillus niger）由来β−Ｄ−ガラク
トシダーゼの約0.5ミリユニツトを含む液〔Ｂ液〕
および0.05M−クエン酸ソーダ緩衝液（PH4.5）
の0.3ml中にたちなたまめ（Jack bean）由来β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ約30ミリユニツトを含む
液〔Ｃ液〕の３種を用意する。この各液にｐ−ニ
トロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシドの2mM液
（Ａ、Ｂ、Ｃ各液に対応した緩衝液で溶解させた
もの。）の１mlを加えてからＡ液は37℃下、Ｂ液
およびＣ液は25℃下で１時間反応させた後、
0.2M−ホウ酸ソーダ緩衝液（PH9.8）〔Ｄ液〕ま
たはEDTA1mMを含む0.2M−ホウ酸ソーダ緩衝
液（PH9.8）（Ｅ液〕の３mlを加え、生成したｐ−
ニトロフエノール量を波長420nｍにおける吸光
直で測定した（１次測定と略す）。次いで１次測
定の終了した上記各溶液を上記反応条件下に更に
一夜放置した後、再度波長420nｍにおける吸光
度を測定した（２次測定）。 以上、１次測定の結果を100とし、２次測定の
成績を相対値で示すと

【表】 となつた。即ち、１次測定時従来のホウ酸ソーダ
緩衝液のみを用いた場合は１次測定後においても
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用が更に進行したの
に対し、EDTA1nM添加時においてはいずれの
起源由来のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用につい
てもその作用は完全に停止した。 実施例 ２ 不溶化β−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用に対する
各種キレート剤の阻害効果 加藤らの方法（加藤兼房ら、化学と生物14（No.
11）737、14（No.12）817（1976））にしたがつて
TSH（甲状腺刺激ホルモン）抗体を不溶化せしめ
たガラスビーズ（６mmΦ×６mm）および大腸菌産
生のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを標識したTSH
−酵素複合体を調製した後、加藤らの方法の緩衝
液Ａ液0.3ml中に前記ビーズ１ケおよび前記の
TSH−酵素複合体の希釈液0.01mlを加えて37℃
下一夜静置して反応させた。次いで、このビーズ
を緩衝液Ａ液の１mlを用いて３回洗浄した後、同
Ａ液0.3mlを含む他の試験管へ移してから、酵素
基質４−メチルウンベリフエリル−β−Ｄ−ガラ
クトシドの３×10^-4M液0.05mlを加えて37℃下１
時間静置して反応させた。この反応１時間後に、
0.1M−グリシン−NaOH緩衝液（PH10.3）また
はこの緩衝液に後述の如き各種試薬の１種を
1mMあて加えてからPH10.3に再調製した緩衝液
の１種を2.5mlずつ添加して励起波長360nｍ、蛍
光波長450nｍで生成した４−メチルウンベリフ
エロンの蛍光値を測定した（１次測定）。次いで
１次測定の終了した上記各溶液を室温下更に24時
間放置した後、再度上記の如く蛍光値を測定した
（２次測定）。以上の如くして１次測定で得られた
蛍光値を100とし、２次測定の成績を相対値で示
すと

【表】 となり、不溶化したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ酵
素作用に対しても各種キレート剤の顕著な阻害現
象が認められた。 実施例 ３ 不溶化β−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用に対する
EDTAの阻害効果 大腸菌の産生するβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを
抗体への標識用酵素とするEIA法を応用した市販
のα−フエトプロテイン測定キツト、免疫グロブ
リンＥ測定キツトを用いて、ガラスビーズまたは
ポリスチレンビーズ上に不溶化されたβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ活性を０−ニトロフエニル−β−
Ｄ−ガラクトシドを酵素基質として実施例１の手
順に準じて測定し次表の結果を得た。

【表】 即ち、不溶化したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの
酵素作用は、その不溶化状態が異つてもまた不溶
化したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性測定方法
が可視部吸光法であつてもEDTA添加によるβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用への阻害効果は極め
て大であつた。 実施例 ４ EDTAによるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用
の阻害効果とPHの関係 実施例２の如くして、TSH抗体を不溶化せし
めたガラスビーズの表面上に大腸菌産生のβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼを標識したTSH−酵素複合
体を結合せしめて結果的にβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼを不溶化せしめたビーズを調製した。次に
0.1％−牛血清アルブミン、0.1％−NaN₃、0.1M
−Nacl、10mM Mgcl₂含む0.01M−リン酸緩衝
液（PH7.3）の0.30mlを分注した試験管中に前記
のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ不溶化ビーズを移し
た後、実施例２で用いた酵素基質液0.05mlを加え
てから37℃下静置して反応させた。１時間反応後
に、EDTA1mMを含み、且つPH7.3、PH8.5、PH
9.4、PH10.3に調製された0.1M−グリシン−
NaOH緩衝液の１種を2.5mlずつ添加して実施例
２の手法で生成した４−メチルウンベリフエロン
の蛍光値を測定した（１次測定）。この１次測定
の終了した上記溶液を37℃下更に３時間放置した
後、再度上記の如く蛍光値を測定した（２次測
定）。１次測定で得られた各区における蛍光値を
100とし、２次測定における測定結果を相対値で
示した。

【表】 即ち、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用に対する
EDTAの阻害効果は、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼの至適作用PH域であるPH7.3から大きくずれた
強アルカリ性PH領域において顕著に発現した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ PH値９以上のアルカリ性領域下で、不溶化し
   たβ−Ｄ−ガラクトシダーゼと、エチレンジアミ
   ン四酢酸、エチレンジアミン、しゆう酸及びピロ
   リン酸より成る群より選択されたキレート剤とを
   接触せしめることを特徴とするβ−Ｄ−ガラクト
   シダーゼ作用の停止方法。