CN101171518B - 铁浓度测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及铁浓度测定方法，所述方法用于样品中铁浓度的测定。本发明还涉及在该测定方法中使用的铁测定用试剂和试剂盒。本发明所涉及的测定方法的特征在于，在锂离子的共存下使样品中的铁与铁螯合物显色剂接触，基于产生的显色的程度进行测定。根据本发明可以解决以往的问题即所得到的测定值比以国际标准法得到的测定值低的问题，并且不需要除蛋白等复杂的操作，能够利用自动分析装置测定铁浓度，并且其测定值与以国际标准法的标准添加法得到的测定值近似，所以能够更精确地测定。

Description

铁浓度测定方法
技术领域
本发明涉及使用铁螯合物显色剂利用直接法测定样品中铁浓度的方法，所述方法中在锂离子的共存下进行测定。
背景技术
血清和血浆中的铁浓度的测定被用于贫血、缺铁性贫血、肝硬化等的诊断，其是临床检查领域中的重要的测定项目之一。
作为铁浓度的测定方法，通常为使用例如联吡啶、邻菲咯啉等各种金属螯合物显色剂的比色分析法。考虑灵敏度、特异性、溶解性等时，经常使用红菲绕啉、2-亚硝基-5-(N-丙基-N-磺基丙基氨基)-苯酚(亚硝基PSAP)、3-(2-吡啶基)-5，6-双[2-(5-呋喃基磺酸)]1，2，4-三嗪·二钠盐、三吡啶基三嗪、铁锌体等铁螯合物显色剂。
这些显色剂全部是二价铁的显色剂，所以使用时需要同时使用用于将三价铁还原的还原剂。作为三价铁的还原剂，已知有L-抗坏血酸、硫代乙醇酸、盐酸羟基胺、氢醌、亚硫酸氢盐、亚硫酸钠、硫酸肼、偏亚硫酸氢盐(焦亚硫酸盐)等。
血清中的铁全部以与作为血清球蛋白之一的铁传递蛋白结合的形式存在，所以测定血清铁的总量时，需要将该铁传递蛋白与铁的键合解离，形成游离的铁后进行铁浓度的测定。作为使与铁传递蛋白结合的铁游离的方法，已知有采用除蛋白法的例如国际标准法(临床检查法提要，修订第32版第1次印刷，579页，金井正光编著，平成17年2月20日发行，金原出版株式会社)以及在确立国际标准法的过程中作为其基础数据而受到重视的松原变法(临床检查法提要，修订第32版第1次印刷，580-581页，金井正光编著，平成17年2月20日发行，金原出版株式会社)。根据这些方法，对要测定铁浓度的样品进行除蛋白处理后，加入铁螯合物显色剂，测定吸光度，以此测定样品中铁的总量。
但是，近年随着自动分析装置的发展，临床检查通常也开始通过自动分析装置来进行了。该自动分析装置要求检体或测定用试液的取样量少，所以是经济的，并且其还具有可以一次处理大量检体的优点。因此，期待血清铁等的浓度的测定也使用自动分析装置来进行，但是，国际标准法和松原变法要在测定前对样品进行除蛋白处理，所以其存在难以适于使用自动分析装置进行测定的问题。
与此相对，还存在在样品中直接加入还原剂和显色剂进行比色测定的“直接比色法(以下记作“直接法”)”的铁浓度测定方法(例如非专利文献1：临床检查法提要，修订第32版第1次印刷，579页，金井正光编著，平成17年2月20日发行，金原出版株式会社)。与上述的国际标准法等相比，这种方法是不进行除蛋白操作的方法，能够适用于自动分析装置。因此，临床检查领域中正在普及使用自动分析装置利用直接法测定铁浓度的方法。
但是上述方法存在的问题是，使用自动分析装置利用直接法测定得到的测定值与利用国际标准法测定得到的测定值相比，直接法的测定值比国际标准法的测定值低。由于国际标准法中对样品进行了除蛋白处理，所以能够使样品中的铁完全(100％)与铁传递蛋白发生解离，而对于使用自动分析装置的直接法来说，有报告指出，其不能将铁从铁传递蛋白还原解离出来，所解离出的铁的比例(解离度)约为93％～95％左右(第51届日本临床检查医学会总会，演题编号0-76，2004)，据认为这是引起上述问题的原因之一。
因此，现状是期待确立一种铁浓度测定方法，其既能得到与国际标准法同程度的测定值，又能使用自动分析装置进行测定。
非专利文献1：金井正光编著，临床检查法提要，修订第32版第1次印刷，金原出版株式会社，平成17年2月20日发行，579页
发明内容
本发明是鉴于上述情况而提出的，其课题在于提供利用直接法测定铁浓度的方法以及在该方法中使用的试剂和试剂盒，并且所述测定方法能得到与国际标准法同等的测定值。
本发明的目的在于解决上述课题，其具有如下构成。
(1)样品中铁浓度的测定方法，该方法的特征在于，在锂离子的共存下使样品中的铁与铁螯合物显色剂接触，基于产生的显色的程度进行测定。
(2)一种铁测定用试剂，其含有铁螯合物显色剂和锂离子。
(3)一种铁浓度测定用试剂盒，其含有包含铁螯合物显色剂和锂离子的试剂作为构成试剂。
即，本发明人为解决上述课题进行了深入研究，结果发现，若在锂离子的共存下利用直接法进行铁浓度的测定，则铁与铁传递蛋白的解离得到促进并且与铁螯合物显色剂的反应得以按化学理论量进行，从而完成了本发明。
以往多用红菲绕啉磺酸钠、3-(2-吡啶基)-5，6-双[2-(5-呋喃基磺酸)]1，2，4-三嗪·二钠盐等钠盐作为铁螯合物显色剂，但是，利用这样的钠盐不能实现本发明的效果。并且也并没有发现实际上使用锂盐作为这些铁螯合物显色剂的盐的例子。因此，通过共存有锂离子(该锂离子来自与钠同属于碱金属的锂)而得到上述效果完全是意料之外的。
通过进行本发明的铁浓度测定方法，可以解决与国际标准法相比所得到的测定值低这一现有问题，并且无需除蛋白等的复杂操作，可以利用自动分析装置进行铁浓度测定，而且其测定值与利用国际标准法的标准添加法所得的测定值相近，所以能够进行更精确的测定。
具体实施方式
本发明涉及的铁浓度测定方法为样品中铁浓度的测定方法，其中，在锂离子的共存下使样品中的铁与铁螯合物显色剂接触，基于产生的显色的程度进行测定。
作为本发明的测定方法中使用的铁螯合物显色剂，只要是与铁结合后具有特异吸收的二价铁显色剂即可，例如可以使用本身公知的基于直接法的铁浓度测定中所使用的铁螯合物显色剂。
作为铁螯合物显色剂的具体例子，可以举出例如红菲绕啉磺酸或其盐、2-亚硝基-5-(N-丙基-N-磺基丙基氨基)-苯酚、3-(2-吡啶基)-5，6-双[2-(5-呋喃基磺酸)]1，2，4-三嗪或其盐等。
作为红菲绕啉磺酸或3-(2-吡啶基)-5，6-双[2-(5-呋喃基磺酸)]1，2，4-三嗪的盐，可以举出例如钠、钾、锂等碱金属的盐。
本发明中涉及的铁螯合物显色剂的用量可以结合铁螯合物显色剂的特性进行确定，对其没有特别限制。
例如，使用红菲绕啉磺酸或其盐的情况下，其在试液中的浓度为0-5～5mM左右、优选为1～2mM左右，在最终反应液中的浓度为0.1mM～1mM左右、优选为0.2mM～0.5mM左右。
使用2-亚硝基-5-(N-丙基-N-磺基丙基氨基)-苯酚的情况下，其在试液中的浓度为0.2mM～1mM左右、优选为0.3mM～0.6mM左右，在最终反应液中的浓度为0.06mM～0.4mM左右，优选为0.1mM～0.2mM左右。
使用3-(2-吡啶基)-5，6-双[2-(5-呋喃基磺酸)]1，2，4-三嗪或其盐的情况下，其在试液中的浓度为1mg/mL～5mg/mL左右、优选为1mg/mL～3mg/mL左右，在最终反应液中的浓度为0.2mg/mL～1mg/mL左右，优选为0.3mg/mL～0.7mg/mL左右。
本发明中的锂离子在反应液中的浓度没有特别限制，其用量同样可结合测定体系中使用的铁螯合物显色剂的种类进行确定，其在试液中的浓度以锂离子计为0.1mM～100mM、优选为1mM～100mM左右，在最终反应液中的浓度为0.05mM～100mM、优选为0.5mM～100mM左右。
本发明涉及的测定方法中使用二价铁显色剂，因而需要使样品中结合在铁传递蛋白上的三价铁与铁传递蛋白解离并还原成二价铁。作为为此使用的三价铁的还原剂，抗坏血酸、谷胱甘肽、焦亚硫酸钠、硫代乙醇酸、盐酸羟基胺、硫醇化合物等通常在该领域中使用的还原剂全部可以使用。其中，通常使用的是抗坏血酸。
至于还原剂的用量，根据所用的还原剂的种类、所使用的铁螯合物显色剂和使用时的pH的不同，该用量有所不同，并且随着pH的上升，其必要量也会增加，因此不能一概而论，但可以从通常用于该领域中的范围进行适当选择。该还原剂在试液中的浓度为0.0006mM～400mM、优选为10mM～150mM左右，在最终反应液中的浓度为0.0005mM～300mM、优选为10mM～100mM。
为了实施本发明的铁浓度测定方法，可以使用铁螯合物显色剂并在锂离子的共存下利用本身公知的直接法进行测定，此外只需基于通常的临床检查领域所进行的本身公知的直接法的测定条件(例如反应时间、测定波长等)、测定操作法进行实施即可。
实施基于直接法的铁浓度测定方法时，作为使锂离子共存的方法，只要是最终可以得到含有样品、还原剂、锂离子、铁螯合物显色剂的溶液的方法即可。但是，优选在用还原剂对样品进行处理后加入锂离子，或者将锂离子与还原剂同时加入至样品中。另外，优选在加入锂离子后或者与锂离子同时将铁螯合物显色剂加入至样品中，但并不限于此。但是，不希望在加入锂离子前将铁螯合物显色剂加入至样品中。
另外，作为使锂离子共存于直接测定的测定体系中的方法，通常使用其盐的形式的方法是最简便的，但并不特别地限于该方法。此时使用的盐的种类只要不妨碍该溶液中共存的试剂等的稳定性并且不妨碍铁螯合物显色剂的显色即可，没有特别的限制，可以举出与例如硫酸、硝酸等无机酸的盐；与例如氯、溴、碘等卤原子的盐(卤化物)；与例如醋酸、柠檬酸、葡糖酸、丙酸、泛酸等有机酸的盐；与上述的铁螯合物显色剂的盐等。
实施基于直接法的铁浓度测定方法时，作为使锂离子共存的具体方法，例如可以举出如下方法。
方法(1)：制备还原剂溶液、含锂离子的溶液、铁螯合物显色剂溶液，在样品中依次加入还原剂溶液、含锂离子的溶液、铁螯合物显色剂溶液；
方法(2)：制备含有还原剂和锂离子的溶液、铁螯合物显色剂溶液，在样品中依次加入含有还原剂和锂离子的溶液、铁螯合物显色剂溶液；
方法(3)：制备还原剂溶液以及含有锂离子和铁螯合物显色剂的溶液，在样品中依次加入还原剂溶液、含有锂离子和铁螯合物显色剂的溶液；
方法(4)：制备含有还原剂、锂离子和铁螯合物显色剂的溶液，在样品中加入该溶液，使这些成分一起发挥作用。
上述方法中，从作业效率等考虑，通常的方法是方法(2)，该方法是优选的。
另外，还可以使用通常在临床检查领域中使用的铁浓度测定用的、使用铁螯合物显色剂的市售品，并使锂离子存在于构成该市售品的某种试剂中，形成上述的状态。
作为溶解铁螯合物显色剂、锂离子以及还原剂的溶液，因为希望在对铁螯合物显色剂合适的pH范围内进行铁浓度的测定，所以优选缓冲液。
本发明的测定方法中，测定时的优选pH为pH 1～7，更优选为pH 2～6。作为构成为了使pH处于上述范围而使用的缓冲液的缓冲剂，通常在该领域使用的缓冲液全部可以使用。具体地说，可以举出例如甘氨酸、醋酸、柠檬酸、酒石酸等。
另外，除上述试剂外，当然还可以共存有表面活性剂、各种防腐剂、稳定剂、活化剂、共存物质的影响回避剂以及通常临床检查试剂中所使用的物质。对于这些试剂种类等的浓度范围等，适当选择本身公知的该测定方法中通常使用的浓度范围等就可以，但优选所选择的试剂在本发明的铁浓度测定方法中使用的铁螯合物显色剂的合适pH范围内的稳定性高，并且不妨碍铁螯合物显色剂的显色。
作为本发明涉及的测定方法中使用的表面活性剂，只要其不妨碍所使用的铁螯合物显色剂的显色即可，可以使用非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、两性表面活性剂中的任何类型，只需结合所使用的铁螯合物显色剂的特性适当选择使用。
例如，至于上述的表面活性剂的使用浓度，从通常在该领域中使用的范围中适当选择即可。其在试液中的浓度通常为0.0001％～10％(W/V)左右、优选为0.001％～5％(W/V)左右，在最终反应液中的浓度通常为0.001％～10％(W/V)左右、优选为0.01～5％(W/V)左右。
使铁螯合物显色剂以及锂离子作用于样品后，利用本身公知的直接法测定由于铁螯合物显色剂的作用而产生的显色即可，至于测定时使用的其他试剂、自动分析装置、分光光度计等，通常用于该领域中试剂、装置、分光光度计等均无例外地可以使用。另外，吸光度变化当然还可通过使用主波长和副波长的双波长测光来计算。
此外，用于吸光度测定的测定波长根据所使用的铁螯合物显色剂的种类适当选择即可，使用红菲绕啉磺酸或其盐作为铁螯合物显色剂、以双波长进行测定的情况下，优选在主波长546nm附近、副波长600nm附近进行测定。
作为用于本发明的方法中的样品，可以举出例如血清、血浆等血液成分。
以上述方法(2)(制备含有还原剂和锂离子的溶液、铁螯合物显色剂溶液，在样品中依次加入含有还原剂和锂离子的溶液、铁螯合物显色剂溶液)为例，如下具体说明本发明的铁浓度测定方法。
首先，将例如血液、血清、血浆等要测定铁浓度的样品与含有还原剂、锂离子、缓冲剂以及必要时的表面活性剂等的第一试液(pH 2～6)混合，并在通常10℃～50℃、优选20℃～40℃反应通常2分钟～10分钟、优选5分钟左右。接着，将该反应液与含有铁螯合物显色剂、缓冲剂以及必要时的缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等的第二试液(pH 2～10)混合，并在通常10℃～50℃、优选20℃～40℃反应通常2分钟～15分钟、优选10分钟左右。以吸光度的形式测定由于铁螯合物显色剂的作用而产生的显色。将得到的测定值用于标准曲线，由此求出样品中的铁浓度，所述标准曲线是预先使用例如浓度已知的铁标准液作为样品并与上述同样地进行测定而制成的曲线，其显示铁浓度和吸光度的关系。
上述铁浓度的测定当然可以通过手动方法进行，本发明的方法由于可以用于使用自动分析装置的测定系统，因而当然可以使用自动分析装置进行测定。此外，使用手动方法或自动分析装置进行测定的情况下，对于试剂种类的组合没有特别限定，结合应用的自动分析装置的环境、其他要因等适当进行组合即可。
本发明涉及的铁浓度测定用试剂含有铁螯合物显色剂和锂离子，其优选方式、具体例以及浓度等如上所述。
本发明的铁浓度测定用试剂盒只要含有包含铁螯合物显色剂以及锂离子的试剂作为构成试剂即可。各构成要件的优选方式、具体例以及使用浓度等如上所述。
另外，该试剂盒的各试剂中还可以在通常该领域使用的范围内具有该领域通常使用的例如缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、稳定剂等。另外，该试剂盒中根据需要还可以组合有铁标准品。
另外，该试剂盒由2个以上的试液构成的情况下，各试液中还可含有对测定对象成分进行测定所必须的试剂种类，对于这些试剂种类，可以将其适当分散到各试液中的任一试液中以含有该试剂，并在混合各试液时引发目的成分测定的反应。构成这些试液的试剂种类的使用浓度可从通常在该领域中使用的范围内进行适当选择。
作为本发明的试剂盒的具体实施方式，例如可以举出如下构成。
(1)由含有还原剂的第一试液、含有铁螯合物显色剂的第二试液构成，并且在上述第一试液和第二试液的至少一方中含有锂离子。
(2)以含有还原剂、锂离子、铁螯合物显色剂的试液作为构成试剂。
下面举出实施例和参考例更详细地说明本发明，但这些不对本发明构成任何限制。
实施例
参考例1
根据国际标准法、国际标准法的标准添加法(国际标准法中因除蛋白而导致液量减少，所以为了对其进行修正，向样品中添加3当量(濃度)的铁进行测定，根据与其回归式的X轴的交点求出样品中的铁浓度)以及使用自动分析装置的现有的直接法，测定同样的血清样品1～5的血清中的铁浓度，比较各自的测定值。
(1)国际标准法
根据临床检查法提要(修订第32版第1次印刷，580页，金井正光编著，平成17年2月20日发行，金原出版株式会社)记载的方法如下进行。
[试剂的制备]
·除蛋白试剂：将98g三氯醋酸(特级)溶解在约600mL水中，加入30mL硫代乙醇酸和83mL盐酸(特级)，混合后用水定容到1000mL。用褐色瓶保存。
·显色试剂：在1000mL 1.5M乙酸钠(特级)中加入并溶解250mg红菲绕啉磺酸(道蒂特试剂)。
·铁标准液(200μg/dL)：将1mL铁标准液(Fe1000)(和光纯药工业(株)制造)用水稀释至100mL(1mg/dL)，并将其进一步用水稀释5倍，使用该稀释液。
[血清铁浓度的测定]
1)取血清样品1～5各2.0mL放入容器，分别加入2.0mL除蛋白试剂，用混合器充分混合后，在56℃加热15分钟，然后再次混合，随后进行离心处理。
2)取2.0mL上清液，加入2.0mL显色试剂，充分混合后，放置1 0分钟。
3)与使用血清样品时同样地对水(盲检用)和铁标准液进行上述1)和2)的操作(但是不进行离心处理)。
4)以水为对照，在535nm测定检体、标准液、盲检的各显色液的吸光度，分别记作EA、ES、EB，应用下式计算各样品中的血清铁浓度。
血清铁浓度＝200×(EA-EB)/(ES-EB)μg/dL
结果示于表1。
(2)国际标准法的标准添加法
国际标准法中因除蛋白而导致液量减少，所以为了对其进行修正，向样品中添加3当量的铁，然后进行测定，根据与其回归式的X轴的交点求出样品中的铁浓度。
[试剂以及试验溶液的制备]
取与国际标准法中所用相同的血清样品1～5，每个样品分别放入4个容器，每个容器放入2.0mL，在对应每个样品的四个容器中的三个中加入铁标准液，使其分别为50μg/dL、100μg/dL、150μg/dL，将这三种溶液和没有加入铁标准液的溶液作为试验溶液使用。
试剂使用与上述(1)国际标准法相同的试剂。
[血清铁浓度的测定]
对上述制备的试验溶液按与上述(1)国际标准法相同的步骤进行吸光度的测定。
制作显示得到的吸光度与浓度的关系的曲线图，根据其回归式的X轴与原点的距离求出样品中的铁浓度。
结果一并示于表1。
(3)使用自动分析装置利用现有的直接法的测定方法
使用市售的基于直接法的铁浓度测定用试剂盒(A社制造、B社制造、C社制造；分别记作试剂盒A、试剂盒B、试剂盒C)，试剂盒的组成分别如下所示，根据各试剂盒的现货说明书记载的标准操作法，分别如下设定测定参数，测定血清样品1～5的铁浓度。
结果一并示于表1。
此外，测定使用日立7170S型自动分析装置，将得到的吸光度值用于标准曲线，由此确定铁浓度，所述标准曲线是预先使用例如铁浓度已知的样品代替血清样品并同样地进行测定而制成的曲线，其显示铁浓度和吸光度的关系。
[试剂盒A]
(R-1)缓冲液：含有40mM抗坏血酸并含有表面活性剂的400mM甘氨酸缓冲液(pH3.5)
(R-2)显色试液：含有1.86mM红菲绕啉磺酸钠并含有表面活性剂的40mM甘氨酸缓冲液(pH3.0)
测定方法：2点终点法[16]-[34]
样品量：12μL
R-1：160μL
R-2：40μL
测定波长：600/546nm
测定温度：37℃
标准品浓度：200μg/dL
[试剂盒B]
(R-1)还原剂溶液：含有L-抗坏血酸的溶液。
(R-2)显色液：含有0.45mM 2-亚硝基-5-(N-丙基-N-磺基丙基氨基)-苯酚的溶液
测定方法：2点终点法[16]-[34]
样品量：15μL
R-1：150μL
R-2：60μL
测定波长：750/600nm
测定温度：37℃
标准品浓度：200μg/dL
[试剂盒C]
(R-1)缓冲液：组成不明
(R-2)显色液：含有2.47mg/mL 3-(2-吡啶基)-5，6-双[2-(5-呋喃基磺酸)]1，2，4-三嗪·二钠盐等的溶液
测定方法：2点终点法[16]-[34]
样品量：12μL
R-1：180μL
R-2：45μL
测定波长：700/600nm
测定温度：37℃
标准品浓度：200μg/dL
(4)结果
结果示于下述表1。
表1中，将测定值的比例分别示于各平均值下面的()内，该测定值的比例中，以基于国际标准法的标准添加法进行测定所得到的测定值为100，计算基于国际标准法、或者使用试剂盒A、B或C的直接法进行测定所得到的测定值的比例。
[表1]
                         血清铁浓度(μg/dL)
国际标准法     国际标准法的标准添加法 A B C
  血清1     126     120   118   114   115
  血清2     148     143   139   135   133
  血清3     98     95   93   89   87
  血清4     128     122   119   115   114
  血清5     187     179   175   169   170
平均     137.4(104.2％)     131.8(100％)   128.8(97.7％)   124.4(94.4％)   123.8(93.9％)
由表1可知，与国际标准法和标准添加法所得到的测定值相比，基于现有的直接法测定所得到的测定值较低。
实施例1
[试液的制备]
(R-1)缓冲液
含有10mM的氯化锂、氯化钠、氯化钾或氯化铯(碱金属离子为10mM)、40mM抗坏血酸、以及表面活性剂的400mM甘氨酸缓冲液(pH3.5)
(R-2)显色试液
含有1.86mM红菲绕啉磺酸钠以及表面活性剂的40mM甘氨酸缓冲液(pH3.0)
[血清铁浓度的测定]
使用上述的试液，利用日立7170S型自动分析装置对血清样品6～10进行测定。
〔测定条件〕
如下设定测定参数，测定各样品中的血清铁浓度。
测定方法：2点终点法[16]-[34]
样品量：12μL
R-1：160μL
R-2：40μL
测定波长：600/546nm
测定温度：37℃
标准品浓度：200μg/dL
将所得到的吸光度值用于标准曲线，由此确定铁浓度。所述标准曲线是预先使用例如铁浓度已知的样品代替血清样品并同样地进行测定而制成的曲线，其显示铁浓度和吸光度的关系。
此外，测定时的碱金属离子浓度为约7.5mM。
[结果]
结果示于表2。
作为对照，使用同样的血清样品，根据参考例1的国际标准法的标准添加法进行测定。结果一并示于表2。
表2中，将测定值的比例分别示于各平均值下面的()内，该测定值的比例中，以基于国际标准法的标准添加法进行测定所得到的测定值为100，计算在各碱金属离子的共存下以直接法进行测定所得到的测定值所占的比例。
并且，将与国际标准法的标准添加法的差一并示于表2，其中，以基于国际标准法的标准添加法进行测定得到的测定值为100，计算在各碱金属离子的共存下以直接法进行测定所得到的测定值的比例(％)，将该测定值的比例(％)与以国际标准法的标准添加法进行测定得到的测定值(100％)的差作为“与国际标准法的标准添加法的差”。
表2
                               血清铁浓度(μg/dL)
    国际标准法的标准添加法                         碱金属离子
  无添加   Li   Na   K   Ce
血清6     127   123   126   124   123   125
血清7     152   147   153   147   147   149
血清8     113   111   113   112   112   112
血清9     178   173   176   173   175   175
血清10     88   85   87   86   85   86
平均     131.6   127.8   131.0   128.4   128.4   129.4
    (100％)   (97.1％)   (99.5％)   (97.6％)   (97.6％)   (98.3％)
与国际标准法的标准添加法的差 2.9％ 0.5％ 2.4％ 2.4％ 1.7％
由表2可知，在钠、钾、铯等碱金属离子的共存下以直接法进行测定的情况下，所得到的测定值比以国际标准法的标准添加法所得到的测定值低。与此相对，只有在共存有锂离子的条件下同样以直接法进行测定时所得到的测定值与以国际标准法的标准添加法所得到的测定值近似，能够实现本发明的目的。据推测，这是因为只有在共存有锂离子的条件下铁与铁传递蛋白进行解离时解离出的全部铁才能与螯合物显色剂进行结合并显色。
实施例2
除了在“(R-1)缓冲液”中添加氯化锂使之达到0.1mM、1mM、10mM或100mM的浓度(测定时的锂离子浓度分别为0.075mM、0.75mM、7.5mM、75mM)以外，使用与实施例1同样制备的试剂，以与实施例1同样的方法进行血清样品11～15的铁浓度的测定。
结果示于表3。
作为对照，使用同样的血清样品，以参考例1的国际标准法的标准添加法进行测定。结果一并示于表3。
表3中，将测定值的比例分别示于各平均值下方的()内，该测定值的比例中，以基于国际标准法的标准添加法进行测定所得到的测定值为100，计算在各浓度的氯化锂存在下以直接法进行测定所得到的测定值所占的比例。
[表3]
                                   血清铁浓度(μg/dL)
    国际标准法的标准添加法                    测定时的锂离子浓度(mM)
    0   0.075    0.75     7.5    75
血清11     138     132   136    137     138    138
血清12     115     112   114    116     115    116
血清13     174     169   171    175     173    175
血清14     138     134   135    137     138    137
血清15     92     90   90    93     92    93
平均     131.4(100％)     127.4(97.0％)   129.2(98.3％)    131.6(100.2％)     131.2(99.8％)    131.8(100.3％)
由表3可知，通过共存有锂离子能够更高精度地进行铁浓度的测定，特别是测定时的锂离子共存量为0.075mM以上、更优选为0.075mM～75mM的范围时，测定值没有差别，并且与国际标准法的标准添加法的测定值一致。
实施例3
在参考例1的“(3)使用自动分析装置利用现有的直接法的测定方法”中，在各试剂盒的缓冲液或还原剂溶液中加入氯化锂，使其浓度为10mM(使用试剂盒A和试剂盒C的情况下，测定时的锂离子浓度为7.5mM，使用试剂盒B的情况下，测定时的锂离子浓度为6.7mM)，以此作为(R-1)缓冲液，除此以外以与参考例1同样的方法进行血清样品16～20中血清铁浓度的测定，将其结果作为“添加”的情况示于表4。
另外，以参考例1的“(3)使用自动分析装置利用现有的直接法的测定方法”测定同样的血清样品中的血清铁浓度。将其结果以“无添加”的情况一并示于表4。
另外，作为对照，使用同样的血清样品，以参考例1的国际标准法的标准添加法进行测定。结果一并示于表4。
此外，表4中，将测定值的比例分别示于各平均值的下方的()内，该测定值的比例中，以国际标准法的标准添加法进行测定所得到的测定值为100，计算存在或不存在氯化锂(锂离子)的条件下以直接法进行测定所得到的测定值的比例。并且，以不存在氯化锂下进行测定所得到的测定值为100，将氯化锂存在的条件下使用相同的试剂盒进行测定所得到的测定值的比例也以“相对无添加”一并示于表4。
[表4]
                                   血清铁浓度(μg/dL)
    国际标准法的标准添加法            A          B          C
  无添加   添加   无添加   添加   无添加   添加
  血清16     138   132   138   128   129   128   130
  血清17     115   112   115   109   111   110   111
  血清18     174   169   173   162   164   161   163
  血清19     138   134   138   129   130   128   130
  血清20     92   90   92   86   97   85   88
平均     131.4(100％)   127.4(97.0％)   131.2(99.8％)   122.8(93.5％)   124.2(94.5％)   122.4(93.2％)   124.4(94.7％)
  相对无添加   100％   103.0％   100％   101.1％   100％   101.6％
由表4可知，虽然对于不同种类的铁螯合物显色剂有不同程度的效果，但是使用任一种试剂盒的情况下，在氯化锂(锂离子)的共存下，根据直接法使用铁浓度测定用试剂盒进行测定时，所得到的测定值高于不存在氯化锂下进行测定时所得到的测定值，并且接近于国际标准法的标准添加法的测定值。
产业上的可利用性
本发明提供能得到与国际标准法同等的测定值的以直接法测定铁浓度的方法以及该方法中使用的试剂和试剂盒。
通过进行本发明的铁浓度测定方法，可以解决以往的问题(即所得到的测定值低于以国际标准法得到的测定值的问题)，并且不需要除蛋白等复杂的操作，能够利用自动分析装置测定铁浓度，并且其测定值与以国际标准法的标准添加法的测定值近似，所以能够更精确地测定。

Claims (8)

1.样品中铁浓度的测定方法，该测定方法的特征在于，在最终反应液中的锂离子浓度为0.05mM～100mM的锂离子的共存下使样品中的铁与铁螯合物显色剂接触，基于产生的显色的程度进行测定。
2.如权利要求1所述的测定方法，其中，所述铁螯合物显色剂为红菲绕啉磺酸或其盐、2-亚硝基-5-(N-丙基-N-磺基丙基氨基)-苯酚、3-(2-吡啶基)-5，6-双[2-(5-呋喃基磺酸)]1，2，4-三嗪或其盐。
3.如权利要求1所述的测定方法，其中，所述锂离子来自锂盐。
4.如权利要求1所述的测定方法，其中，所述铁螯合物显色剂是红菲绕啉磺酸或其盐。
5.如权利要求1～4任一项所述的测定方法，其中，共存有还原剂，从而将样品中的铁还原成二价。
6.一种铁浓度测定用试剂盒，所述试剂盒由含有还原剂的第一试液和含有铁螯合物显色剂的第二试液构成，其中上述第一试液和第二试液中的至少一方含有锂离子，试液中的锂离子浓度为0.1～100mM，在用于测定铁离子浓度的最终反应液中，所述锂离子的浓度为0.05mM～100mM。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其中，所述试剂盒通过含有包含还原剂和锂离子的第一试液以及包含铁螯合物显色剂的第二试液来构成。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其中，所述铁螯合物显色剂是红菲绕啉磺酸或其盐。
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