WO2006121027A1 - 鉄濃度測定法 - Google Patents

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Wataru Akahane
Haruhisa Ijiri
Toshiro Hanada
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Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
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    • G01N21/80—Indicating pH value

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring iron concentration in a sample by a direct method using an iron chelate color former, and relates to a method for measuring in the presence of lithium ions.
  • these color formers are all divalent iron color formers, they need to be used in combination with a reducing agent for reducing trivalent iron.
  • trivalent iron reducing agents include L-ascorbic acid, thioglycolic acid, hydroxylamine hydrochloride, hydroquinone, hydrated sulfate, sodium sulfite, hydrazine sulfate, and metabisulfite (pyrosulfite). ing.
  • a deproteinization method As a method for releasing iron bound to transferrin, a deproteinization method is applied.
  • an international standard method (clinical test method proposal, revised 32nd edition, first edition, page 579, edited by Masamitsu Kanai, February 2005 20 Issued in Japan, Kinbara Edition Co., Ltd.), and the Matsubara Modified Method, which was emphasized as basic data in the process of establishing international standard law And edited by Masamitsu Kanai, published on February 20, 2005, Kanehara Publishing Co., Ltd.).
  • the iron chelate color former is added and the absorbance is measured to determine the total amount of iron in the sample.
  • the measured value obtained by the direct method using an automatic analyzer becomes the measured value of the international standard method.
  • the sample is deproteinized, so the iron in the sample can be completely (100%) released.
  • the direct method using an automatic analyzer can also release iron to the reduction.
  • the ratio of iron released (freeness) is about 93-95% (The 51st Annual Meeting of the Japanese Society for Clinical Laboratory Medicine, Abstract No. 0-76, 2004). This is one of the causes of such problems.
  • Non-Patent Document 1 Edited by Masamitsu Kanai, Proposal of Clinical Examination Law, Revised 32nd edition, 1st edition, Kanehara Publishing Co., Ltd., issued February 20, 2005, page 579
  • the present invention has been made in view of the above situation, and provides an iron concentration measurement method by a direct method, and a reagent and kit used therefor, which can obtain a measurement value equivalent to the international standard method. Let it be an issue.
  • the present invention has been made for the purpose of solving the above-described problems, and has the following configuration.
  • a method for measuring the concentration of iron in a sample wherein the iron in the sample is brought into contact with an iron chelate color former in the presence of lithium ions, and measurement is performed based on the degree of coloration that occurs.
  • a reagent for measuring iron comprising an iron chelate color former and lithium ions.
  • a kit for measuring iron concentration comprising a reagent containing an iron chelate color former and lithium ions as a constituent reagent.
  • the iron concentration measurement method of the present invention By performing the iron concentration measurement method of the present invention, the problem of low measurement values obtained compared to the international standard method, which has been a problem in the past, is solved, and complicated operations such as deproteinization are required. Therefore, the iron concentration can be measured by an automatic analyzer, and the measured value is close to the measured value by the standard addition method of the international standard method, so that more accurate measurement is possible.
  • the iron concentration measurement method according to the present invention is described as follows: "Iron and iron chelate in a sample in the presence of lithium ions.” A method for measuring the iron concentration in a sample, characterized in that the measurement is performed based on the degree of color development that is caused by contacting with a color former. Is.
  • the iron chelate color former used in the measurement method of the present invention may be any divalent iron color former that binds to iron and has specific absorption, for example, a direct method known per se. It is possible to use an iron chelate color former that has been used for the measurement of iron concentration by the above method.
  • iron chelate color former examples include, for example, bathophenantorin phosphorus sulfonic acid or a salt thereof, 2-troso-5- (N propyl-N-sulfopropylamino) -phenol, 3— (2 pyridyl) 5 , 6 bis [2- (5 furylsulfonic acid)] 1,2,4 triazine or a salt thereof.
  • the amount of the iron chelate color former according to the present invention is not particularly limited as long as it is determined according to the characteristics of the iron chelate color former.
  • the concentration in the test solution is about 0.5 to 5 mM, preferably about 1 to 2 mM, and the concentration in the final reaction solution is 0.1 to : About LmM, preferably about 0.2 to 0.5 mM.
  • the concentration in the test solution is about 0.2-lmM, preferably about 0.3-0.6 mM.
  • concentration in the final reaction solution is about 0.06 to 0.4 mM, preferably about 0.1 to 0.2 mM.
  • the concentration in the test solution is 1 to 5 mgZmL.
  • the concentration in the final reaction solution is about 0.2 to 1 mgZmL, preferably about 0.3 to 0.7 mgZmL.
  • the concentration of the lithium ion according to the present invention in the reaction solution may be determined according to the type of the iron chelate color former used in the same measurement system, although the amount used is not particularly limited.
  • the concentration in the lithium ion is O.lmM ⁇ : LOOmM, preferably 1
  • the concentration in the final reaction solution is about 0.05 to: LOOmM, preferably about 0.5 to about LOOmM.
  • the measurement method according to the present invention uses a divalent iron color former, it binds to the transferrin in the sample, releases the transferrin force of the trivalent iron, and reduces it to divalent iron.
  • the trivalent iron reducing agent used for this purpose all reducing agents usually used in this field such as ascorbic acid, glutathione, sodium pyrosulfite, thioglycolic acid, hydroxylamine hydrochloride, thiol compounds, etc. are used. Is possible. Of these, ascorbic acid is commonly used.
  • the amount of reducing agent used varies depending on the type of reducing agent used, the iron chelate color former used, and the pH at the time of use, and the required amount increases with increasing pH, so it cannot be said unconditionally. However, what is necessary is just to select suitably from the range normally used in this field
  • the concentration in the test solution is 0.0006 to 400 mM, preferably about 10 to 150 mM, and the concentration in the final reaction solution is preferably 0.0005 to 300 mM, preferably 10 to 100 mM.
  • the method for measuring the iron concentration of the present invention is carried out in the field of normal clinical tests, except that an iron chelate color former is used and measurement is performed by a known direct method in the presence of lithium ions. Please follow the measurement conditions of the direct method known per se (for example, reaction time, measurement wavelength, etc.) and the measurement operation method.
  • a method for allowing lithium ions to coexist when the iron concentration measurement method by the direct method is carried out, finally, a method in which a solution containing a sample, a reducing agent, lithium ions, and an iron chelate color former is obtained. If it is. However, it is preferable that the lithium ions be applied to the sample at the same time as the force applied after the sample is treated with the reducing agent or the reducing agent.
  • the iron chelate color former is preferably added to the sample after lithium ions are added or simultaneously with lithium ions. However, it is not desirable to add the iron chelate color former to the sample before adding lithium ions.
  • a method for allowing lithium ions to coexist in a measurement system for direct measurement a method in which the method of using a salt form thereof is usually the simplest is not particularly limited to this method.
  • the type of salt used at this time may impair the stability of reagents coexisting in the solution, It is not particularly limited as long as it does not inhibit the color formation of the chelating color former, but for example, a salt with an inorganic acid such as sulfuric acid or nitric acid, for example, a salt with a halogen atom such as chlorine, bromine or iodine (halogenated compound) ), Salts with organic acids such as acetic acid, citrate, darconic acid, propionic acid and pantothenic acid, and salts with iron chelating colorants as described above.
  • a reducing agent solution, a solution containing lithium ions, and an iron chelate color former solution are prepared, and a reducing agent solution, a solution containing lithium ions, and an iron chelate color former solution are added to the sample in this order.
  • the method (2) is general and preferable in consideration of work efficiency and the like.
  • the preferred pH at the time of measurement in the measurement method of the present invention is ⁇ 1-7, more preferably pH2-6.
  • the buffering agent constituting the buffer used for adjusting the pH to the above range all those usually used in this field can be used. Specific examples include glycine, acetic acid, citrate, and tartaric acid.
  • surfactants, various preservatives, stabilizers, activators, coexisting substance influence avoidance agents, and substances commonly used in clinical diagnostic agents may coexist. Needless to say, it doesn't matter.
  • concentration range of these reagents and the like it is sufficient to appropriately select and use a concentration range ordinarily used in the measurement method known per se, but the iron chelate used in the iron concentration measurement method of the present invention is sufficient. It is desirable to select a color former that is stable within the optimum pH range of the color former and that does not inhibit the color development of the iron chelate color former.
  • the surfactant used in the measurement method according to the present invention is a nonionic surfactant, a cationic surfactant, an anion unless it inhibits the color development of the iron chelate color former to be used.
  • Either an ionic surfactant or an amphoteric surfactant can be used, and it may be appropriately selected according to the characteristics of the iron chelate color former to be used.
  • the use concentration of the surfactant as described above may be appropriately selected from the range usually used in this field.
  • the concentration in the test solution is usually about 0.0001 to 10% (WZV), preferably about 0.001 to 5% (WZV).
  • the concentration in the final reaction solution is usually about 0.001 to 10% (wZv), Preferably, it is about 0.01 to 5% (wZv).
  • the iron chelate color former and lithium ions are allowed to act on the sample, other reagents used in the measurement can be measured by measuring the color produced by the action of the iron chelate color former in accordance with a direct method known per se. Any of the automatic analyzers, spectrophotometers, etc. that are usually used in this field can be used without exception. Needless to say, the change in absorbance may be obtained by two-wavelength photometry using the main wavelength and the sub wavelength.
  • the measurement wavelength for absorbance measurement may be appropriately selected depending on the type of iron chelate color former to be used.
  • the iron chelate color former bathophenantorin phosphosulfonic acid or a salt thereof is used, and at two wavelengths.
  • Examples of the sample used in the method of the present invention include blood components such as serum and plasma.
  • the iron concentration measurement method of the present invention is the same as the method of (2) above (a solution containing a reducing agent and lithium ions and an iron chelate color former solution are prepared, and the sample contains the reducing agent and lithium ions.
  • a method of adding a solution followed by an iron chelate color former solution It becomes as follows.
  • a sample to be measured for iron concentration such as blood, serum, and plasma, and a first reagent solution (pH 2 to 6) containing a reducing agent, lithium ions, a buffering agent, and a surfactant if necessary.
  • the mixture is usually reacted at 10 to 50 ° C, preferably 20 to 40 ° C, usually 2 to: L0 minutes, preferably about 5 minutes.
  • the reaction solution is mixed with an iron chelate color former and a buffer, and if necessary, a second test solution (pH 2 to 10) containing a buffer, a preservative, a surfactant, etc., and usually 10 to 50 ° C,
  • a second test solution pH 2 to 10
  • the reaction is preferably performed at 20 to 40 ° C., usually for 2 to 15 minutes, preferably about 10 minutes.
  • the color developed by the action of the iron chelate color former is measured as the absorbance.
  • the measured values obtained are measured in the same manner using, for example, an iron standard solution with a known concentration as a sample, and applied to a calibration curve showing the relationship between the prepared iron concentration and absorbance. Concentration is required
  • the above-described iron concentration measurement may be performed by a method of course.
  • the method of the present invention can be applied to a measurement system using an automatic analyzer, and thus is performed using an automatic analyzer. Needless to say.
  • the reagent for measuring iron concentration according to the present invention contains an iron chelate color former and lithium ions, and preferred embodiments, specific examples, concentration concentrations, and the like are as described above.
  • the iron concentration measurement kit of the present invention only needs to contain a reagent containing an iron chelate color former and lithium ions as constituent reagents. Preferred embodiments, specific examples, use concentrations and the like of each component are as described above.
  • each reagent of the kit contains, for example, buffers, preservatives, surfactants, stabilizers and the like that are usually used in this field, in a range normally used in this field. It's good.
  • an iron standard product may be combined with the kit as necessary.
  • each test solution contains reagents necessary for measuring the component to be measured. These reagents are mixed with each test solution. What is necessary is just to disperse
  • concentrations of reagents used in these reagents are usually used in this field. V, choose from the range you want!
  • kits of the present invention include, for example, the following configurations.
  • a test solution containing a reducing agent, lithium ions, and an iron chelate color former is used as a constituent reagent.
  • Deproteinization reagent 98 g of trichloroacetic acid (special grade) was dissolved in about 600 mL of water, and 30 mL of thioglycolic acid and 83 mL of hydrochloric acid (special grade) were mixed together and mixed to make lOOOmL with water. Stored in a brown bottle.
  • Iron standard solution 200 gZdL: Iron standard solution (FelOOO) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Dilute lmL with water to make lOOmL (lmgZdL), and use it diluted 5 times with water. It was.
  • FelOOO Iron standard solution
  • Serum iron concentration 200 X (E E) / (E E) ⁇ g / dL
  • the amount of liquid is reduced by deproteinization.
  • three concentrations of iron are added to the sample and measured, and the iron concentration in the sample is determined from the intersection with the X axis of the regression equation. Is the law.
  • the absorbance of the test solution prepared above was measured by the same procedure as the international standard method described in (1) above.
  • a graph showing the relationship between the obtained absorbance and concentration was prepared, and the iron concentration in the sample was determined from the distance between the X-axis and the origin of the regression equation.
  • kits for measuring iron concentration by direct methods of the following compositions manufactured by Company A, Company B, Company C. Kits A, Kits B, and Kits C, respectively. Instructions In accordance with the standard operating method described in the above, the measurement parameters were set as follows, and the iron concentrations of serum samples 1 to 5 were measured.
  • the measurement was performed using Hitachi 7170S automatic analyzer, and the obtained absorbance values were obtained in the same manner using a sample with a known iron concentration instead of a serum sample.
  • the iron concentration was determined by fitting it to a calibration curve showing the relationship.
  • Reducing agent solution A solution containing L ascorbic acid.
  • Serum samples 6 to 10 were measured using the above-described test solution and using a Hitachi 7170S automatic analyzer.
  • the measurement parameters were set as follows, and the serum iron concentration in each sample was measured. Measurement method: 2 point end [16] — [34]
  • the obtained absorbance value is applied to a calibration curve showing the relationship between the iron concentration and the absorbance obtained in advance using a sample with a known iron concentration instead of a serum sample. was determined.
  • the alkali metal ion concentration at the time of measurement is about 7.5 mM.
  • (R-1) buffer was added with lithium chloride so that the concentration would be 0.1 mM, lmM, 10 mM or lOOmM (the lithium ion concentrations at the time of measurement were 0.075 mM and 0.75 mM, respectively). , 7.5 mM, 75 mM), and using the reagents prepared in the same manner as in Example 1, the iron concentrations of serum samples 11 to 15 were measured in the same manner as in Example 1.
  • the lithium ion coexistence amount during measurement is 0.075 mM or more, more preferably 0.075 In the range of ⁇ 75 mM, there was no difference in the measured value, and it was consistent with the measured value of the standard addition method of the international standard method.
  • the degree of effect varies depending on the type of iron chelate color former, but no matter which kit is used, the direct method is used in the presence of lithium chloride (lithium ion).
  • the measured value obtained by using the iron concentration measurement kit is higher than that measured in the absence of lithium chloride, and is equivalent to the standard addition method of the international standard method. You can see that they are approaching.
  • the present invention provides a method for measuring iron concentration by a direct method, and a reagent and a kit used therefor, which can obtain a measurement value equivalent to the international standard method.
  • the iron concentration measurement method of the present invention By performing the iron concentration measurement method of the present invention, the problem that the measured value obtained is lower than the international standard method, which has been a problem in the past, is solved, and complicated operations such as deproteinization are not required,
  • the iron concentration can be measured by an automatic analyzer, and the measured value is close to the measured value by the standard addition method of the international standard method, so that more accurate measurement is possible.

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Abstract

　リチウムイオンの共存下、試料中の鉄と鉄キレート発色剤とを接触させ、生じる発色の程度に基づいて測定を行うことを特徴とする、試料中の鉄濃度測定法、これに用いられる鉄測定用試薬及びキットを開示する。 　本発明によれば、従来問題となっていた国際標準法に比べて得られる測定値が低いという問題を解決し、また除蛋白等の煩雑な操作を必要とせず、自動分析装置による鉄濃度測定を可能とし、更にその測定値は国際標準法の標準添加法での測定値に近似しているので、より正確な測定が可能となる。

Description

明 細 書
鉄濃度測定法
技術分野
[0001] 本発明は、鉄キレート発色剤を用いた直接法による試料中の鉄濃度測定法であつ て、リチウムイオンの共存下に測定を行う方法に関する。
背景技術
[0002] 血清及び血漿中の鉄濃度測定は、貧血、鉄欠乏性貧血，肝硬変等の診断に利用 されており、臨床検査の分野においては重要な測定項目の 1つである。
[0003] 鉄濃度の測定方法としては、例えばジピリジル、 o フ ナント口リン等の各種金属 キレート発色剤を用いた比色分析法が一般的である。感度、特異性、溶解性等を考 慮すると、バソフェナント口リン、 2 -トロソ一 5— (N プロピノレー N—スノレホプロピ ルァミノ）一フエノール（ニトロソ PSAP)、 3— (2 ピリジル) 5, 6 ビス [2— (5 フリ ルスルホン酸)] 1,2,4 トリアジン'ニナトリウム塩、トリピリジルトリアジン、フエロジン等 の鉄キレート発色剤がよく使われて!/ヽる。
[0004] これらの発色剤は、全て二価の鉄の発色剤なので、使用に当たっては三価の鉄を 還元するための還元剤の併用を必要とする。三価の鉄の還元剤としては、 L ァスコ ルビン酸、チォグリコール酸、塩酸ヒドロキシルァミン、ハイドロキノン、ハイド口サルフ アイト、亜硫酸ナトリウム、硫酸ヒドラジン、メタ重亜硫酸塩 (ピロ亜硫酸塩)等が知られ ている。
[0005] 血清中の鉄は、全て血清グロブリンの 1つであるトランスフェリンと結合した形で存在 するので、血清鉄の総量を測定する場合には、このトランスフ リンと鉄との結合を外 し、遊離の鉄として力も鉄濃度の測定を行う必要がある。トランスフェリンと結合した鉄 を遊離させる方法としては、除蛋白法を適用する例えば国際標準法 (臨床検査法提 要、改訂第 32版第 1刷、 579頁、金井正光編著、平成 17年 2月 20日発行、金原出 版株式会社)、及び国際標準法が確立される過程において、その基礎データとして 重要視された松原変法 (臨床検査法提要、改訂第 32版第 1刷、 580— 581頁、金井 正光編著、平成 17年 2月 20日発行、金原出版株式会社)が知られている。これらの 方法に従って、鉄濃度を測定すべき試料を除蛋白処理した後、鉄キレート発色剤を 加えて吸光度を測定することで、試料中の鉄の総量を測定する。
[0006] ところで近年、自動分析装置の発達に伴い、臨床検査は自動分析装置により行わ れるのが一般的となりつつある。この自動分析装置は検体や測定用試液の採取量が 少ないため経済的であり、また一度に多数の検体を処理できるという利点がある。そ のため、血清鉄等の濃度の測定も自動分析装置を用いて行うことが望まれるが、国 際標準法及び松原変法は、測定の前に試料を除蛋白処理するため、自動分析装置 を用いる測定に適用することが難し 、と 、う問題がある。
[0007] これに対し、試料に直接還元剤と発色剤とを加えて比色測定する「直接比色法 (以 下、「直接法」と記載する。；)」という鉄濃度測定方法がある (例えば非特許文献 1 :臨 床検査法提要、改訂第 32版第 1刷、 579頁、金井正光編著、平成 17年 2月 20日発 行、金原出版株式会社)。この方法は、前記した国際標準法等に比較して、除蛋白 操作を行わない方法であり、自動分析装置に適用することができる。そのため臨床検 查分野では、自動分析装置を用いた直接法による鉄濃度測定方法が普及して!/、る。
[0008] しかしながら、自動分析装置を用いた直接法による測定で得られる測定値と、国際 標準法による測定で得られる測定値とを比較すると、直接法の測定値が国際標準法 の測定値に比べて低値であるという問題がある。国際標準法では試料を除蛋白処理 するので、試料中の鉄をトランスフェリン力 完全に（100%)遊離させることができる 力 自動分析装置を用いた直接法では、トランスフェリン力も鉄を還元に遊離させるこ とができず、遊離する鉄の割合 (遊離度）は約 93〜95%程度であるという報告があり (第 51回日本臨床検査医学会総会、演題番号 0— 76, 2004)、これが上記したよう な問題を引き起こす原因の一つと考えられる。
[0009] そのため、国際標準法と同程度の測定値が得られ、かつ自動分析装置を用いた測 定を行える、鉄濃度測定法の確立が望まれている現状にあった。
[0010] 非特許文献 1：金井正光編著、臨床検査法提要、改訂第 32版第 1刷、金原出版株式 会社、平成 17年 2月 20日発行、 579頁
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0011] 本発明は上記した如き状況に鑑みなされたもので、国際標準法と同等の測定値が 得られる、直接法による鉄濃度測定法、及びこれに用いられる試薬並びにキットを提 供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0012] 本発明は、上記課題を解決する目的でなされたものであり、以下の構成よりなる。
( 1)リチウムイオンの共存下、試料中の鉄と鉄キレート発色剤とを接触させ、生じる発 色の程度に基づいて測定を行うことを特徴とする、試料中の鉄濃度測定法。
(2)鉄キレート発色剤とリチウムイオンとを含んでなる、鉄測定用試薬。
(3)鉄キレート発色剤とリチウムイオンとを含む試薬を構成試薬として含んでなる、鉄 濃度測定用キット。
[0013] すなわち本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、直接 法による鉄濃度の測定を、リチウムイオンの共存下に行うと、トランスフェリンからの鉄 の遊離が促進され、鉄キレート発色剤との反応が化学量論的に進行することを見出 し、本発明を完成するに至った。
[0014] 従来から、鉄キレート発色剤としてバソフェナント口リンスルホン酸ナトリウム、 3— (2
-ピリジル) - 5,6-ビス [2 - (5—フリルスルホン酸)] 1,2,4-トリァジン ·ニナトリウム 塩等のナトリウム塩がよく用いられてきた力 このようなナトリウム塩では、本発明のよう な効果は認められない。また、これら鉄キレート発色剤の塩としてリチウム塩が実際に 用いられた例も見つ力つていない。そのため、ナトリウムと同様にアルカリ金属に属す るリチウムに由来するイオンを共存させると、上記した如き効果が得られるとは全く意 外なことであった。
発明の効果
[0015] 本発明の鉄濃度測定法を行うことにより、従来問題となっていた国際標準法に比べ て得られる測定値が低いという問題を解決し、また除蛋白等の煩雑な操作を必要と せず、自動分析装置による鉄濃度測定を可能とし、更にその測定値は国際標準法の 標準添加法での測定値に近似して 、るので、より正確な測定が可能となった。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 本発明に係る鉄濃度測定法は、「リチウムイオンの共存下、試料中の鉄と鉄キレート 発色剤とを接触させ、生じる発色の程度に基づいて測定を行うことを特徴とする、試 料中の鉄濃度測定法。」である。
[0017] 本発明の測定法に於いて用いられる鉄キレート発色剤としては、鉄と結合して特異 的な吸収を有する、二価の鉄の発色剤であればよぐ例えば自体公知の直接法によ る鉄濃度の測定にぉ 、て用いられて 、る鉄キレート発色剤が使用できる。
[0018] 鉄キレート発色剤の具体例としては、例えばバソフェナント口リンスルホン酸又はそ の塩、 2 -トロソ— 5— (N プロピル— N—スルホプロピルアミノ）—フエノール、 3 — (2 ピリジル) 5, 6 ビス [2— (5 フリルスルホン酸)] 1,2,4 トリァジン又はその 塩等が挙げられる。
[0019] バソフェナント口リンスルホン酸又は 3— (2 ピリジル) 5, 6 ビス [2— (5 フリルス ルホン酸)] 1,2,4 トリァジンの塩としては、例えばナトリウム、カリウム、リチウム等のァ ルカリ金属との塩が挙げられる。
[0020] 本発明に係る鉄キレート発色剤の使用量は、その鉄キレート発色剤の特性に合わ せて決定すれば良ぐ特に制限はない。
[0021] 例えば、ノ ソフエナント口リンスルホン酸又はその塩を用いる場合は、試液中の濃度 としては 0.5〜5mM程度、好ましくは l〜2mM程度であり、最終の反応液中の濃度 として、 0.1〜： LmM程度、好ましくは 0.2〜0.5mM程度である。
[0022] 2 -トロソ一 5— (N—プロピル一 N—スルホプロピルァミノ）一フエノールを用いる 場合は、試液中の濃度としては 0.2〜lmM程度、好ましくは 0.3〜0.6mM程度であ り、最終の反応液中の濃度として、 0.06〜0.4mM程度、好ましくは 0.1〜0.2mM程 度である。
[0023] 3— (2 ピリジル) - 5,6-ビス [2 - (5—フリルスルホン酸)] 1,2,4 トリァジン又はそ の塩を用いる場合は、試液中の濃度としては l〜5mgZmL程度、好ましくは l〜3m gZmL程度であり、最終の反応液中の濃度として、 0.2〜lmgZmL程度、好ましく は 0.3〜0.7mgZmL程度である。
[0024] 本発明に係るリチウムイオンの反応液中の濃度としては、特に制限はなぐ使用量 も同じ測定系に用いる鉄キレート発色剤の種類に合わせて使用量を決定すれば良 いが、試液中の濃度としては、リチウムイオンとして O.lmM〜： LOOmM、好ましくは 1 〜100mM程度であり、最終の反応液中の濃度として、 0. 05〜： LOOmM、好ましくは 0. 5〜： LOOmM程度である。
[0025] 本発明に係る測定法では二価の鉄の発色剤を用いるため、試料中のトランスフェリ ンに結合して 、る三価の鉄をトランスフェリン力 遊離させて、二価の鉄に還元する必 要がある。そのために用いられる三価の鉄の還元剤としては、ァスコルビン酸、グルタ チオン、ピロ亜硫酸ナトリウム、チォグリコール酸、塩酸ヒドロキシルァミン、チオール 化合物等，通常この分野で使用している還元剤が全て使用可能である。中でもァス コルビン酸が一般によく用いられる。
[0026] 還元剤の使用量としては、用いられる還元剤の種類、使用する鉄キレート発色剤、 使用時の pHによって異なり、 pHの上昇に伴ってその必要量も増加するため一概に は言えないが、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよい。試液中の 濃度としては 0.0006〜400mM、好ましくは 10〜150mM程度であり、最終の反応 液中の濃度として 0. 0005〜300mM、好ましくは 10〜100mMの範囲の使用が望 ましい。
[0027] 本発明の鉄濃度測定方を実施するには、鉄キレート発色剤を用い、リチウムイオン の共存下に自体公知の直接法による測定法を行う以外は、通常の臨床検査の分野 で行われて!/ヽる自体公知の直接法の測定条件 (例えば反応時間、測定波長等)や、 測定操作法に準じて実施すればょ ヽ。
[0028] 直接法による鉄濃度測定法を実施する際に、リチウムイオンを共存させる方法とし ては、最終的に、試料、還元剤、リチウムイオン、鉄キレート発色剤を含有する溶液が 得られる方法であればよい。但し、リチウムイオンは、試料を還元剤で処理した後に 加える力、又は還元剤と同時に試料にカ卩えることが好ましい。また、鉄キレート発色剤 は、リチウムイオンをカ卩えた後又はリチウムイオンと同時に試料に加えた方が好ましい 力 これらに限定されるものではない。但し、リチウムイオンを加える前に、鉄キレート 発色剤を試料に加えるのは望ましくない。
[0029] また、リチウムイオンを直接測定の測定系に共存させる方法としては、通常これの塩 の形で用いる方法が最も簡便である力 特にこの方法に限定されるものではない。こ の際に使用する塩の種類は、該溶液中に共存する試薬等の安定性を阻害したり、鉄 キレート発色剤の発色を阻害しな 、ものであれば特に限定されな 、が、例えば硫酸 、硝酸等の無機酸との塩、例えば塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子との塩 (ハロ ゲン化物）、例えば酢酸、クェン酸、ダルコン酸、プロピオン酸、パントテン酸等の有 機酸との塩、上記した如き鉄キレート発色剤との塩等が挙げられる。
[0030] 直接法による鉄濃度測定法を実施する際に、リチウムイオンを共存させる具体的な 方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
(1)還元剤溶液、リチウムイオンを含有する溶液、鉄キレート発色剤溶液を調製して おき、試料に還元剤溶液、リチウムイオンを含有する溶液、鉄キレート発色剤溶液の 順に加える方法、
(2)還元剤とリチウムイオンを含有する溶液と、鉄キレート発色剤溶液を調製し、試料 に還元剤とリチウムイオンを含有する溶液、鉄キレート発色剤溶液の順に加える方法
(3)還元剤溶液、及びリチウムイオンと鉄キレート発色剤を含有する溶液を調製し、 試料に還元剤溶液、リチウムイオンと鉄キレート発色剤を含有する溶液の順に加える 方法。
(4)還元剤、リチウムイオン及び鉄キレート発色剤を含有する溶液を調製し、試料に 該溶液を加えて、これらの成分を一度に作用させる方法。
[0031] 以上の中でも、作業効率等を考慮すると、（2)の方法が一般的であり、好ましい。
[0032] また、通常臨床検査の分野で用いられる鉄濃度測定用の、鉄キレート発色剤を用 いる市販品を用い、その市販品を構成する試薬類の何れかに、上記の状態となるよ うに、リチウムイオンを存在させて用いてもよい。
[0033] 鉄キレート発色剤、リチウムイオン及び還元剤を溶解する溶液としては、鉄濃度の 測定を鉄キレート発色剤の至適 pH範囲内で行うことが望ま 、ため、緩衝液が好ま しい。
[0034] 本発明の測定法における測定時の好ましい pHは、 ρΗ1〜7、更に好ましくは pH2 〜6である。 pHを上記した如き範囲とするために用いられる緩衝液を構成する緩衝 剤としては、通常この分野で用いられるものは全て使用可能である。具体的には、例 えばグリシン、酢酸、クェン酸、酒石酸等が挙げられる。 [0035] 更に、これらの試薬の他に、界面活性剤、各種防腐剤、安定化剤、賦活剤、共存物 質の影響回避剤及び通常臨床検査薬に使用している物質を共存させてもかまわな いことは言うまでもない。これら試薬類等の濃度範囲等も、自体公知の該測定方法に 於て通常用いられる濃度範囲等を適宜選択して用いることで足りるが、本発明の鉄 濃度測定法に於いて用いられる鉄キレート発色剤の至適 pH範囲内で、安定性が高 く、また鉄キレート発色剤の発色を阻害しな 、ものを選択することが望ま 、。
[0036] 本発明に係る測定法に用いられる界面活性剤としては、使用する鉄キレート発色 剤の発色を阻害するものでなければ、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性 剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤の何れもが使用可能で、使用する鉄キ レート発色剤の特性に合わせて適宜選択して使用すれば良い。
[0037] 例えば、上記した如き界面活性剤の使用濃度は通常この分野で用いられる範囲か ら適宜選択すればよい。試液中の濃度としては通常 0.0001〜10% (WZV)程度、 好ましくは 0.001〜5% (WZV)程度であり、最終の反応液中の濃度として、通常 0. 001-10% (wZv)程度、好ましくは 0.01〜5% (wZv)程度である。
[0038] 試料に鉄キレート発色剤及びリチウムイオンを作用させた後は、自体公知の直接法 に従い、鉄キレート発色剤の作用による発色を測定すればよぐ測定時に使用するそ の他の試薬や自動分析装置、分光光度計等は、通常この分野で使用されているもの は何れも例外なく使用し得る。また、吸光度変化は、主波長と副波長を使用する 2波 長測光により求めてもよいことは言うまでもない。
[0039] 尚、吸光度測定のための測定波長は、使用する鉄キレート発色剤の種類によって 適宜選択すればよいが、鉄キレート発色剤としてバソフェナント口リンスルホン酸又は その塩を使用し、 2波長で測定する場合には、主波長 546nm付近、副波長 600nm 付近で測定することが好ま 、。
[0040] 本発明の方法に用いられる試料としては、例えば血清、血漿等の血液成分が挙げ られる。
[0041] 本発明の鉄濃度測定法を、前記 (2)の方法 (還元剤とリチウムイオンを含有する溶 液と、鉄キレート発色剤溶液を調製し、試料に還元剤とリチウムイオンを含有する溶 液、鉄キレート発色剤溶液の順に加える方法。）を例にとって具体的に示すと、例え ば以下の如くなる。
[0042] 先ず、例えば血液、血清、血漿等の鉄濃度を測定すべき試料と、還元剤とリチウム イオンと緩衝剤、要すれば界面活性剤等を含む第一試液 (pH2〜6)とを混合し、通 常 10〜50°C、好ましくは 20〜40°Cで、通常 2〜： L0分間、好ましくは 5分間程度反応 させる。次いで、該反応液と、鉄キレート発色剤と緩衝剤、要すれば緩衝剤、防腐剤 、界面活性剤等を含む第 2試液 (pH2〜 10)とを混合し、通常 10〜50°C、好ましくは 20〜40°Cで、通常 2〜15分間、好ましくは 10分間程度反応させる。鉄キレート発色 剤の作用により得られる発色を吸光度として測定する。得られた測定値を、例えば予 め濃度既知の鉄標準液を試料として用いて同様に測定を行い、作成された鉄濃度と 吸光度との関係を示す検量線に当てはめることにより、試料中の鉄濃度が求められる
[0043] 上記鉄濃度の測定は、用手法によって行っても良いことはもちろんである力 本発 明の方法は、自動分析装置を用いた測定系に適用できるので、自動分析装置を用 いて行っても良いことは云うまでもない。尚、用手法又は自動分析装置を用いて測定 を行う場合の試薬類の組み合わせについては、特に限定はされず、適用する自動分 析装置の環境、その他の要因等に合わせて適宜行えば良 、。
[0044] 本発明に係る鉄濃度測定用試薬は、鉄キレート発色剤とリチウムイオンを含んでな るものであり、その好ましい態様、具体例及び濃度濃度等は先に述べた通りである。
[0045] 本発明の鉄濃度測定用キットは、鉄キレート発色剤と、リチウムイオンとを含む試薬 を構成試薬として含んでなるものであればよい。夫々の構成要素の好ましい態様、具 体例及び使用濃度等については先に述べた通りである。
[0046] また、当該キットの各試薬中には、この分野で通常用いられる、例えば緩衝剤、防 腐剤、界面活性剤、安定化剤等を通常この分野で使用される範囲含有していてもよ い。更に、当該キットには、必要に応じて、鉄標準品が組み合わされていてもよい。
[0047] また、当該キットが複数の試液で構成される場合、各試液中には、測定対象成分を 測定する為に必要な試薬類も含有させるが、これら試薬類は、各試液を混合した時 点で目的の成分測定の反応が開始されるように各試液の何れかに適宜分散させて 含有させればよい。これら試液を構成する試薬類の使用濃度は、通常この分野で用 V、られる範囲から適宜選択すればよ!、。
[0048] 本発明のキットの具体的な実施態様としては、例えば以下の如き構成が挙げられる
(1)還元剤を含んでなる第一試液と、鉄キレート発色剤を含んでなる第二試液とか らなるものであって、リチウムイオンが前記第一試液と第二試液の少なくとも一方に含 まれているもの。
[0049] (2)還元剤とリチウムイオンと鉄キレート発色剤を含んでなる試液を構成試薬とする もの。
[0050] 以下に、実施例及び参考例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこ れらにより何ら限定されるものではない。
実施例
[0051] 参考例 1
国際標準法、国際標準法の標準添加法 (国際標準法は除蛋白により液量が少なく なるので、その補正の目的で 3濃度の鉄を試料に添加して測定し、その回帰式の X 軸との交点より試料中の鉄濃度を求める方法)及び自動分析装置を用いた従来の直 接法により、同じ血清試料 1〜5中の血清中鉄濃度を測定し、夫々の測定値を比較し た。
[0052] (1)国際標準法
臨床検査法提要、改訂第 32版第 1刷、 580頁、金井正光編著、平成 17年 2月 20 日発行、金原出版株式会社に記載された方法に従い、下記の通り行った。
[試薬の調製]
•除蛋白試薬：トリクロル酢酸 (特級） 98gを水約 600mLに溶解させ、チォグリコール 酸 30mLと塩酸（特級） 83mLをカ卩えて混和し、水で lOOOmLとした。褐色瓶にて保 存した。
'発色試薬： 1.5M酢酸ナトリウム（特級） lOOOmLにバソフェナント口リンスルホン酸 (ドーダイト試薬） 250mgを加えて溶解した。
•鉄標準液 (200 gZdL)：鉄標準液 (FelOOO) (和光純薬工業 (株)製) lmLを水 で薄めて lOOmLとし（lmgZdL)、これを更に水で 5倍に希釈したものを用いた。
[血清鉄濃度の測定] 1)血清試料 1〜5を容器に 2.0mLずつ取り、それぞれ除蛋白試薬 2.0mLを加え、ミ キサ一で十分に混和後、 56°Cで 15分間加温後、再び混和してから遠心処理した。
2)上清 2.0mLを取り、発色試薬 2.0mLをカ卩えて良く混和し、 10分間放置した。
3)水 (盲検用）および鉄標準液について、血清試料を用いた場合と同様に上記 1)及 び 2)の操作を行った (但し、遠心処理は行わな力つた)。
4)検体、標準液、盲検の各発色液を、水を対照として 535nmで吸光度を測定し、そ れぞれ E 、 E、 Eとし、下記式に当てはめて各試料中の血清鉄濃度を測定した。
A S B
血清鉄濃度 = 200 X (E E ) / (E E ) μ g/dL
A B S B
結果を表 1に示す。
[0053] (2)国際標準法の標準添加法
国際標準法は除蛋白により液量が少なくなるので、その補正の目的で 3濃度の鉄を 試料に添加して測定し、その回帰式の X軸との交点より試料中の鉄濃度を求める方 法である。
[試薬及び試験溶液の調製]
国際標準法で用いたと同じ血清試料 1〜5夫々を 4個の容器に 2.0mLずつ取り、そ のうちの 3個に鉄標準液をそれぞれ 50 gZdL、 100 ^ g/dL, 150 /z gZdLとなる ように加えたものを調製し、これと鉄標準液を加えて 、な 、ものを試験溶液として用い た。
試薬は、前記 (1)の国際標準法と同じものを用いた。
[血清鉄濃度の測定]
上記で調製した試験溶液について前記 (1)の国際標準法と同じ手順で吸光度の測 定を行った。
得られた吸光度と濃度との関係を示すグラフを作成し、その回帰式の X軸と原点と の距離から、試料中の鉄濃度を求めた。
結果を表 1に併せて示す。
[0054] (3)自動分析装置を用いた従来の直接法による測定方法
市販の、それぞれ以下の組成の直接法による鉄濃度測定用キット (A社製、 B社製 、 C社製。夫々キット A、キット B、キット Cとする。）を用い、夫々のキットの現品説明書 に記載の標準操作法に従 、、それぞれ測定パラメーターを以下のように設定して、 血清試料 1〜5の鉄濃度を測定した。
結果を表 1に併せて示す。
尚、測定は日立 7170S形自動分析装置を用いて行い、得られた吸光度値を、予め 血清試料の代わりに鉄濃度既知の試料を用いて同様に測定を行って得られた、鉄 濃度と吸光度の関係を示す検量線に当てはめることにより、鉄濃度を決定した。
[0055] [キット A]
(R-1)緩衝液： 40mM ァスコルビン酸、及び界面活性剤を含有する 400mM グリシン緩衝液 (ρΗ3.5)
(R—2)発色試液： 1.86mM バソフェナント口リンスルホン酸ナトリウム、及び界面 活性剤を含有する 40mM グリシン緩衝液 (pH3.0)
測定方法 ；2ポイント エンド [16]— [34]
試料量 ；12
R-1 ;160 μL·
R-2 ； 40μL·
測定波長 ；600Z546nm
測定温度 ；37°C
標準品濃度； 200/zgZdL
[0056] [キット B]
(R-1)還元剤溶液： L ァスコルビン酸を含有する溶液。
(R- 2)呈色液： 0.45mM 2 二トロソ— 5— (N—プロピル - N スルホプロピル ァミノ) フエノールを含有する溶液
測定方法 ；2ポイント エンド [16]— [34]
試料直 ■,15μL·
R-1 ;150 μL·
R-2 ；
測定波長 ；750Z600nm
測定温度 ；37°C 標準品濃度； 200/zgZdL
[0057] [キット C]
(R— 1)緩衝液:組成不明
(R- 2)発色液： 2.47mgZmL 3— (2 ピリジル) 5,6 ビス [2— (5 フリルスル ホン酸)] 1,2,4 トリァジン'ニナトリウム塩他を含む溶液
測定方法 ；2ポイント エンド [16]— [34]
試料量 ；12
R-1 ;180 μL·
R-2 ； 45μL·
測定波長 ；700Z600nm
測定温度 ；37°C
標準品濃度； 200/zgZdL
[0058] (4)結果
結果を、下記表 1に示す。
表 1に於いて、国際標準法の標準添加法による測定を行って得られた測定値を 10 0とした場合の、国際標準法、又はキット A、 B又は Cを用いた直接法による測定を行 つて得られた測定値の割合を、各平均値の下、（ ）内に夫々示す。
[0059] [表 1]
Figure imgf000013_0001
[0060] 表 1から明らかな如ぐ従来の直接法に基づいて測定して得られた測定値は、いず れも国際標準法及び標準添加法で得られた測定値に比べて低値となることが判る。
[0061] 実施例 1
[試液の調製]
(R - 1)緩衝液
10mMの塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム又は塩化セシウム（アルカリ金 属イオンとして 10mM)、 40mMァスコルビン酸、及び界面活性剤を含有する 400m M グリシン緩衝液 (pH3.5)
(R— 2)発色試液
1.86mM バソフェナント口リンスルホン酸ナトリウム、及び界面活性剤を含有する 4 OmM グリシン緩衝液（pH3.0)
[0062] [血清鉄濃度の測定]
血清試料 6〜10について、上記した試液を用い、 日立 7170S形自動分析装置を 用いて測定を行った。
〔測定条件〕
測定パラメータを以下のように設定して、各試料中の血清鉄濃度を測定した。 測定方法 ；2ポイント エンド [16]— [34]
試料量 ；12
R- 1 ; 160 μ L·
R- 2 ； 40 μ L·
測定波長 ；600Z546nm
測定温度 ；37°C
標準品濃度； 200 /z gZdL
鉄濃度は、得られた吸光度値を、予め血清試料の代わりに鉄濃度既知の試料を用 いて同様に測定を行って得られた、鉄濃度と吸光度の関係を示す検量線に当ては めることにより決定した。
尚、測定時のアルカリ金属イオン濃度は、約 7.5mMである。
[0063] [結果]
結果を表 2に示す。 対照として、同じ血清試料を用いて、参考例 1の国際標準法の標準添加法による測 定を行った。結果を表 2に併せて示す。
表 2に於いて、国際標準法の標準添加法による測定を行って得られた測定値を 10 0とした場合の、各アルカリ金属イオンの共存下に直接法による測定を行って得られ た測定値の割合を、各平均値の下、（ ）内に夫々示す。
また、上記で得られた「国際標準法の標準添加法による測定を行って得られた測定 値を 100とした場合の、各アルカリ金属イオンの共存下に直接法による測定を行って 得られた測定値の割合 (％)」の、国際標準法の標準添加法による測定を行って得ら れた測定値（100%)との差を、「国際標準法の標準添加法との差」として、表 2に併 せて示す。
[0064] [表 2]
Figure imgf000015_0001
[0065] 表 2から明らかな如ぐナトリウム、カリウム、セシウム等のアルカリ金属イオンの共存 下に直接法による測定を行った場合、得られた測定値は国際標準法の標準添加法 で得られた測定値よりも低くなつてしまった。これに対し、リチウムイオンの共存下に、 同様に直接法による測定を行った場合のみ、得られた測定値は国際標準法の標準 添加法での測定値に近似し、本発明の目的を達成することができることが判った。こ れは、リチウムイオンを共存下でのみ、トランスフェリン力もの鉄が遊離した際に、遊離 した全ての鉄がキレート発色剤と結合し、発色したためと推測される。
[0066] 実施例 2
「（R— 1)緩衝液」に、 0.1mM、 lmM、 10mM又は lOOmMの濃度となるように塩 ィ匕リチウムを添カ卩した（測定時のリチウムイオン濃度は、夫々 0. 075mM、 0.75mM 、 7.5mM、 75mM)以外は、実施例 1と同様に調製した試薬を用い、実施例 1と同様 の方法で血清試料 11〜 15の鉄濃度の測定を行った。
結果を表 3に示す。
対照として、同じ血清試料を用いて、参考例 1の国際標準法の標準添加法による測 定を行った。結果を表 3に併せて示す。
表 3に於いて、国際標準法の標準添加法による測定を行って得られた測定値を 10 0とした場合の、各濃度の塩化リチウム存在下で直接法による測定を行って得られた 測定値の割合を、各平均値の下、（ ）内に夫々示す。
[0067] [表 3]
Figure imgf000016_0001
[0068] 表 3から明らかな如ぐリチウムイオンを共存させることにより、より高精度に鉄濃度の 測定が行い得ることが判る力 特に測定時のリチウムイオン共存量が 0.075mM以上 、より好ましくは 0.075〜75mMの範囲であれば、測定値に差はなぐまた、国際標 準法の標準添加法の測定値と一致した。
[0069] 実施例 3
参考例 1の「 (3)自動分析装置を用いた従来の直接法による測定方法」に於 、て、 各キットの緩衝液又は還元剤溶液に、塩化リチウムを 10mM (測定時のリチウムィォ ン濃度は、キット Aとキット Cを用いた場合は 7.5mM、キット Bを用いた場合は 6.7m M)となるように添加したものを (R— 1)緩衝液として用いた以外は、参考例 1と同様 の方法で、血清試料 16〜20中の血清鉄濃度の測定を行った結果を「添加」の場合 として表 4に示す。
また、参考例 1の「（3)自動分析装置を用いた従来の直接法による測定方法」で、 同じ血清試料中の血清鉄濃度の測定を行った。結果を「無添加」の場合として表 4〖こ 併せて示す。
更に、対照として、同じ血清試料を用いて、参考例 1の国際標準法の標準添加法に よる測定を行った。結果を表 4に併せて示す。
尚、表 4に於いて、国際標準法の標準添加法による測定を行って得られた測定値 を 100とした場合の、塩化リチウム（リチウムイオン)の存在下又は非存在下に測定を 行って得られた測定値の割合を、各平均値の下、 ( )内に夫々示す。また、塩化リチ ゥム非存在下に測定を行って得られた測定値を 100とした場合の、塩化リチウム存在 下に同じキットを用いて測定を行って得られた測定値の割合も、「対無添加」として、 表 4に併せて示す。
[表 4]
Figure imgf000017_0001
表 4から明らかな如ぐ鉄キレート発色剤の種類によって効果の程度は異なるが、何 れのキットを用いた場合でも、塩化リチウム (リチウムイオン)の共存下に、直接法によ る鉄濃度測定用キットを用いて測定を行うことにより、得られた測定値は、塩化リチウ ム非存在下に測定を行った場合より高くなり、しかも国際標準法の標準添加法の測 定値に近づくことが判る。
産業上の利用可能性
本発明は国際標準法と同等の測定値が得られる、直接法による鉄濃度測定法、及 びこれに用いられる試薬並びにキットを提供する。
本発明の鉄濃度測定法を行うことにより、従来問題となっていた国際標準法に比べ て得られる測定値が低いという問題を解決し、また除蛋白等の煩雑な操作を必要と せず、自動分析装置による鉄濃度測定を可能とし、更にその測定値は国際標準法の 標準添加法での測定値に近似して 、るので、より正確な測定が可能となる。

Claims

請求の範囲
[I] リチウムイオンの共存下、試料中の鉄と鉄キレート発色剤とを接触させ、生じる発色 の程度に基づいて測定を行うことを特徴とする、試料中の鉄濃度測定法。
[2] 鉄キレート発色剤が、バソフェナント口リンスルホン酸又はその塩、 2— -トロソ— 5
- (N—プロピル— N—スルホプロピルァミノ）—フエノール、 3— (2—ピリジル） - 5,6 —ビス [2— (5—フリルスルホン酸) ] 1,2,4—トリァジン又はその塩である、請求項 1に 記載の測定法
[3] リチウムイオンが、リチウム塩に由来するものである、請求項 1に記載の測定法。
[4] 鉄キレート発色剤がバソフェナント口リンスルホン酸又はその塩である、請求項 1に 記載の測定法。
[5] 還元剤を共存させて、試料中の鉄を二価に還元させる、請求項 1〜4の何れかに記 載の測定法。
[6] 鉄キレート発色剤とリチウムイオンとを含んでなる、鉄測定用試薬。
[7] 鉄キレート発色剤がバソフェナント口リンスルホン酸又はその塩である、請求項 6に 記載の試薬。
[8] 鉄キレート発色剤とリチウムイオンとを含む試薬を構成試薬として含んでなる、鉄濃 度測定用キット。
[9] 還元剤を含んでなる第一試液と、鉄キレート発色剤を含んでなる第二試液とからな るものであって、リチウムイオンが前記第一試液と第二試液の少なくとも一方に含まれ ている、請求項 8に記載のキット。
[10] 還元剤とリチウムイオンを含んでなる第一試液と、鉄キレート発色剤を含んでなる第 二試液とを含んでなる、請求項 8に記載のキット。
[II] 鉄キレート発色剤がバソフェナント口リンスルホン酸又はその塩である、請求項 8に 記載のキット。
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