JP2002189030A - 不飽和鉄結合能の測定方法及び測定試薬 - Google Patents
不飽和鉄結合能の測定方法及び測定試薬Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】試料のＵＩＢＣを測定する際の測定値のばらつ
きを抑え、ＵＩＢＣ測定値を再現性よく、精度高く測定
することができる測定方法及び測定試薬を提供する。 【構成】試料中に含まれるトランスフェリンに対して既
知過剰量の鉄を少なくとも含む第１試薬を試料に添加
し、次にこれに少なくともキレート発色剤を含む第２試
薬を添加した後、この最終反応液中におけるトランスフ
ェリンに結合せずに残存した鉄量を比色法により測定
し、そして、この残存した鉄量を添加した鉄量から差し
引くことにより、試料の不飽和鉄結合能を測定する不飽
和鉄結合能の測定方法において、前記最終反応液中での
鉄濃度が、９μＭ以下であることを特徴とする、試料の
不飽和鉄結合能の測定方法。
きを抑え、ＵＩＢＣ測定値を再現性よく、精度高く測定
することができる測定方法及び測定試薬を提供する。 【構成】試料中に含まれるトランスフェリンに対して既
知過剰量の鉄を少なくとも含む第１試薬を試料に添加
し、次にこれに少なくともキレート発色剤を含む第２試
薬を添加した後、この最終反応液中におけるトランスフ
ェリンに結合せずに残存した鉄量を比色法により測定
し、そして、この残存した鉄量を添加した鉄量から差し
引くことにより、試料の不飽和鉄結合能を測定する不飽
和鉄結合能の測定方法において、前記最終反応液中での
鉄濃度が、９μＭ以下であることを特徴とする、試料の
不飽和鉄結合能の測定方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料の不飽和鉄結
合能の測定方法及び測定試薬に関する。本発明は、特
に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野に
おいて有用なものである。
合能の測定方法及び測定試薬に関する。本発明は、特
に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野に
おいて有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】鉄は、人体内に約４．２ｇ存在してお
り、これらの鉄はその約２／３が赤血球内の血色素鉄と
して存在し、残りの約１／３が貯蔵鉄として、肝臓、脾
臓、骨髄等の組織に存在する。血清中の鉄は、ごく微量
（３〜４ｍｇ）であり、そのほとんど全てが、β１−グ
ロブリンに属するトランスフェリンと結合して存在して
いる。このトランスフェリンの１分子には、２分子の鉄
イオンが結合できる。トランスフェリンの約１／３が鉄
によって飽和されており、残りの約２／３は鉄が結合し
ていない不飽和の状態で存在している。この鉄が結合し
ていない不飽和のトランスフェリンに結合することので
きる鉄量を不飽和鉄結合能（以下、ＵＩＢＣと略す。）
と呼び、血清鉄とＵＩＢＣの和を総鉄結合能（ＴＩＢ
Ｃ）と呼んでおり、「ＴＩＢＣ＝血清鉄＋ＵＩＢＣ」と
いう関係が成り立っている。これら血清鉄、ＵＩＢＣ及
びＴＩＢＣは、臨床面において鉄欠乏性貧血、鉄芽球性
貧血、再生不良性貧血、真性多血症、ヘモクロマトーシ
ス等の血液疾患、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変症等の肝
疾患、慢性炎症・感染症等の各種疾患と関係があり、そ
の測定は臨床上極めて重要とされている。
り、これらの鉄はその約２／３が赤血球内の血色素鉄と
して存在し、残りの約１／３が貯蔵鉄として、肝臓、脾
臓、骨髄等の組織に存在する。血清中の鉄は、ごく微量
（３〜４ｍｇ）であり、そのほとんど全てが、β１−グ
ロブリンに属するトランスフェリンと結合して存在して
いる。このトランスフェリンの１分子には、２分子の鉄
イオンが結合できる。トランスフェリンの約１／３が鉄
によって飽和されており、残りの約２／３は鉄が結合し
ていない不飽和の状態で存在している。この鉄が結合し
ていない不飽和のトランスフェリンに結合することので
きる鉄量を不飽和鉄結合能（以下、ＵＩＢＣと略す。）
と呼び、血清鉄とＵＩＢＣの和を総鉄結合能（ＴＩＢ
Ｃ）と呼んでおり、「ＴＩＢＣ＝血清鉄＋ＵＩＢＣ」と
いう関係が成り立っている。これら血清鉄、ＵＩＢＣ及
びＴＩＢＣは、臨床面において鉄欠乏性貧血、鉄芽球性
貧血、再生不良性貧血、真性多血症、ヘモクロマトーシ
ス等の血液疾患、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変症等の肝
疾患、慢性炎症・感染症等の各種疾患と関係があり、そ
の測定は臨床上極めて重要とされている。
【０００３】現在、ＵＩＢＣの測定方法として広く用い
られている方法は、血清にあらかじめ既知過剰量の鉄を
添加してトランスフェリンを鉄で飽和させた後、トラン
スフェリンに結合せずに残存した鉄量を比色法により測
定し、これを添加した鉄量から差し引くことによりＵＩ
ＢＣを測定する方法である。この測定方法は、遠心分離
操作や除蛋白操作が不要であるため操作が簡便であり、
測定の自動化も可能であることから汎用されている。し
かしながら、この測定方法では、分注誤差又は、光源の
光度変化や検出器の感度変動に起因する分光光度計の機
械的誤差によって、測定値にかなりのばらつきが見られ
ることがあった。また、従来より、測定値のばらつきを
抑えるために、試料の量を増やすということも一般的に
行われている。
られている方法は、血清にあらかじめ既知過剰量の鉄を
添加してトランスフェリンを鉄で飽和させた後、トラン
スフェリンに結合せずに残存した鉄量を比色法により測
定し、これを添加した鉄量から差し引くことによりＵＩ
ＢＣを測定する方法である。この測定方法は、遠心分離
操作や除蛋白操作が不要であるため操作が簡便であり、
測定の自動化も可能であることから汎用されている。し
かしながら、この測定方法では、分注誤差又は、光源の
光度変化や検出器の感度変動に起因する分光光度計の機
械的誤差によって、測定値にかなりのばらつきが見られ
ることがあった。また、従来より、測定値のばらつきを
抑えるために、試料の量を増やすということも一般的に
行われている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】前記のように、従来の
試料のＵＩＢＣの測定方法及び測定試薬は、測定値の再
現性が悪く、精密性に問題のあるものであった。よっ
て、本発明の課題は、ＵＩＢＣ測定値の再現性を向上さ
せた測定試薬及び測定方法を提供することである。
試料のＵＩＢＣの測定方法及び測定試薬は、測定値の再
現性が悪く、精密性に問題のあるものであった。よっ
て、本発明の課題は、ＵＩＢＣ測定値の再現性を向上さ
せた測定試薬及び測定方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の問
題点の解決を目指して鋭意検討を行った結果、ＵＩＢＣ
測定時の最終反応液中の鉄濃度が、９μＭ以下の場合に
ＵＩＢＣ測定値の再現性が向上することを見出し、試料
のＵＩＢＣ値を精度よく測定することができる測定方法
及び測定試薬を完成するに至った。
題点の解決を目指して鋭意検討を行った結果、ＵＩＢＣ
測定時の最終反応液中の鉄濃度が、９μＭ以下の場合に
ＵＩＢＣ測定値の再現性が向上することを見出し、試料
のＵＩＢＣ値を精度よく測定することができる測定方法
及び測定試薬を完成するに至った。
【０００６】すなわち本発明は、試料中に含まれるトラ
ンスフェリンに対して既知過剰量の鉄を少なくとも含む
第１試薬を試料に添加し、次にこれに少なくともキレー
ト発色剤を含む第２試薬を添加した後、この最終反応液
中におけるトランスフェリンに結合せずに残存した鉄量
を比色法により測定し、そして、この残存した鉄量を添
加した鉄量から差し引くことにより、試料の不飽和鉄結
合能を測定する不飽和鉄結合能の測定方法において、前
記最終反応液中での鉄濃度が、９μＭ以下であることを
特徴とする、試料の不飽和鉄結合能の測定試薬である。
ンスフェリンに対して既知過剰量の鉄を少なくとも含む
第１試薬を試料に添加し、次にこれに少なくともキレー
ト発色剤を含む第２試薬を添加した後、この最終反応液
中におけるトランスフェリンに結合せずに残存した鉄量
を比色法により測定し、そして、この残存した鉄量を添
加した鉄量から差し引くことにより、試料の不飽和鉄結
合能を測定する不飽和鉄結合能の測定方法において、前
記最終反応液中での鉄濃度が、９μＭ以下であることを
特徴とする、試料の不飽和鉄結合能の測定試薬である。
【０００７】また、本発明の測定方法においては、第１
試薬中の鉄濃度が、下記式で示される濃度以上であるこ
とが好ましい。 Ｃ１＝６００（μｇ／ｄＬ）×ＶＳ／ＶＲ１ （式中、Ｃ１は第１試薬中の鉄濃度、ＶＳは試料の量、
ＶＲ１は第１試薬の試薬量を示す）
試薬中の鉄濃度が、下記式で示される濃度以上であるこ
とが好ましい。 Ｃ１＝６００（μｇ／ｄＬ）×ＶＳ／ＶＲ１ （式中、Ｃ１は第１試薬中の鉄濃度、ＶＳは試料の量、
ＶＲ１は第１試薬の試薬量を示す）
【０００８】更に、本発明は、試料の不飽和鉄結合能の
測定試薬において、少なくとも試料中に含まれるトラン
スフェリンに対して既知過剰量の鉄を含む第１試薬と、
少なくともキレート発色剤を含む第２試薬の２試薬とか
らなり、試料と第１試薬及び第２試薬を測定時の添加量
の比で混合した際に、この最終反応液中での鉄濃度が９
μＭ以下となるように前記過剰量の鉄を第１試薬に含有
させることを特徴とする、試料の不飽和鉄結合能の測定
試薬である。
測定試薬において、少なくとも試料中に含まれるトラン
スフェリンに対して既知過剰量の鉄を含む第１試薬と、
少なくともキレート発色剤を含む第２試薬の２試薬とか
らなり、試料と第１試薬及び第２試薬を測定時の添加量
の比で混合した際に、この最終反応液中での鉄濃度が９
μＭ以下となるように前記過剰量の鉄を第１試薬に含有
させることを特徴とする、試料の不飽和鉄結合能の測定
試薬である。
【０００９】また、本発明の測定試薬においては、第１
試薬中の鉄濃度が、下記式で示される濃度以上となるよ
うに前記既知過剰量の鉄を第１試薬に含有させることが
好ましい。 Ｃ１＝６００（μｇ／ｄＬ）×ＶＳ／ＶＲ１ （式中、Ｃ１は第１試薬中の鉄濃度、ＶＳは試料の量、
ＶＲ１は第１試薬の試薬量を示す）
試薬中の鉄濃度が、下記式で示される濃度以上となるよ
うに前記既知過剰量の鉄を第１試薬に含有させることが
好ましい。 Ｃ１＝６００（μｇ／ｄＬ）×ＶＳ／ＶＲ１ （式中、Ｃ１は第１試薬中の鉄濃度、ＶＳは試料の量、
ＶＲ１は第１試薬の試薬量を示す）
【００１０】
【発明の実施の形態】〔１〕試料の不飽和鉄結合能の測
定方法及び測定試薬 本発明の測定方法及び測定試薬では、試料中に含まれる
トランスフェリンに対して既知過剰量の鉄を少なくとも
含む第１試薬を試料に添加し、次にこれに少なくともキ
レート発色剤を含む第２試薬を添加した後、この最終反
応液中におけるトランスフェリンに結合せずに残存した
鉄量を比色法により測定し、そして、この残存した鉄量
を添加した鉄量から差し引くことにより、試料のＵＩＢ
Ｃ値を求めることができる。
定方法及び測定試薬 本発明の測定方法及び測定試薬では、試料中に含まれる
トランスフェリンに対して既知過剰量の鉄を少なくとも
含む第１試薬を試料に添加し、次にこれに少なくともキ
レート発色剤を含む第２試薬を添加した後、この最終反
応液中におけるトランスフェリンに結合せずに残存した
鉄量を比色法により測定し、そして、この残存した鉄量
を添加した鉄量から差し引くことにより、試料のＵＩＢ
Ｃ値を求めることができる。
【００１１】（１）試料 本発明の測定方法及び測定試薬において、試料とは、試
料のＵＩＢＣの測定を行おうとするもののことであり、
このようなものであれば特に限定されない。
料のＵＩＢＣの測定を行おうとするもののことであり、
このようなものであれば特に限定されない。
【００１２】例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿
等が挙げられる。
等が挙げられる。
【００１３】（２）既知過剰量の鉄 本発明の測定方法及び測定試薬においては、試料のＵＩ
ＢＣを測定するために既知過剰量の鉄を含む第１試薬を
試料に添加する。ここで、既知過剰量とは、試料中のト
ランスフェリンを完全に鉄で飽和させるために充分かつ
過剰な量のことをいう。また、添加する鉄としては、二
価又は三価の鉄を用いることができる。二価の鉄として
は、例えば、硫酸第一鉄アンモニウム、シュウ酸第一鉄
アンモニウム、クエン酸第一鉄アンモニウム、塩化第一
鉄等を挙げることができる。また、三価の鉄としては、
例えば、硫酸第二鉄アンモニウム、シュウ酸第二鉄アン
モニウム、クエン酸第二鉄アンモニウム、塩化第二鉄等
を挙げることができる。
ＢＣを測定するために既知過剰量の鉄を含む第１試薬を
試料に添加する。ここで、既知過剰量とは、試料中のト
ランスフェリンを完全に鉄で飽和させるために充分かつ
過剰な量のことをいう。また、添加する鉄としては、二
価又は三価の鉄を用いることができる。二価の鉄として
は、例えば、硫酸第一鉄アンモニウム、シュウ酸第一鉄
アンモニウム、クエン酸第一鉄アンモニウム、塩化第一
鉄等を挙げることができる。また、三価の鉄としては、
例えば、硫酸第二鉄アンモニウム、シュウ酸第二鉄アン
モニウム、クエン酸第二鉄アンモニウム、塩化第二鉄等
を挙げることができる。
【００１４】また、本発明における、最終反応液中にお
ける鉄の含有濃度は９μＭ以下である。ここで最終反応
液とは、試料と第１試薬及び第２試薬とを合わせた液の
ことをいう。
ける鉄の含有濃度は９μＭ以下である。ここで最終反応
液とは、試料と第１試薬及び第２試薬とを合わせた液の
ことをいう。
【００１５】また、本発明においては、試料と第１試薬
及び第２試薬とを試料のＵＩＢＣを測定する際の各々の
添加量で混合した場合に、この混合後の最終反応液中の
鉄濃度が９μＭ以下となるように、前記の鉄を第１試薬
に含有させるようにする。
及び第２試薬とを試料のＵＩＢＣを測定する際の各々の
添加量で混合した場合に、この混合後の最終反応液中の
鉄濃度が９μＭ以下となるように、前記の鉄を第１試薬
に含有させるようにする。
【００１６】この試料と第１試薬及び第２試薬とをＵＩ
ＢＣを測定する際の各々の添加量で混合した後の最終反
応液中の鉄濃度と第１試薬中の鉄濃度との関係式を下記
の数式１に示した。
ＢＣを測定する際の各々の添加量で混合した後の最終反
応液中の鉄濃度と第１試薬中の鉄濃度との関係式を下記
の数式１に示した。
【００１７】
【数１】
【００１８】ＵＩＢＣ測定時の試料、第１試薬及び第２
試薬の添加量（ＶＳ、Ｖ１、Ｖ２）が定まっている場合
には、混合後の最終反応液中の鉄濃度（ＣＭ）が、９μ
Ｍ以下となるように数式１に従って、第１試薬に含有さ
せる鉄濃度を決めればよい。
試薬の添加量（ＶＳ、Ｖ１、Ｖ２）が定まっている場合
には、混合後の最終反応液中の鉄濃度（ＣＭ）が、９μ
Ｍ以下となるように数式１に従って、第１試薬に含有さ
せる鉄濃度を決めればよい。
【００１９】また、本発明においては、第１試薬中の鉄
濃度が、下記式で示される濃度以上となるように前記既
知過剰量の鉄を第１試薬に含有させることが好ましい。 Ｃ１＝６００（μｇ／ｄＬ）×ＶＳ／ＶＲ１ （式中、Ｃ１は第１試薬中の鉄濃度、ＶＳは試料の量、
ＶＲ１は第１試薬の試薬量を示す）
濃度が、下記式で示される濃度以上となるように前記既
知過剰量の鉄を第１試薬に含有させることが好ましい。 Ｃ１＝６００（μｇ／ｄＬ）×ＶＳ／ＶＲ１ （式中、Ｃ１は第１試薬中の鉄濃度、ＶＳは試料の量、
ＶＲ１は第１試薬の試薬量を示す）
【００２０】健常者及び鉄欠乏性貧血等の各種疾患の罹
患者におけるＵＩＢＣ値は、内田立身著「鉄欠乏性貧血
−鉄の基礎と臨床−」，新興医学出版社，４０〜４４
頁，１９９６年等に記載されているように、通常６００
μｇ／ｄＬ未満である。よって、ＵＩＢＣの測定方法及
び測定試薬の性能としては、６００μｇ／ｄＬまでのＵ
ＩＢＣが測定できるようになっていることが望ましい。
この６００μｇ／ｄＬのＵＩＢＣが測定できる時、すな
わち、ＵＩＢＣが６００μｇ／ｄＬの試料（試料の量：
ＶＳ）を、第１試薬（第１試薬の量：ＶＲ１）に含まれ
る鉄（濃度：Ｃ１）で飽和できる時、以下の式が成り立
つ。 ６００（μｇ／ｄＬ）×ＶＳ＝Ｃ１×ＶＲ１ つまり、Ｃ１＝６００（μｇ／ｄＬ）×ＶＳ／ＶＲ１ よって、第１試薬に含有させる既知過剰量の鉄の濃度
を、上記式で示される濃度以上とすることにより、健常
者及び各種疾患の罹患者におけるＵＩＢＣ値を問題なく
測定することができる。
患者におけるＵＩＢＣ値は、内田立身著「鉄欠乏性貧血
−鉄の基礎と臨床−」，新興医学出版社，４０〜４４
頁，１９９６年等に記載されているように、通常６００
μｇ／ｄＬ未満である。よって、ＵＩＢＣの測定方法及
び測定試薬の性能としては、６００μｇ／ｄＬまでのＵ
ＩＢＣが測定できるようになっていることが望ましい。
この６００μｇ／ｄＬのＵＩＢＣが測定できる時、すな
わち、ＵＩＢＣが６００μｇ／ｄＬの試料（試料の量：
ＶＳ）を、第１試薬（第１試薬の量：ＶＲ１）に含まれ
る鉄（濃度：Ｃ１）で飽和できる時、以下の式が成り立
つ。 ６００（μｇ／ｄＬ）×ＶＳ＝Ｃ１×ＶＲ１ つまり、Ｃ１＝６００（μｇ／ｄＬ）×ＶＳ／ＶＲ１ よって、第１試薬に含有させる既知過剰量の鉄の濃度
を、上記式で示される濃度以上とすることにより、健常
者及び各種疾患の罹患者におけるＵＩＢＣ値を問題なく
測定することができる。
【００２１】ここで、試料の量（ＶＳ）が２０μＬ、第
１試薬の試薬量（ＶＲ１）が２５０μＬの場合の第１試
薬中の鉄濃度（Ｃ１）は、以下のように計算することが
できる。まず、単位を統一するために、６００（μｇ／
ｄＬ）×１０＝６０００（μｇ／Ｌ）とした上で、各々
の数字を上記の式に当てはめると、Ｃ１＝〔６０００
（μｇ／Ｌ）×２０（μＬ）〕／２５０（μＬ）＝４８
０（μｇ／Ｌ）となる。つまり、第１試薬中の鉄濃度を
４８０μｇ／Ｌ以上とすればよいということになる。
１試薬の試薬量（ＶＲ１）が２５０μＬの場合の第１試
薬中の鉄濃度（Ｃ１）は、以下のように計算することが
できる。まず、単位を統一するために、６００（μｇ／
ｄＬ）×１０＝６０００（μｇ／Ｌ）とした上で、各々
の数字を上記の式に当てはめると、Ｃ１＝〔６０００
（μｇ／Ｌ）×２０（μＬ）〕／２５０（μＬ）＝４８
０（μｇ／Ｌ）となる。つまり、第１試薬中の鉄濃度を
４８０μｇ／Ｌ以上とすればよいということになる。
【００２２】また、三価の鉄は水溶液中では不安定なた
め、キレート剤を共存させることが好ましい。ここで、
キレート剤としては、鉄とトランスフェリンの結合や鉄
とキレート発色剤の反応を妨害せず還元剤によって速や
かに二価の鉄を遊離するキレート剤を使用するのが好ま
しい。このようなキレート剤としては、例えば、クエン
酸ナトリウム、マロン酸、酒石酸、ニトリロ三酢酸等を
挙げることが出来る。また、キレート剤の濃度は、キレ
ート剤の種類によって最適濃度は異なるが、前記第１試
薬中において、０．４〜８５ｍＭの範囲にあることが好
ましく、４〜８．５ｍＭの範囲が特に好ましい。
め、キレート剤を共存させることが好ましい。ここで、
キレート剤としては、鉄とトランスフェリンの結合や鉄
とキレート発色剤の反応を妨害せず還元剤によって速や
かに二価の鉄を遊離するキレート剤を使用するのが好ま
しい。このようなキレート剤としては、例えば、クエン
酸ナトリウム、マロン酸、酒石酸、ニトリロ三酢酸等を
挙げることが出来る。また、キレート剤の濃度は、キレ
ート剤の種類によって最適濃度は異なるが、前記第１試
薬中において、０．４〜８５ｍＭの範囲にあることが好
ましく、４〜８．５ｍＭの範囲が特に好ましい。
【００２３】（３）比色法による測定 本発明の測定方法及び測定試薬においては、試料中のト
ランスフェリンに結合せずに残存した鉄を比色法により
測定する。ここで、残存した鉄を比色法により測定する
方法としては、キレート発色剤を含む第２試薬を前記の
試料と第１試薬の混合液に添加し、キレート発色剤と残
存した鉄とを結合させて、このキレート発色剤が鉄と結
合することにより生じる吸収スペクトルの変化、色調の
変化などを吸光度を測ることにより測定すればよい。こ
こで、キレート発色剤としては、例えば２−ニトロソ−
５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フ
ェノール、トリピリジルトリアジン等のニトロソアミノ
フェノール誘導体、バソフェナンスロリン等及びそれら
の塩等が挙げられる。塩としては、例えば、ナトリウム
塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、塩酸塩、酢酸塩等
が挙げられる。また、キレート発色剤の濃度としては、
前記第２試薬中において、０．５〜２０ｍＭの範囲にあ
ることが好ましく、０．７〜４ｍＭの範囲が特に好まし
い。
ランスフェリンに結合せずに残存した鉄を比色法により
測定する。ここで、残存した鉄を比色法により測定する
方法としては、キレート発色剤を含む第２試薬を前記の
試料と第１試薬の混合液に添加し、キレート発色剤と残
存した鉄とを結合させて、このキレート発色剤が鉄と結
合することにより生じる吸収スペクトルの変化、色調の
変化などを吸光度を測ることにより測定すればよい。こ
こで、キレート発色剤としては、例えば２−ニトロソ−
５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フ
ェノール、トリピリジルトリアジン等のニトロソアミノ
フェノール誘導体、バソフェナンスロリン等及びそれら
の塩等が挙げられる。塩としては、例えば、ナトリウム
塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、塩酸塩、酢酸塩等
が挙げられる。また、キレート発色剤の濃度としては、
前記第２試薬中において、０．５〜２０ｍＭの範囲にあ
ることが好ましく、０．７〜４ｍＭの範囲が特に好まし
い。
【００２４】なお、キレート発色剤の中には、三価の鉄
とは反応しないものもある。この三価の鉄とは反応しな
いキレート発色剤を使用する場合には、三価の鉄を二価
に還元するために還元剤を試薬に含有させる必要があ
る。この場合、添加する還元剤としては、例えば、チオ
グリコール酸、アスコルビン酸、塩酸ヒドロキシルアミ
ン等及びその塩等を用いることができる。なお、この還
元剤は、第１試薬に含有させてもよいし、第２試薬に含
有させてもよいが、第２試薬に含有させるのが好まし
い。また、これらの還元剤の濃度としては、前記第１試
薬又は第２試薬中において、０．１〜１０ｍＭの範囲に
あることが好ましく、０．２〜４ｍＭの範囲が特に好ま
しい。
とは反応しないものもある。この三価の鉄とは反応しな
いキレート発色剤を使用する場合には、三価の鉄を二価
に還元するために還元剤を試薬に含有させる必要があ
る。この場合、添加する還元剤としては、例えば、チオ
グリコール酸、アスコルビン酸、塩酸ヒドロキシルアミ
ン等及びその塩等を用いることができる。なお、この還
元剤は、第１試薬に含有させてもよいし、第２試薬に含
有させてもよいが、第２試薬に含有させるのが好まし
い。また、これらの還元剤の濃度としては、前記第１試
薬又は第２試薬中において、０．１〜１０ｍＭの範囲に
あることが好ましく、０．２〜４ｍＭの範囲が特に好ま
しい。
【００２５】（４）ＵＩＢＣ測定時のｐＨ 本発明の測定方法及び測定試薬においては、トランスフ
ェリンと鉄が安定に結合できるようなｐＨにすることが
望ましい。例えば、ｐＨが７〜１０の範囲が好ましく、
ｐＨ８〜９の範囲が特に好ましい。また、前記のｐＨ範
囲となるように用いる緩衝液としては、前記のｐＨ範囲
に緩衝能がある従来公知の緩衝液を適宜使用することが
できる。例えば、トリス緩衝液、モノエタノールアミン
緩衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液等の緩衝液を挙げ
ることができる。
ェリンと鉄が安定に結合できるようなｐＨにすることが
望ましい。例えば、ｐＨが７〜１０の範囲が好ましく、
ｐＨ８〜９の範囲が特に好ましい。また、前記のｐＨ範
囲となるように用いる緩衝液としては、前記のｐＨ範囲
に緩衝能がある従来公知の緩衝液を適宜使用することが
できる。例えば、トリス緩衝液、モノエタノールアミン
緩衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液等の緩衝液を挙げ
ることができる。
【００２６】（５）試薬の構成成分 本発明の測定方法及び測定試薬においては、第１試薬及
び／又は第２試薬には、前記の成分の他に、公知の防腐
剤、安定化剤、及び界面活性剤等を必要に応じて適宜含
有させることができる。
び／又は第２試薬には、前記の成分の他に、公知の防腐
剤、安定化剤、及び界面活性剤等を必要に応じて適宜含
有させることができる。
【００２７】なお、特開平２−１５６１６０号公報に記
載されている陰イオン性界面活性剤を使用した場合、添
加した既知過剰量の鉄が非特異的に試料中のアルブミン
等の血清タンパク質に結合することを抑制することがで
きるため、アルブミンと結合した鉄量をもＵＩＢＣとし
て誤って測定することなく、より正確な測定を行うこと
ができる。ここで、陰イオン性界面活性剤としては、例
えば、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエ
ーテル硫酸塩、Ｎ−アシルアミノ酸及びその塩、Ｎ−ア
シルメチルタウリン塩、ポリオキシエチレンアルキルエ
ーテル酢酸塩等を挙げることができる。
載されている陰イオン性界面活性剤を使用した場合、添
加した既知過剰量の鉄が非特異的に試料中のアルブミン
等の血清タンパク質に結合することを抑制することがで
きるため、アルブミンと結合した鉄量をもＵＩＢＣとし
て誤って測定することなく、より正確な測定を行うこと
ができる。ここで、陰イオン性界面活性剤としては、例
えば、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエ
ーテル硫酸塩、Ｎ−アシルアミノ酸及びその塩、Ｎ−ア
シルメチルタウリン塩、ポリオキシエチレンアルキルエ
ーテル酢酸塩等を挙げることができる。
【００２８】（６）試料のＵＩＢＣ測定の一例 次に、本発明のＵＩＢＣの測定方法及び測定試薬を用い
て試料のＵＩＢＣを測定する場合の一例をより具体的に
説明すると、例えば、試料に少なくとも（トランスフェ
リン量よりも過剰の）既知量の三価の鉄を含む第１試薬
を添加して試料中のトランスフェリンと三価の鉄を結合
させる。次に、少なくともキレート発色剤及び還元剤を
含む第２試薬を添加してトランスフェリンと結合せずに
残存した三価の鉄を還元剤によって二価に還元し、二価
の鉄をキレート発色剤と結合させる。このキレート発色
剤が二価の鉄と結合することにより生じる吸収スペクト
ルの変化、色調の変化などを吸光度を測ることにより求
める比色法により測定し、残存した鉄量を求める。この
残存した鉄量を添加した既知過剰量の鉄量から差し引く
ことによりＵＩＢＣ値を求めることができる。また、測
定は、レートアッセイ法及びエンドポイント法のいずれ
の方法でも行うことができる。
て試料のＵＩＢＣを測定する場合の一例をより具体的に
説明すると、例えば、試料に少なくとも（トランスフェ
リン量よりも過剰の）既知量の三価の鉄を含む第１試薬
を添加して試料中のトランスフェリンと三価の鉄を結合
させる。次に、少なくともキレート発色剤及び還元剤を
含む第２試薬を添加してトランスフェリンと結合せずに
残存した三価の鉄を還元剤によって二価に還元し、二価
の鉄をキレート発色剤と結合させる。このキレート発色
剤が二価の鉄と結合することにより生じる吸収スペクト
ルの変化、色調の変化などを吸光度を測ることにより求
める比色法により測定し、残存した鉄量を求める。この
残存した鉄量を添加した既知過剰量の鉄量から差し引く
ことによりＵＩＢＣ値を求めることができる。また、測
定は、レートアッセイ法及びエンドポイント法のいずれ
の方法でも行うことができる。
【００２９】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこの実施例により限定されるものではな
い。
るが、本発明はこの実施例により限定されるものではな
い。
【００３０】〔実施例〕 （血清試料のＵＩＢＣの測定）ＵＩＢＣ測定方法及び測
定試薬にて、鉄濃度を変化させた場合の試料のＵＩＢＣ
測定の再現性向上への効果を確かめた。
定試薬にて、鉄濃度を変化させた場合の試料のＵＩＢＣ
測定の再現性向上への効果を確かめた。
【００３１】（１）試薬の調製 ＵＩＢＣ測定用第１試薬の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ８．５
（２０℃）に調整し、鉄濃度が異なる４種類のＵＩＢＣ
測定用第１試薬を調製した。
に溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ８．５
（２０℃）に調整し、鉄濃度が異なる４種類のＵＩＢＣ
測定用第１試薬を調製した。
【００３２】硫酸第二鉄アンモニウム・１２水塩 １７．９０μＭ、１６．１２μＭ、１４．３１μＭ、１
０．７４μＭクエン酸ナトリウム ８．５ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ０．１６Ｍ
０．７４μＭクエン酸ナトリウム ８．５ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ０．１６Ｍ
【００３３】ＵＩＢＣ測定用第２試薬の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨ８．５（２０℃）に調整し、ＵＩＢＣ測
定用第２試薬を調製した。
に溶解し、ｐＨ８．５（２０℃）に調整し、ＵＩＢＣ測
定用第２試薬を調製した。
【００３４】２−ニトロソ−５−（Ｎ−）プロピル−Ｎ
−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フェノール
１．１９ｍＭ アスコルビン酸 １．０１ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ０．１６Ｍ
−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フェノール
１．１９ｍＭ アスコルビン酸 １．０１ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ０．１６Ｍ
【００３５】（２）ＵＩＢＣの測定 日立製作所社製７１５０形自動分析装置にてＵＩＢＣの
測定を行った。血清試料２０μＬに前記（１）ので調
製したＵＩＢＣ測定用第１試薬２５０μＬを添加して、
混和後３７℃で５分間反応させた後、前記（１）ので
調製した第２試薬１２５μＬを添加し、３７℃で５分間
反応させた。主波長７５０ｎｍ及び副波長６００ｎｍに
おけるＵＩＢＣ測定用第２試薬添加５分後（５０ポイン
ト）の吸光度からＵＩＢＣ測定用第２試薬添加直前（２
４ポイント）の吸光度を差し引き、吸光度差を求め、残
存する鉄量を算出した。そして、この残存する鉄量を添
加した鉄量から差し引くことにより、ＵＩＢＣ値を求め
た。
測定を行った。血清試料２０μＬに前記（１）ので調
製したＵＩＢＣ測定用第１試薬２５０μＬを添加して、
混和後３７℃で５分間反応させた後、前記（１）ので
調製した第２試薬１２５μＬを添加し、３７℃で５分間
反応させた。主波長７５０ｎｍ及び副波長６００ｎｍに
おけるＵＩＢＣ測定用第２試薬添加５分後（５０ポイン
ト）の吸光度からＵＩＢＣ測定用第２試薬添加直前（２
４ポイント）の吸光度を差し引き、吸光度差を求め、残
存する鉄量を算出した。そして、この残存する鉄量を添
加した鉄量から差し引くことにより、ＵＩＢＣ値を求め
た。
【００３６】なお、血清試料と上記の４種類のＵＩＢＣ
測定用第１試薬及び上記のＵＩＢＣ測定用第２試薬とを
上記の添加量で混合した後の最終反応液中の鉄濃度は、
各々、下記の通りとなる。 １１．３３μＭ、１０．２０μＭ、９．０６μＭ、６．
８０μＭ
測定用第１試薬及び上記のＵＩＢＣ測定用第２試薬とを
上記の添加量で混合した後の最終反応液中の鉄濃度は、
各々、下記の通りとなる。 １１．３３μＭ、１０．２０μＭ、９．０６μＭ、６．
８０μＭ
【００３７】（３）測定結果 ＵＩＢＣ測定用第１試薬及びＵＩＢＣ測定用第２試薬を
用いて、血清試料のＵＩＢＣを２０回測定した時の測定
結果を表１及び図１に示した。なお、この表１に示した
数値は、各試薬において、血清試料を２０回連続測定し
た場合のＵＩＢＣ測定値のばらつきを示す変動係数（Ｃ
Ｖ）〔標準偏差／平均値〕（％）を表す。
用いて、血清試料のＵＩＢＣを２０回測定した時の測定
結果を表１及び図１に示した。なお、この表１に示した
数値は、各試薬において、血清試料を２０回連続測定し
た場合のＵＩＢＣ測定値のばらつきを示す変動係数（Ｃ
Ｖ）〔標準偏差／平均値〕（％）を表す。
【００３８】
【表１】
【００３９】また、図１において、横軸は試料、ＵＩＢ
Ｃ測定用第１試薬及びＵＩＢＣ測定用第２試薬を上記の
添加量で混合した後の最終反応液中での鉄濃度を表し、
縦軸は試料を２０回連続測定した場合のＵＩＢＣ測定値
のばらつきを示す変動係数（ＣＶ）〔標準偏差／平均
値〕を表す。
Ｃ測定用第１試薬及びＵＩＢＣ測定用第２試薬を上記の
添加量で混合した後の最終反応液中での鉄濃度を表し、
縦軸は試料を２０回連続測定した場合のＵＩＢＣ測定値
のばらつきを示す変動係数（ＣＶ）〔標準偏差／平均
値〕を表す。
【００４０】
【図１】
【００４１】表１及び図１から明らかなように、ＵＩＢ
Ｃ測定試薬による測定では、最終反応液中の鉄濃度が１
１．３３μＭ及び１０．２０μＭの場合の変動係数は各
々３．４３％、３．３１％であった。これに対し、最終
反応液中の鉄濃度が９．０６μＭ及び６．８０μＭの場
合の変動係数は各々１．８４％、２．０６％となってお
り、ＵＩＢＣ測定値のばらつきを示す変動係数が明らか
に小さくなっている。このように、最終反応液中の鉄濃
度を９μＭ以下とすることにより、測定値の変動が抑え
られ再現性が向上することが分かる。
Ｃ測定試薬による測定では、最終反応液中の鉄濃度が１
１．３３μＭ及び１０．２０μＭの場合の変動係数は各
々３．４３％、３．３１％であった。これに対し、最終
反応液中の鉄濃度が９．０６μＭ及び６．８０μＭの場
合の変動係数は各々１．８４％、２．０６％となってお
り、ＵＩＢＣ測定値のばらつきを示す変動係数が明らか
に小さくなっている。このように、最終反応液中の鉄濃
度を９μＭ以下とすることにより、測定値の変動が抑え
られ再現性が向上することが分かる。
【００４２】このことより、本発明の測定方法及び測定
試薬は、ＵＩＢＣの測定値が変動しばらつくことを抑制
することができ、これにより、再現性がよく、精度が高
いＵＩＢＣ測定値を得られることが確かめられた。
試薬は、ＵＩＢＣの測定値が変動しばらつくことを抑制
することができ、これにより、再現性がよく、精度が高
いＵＩＢＣ測定値を得られることが確かめられた。
【００４３】
【発明の効果】本発明の測定方法及び測定試薬は、最終
反応液中の鉄濃度を９μＭ以下とすることにより、試料
のＵＩＢＣの測定値のばらつきを抑え、ＵＩＢＣ測定値
を再現性よく、精度高く測定することができるものであ
る。そして、これにより、疾患の診断等の場において、
誤差を含まない、かつ正確なＵＩＢＣ測定値を提供する
ことができるものである。
反応液中の鉄濃度を９μＭ以下とすることにより、試料
のＵＩＢＣの測定値のばらつきを抑え、ＵＩＢＣ測定値
を再現性よく、精度高く測定することができるものであ
る。そして、これにより、疾患の診断等の場において、
誤差を含まない、かつ正確なＵＩＢＣ測定値を提供する
ことができるものである。
【図１】本発明のＵＩＢＣ測定方法及び測定試薬での、
最終反応液中の鉄濃度による測定値の再現性への効果を
示した図である。
最終反応液中の鉄濃度による測定値の再現性への効果を
示した図である。
Claims (4)
- 【請求項１】 試料中に含まれるトランスフェリンに対
して既知過剰量の鉄を少なくとも含む第１試薬を試料に
添加し、次にこれに少なくともキレート発色剤を含む第
２試薬を添加した後、この最終反応液中におけるトラン
スフェリンに結合せずに残存した鉄量を比色法により測
定し、そして、この残存した鉄量を添加した鉄量から差
し引くことにより、試料の不飽和鉄結合能を測定する不
飽和鉄結合能の測定方法において、前記最終反応液中で
の鉄濃度が、９μＭ以下であることを特徴とする、試料
の不飽和鉄結合能の測定方法。 - 【請求項２】 第１試薬中の鉄濃度が、下記式で示され
る濃度以上であることを特徴とする、請求項１に記載の
試料の不飽和鉄結合能の測定方法。 Ｃ１＝６００（μｇ／ｄＬ）×ＶＳ／ＶＲ１ （式中、Ｃ１は第１試薬中の鉄濃度、ＶＳは試料の量、
ＶＲ１は第１試薬の試薬量を示す） - 【請求項３】 試料の不飽和鉄結合能の測定試薬におい
て、少なくとも試料中に含まれるトランスフェリンに対
して既知過剰量の鉄を含む第１試薬と、少なくともキレ
ート発色剤を含む第２試薬の２試薬とからなり、試料と
第１試薬及び第２試薬を測定時の添加量の比で混合した
際に、この最終反応液中での鉄濃度が９μＭ以下となる
ように前記過剰量の鉄を第１試薬に含有させることを特
徴とする、不飽和鉄結合能の測定試薬。 - 【請求項４】 第１試薬中の鉄濃度が、下記式で示され
る濃度以上となるように前記既知過剰量の鉄を第１試薬
に含有させることを特徴とする、請求項３に記載の試料
の不飽和鉄結合能の測定試薬。 Ｃ１＝６００（μｇ／ｄＬ）×ＶＳ／ＶＲ１ （式中、Ｃ１は第１試薬中の鉄濃度、ＶＳは試料の量、
ＶＲ１は第１試薬の試薬量を示す）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000404561A JP2002189030A (ja) | 2000-12-21 | 2000-12-21 | 不飽和鉄結合能の測定方法及び測定試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000404561A JP2002189030A (ja) | 2000-12-21 | 2000-12-21 | 不飽和鉄結合能の測定方法及び測定試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002189030A true JP2002189030A (ja) | 2002-07-05 |
Family
ID=18868500
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000404561A Withdrawn JP2002189030A (ja) | 2000-12-21 | 2000-12-21 | 不飽和鉄結合能の測定方法及び測定試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002189030A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020067437A1 (ja) * | 2018-09-28 | 2020-04-02 | ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社 | エタノールアミンリン酸の測定方法 |
| CN111257549A (zh) * | 2018-12-03 | 2020-06-09 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 检测血清中的不饱和铁结合力的试剂盒及方法 |
| CN115290584A (zh) * | 2022-08-05 | 2022-11-04 | 中拓生物有限公司 | 一种稳定的不饱和铁结合力测定试剂盒 |
-
2000
- 2000-12-21 JP JP2000404561A patent/JP2002189030A/ja not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020067437A1 (ja) * | 2018-09-28 | 2020-04-02 | ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社 | エタノールアミンリン酸の測定方法 |
| CN111257549A (zh) * | 2018-12-03 | 2020-06-09 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 检测血清中的不饱和铁结合力的试剂盒及方法 |
| CN115290584A (zh) * | 2022-08-05 | 2022-11-04 | 中拓生物有限公司 | 一种稳定的不饱和铁结合力测定试剂盒 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20080304 |