CN110892268A - 用于荧光和比色蛋白质定量的方法和组合物 - Google Patents

用于荧光和比色蛋白质定量的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

用于通过荧光测定和/或比色检测测定样品中蛋白质或肽的浓度的组合物、试剂盒和方法。通过本组合物、试剂盒和方法对蛋白质和肽或肽混合物进行的快速定量提供了一个或多个优点，例如但不限于可在室温下工作、不需要高温或长温育时间、高敏感度、低S/N背景、以大样品体积和小样品体积进行检测、并在含有洗涤剂和有机溶剂的样品中进行检测的方法。

Description

用于荧光和比色蛋白质定量的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年7月14日提交的美国临时专利申请第62/532,906号的优先权权益。
技术领域
用于通过荧光测定和/或比色检测测定样品中蛋白质或肽的浓度的组合物、试剂盒和方法。
背景技术
在进一步分离和表征蛋白质样品之前，必须进行蛋白质定量。这是提交蛋白质样品进行色谱、电泳和免疫化学分离或分析之前通常需要的步骤。
蛋白质定量最通常使用比色测定来进行。市售比色蛋白质和肽溶液定量方法包含缩二脲(Gornall等人，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》，177(1949)751)、酚试剂法(Lowry等人，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》，193(1951)265)、二辛可宁酸(BCA)(Smith等人，《分析生物化学(Anal.Biochem.)》，150(1985)76)、考马斯蓝G-250染料结合(Bradford，《分析生物化学(Anal.Biochem.)》，72(1976)248)和胶体金(Stoscheck，《分析生物化学(Anal.Biochem.)》，160(1987)301)。
缩二脲法基于与铜离子形成络合物的蛋白质。肽氮在碱性条件下与铜(II)离子结合，产生紫色。产物的吸收最大值为550nm。敏感度为1mg蛋白质/ml到6mg蛋白质/ml。与其它商业比色蛋白质测定方法相比，缩二脲法是一种相对不敏感的蛋白质测定方法。
另一种方法组合了缩二脲反应和铜(1)-浴铜灵螯合反应(通过与铜-浴铜灵螯合反应组合的反向缩二脲法进行的蛋白质的测定(Determination of Proteins by aReverse Biuret Method Combined with the Copper-Bathocuproine ChelateReaction)，《临床化学学报(Clinica Chimica Acta.)》，216(1993)103-111)。在本方法中，样品蛋白质在第一步期间形成Cu2+-蛋白质螯合络合物(缩二脲反应)。多余的Cu2+被抗坏血酸还原为Cu+，从而允许Cu+在第二步期间使形成Cu+-浴铜灵螯合络合物。所形成的Cu+-浴铜灵螯合络合物的量与蛋白质浓度成反比。这是使用浴铜灵螯合剂测定蛋白质浓度的负性或间接测定。酚试剂法是改良的缩二脲反应。它分两个步骤进行：首先，肽键在碱性条件下与铜(II)离子反应，然后Folin-Ciocalteau磷钼-磷钨酸通过芳香族氨基酸的铜催化氧化还原为杂多钼蓝。产物的吸收最大值为750nm。酚试剂法比缩二脲法更敏感，对牛血清白蛋白(BSA)的线性敏感度为0.1mg蛋白质/ml到1.5mg蛋白质/ml。某些氨基酸、洗涤剂、脂质、糖和核酸会干扰反应。所述反应是pH依赖性的，并且pH应保持在pH 10和pH 10.5之间。
BCA法与酚试剂法相关，因为蛋白质中的肽键会首先在碱性介质中还原铜离子(Cu2+)以产生四齿亚铜离子(Cu1+)络合物。然后，亚铜离子络合物与BCA反应(每个Cu1+2个BCA分子)以形成可以在562nm下测量的深紫色。
BCA-铜反应如下示出：
Figure BDA0002371080020000021
由于BCA在碱性介质中稳定，因此BCA法可以在一个步骤中进行，相比之下，酚试剂法需要两个步骤。与酚试剂法相比，BCA法更好地耐受样品中潜在的抑制性或干扰性化合物。例如，与仅1％SDS、0.03％曲拉通(Triton)X-100和0.062％吐温(Tween)-20可以存在并且不会干扰酚试剂法相比，十二烷基硫酸钠(SDS)、曲拉通X-100和吐温-20各自至多可以存在5％并且不会干扰BCA法。与酚试剂法相比，BCA法还具有更高的敏感度和更大的线性工作范围。
MICRO BCATM蛋白质测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific)允许通过使用更大的样品体积获得更高的敏感度来对稀释样品溶液(0.5μg/ml到20μg/ml)进行定量。尽管敏感度提高了，但样品体积要求却限制或妨碍了其用于多种肽样品的定量。
用于定量肽的改良的BCA测定(Kapoor等人，《分析生物化学(AnalyticalBiochemistry)》，393(2009)138-140)承认难以测量肽浓度是由于高度的肽间差异(主要由于肽疏水性)。改良的BCA法通过在用BCA工作试剂温育之前在SDS存在下于95℃下处理五分钟来使肽变性，从而来估算肽浓度。然而，低于500μg/ml的数据非常接近噪声水平，因此不可靠。
美国专利第4,839,295号公开了使用二辛可宁酸作为螯合剂来检测蛋白质，在562nm下测量吸光度。
胶体金法是比色蛋白质测定方法中最敏感的方法。其敏感度为约2μg/ml到20μg/ml蛋白质。然而，存在显著的蛋白质间差异。蛋白质与胶体金的结合会导致胶体金吸光度的变化，其与溶液中蛋白质的量成比例。除硫醇和十二烷基硫酸钠(SDS)以外的大多数常用试剂均与胶体金法兼容。
考马斯蓝G-250染料结合法基于当考马斯蓝G-250在酸性介质中结合蛋白质时发生的从470nm到595nm的即时吸光度变化。显色迅速，并且可以在十分钟内进行测定。考马斯蓝G-250染料结合方相对不受常用试剂(除洗涤剂)的干扰。存在中等的蛋白质间差异，并且所述方法不太适用于肽。
总蛋白质测定(Sozgen等人，《塔兰塔(Talanta)》，68(2006)1601-1609，在碱性介质中使用铜(II)新亚铜试剂进行分光光度总蛋白质测定(Spectrophotometric totalprotein assay with copper(II)neocuproine reagent in alkaline medium))在碱性介质以及氢氧化物-碳酸盐-酒石酸盐溶液中使用铜(II)-新亚铜(Nc)试剂，以新亚铜为螯合剂。在40℃下温育30分钟后，在450nm下针对试剂空白读取还原产物Cu(I)-Nc络合物的吸光度。由于新亚铜在碱性水溶液中的溶解度有限，因此本测定的敏感度有限。
美国专利第5,693,291号公开了一种定量蛋白质方法。所述方法是间接两步法。它使用两种试剂：试剂A(酒石酸盐溶液和硫酸铜)和试剂B(还原剂(例如，抗坏血酸)和浴铜灵二磺酸二钠盐(作为螯合剂))。在第一步中，铜离子与样品中存在的蛋白质络合以形成络合物，其中Cu2+离子被还原为Cu+。在第二步中，抗坏血酸将未通过与样品蛋白质络合而还原的多余的Cu2+离子还原为Cu+离子。Cu+离子与浴铜灵络合以形成红褐色，其通过比色法检测。根据本方法，样品中更大数量的蛋白质会导致可以在第二步中被抗坏血酸还原的Cu2+离子的利用率更低，因此样品中更大数量的蛋白质对应于浴铜灵螯合导致的显色量更低。换句话说，如果样品中不存在蛋白质，则所有的Cu2+离子在第二步中都会被抗坏血酸还原，从而通过浴铜灵螯合形成最大颜色。由于蛋白质的量/数量与所形成的颜色的数/数量/强度成反比，因此本测定是间接测定。
另外，根据美国专利第5,693,291号的间接方法，试剂A在碱性溶液中含有0.7到2mmol/l Cu2+离子和2到4mmol/l酒石酸盐。试剂B含有1到1.5mmol/l抗坏血酸和0.5到0.8mmol/l的浴铜灵。试剂A与试剂B的比例为1:8到1:12，即1份试剂A剂A比8-12份试剂B。试剂A和试剂B的组合体积在750μl和3000μl之间，即比较大。所述方法的第一步将100μl试剂A与50μl样品混合，随后在室温下温育5分钟到60分钟。所述方法的第二步将1ml试剂B加入第一步混合物，随后短暂混合并在485nm下读取。本负性或间接测定通过浴铜灵螯合前的样品与浴铜灵螯合后的样品的吸光度差异对蛋白质进行定量。因此，它不如直接定量蛋白质的正性或直接测定准确。它还使用了较大的标准蛋白质/试剂体积比(标准蛋白质/试剂A体积比为1:1.6到1:2.4)。
本公开中描述的组合物、试剂盒和方法克服了本领域的缺点并提供了另外的益处。
发明内容
本公开提供了用于快速定量适于荧光测定和/或比色检测的蛋白质和肽或肽混合物的组合物、试剂盒和方法。本文提供的用于快速定量蛋白质和肽或肽混合物的组合物、试剂盒和方法提供了一个或多个优点，例如组合物简单、方法工作快速、可在室温下工作、不需要高温或长温育时间、高敏感度、低S/N背景、以大样品体积和小样品体积进行检测、并在含有洗涤剂和有机溶剂的样品中进行检测的方法。
在一些实施例中，本公开提供了一种组合物，其包括：乙腈；和包括或具有以下通式(I)的试剂：
Figure BDA0002371080020000051
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地为烷基，包含但不限于C1-C6直链或支链烷基或C6-C20芳基、烷基芳基或芳基烷基，例如甲基(-CH3)、乙基(-CH2CH3)、丙基(-CH2CH2CH3)、丁基(-CH2CH2CH2CH3)或苯基(-C6H5)；R3、R4、R5和R6各自还另外独立地选自由以下组成的群组：氢(H)、钠(Na+)的磺酸(-SO3 -)盐、钾(K+)的磺酸(-SO3 -)盐、锂(Li+)的磺酸(-SO3 -)盐、钠(Na+)的膦酸(-PO3 -)盐、钾(K+)的膦酸(-PO3 -)盐、锂(Li+)的膦酸(-PO3 -)盐、钠(Na+)的羧酸(-CO2 -)盐、钾(K+)的羧酸(-CO2 -)盐和锂(Li+)的羧酸(-CO2 -)盐；其中当R5和R6是苯基(-C6H5)时，所述苯基(-C6H5)可以另外独立地具有附接到其的分子，所述分子选自由以下组成的群组：钠(Na+)的磺酸(-SO3 -)盐、钾(K+)的磺酸(-SO3 -)盐、锂(Li+)的磺酸(-SO3 -)盐；钠(Na+)的膦酸(-PO3 -)盐、钾(K+)的膦酸(-PO3 -)盐、锂(Li+)的膦酸(-PO3 -)盐、钠(Na+)的羧酸(-CO2 -)盐、钾(K+)的羧酸(-CO2 -)盐和锂(Li+)的羧酸(-CO2 -)盐；并且其中所述试剂以水合((I)H2O)或非水合形式存在。
在一些非限制性实例中，通式(I)的试剂具有分子式：
Figure BDA0002371080020000061
并且是以上结构的水合物或非水合物形式。
在一些非限制性实例中，通式(I)的试剂具有分子式：
Figure BDA0002371080020000062
并且是以上结构的水合物或非水合物形式。
在一些非限制性实例中，通式(I)的试剂具有分子式：
Figure BDA0002371080020000063
并且是以上结构的水合物或非水合物形式。
在一些非限制性实例中，通式(I)的试剂具有分子式：
Figure BDA0002371080020000064
并且是以上结构的水合物或非水合物形式。
在一些实施例中，本公开的组合物包括试剂，所述试剂具有、包括或为通式(I)和/或上述任何一个或多个分子式(包含其任何组合)。
在一些实施例中，本公开的组合物包括乙腈、试剂，所述试剂为通式(I)和/或上述任何一个或多个分子式(包含其任何组合)。
在一些实施例中，在本公开的组合物中，式(I)和/或上述任何一个或多个分子式的试剂的浓度范围为约0.01M到0.1M。
在一些实施例中，在本公开的组合物中，乙腈的浓度范围为约5％-30％。乙腈浓度以体积/体积％测量，可以为5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％并且包含其间的值。
在一些实施例中，本公开的组合物进一步包括酒石酸盐。酒石酸盐可以是酒石酸钠、酒石酸钾或酒石酸钾钠。在一些实施例中，酒石酸盐的浓度范围为约5.7mM到约22.7mM并且包含其间的值。
在一些实施例中，本公开的组合物进一步包括碳酸氢钠或碳酸氢钾。
在一些实施例中，本公开的组合物进一步包括缓冲液，所述缓冲液选自由以下组成的群组：3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、硼酸盐、碳酸盐-碳酸氢盐、4-(环己基氨基)-1-丁磺酸(CABS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、N-三(羟甲基)甲基-4-氨基丁磺酸(TABS)4-(N-吗啉代)丁磺酸(MOBS)2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)、N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)哌嗪-1,4-双(2-羟基丙磺酸)二水合物、哌嗪-N,N'-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)。
在一些实施例中，本公开的组合物包括CAPS缓冲液。在一些实施例中，本公开的组合物包括CABS缓冲液。在一些实施例中，本公开的组合物包括硼酸盐缓冲液。
在一些实施例中，本公开的组合物可以进一步包括铜。在一些实施例中，可以将铜加入本公开的组合物。铜优选为提供Cu2+离子源的形式。在一些实施例中，铜包括在硫酸铜(II)、溴化铜(II)、氯化铜(II)、氟化铜(II)、高氯酸铜(II)、钼酸铜(II)、硝酸铜(II)、氢氧化铜(II)、四氟硼酸铜(II)中。在一些实施例中，铜的浓度范围为约0.25mM到约0.5mM。
本公开的组合物的pH范围可以为约11-12.2。在一些实施例中，本公开的组合物的pH为11、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12、12.1或12.2。
在一些实施例中，本公开的组合物包括用于终止反应的终止溶液。示例性终止溶液包含但不限于乙酸、柠檬酸、抗坏血酸、甲酸、盐酸或硫酸。
在一些实施例中，本公开的组合物包括信号增强剂，所述信号增强剂包括被加入以增强荧光发射的金属螯合剂。示例性信号增强剂包括次氮基三乙酸(NTA)——N(CH2CO2H)3、乙二胺四乙酸(EDTA)、亚氨基二乙酸(IDA)或三羧甲基乙二胺(TED)中的一种或多种。
在一些实施例中，本公开的组合物包括被加入以增强荧光发射的信号增强剂和终止溶液。示例性信号增强剂包含但不限于金属螯合剂次氮基三乙酸(NTA)——N(CH2CO2H)3、乙二胺四乙酸(EDTA)、亚氨基二乙酸(IDA)或三羧甲基乙二胺(TED)。示例性终止溶液包含但不限于乙酸、柠檬酸、抗坏血酸、甲酸、盐酸或硫酸。
在一些实施例中，本公开提供了一种用于测定样品中蛋白质或肽浓度的方法，其包括：(a)将所述样品与下面列出的组分合并以形成混合物，所述组分包括：铜；乙腈；和具有下述通式(I)的试剂：
Figure BDA0002371080020000081
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地为烷基，包含但不限于C1-C6直链或支链烷基或C6-C20芳基、烷基芳基或芳基烷基，例如甲基(-CH3)、乙基(-CH2CH3)、丙基(-CH2CH2CH3)、丁基(-CH2CH2CH2CH3)或苯基(-C6H5)；R3、R4、R5和R6各自还另外独立地选自由以下组成的群组：氢(H)、钠(Na+)的磺酸(-SO3 -)盐、钾(K+)的磺酸(-SO3 -)盐、锂(Li+)的磺酸(-SO3 -)盐、钠(Na+)的膦酸(-PO3 -)盐、钾(K+)的膦酸(-PO3 -)盐、锂(Li+)的膦酸(-PO3 -)盐、钠(Na+)的羧酸(-CO2 -)盐、钾(K+)的羧酸(-CO2 -)盐和锂(Li+)的羧酸(-CO2 -)盐；其中当R5和R6是苯基(-C6H5)时，所述苯基(-C6H5)可以另外独立地具有附接到其的分子，所述分子选自由以下组成的群组：钠(Na+)的磺酸(-SO3 -)盐、钾(K+)的磺酸(-SO3 -)盐、锂(Li+)的磺酸(-SO3 -)盐；钠(Na+)的膦酸(-PO3 -)盐、钾(K+)的膦酸(-PO3 -)盐、锂(Li+)的膦酸(-PO3 -)盐、钠(Na+)的羧酸(-CO2 -)盐、钾(K+)的羧酸(-CO2 -)盐和锂(Li+)的羧酸(-CO2 -)盐；并且其中所述试剂以水合((I)H2O)或非水合形式存在；(b)在足以形成有色络合物的条件下温育所述混合物；和(c)在第一波长下测量由所述有色络合物激发的荧光变化，并且在第二波长下测量发射，或者(c)通过测量所述有色络合物的吸光度。
在一些实施例中，在测量荧光时，所述有色络合物被激发的第一波长在450nm到约480nm之间。在一些实施例中，在测量荧光时，测量荧光发射的第二波长(在第一波长下的激发之后)在660nm到约730nm之间。在一些实施例中，在测量荧光时，测量荧光发射的第二波长(在第一波长下的激发之后)在510nm到约580nm之间。
通常，荧光变化或荧光发射通过荧光计测量或测定。
在一些实施例中，测量所述有色络合物的所述荧光为所述样品中蛋白质或肽浓度的直接指示。样品中蛋白质或肽浓度的直接指示对应于所测量的荧光的量与所述样品中蛋白质或肽的量/数量/浓度成正比的方法。在一些实施例中，当在上述方法的步骤(b)中形成的所述有色络合物在450nm-480nm范围内的第一波长下被激发并且当在660nm-730nm范围内的第二波长下测量荧光发射时，荧光的变化是所述样品中蛋白质或肽浓度的直接测量。
在一些实施例中，测量所述荧光为所述样品中蛋白质或肽浓度的间接指示。样品中蛋白质或肽浓度的间接指示对应于所测量的荧光的量与所述样品中蛋白质或肽的量/数量/浓度成反比的方法。在一些实施例中，当在上述方法的步骤(b)中形成的所述有色络合物在450nm-480nm范围内的第一波长下被激发并且当在510nm到约580nm范围内的第二波长下测量荧光发射时，所述样品中蛋白质或肽的量或数量或浓度与所测量的荧光间接相关。
在所述方法的实施例中，当步骤(c)包括测量所述有色络合物的所述吸光度时，所述吸光度或比色变化通常通过分光光度计或自动微孔板读取仪(例如但不限于Genesys、Spectronic、Evolution或NanoDropTM分光光度计(所有仪器均由Thermo FisherScientific制造))测量或测定。在一些实施例中，测量所述有色络合物的所述吸光度是在450nm到500nm下完成的。测量所述有色络合物的所述吸光度是所述样品中蛋白质或肽浓度的直接指示。样品中蛋白质或肽浓度的直接指示对应于所测量的吸光度的量与所述样品中蛋白质或肽的量/数量/浓度成正比的方法。
在一些实施例中，本公开的方法进一步包括通过将步骤(c)中测量的所述荧光或所述吸光度与至少一种含有已知浓度的蛋白质或肽的对照样品的所测量的荧光或吸光度进行比较来测定所述样品中的蛋白质或肽浓度。具有预定浓度范围的蛋白质或肽的对照样品被称为蛋白质标准品或肽标准品。在一些实施例中，通过本方法测定包括在各种浓度下的蛋白质标准品或肽标准品的荧光发射或吸光度的标准曲线，并且绘制蛋白质或肽在各种浓度下的荧光发射强度或吸光度值。然后，通过本方法测定未知样品蛋白质或肽的浓度，并将所述未知样品的所述荧光发射或吸光度绘制在所述标准曲线上以测定其浓度。常用的蛋白质标准品包含但不限于牛血清白蛋白(BSA)、纯化的抗体(例如，兔IgG、小鼠IgG等)。常用的肽标准品包含但不限于牛血清白蛋白(BSA)的胰蛋白酶消化物、蛋白A、蛋白A/G的胰蛋白酶消化物、HeLa细胞裂解物等。蛋白质标准品或肽标准品是通过本领域已知方法预先测定浓度的任何种类的蛋白质、肽、肽混合物或蛋白质消化物。
在一些实施例中，本公开的方法进一步包括在步骤(b)并且在步骤(c)之前加入终止溶液。示例性终止溶液包含但不限于乙酸、柠檬酸、甲酸、盐酸或硫酸中的一种或多种。对于所有测试的样品以及对于任何测试的蛋白质/肽标准品，可以在由进行本公开的方法的人决定的时间加入终止溶液，以通过在给定时间(例如，5分钟或0-5分钟之间的任何时间)终止反应或防止有色络合物的进一步形成来提供信号的均匀性。在一些实施例中，终止溶液将信号保持在可检测范围内。在一些实施例中，在使用荧光计测量蛋白质浓度的同时加入终止溶液。
在一些实施例中，本公开的方法进一步包括在步骤(b)之后并且在步骤(c)之前加入信号增强剂。增强剂可以将荧光信号增强到最佳可检测水平。示例性增强剂包含但不限于金属螯合剂次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、亚氨基二乙酸(IDA)或三羧甲基乙二胺(TED)。
在一些实施例中，本公开的方法进一步包括在步骤(b)之后并且在步骤(c)之前将终止溶液和增强剂一起加入。
在本公开的方法的一些实施例中，所述样品是具有一种或多种浓度待测定的蛋白质或肽的生物样品或人工生成样品。生物样品可以包括细胞、组织、(细胞、组织的)裂解物、器官、体液(包含但不限于血液、血浆、血清、骨髓、脑脊髓液、脊椎抽液、唾液、鼻液、尿液和粪便)。
通过本公开的方法测定其浓度的蛋白质可以是多肽、糖肽、多聚蛋白质、磷蛋白、任何翻译后修饰的蛋白质及其组合。在本公开的方法的一些实施例中，测定其浓度的肽是三个氨基酸或更长。
在本公开的方法的一些实施例中，加入样品的铜提供了Cu2+离子源。铜可以包括在硫酸铜(II)、溴化铜(II)、氯化铜(II)、氟化铜(II)、高氯酸铜(II)、钼酸铜(II)、硝酸铜(II)、氢氧化铜(II)、四氟硼酸铜(II)中。在所述方法的一些实施例中，加入所述样品的铜的浓度范围为约0.25mM到约0.5mM。
在本公开的方法的一些实施例中，乙腈的浓度为5％、10％、15％、20％、25％、30％(包含其间的值)。乙腈的浓度以体积/体积％测量。
在本公开的方法的一些实施例中，其中所述样品进一步与酒石酸盐合并。在一些实施例中，所述样品可以与酒石酸钠、酒石酸钾或酒石酸钾钠合并。在一些实施例中，酒石酸盐的浓度范围为约5.7mM到约22.7mM(包含其间的值)。在本公开的方法的一些实施例中，所述样品进一步与碳酸氢钠合并。
在本公开的方法的一些实施例中，所述样品进一步与缓冲液合并，所述缓冲液选自由以下组成的群组：3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、硼酸盐、碳酸盐-碳酸氢盐、4-(环己基氨基)-1-丁磺酸(CABS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、N-三(羟甲基)甲基-4-氨基丁磺酸(TABS)4-(N-吗啉代)丁磺酸(MOBS)2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)、N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)哌嗪-1,4-双(2-羟基丙磺酸)二水合物、哌嗪-N,N'-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)。
在本公开的方法的一些实施例中，所述样品进一步与所述CAPS缓冲液合并。在本公开的方法的一些实施例中，所述样品进一步与所述CABS缓冲液合并。在本公开的方法的一些实施例中，所述样品进一步与所述硼酸盐缓冲液合并。
在本公开的方法的一些实施例中，所述混合物的pH范围为约11-12.2。所述混合物的pH可以是11、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12、12.1或12.2。
在本公开的方法的一些实施例中，所述温育在室温下进行。室温是约18℃到约26℃范围内的温度，并且涵盖以下温度：18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃和26℃并包含这些值之间的温度。室温可以在约20℃到约24℃的范围内，并且在一些实施例中，室温可以为约22℃。
一些实施例提供了一种快速蛋白质或肽浓度检测方法，其中所述有色络合物形成，并且可以在少于25分钟内、少于10分钟内、5分钟内、少于5分钟内、4分钟内、3分钟内、2分钟内、1分钟内、少于1分钟内、45秒内、30秒内、15秒内、少于15秒内和瞬时通过比色法或以荧光发射的形式测量。
通过本公开的方法，可以检测到的蛋白质或肽的浓度为20μg/ml到2000μg/ml。
在一些实施例中，可以用于通过本方法检测蛋白质或肽浓度的样品体积为约5μl到约20μl、约5μl、约10μl到20μl、约15μl到20μl和约200μl。
包括多种蛋白质或肽的样品可以用于通过本方法的蛋白质或肽浓度测定。
在所述方法的一些实施例中，通式(I)的试剂具有下述一个或多个分子的分子式，其包含：
Figure BDA0002371080020000131
和以上的水合物或非水合物形式；
Figure BDA0002371080020000132
和以上的水合物或非水合物形式；
Figure BDA0002371080020000133
和以上的水合物或非水合物形式；
Figure BDA0002371080020000141
和以上的水合物或非水合物形式。
在一些实施例中，所述方法适于分析在水性溶剂、有机溶剂及其组合中的样品。可以通过本公开的方法分析的样品可以包括有机溶剂、洗涤剂和/或用于改善蛋白质或肽可溶性或稳定性的试剂中的至少一种。示例性洗涤剂包含但不限于曲拉通X-100、曲拉通X-114、NP-40、吐温80、吐温20、CHAPS和SDS中的一种或多种。在一些实施例中，所述样品可以包括洗涤剂，例如但不限于5％曲拉通X-100、5％曲拉通X-114、5％NP-40、5％吐温80、5％吐温20、5％CHAPS、5％SDS。
本公开的方法可以进一步包括对其浓度通过一种或多种方法进一步测定的所述蛋白质或肽进行分析，所述一种或多种方法包含色谱、电泳、免疫测定、质谱、核磁共振(NMR)或红外(IR)光谱。
本公开还提供了试剂盒，其包括：1)组合物，其包括乙腈和具有下述所述通式(I)的试剂：
Figure BDA0002371080020000142
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地为烷基，包含但不限于C1-C6直链或支链烷基或C6-C20芳基、烷基芳基或芳基烷基，例如甲基(-CH3)、乙基(-CH2CH3)、丙基(-CH2CH2CH3)、丁基(-CH2CH2CH2CH3)或苯基(-C6H5)；R3、R4、R5和R6各自还另外独立地选自由以下组成的群组：氢(H)、钠(Na+)的磺酸(-SO3 -)盐、钾(K+)的磺酸(-SO3 -)盐、锂(Li+)的磺酸(-SO3 -)盐、钠(Na+)的膦酸(-PO3 -)盐、钾(K+)的膦酸(-PO3 -)盐、锂(Li+)的膦酸(-PO3 -)盐、钠(Na+)的羧酸(-CO2 -)盐、钾(K+)的羧酸(-CO2 -)盐和锂(Li+)的羧酸(-CO2 -)盐；其中当R5和R6是苯基(-C6H5)时，所述苯基(-C6H5)可以另外独立地具有附接到其的分子，所述分子选自由以下组成的群组：钠(Na+)的磺酸(-SO3 -)盐、钾(K+)的磺酸(-SO3 -)盐、锂(Li+)的磺酸(-SO3 -)盐；钠(Na+)的膦酸(-PO3 -)盐、钾(K+)的膦酸(-PO3 -)盐、锂(Li+)的膦酸(-PO3 -)盐、钠(Na+)的羧酸(-CO2 -)盐、钾(K+)的羧酸(-CO2 -)盐和锂(Li+)的羧酸(-CO2 -)盐；并且其中所述试剂以水合((I)H2O)或非水合形式存在；和2)铜；每种成分包含在一个或多个单独容器中。
在本公开的试剂盒的一些实施例中，所述式(I)的试剂的浓度范围为约0.01M到约0.1M；乙腈的浓度范围为约5％-30％；并且铜的浓度范围为约0.25mM到约0.5mM。范围包含其间的所有值。
本公开的试剂盒中包括的组合物可以进一步包括一种或多种成分，包含酒石酸盐(选自酒石酸钠、酒石酸钾)、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钾钠和一种或多种缓冲液，所述缓冲液选自3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、硼酸盐、碳酸盐-碳酸氢盐、4-(环己基氨基)-1-丁磺酸(CABS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、N-三(羟甲基)甲基-4-氨基丁磺酸(TABS)4-(N-吗啉代)丁磺酸(MOBS)2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)、N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)哌嗪-1,4-双(2-羟基丙磺酸)二水合物、哌嗪-N,N'-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)。
在本公开的试剂盒的一些实施例中，酒石酸盐的浓度为约5.7mM到约22.7mM，碳酸氢钠、碳酸氢钾或碳酸氢钾钠的浓度为约0.01-0.2M。本公开的试剂盒的所述组分的pH在使用中为约11-12.2。
在一些实施例中，本公开的试剂盒进一步包括一种或多种终止溶液，用于阻止荧光信号(或比色信号)超过可检测信号水平，所述终止溶液包括乙酸、柠檬酸、抗坏血酸、甲酸、盐酸或硫酸。终止溶液将包装在所述试剂盒中的单独容器中。
在一些实施例中，本公开的试剂盒进一步包括一种或多种用于增强荧光发射的试剂。示例性信号增强剂包含一种或多种金属螯合剂，例如但不限于EDTA、IDA、NTA和TED。如果需要信号增强，增强剂将包装在所述试剂盒中的单独容器中，以供使用。
在本公开的试剂盒的一些实施例中，一种或多种终止溶液和一种或多种信号增强剂可以一起包装在单独容器中。
尽管上文已经公开了具体的优点，但是将理解，各个实施例可以包含先前公开的优点中的全部、一些或不包含先前公开的优点。根据本公开的教导，其它技术优点对于本领域技术人员而言可以变得显而易见。根据以下章节中的详细描述，本教导的这些和其它特征将变得更加明显。
附图说明
参考下面的一个或多个附图，可以更好地理解本公开的一个或多个实施例。本领域技术人员将理解，以下描述的附图仅用于说明目的。附图并不旨在以任何方式限制本教导的范围。
图1示出了根据本公开的一个实施例的使用根据本文提供的某些实施例的方法和组合物的蛋白质定量，其示出了在室温下不同温育时间的各种浓度的蛋白质标准BSA的检测；
图2示出了与商业BCATM法相比，使用根据本文提供的某些实施例的方法的蛋白质定量，并且描绘了根据本公开的一个实施例的相对于BCATM的极大时间改进和温育温度。
图3示出了根据本公开的一个实施例的相较于商业BCATM法的使用根据本文提供的某些实施例的方法和组合物的几种裂解物的蛋白质定量。
图4示出了根据本公开的一个实施例的相较于商业BCATM法并且相较于蛋白质数量的理论测定的使用本文提供的本方法的一个实施例的蛋白质定量；
图5示出了根据本公开的一个实施例的以不同时间(包含在少至一分钟内)使用本文提供的使用比色检测的本方法的一个实施例和组合物的一个实施例的快速蛋白质定量；
图6示出了根据本文公开的一个实施例的使用本文提供的本方法的一个实施例的快速蛋白质定量，其相较于商业BCATM法在更少的时间内提供了更大的信号；
图7示出了根据本公开的一个实施例的改变乙腈浓度对在示例性方法中使用本文提供的示例性组合物测量蛋白质浓度的影响；
图8示出了根据本公开的一个实施例的改变乙腈浓度对使用本文提供的某些示例性组合物和方法测量蛋白质浓度的影响；
图9示出了根据本公开的一个实施例的相较于通过吸光度检测所测量或通过荧光检测所测量的使用本文提供的本组合物和方法的一个实施例测量的蛋白质定量；
图10展示并比较了根据本公开的一个实施例的几种终止溶液对本文提供的用于使用荧光测定测量定量蛋白质的方法的一个实施例的终止效力；
图11A和图11B展示并比较了根据本公开的一个实施例的几种终止溶液对本文提供的用于使用荧光测定测量定量蛋白质的方法的一个实施例的终止效力；
图12展示并比较了根据本公开的一个实施例的信号增强剂对于本文提供的用于使用荧光测定测量定量蛋白质的方法的一个实施例的使用；
图13展示并比较了根据本公开的一个实施例的几种HCl终止溶液对本文提供的用于使用荧光测定测量定量蛋白质的方法的一个实施例的终止效力；
图14A和图14B展示并比较了根据本公开的一个实施例的几种酸终止溶液浓度和体积对本文提供的用于使用荧光测定测量定量蛋白质的方法的一个实施例的终止效力；
图15比较了根据本公开的一个实施例的几种溶液对本文提供的用于使用荧光测定测量定量蛋白质的方法的一个实施例的终止效力；
图16比较了根据本公开的一个实施例的几种溶液对本文提供的用于使用荧光测定测量定量蛋白质的方法的一个实施例的终止效力；
图17描绘了对于本公开的方法的一个实施例的通过荧光计进行的荧光信号检测的起始时间线；和
图18示出了根据本公开的一个实施例的使用根据本文提供的某些实施例的方法和几种示例性组合物的蛋白质定量，其示出了相较于商业BCA法的各种浓度的蛋白质标准BSA的检测。
具体实施方式
应当理解，前面的一般描述和下面的详细描述都仅仅是示例性和说明性的，并不旨在限制当前教导的范围。在本申请中，单数的使用包含复数，除非另有具体说明。另外，“包括(comprise)”、“含有(contain)”和“包含(include)”或这些根词的变型(例如但不限于“包括(comprises)”、“含有(contained)”和“包含(including)”)的使用并不旨在是限制性的。除非另有说明，否则“或”的使用是指“和/或”。术语“和/或”是指之前和之后的术语可以一起或分开使用。出于说明目的，而非作为限制，“X和/或Y”可以是指“X”或“Y”或“X和Y”。
每当本文提供数值范围时，所述范围旨在包含起始值和终末值以及其间的任何值或值范围，除非另有具体说明。例如，“从0.2到0.5”是指0.2、0.3、0.4、0.5；其间的范围，例如0.2-0.3、0.3-0.4、0.2-0.4；其间的增量，例如0.25、0.35、0.225、0.335、0.49；其间的增量范围，例如0.26-0.39；等等。
如本文使用，术语“或其组合”是指所述术语之前的所列项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在包含以下中的至少一种：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，如果在特定上下文中顺序很重要，则还包含BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。继续本实例，明确包含的是含有一个或多个项目或术语的重复的组合，例如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。本领域技术人员将理解，除非从上下文明显看出，否则通常对任何组合中的项目或术语的数量没有限制。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为以任何方式限制所描述的主题。本申请中引用的所有文献和类似材料，包含但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文和互联网网页，无论此些文献和类似材料的格式如何，均明确地通过引用并入本文用于任何目的。如果一个或多个并入的文献和类似材料定义或使用的术语与本申请中所述术语的定义相矛盾，则以本申请为准。尽管结合各个实施例描述了本教导，但是并不旨在将本教导限于此些实施例。相反，如本领域技术人员将理解，本教导涵盖各种替代、修改和等同。
尽管本领域已知几种蛋白质和肽定量方法，但是本公开提供了用于蛋白质和肽的快速定量的组合物、试剂盒和方法，其中根据一些实施例，所述方法可以于室温下在十分钟或更短时间内、五分钟或更短时间内、1分钟或更短时间内进行，并且适于荧光测定和/或比色检测。本文提供的用于蛋白质和肽或肽混合物的快速定量的组合物、试剂盒和方法提供了一个或多个优点，例如不需要高温或长温育时间、高敏感度、低S/N背景、低检测可变性、可以大样品体积和小样品体积进行检测、能够检测复杂裂解物以及可在含有洗涤剂和有机溶剂的样品中进行检测。
如以上章节所讨论，美国专利第5,693,291号公开了一种用于蛋白质定量的间接方法。所述方法是间接两步法，其中首先使样品与包括酒石酸盐和硫酸铜的第一试剂(试剂A)反应。在第一步中，硫酸铜的铜离子与样品中存在的蛋白质络合以形成蛋白质-铜络合物，其中Cu2+离子被还原为Cu+。此处的蛋白质-铜络合物是蛋白质-Cu+络合物。在第二步骤中，然后用包括抗坏血酸(作为还原剂)和浴铜灵(作为Cu+离子螯合剂)的试剂B处理多余的Cu2+离子(即未通过形成蛋白质-铜络合物而还原为Cu+的Cu2+离子)。这些多余的(未结合的)Cu2+离子被抗坏血酸还原以形成Cu+离子。如此形成的Cu+离子被浴铜灵螯合以形成具有红褐色的浴铜灵-Cu+络合物，其通过比色法检测。根据本方法，样品中更大数量的蛋白质会导致可以在第二步中被抗坏血酸还原的游离Cu2+离子的利用率更低。因此，样品中更大数量的蛋白质对应于Cu+离子的浴铜灵螯合导致的显色量更低。由于蛋白质的量/数量与所形成的颜色的量/数量/强度成反比，因此本测定是间接测定。
由一个或多个本发明人于2015年12月17日公开的，优先权日为2014年6月11日(美国申请14/734,678)的PCT专利申请号PCT/US2015/034960的公开内容公开了一种用于肽和/或蛋白质定量的直接方法。根据PCT/US2015/034960，将包括蛋白质或肽的样品与硫酸铜合并，导致了蛋白质-铜/肽-铜络合物的形成，其中Cu2+离子被还原为Cu+。此处的蛋白质-铜络合物是蛋白质-Cu+络合物。然后，浴铜灵与蛋白质上的Cu+离子反应以形成呈橙褐色的浴铜灵-Cu+-蛋白质螯合物。然后，在450nm到500nm下测量吸光度。根据本方法，由于蛋白质-Cu+络合物与浴铜灵螯合以形成被测量的颜色，因此样品中更大数量或浓度的蛋白质或肽会导致更大程度的Cu2+到Cu+的还原，并且形成更大量的浴铜灵-Cu+-蛋白质螯合物，其通过分光光度法在450nm到500nm下测量。
Rapisarada等人在“通过Cu(I)淬灭浴铜灵二磺酸盐荧光作为铜定量的基础(Quenching of bathocuproine disulfonate fluorescence by Cu(I)as a basis forcopper quantification)”，《分析生物化学(Analytical Biochemistry)》，307(2002)105-109中公开了用于使用浴铜灵二磺酸二钠盐水合物的荧光性质测定蛋白质中的铜浓度的方法。本文章描述了在中性pH 7.5时通过增加Cu(I)的浓度进行的770nm下的浴铜灵二磺酸盐(BCS)发射(λex 580nm)的线性淬灭。用于测定可溶性蛋白质中的总铜含量的程序被描述为具有三个步骤：在pH<1时释放铜，在稳定铜的柠檬酸盐的存在下进行中和，和在螯合剂BCS的存在下通过抗坏血酸盐将铜还原为Cu(I)。标准铜样品与测试样品在相同的介质和条件下平行运行。根据测试样品在770nm下的发射(λex 580nm)与BCS荧光与铜浓度的标准曲线比较，计算出测试样品中的铜的含量。
本发明人惊奇地发现了已被应用在当前公开的用于使用荧光测定检测定量蛋白质的组合物、试剂盒和方法中的浴铜灵化合物的新荧光性质。使用本公开的组合物(其具有较少的组分，例如其不包括还原剂(例如，抗坏血酸))，本发明人设计了用于定量蛋白质或肽的新方法，其使用了较少且简化的步骤，例如但不限于步骤不需要pH的大幅改变，不需要高温，相较于现有方法仅需要5分钟或更短时间的温育时间，不需要将样品与另外的还原剂(例如，抗坏血酸)接触以将Cu2+还原为Cu+。在一些实施例中，本公开的组合物、试剂盒和方法允许在碱性条件下检测蛋白质或肽浓度。
令人惊奇的是，本发明人还发现，使用本组合物的本快速方法可以通过光谱检测方法或荧光测定方法以相同的准确性和敏感度进行检测。因此，使用当前公开的新组合物、试剂盒和方法，通过与样品蛋白质或肽络合以形成蛋白质-Cu+络合物或肽-Cu+络合物，实现了Cu2+到Cu+的快速还原。此外，新组合物允许在同一步骤中通过浴铜灵分子螯合蛋白质-Cu+络合物中的Cu+离子(无需：pH改变；和/或高温和/或温育时间延长)，以形成蛋白质-Cu+-浴铜灵螯合络合物。可以在第一波长下激发本蛋白质-Cu+-浴铜灵螯合络合物，并在第二波长下测量荧光发射，以使用荧光计测定蛋白质或肽浓度。也可以使用分光光度计通过比色法测量包括蛋白质-Cu+-浴铜灵螯合络合物的有色络合物。这允许单一测定形式在多种检测平台上使用。
荧光蛋白质或肽定量方法的一个或多个优点包含但不限于：测定速度以及另外能够通过比色法或使用荧光测量或结合两者来测定蛋白质浓度。这具有多个优点，例如提供了对结果的内部检查，因为可以通过比色法计算蛋白质浓度并使用荧光来确认结果。可替代地，可以使用荧光模式来计算蛋白质或肽浓度，然后使用比色模式来确认结果。本方法和组合物提供的另外的优点是，由于手持式荧光装置(例如但不限于QubitTM平台)可以与这些方法一起使用，因此可以在现场环境中进行蛋白质或肽浓度的测量。这对于需要在现场环境中进行测量(即无需访问实验室/诊所)的应用尤其有用，例如人类识别(HID)、犯罪现场检测、蛋白质临床检测(用于农村环境、第三世界地区、战场情况中的诊断、农场或牧场或野外的动物疾病的诊断、食品安全测试等)。
本公开的组合物、试剂盒和方法允许了于室温下通过荧光测定法或通过比色法进行的蛋白质或肽浓度的快速检测(在一些实施例中，在10分钟或更短时间内；在一些实施例中，在5分钟内、少于5分钟内、4分钟内、3分钟内、2分钟内、1分钟内、少于一分钟内、45秒内、30秒内、15秒内或瞬时)。
组合物：
本文提供了组合物，其包括：乙腈；和具有或包括通式(I)的试剂：
Figure BDA0002371080020000221
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地为烷基，包含但不限于C1-C6直链或支链烷基或C6-C20芳基、烷基芳基或芳基烷基，例如甲基(-CH3)、乙基(-CH2CH3)、丙基(-CH2CH2CH3)、丁基(-CH2CH2CH2CH3)或苯基(-C6H5)；R3、R4、R5和R6各自还另外独立地选自由以下组成的群组：氢(H)、钠(Na+)的磺酸(-SO3 -)盐、钾(K+)的磺酸(-SO3 -)盐、锂(Li+)的磺酸(-SO3 -)盐、钠(Na+)的膦酸(-PO3 -)盐、钾(K+)的膦酸(-PO3 -)盐、锂(Li+)的膦酸(-PO3 -)盐、钠(Na+)的羧酸(-CO2 -)盐、钾(K+)的羧酸(-CO2 -)盐和锂(Li+)的羧酸(-CO2 -)盐；其中当R5和R6是苯基(-C6H5)时，所述苯基(-C6H5)可以另外独立地具有附接到其的分子，所述分子选自由以下组成的群组：钠(Na+)的磺酸(-SO3 -)盐、钾(K+)的磺酸(-SO3 -)盐、锂(Li+)的磺酸(-SO3 -)盐；钠(Na+)的膦酸(-PO3 -)盐、钾(K+)的膦酸(-PO3 -)盐、锂(Li+)的膦酸(-PO3 -)盐、钠(Na+)的羧酸(-CO2 -)盐、钾(K+)的羧酸(-CO2 -)盐和锂(Li+)的羧酸(-CO2 -)盐；并且其中所述试剂以水合((I)H2O)或非水合形式存在。
在一些实施例中，式(I)的分子是1,10-菲咯啉。在一些非限制性实例中，通式(I)的试剂具有下述一个或多个分子式，其包含：
Figure BDA0002371080020000231
和以上结构的水合物或非水合物形式；
Figure BDA0002371080020000232
和以上结构的水合物或非水合物形式；
Figure BDA0002371080020000233
和以上结构的水合物或非水合物形式；和/或
Figure BDA0002371080020000234
并且是以上结构的水合物或非水合物形式。
本公开的组合物的实施例包括乙腈；和通式(I)的试剂，其包含例如上述一个或多个分子式(包含其任何组合)。
在一些示例性实施例中，本公开的组合物包括式(I)的试剂，其包含上述一个或多个分子式，其范围为约0.01M到0.1M(包含其间的值)；和乙腈，其浓度范围为约5％-30％。乙腈浓度以体积/体积％测量，可以为5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％并且包含其间的值。
在一些示例性实施例中，本公开的组合物进一步包括酒石酸盐。酒石酸盐可以是酒石酸钠、酒石酸钾或酒石酸钾钠。在一些实施例中，酒石酸盐的浓度范围为约5.7mM到约22.7mM(包含其间的值)。在一些实施例中，本公开的组合物进一步包括碳酸氢钠或碳酸氢钾。
本公开的组合物进一步包括缓冲液，所述缓冲液选自由以下组成的群组：3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、硼酸盐、碳酸盐-碳酸氢盐、4-(环己基氨基)-1-丁磺酸(CABS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、N-三(羟甲基)甲基-4-氨基丁磺酸(TABS)4-(N-吗啉代)丁磺酸(MOBS)2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)、N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)哌嗪-1,4-双(2-羟基丙磺酸)二水合物、哌嗪-N,N'-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)。
这些缓冲液中的一些的结构在下面阐述。这些缓冲液中的一些的化学结构在下面提供。CAPS的结构：
Figure BDA0002371080020000241
CABS的结构：
Figure BDA0002371080020000251
CAPSO的结构：
Figure BDA0002371080020000252
TABS的结构：
Figure BDA0002371080020000253
MOBS的结构：
Figure BDA0002371080020000254
CHES的结构：
Figure BDA0002371080020000255
AMPSO的结构：
Figure BDA0002371080020000256
POPSO的结构：
Figure BDA0002371080020000261
在一些示例性实施例中，本发明的组合物包括CAPS缓冲液或CABS缓冲液或硼酸盐缓冲液。在一些非限制性实施例中，如上所述的缓冲液为组合物提供稳定性。在一些非限制性实施例中，如上所述的缓冲液防止乙腈从溶液析出并为组合物提供稳定性。
本公开的组合物的pH范围可以为约11-12.2。在一些实施例中，本公开的组合物的pH为11、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12、12.1或12.2。
在一些实施例中，本公开的组合物可以进一步包括铜。在一些实施例中，可以将铜加入本公开的组合物。铜优选为提供Cu2+离子源的形式。在一些实施例中，铜包括在硫酸铜(II)、溴化铜(II)、氯化铜(II)、氟化铜(II)、高氯酸铜(II)、钼酸铜(II)、硝酸铜(II)、氢氧化铜(II)、四氟硼酸铜(II)中。在一些实施例中，铜的浓度范围为约0.25mM到约0.5mM并且包含其间的值。
在一些实施例中，本公开的组合物包括用于终止反应的终止溶液。示例性终止溶液包含但不限于乙酸、柠檬酸、抗坏血酸、甲酸、盐酸或硫酸。
在一些实施例中，本公开的组合物包括信号增强剂，所述信号增强剂包括被加入以增强荧光发射的金属螯合剂。示例性信号增强剂包括次氮基三乙酸(NTA)——N(CH2CO2H)3、乙二胺四乙酸(EDTA)、亚氨基二乙酸(IDA)或三羧甲基乙二胺(TED)中的一种或多种。
在一些实施例中，本公开的组合物包括被加入以增强荧光发射的信号增强剂和终止溶液。示例性信号增强剂包含但不限于金属螯合剂次氮基三乙酸(NTA)——N(CH2CO2H)3、乙二胺四乙酸(EDTA)、亚氨基二乙酸(IDA)或三羧甲基乙二胺(TED)。示例性终止溶液包含但不限于乙酸、柠檬酸、抗坏血酸、甲酸、盐酸或硫酸。
方法：
在一些实施例中，本公开提供了一种用于测定样品中蛋白质或肽浓度的方法，其包括以下步骤：(a)将所述样品与下面列出的组分合并以形成混合物，所述组分包括：铜；乙腈；和具有或包括下述通式(I)的试剂：
Figure BDA0002371080020000271
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地为烷基，包含但不限于C1-C6直链或支链烷基或C6-C20芳基、烷基芳基或芳基烷基，例如甲基(-CH3)、乙基(-CH2CH3)、丙基(-CH2CH2CH3)、丁基(-CH2CH2CH2CH3)或苯基(-C6H5)；R3、R4、R5和R6各自还另外独立地选自由以下组成的群组：氢(H)、钠(Na+)的磺酸(-SO3 -)盐、钾(K+)的磺酸(-SO3 -)盐、锂(Li+)的磺酸(-SO3 -)盐、钠(Na+)的膦酸(-PO3 -)盐、钾(K+)的膦酸(-PO3 -)盐、锂(Li+)的膦酸(-PO3 -)盐、钠(Na+)的羧酸(-CO2 -)盐、钾(K+)的羧酸(-CO2 -)盐和锂(Li+)的羧酸(-CO2 -)盐；其中当R5和R6是苯基(-C6H5)时，所述苯基(-C6H5)可以另外独立地具有附接到其的分子，所述分子选自由以下组成的群组：钠(Na+)的磺酸(-SO3 -)盐、钾(K+)的磺酸(-SO3 -)盐、锂(Li+)的磺酸(-SO3 -)盐；钠(Na+)的膦酸(-PO3 -)盐、钾(K+)的膦酸(-PO3 -)盐、锂(Li+)的膦酸(-PO3 -)盐、钠(Na+)的羧酸(-CO2 -)盐、钾(K+)的羧酸(-CO2 -)盐和锂(Li+)的羧酸(-CO2 -)盐；并且其中所述试剂以水合((I)H2O)或非水合形式存在；(b)在足以形成有色络合物的条件下温育所述混合物；和(c)在第一波长下测量由所述有色络合物激发的荧光变化，并且在第二波长下测量发射，或者(c)通过测量所述有色络合物的吸光度。
在所述方法的一些实施例中，通式(I)的试剂具有下述一个或多个分子的分子式，其包含：
Figure BDA0002371080020000281
和以上的水合物或非水合物形式；
Figure BDA0002371080020000282
和以上的水合物或非水合物形式；
Figure BDA0002371080020000283
和以上的水合物或非水合物形式；
Figure BDA0002371080020000284
和以上的水合物或非水合物形式。
在本公开的方法的一些实施例中，加入样品的铜提供了Cu2+离子源。铜可以包括在硫酸铜(II)、溴化铜(II)、氯化铜(II)、氟化铜(II)、高氯酸铜(II)、钼酸铜(II)、硝酸铜(II)、氢氧化铜(II)、四氟硼酸铜(II)中。在所述方法的一些实施例中，加入样品的铜的浓度范围为约0.25mM到约0.5mM(包含其间的值)。
在本公开的方法的一些实施例中，乙腈的浓度为为5％、10％、15％、20％、25％、30％(包含其间的值)。
在本公开的方法的一些实施例中，所述样品进一步与酒石酸盐(例如，酒石酸钠、酒石酸钾或酒石酸钾钠)合并。在本公开的方法的一些实施例中，所述样品进一步与碳酸氢钠合并。在本公开的方法的一些实施例中，所述样品进一步与缓冲液合并，所述缓冲液选自由以下组成的群组：3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、硼酸盐、碳酸盐-碳酸氢盐、4-(环己基氨基)-1-丁磺酸(CABS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、N-三(羟甲基)甲基-4-氨基丁磺酸(TABS)4-(N-吗啉代)丁磺酸(MOBS)2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)、N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)哌嗪-1,4-双(2-羟基丙磺酸)二水合物、哌嗪-N,N'-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)。在本公开的方法的一些实施例中，所述样品进一步与所述CAPS缓冲液合并。在本公开的方法的一些实施例中，所述样品进一步与所述CABS缓冲液合并。在本公开的方法的一些实施例中，所述样品进一步与所述硼酸盐缓冲液合并。
在本公开的方法的一些实施例中，所述混合物的pH范围为约11-12.2。所述混合物的pH可以是11、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12、12.1或12.2。
在本公开的方法的一些实施例中，所述温育在室温下进行。室温是约18℃到约26℃范围内的温度，并且涵盖以下温度：18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃和26℃并包含这些值之间的温度。室温可以在约20℃到约24℃的范围内，并且在一些实施例中，室温可以为约22℃。
一些实施例提供了一种快速蛋白质或肽浓度检测方法，其中所述有色络合物形成，并且可以在少于25分钟内、少于10分钟内、5分钟内、少于5分钟内、4分钟内、3分钟内、2分钟内、1分钟内、少于1分钟内、45秒内、30秒内、15秒内或瞬时通过比色法或以荧光发射的形式测量。
在测量荧光时，所述有色络合物被激发的第一波长在450nm到约480nm之间。在一些实施例中，在测量荧光时，测量荧光发射的第二波长(在第一波长下的激发之后)在660nm到约730nm之间。在一些实施例中，在测量荧光时，测量荧光发射的第二波长(在第一波长下的激发之后)在510nm到约580nm之间。
通常，荧光变化或荧光发射通过荧光计测量或测定。可以使用的示例性荧光计为但不限于QubitTM(Thermo Fisher Scientific)、Varioskan(Thermo Fisher Scientific)，Quantus荧光计(Promega)；Gemini(Molecular Devices)，或通过NanoDropTM荧光计(ThermoFisher Scientific)。
在一些实施例中，测量所述有色络合物的所述荧光为所述样品中蛋白质或肽浓度的直接指示。样品中蛋白质或肽浓度的直接指示对应于所测量的荧光的量与所述样品中蛋白质或肽的量/数量/浓度成正比的方法。在一些实施例中，当在上述方法的步骤(b)中形成的所述有色络合物在450nm-480nm范围内的第一波长下被激发并且当在660nm-730nm范围内的第二波长下测量荧光发射时，荧光的变化是所述样品中蛋白质或肽浓度的直接测量。
当在450-480nm下激发时，浴铜灵-Cu(I)络合物产生660-730nm下的荧光发射信号。660-730nm下的发射信号只能来自浴铜灵-Cu(I)络合物。存在的Cu(I)是蛋白质/肽将Cu(II)还原为Cu(I)的结果。因此，660-730nm下的荧光发射信号的量与所产生的Cu(I)的量成正比，所产生的Cu(I)的量与存在的蛋白质/肽的量成正比。
在一些实施例中，本公开的方法进一步包括在0分钟到5分钟的温育时间(包含本时间范围期间的温育时间)之后并且在测量荧光之前，向有所述色络合物加入一种或多种终止溶液。在一些实施例中，所述温育时间可以是少于1分钟、少于5分钟、5分钟、多于5分钟并且可以是10分钟或更长时间。根据本公开的示例性终止溶液包含乙酸、盐酸、硫酸。终止溶液终止测定反应并防止所述有色络合物的进一步形成，从而将发射的荧光保持在可检测范围内。所述终止溶液通过使测定溶液呈酸性来终止测定。本公开的终止溶液不淬灭荧光。
在一些实施例中，本公开的方法进一步包括加入增强剂以增强或改善荧光发射信号。可以加入螯合剂(例如，EDTA、NTA、IDA和TED)作为增强剂。
在一些实施例中，本公开的方法进一步包括在步骤(b)并且在步骤(c)之前加入终止溶液。示例性终止溶液包含但不限于乙酸、柠檬酸、甲酸、盐酸或硫酸中的一种或多种。对于所有测试的样品以及对于任何测试的蛋白质/肽标准品，可以在由进行本公开的方法的人决定的时间加入终止溶液，以通过在给定时间(例如，5分钟或0-5分钟之间的任何时间)终止反应或防止有色络合物的进一步形成来提供信号的均匀性。在一些实施例中，终止溶液将信号保持在可检测范围内。在一些实施例中，在使用荧光计测量蛋白质浓度的同时加入终止溶液。
在一些实施例中，本公开的方法进一步包括在步骤(b)之后并且在步骤(c)之前加入信号增强剂。增强剂可以将荧光信号增强到最佳可检测水平。
在一些实施例中，本公开的方法进一步包括在步骤(b)之后并且在步骤(c)之前将终止溶液和增强剂一起加入。
在一些实施例中，测量所述荧光为所述样品中蛋白质或肽浓度的间接指示。样品中蛋白质或肽浓度的间接指示对应于所测量的荧光的量与所述样品中蛋白质或肽的量/数量/浓度成反比的方法。在一些实施例中，当在上述方法的步骤(b)中形成的所述有色络合物在450nm-480nm范围内的第一波长下被激发并且当在510nm到约580nm范围内的第二波长下测量荧光发射时，所述样品中蛋白质或肽的量或数量或浓度与所测量的荧光间接相关。尽管不限于理论，但当在450nm-480nm下被激发时，浴铜灵具有510-580nm下的荧光发射。本荧光发射来自未结合Cu(I)的浴铜灵。随着游离浴铜灵的量减少，由于与结合到样品中的蛋白质的Cu(I)络合，510-580nm下的荧光发射也减少了。
本公开的方法可以进一步包括通过将步骤(c)中测量的所述荧光与至少一种含有已知浓度的蛋白质或肽的对照样品的所测量的荧光进行比较来测定所述样品中的蛋白质或肽浓度。具有预定浓度范围的蛋白质或肽的对照样品被称为蛋白质标准品或肽标准品。在一个示例性实施例中，通过本方法测定包括在各种浓度下的蛋白质标准品或肽标准品的荧光发射的标准曲线，并且绘制标准蛋白质或标准肽在各种浓度下的荧光发射强度。然后，通过本方法测定未知样品蛋白质或肽的浓度，并将所述未知样品的所述荧光发射绘制在所述标准曲线上以测定其浓度。蛋白质标准品或肽标准品是通过本领域已知方法预先测定浓度的任何种类的蛋白质、肽、肽混合物或蛋白质消化物。
常用的蛋白质标准品包含但不限于牛血清白蛋白(BSA)、纯化的抗体(例如，兔IgG、小鼠IgG、山羊IgG、绵羊IgG或人IgG等)。常用的肽标准品包含但不限于牛血清白蛋白(BSA)的胰蛋白酶消化物、蛋白A、蛋白A/G的胰蛋白酶消化物、HeLa细胞裂解物等。蛋白质标准品或肽标准品是通过本领域已知方法预先测定浓度的任何种类的蛋白质、肽、肽混合物或蛋白质消化物。
在所述方法的实施例中，当步骤(c)包括测量所述有色络合物的所述吸光度时，所述吸光度或比色变化通常通过分光光度计或自动微孔板读取仪测量或测定。在一些实施例中，测量所述有色络合物的所述吸光度是在450nm到500nm下完成的。测量所述有色络合物的所述吸光度是所述样品中蛋白质或肽浓度的直接指示。样品中蛋白质或肽浓度的直接指示对应于所测量的吸光度的量与所述样品中蛋白质或肽的量/数量/浓度成正比的方法。
在一些实施例中，本公开的方法进一步包括通过将步骤(c)中测量的所述吸光度与至少一种含有已知浓度的蛋白质或肽的对照样品的所测量的吸光度进行比较来测定所述样品中的蛋白质或肽浓度。如上所述，具有预定浓度范围的蛋白质或肽的对照样品被称为蛋白质标准品或肽标准品。在一些实施例中，通过本方法测定包括在各种浓度下的蛋白质标准品或肽标准品的吸光度的标准曲线，并且绘制标准蛋白质或标准肽在各种浓度下的吸光度值。然后，通过本方法测定未知样品蛋白质或肽的浓度，并将所述未知样品的所述吸光度绘制在所述标准曲线上以测定其浓度。蛋白质标准品或肽标准品是通过本领域已知方法预先测定浓度的任何种类的蛋白质、肽、肽混合物或蛋白质消化物。
可以通过本公开的方法分析各种类型的样品，以测定其中的蛋白质或肽浓度。例如，样品可以是具有一种或多种浓度待测定的蛋白质或肽的生物样品或人工生成/创造样品。示例性生物样品可以包含但不限于细胞、组织、(细胞、组织的)裂解物、器官、体液(包含但不限于血液、血浆、血清、骨髓、脑脊髓液、脊椎抽液、唾液、鼻液、尿液和粪便)。示例性人工生成/创造样品可以包含但不限于实验室中生成的合成蛋白质或肽。
当前公开的方法适于分析在水性溶剂、有机溶剂以及作为水性和有机溶剂的组合的溶剂中的样品。例如，含有浓度待测定的蛋白质或肽的样品可以是裂解物或复杂裂解物，所述复杂裂解物中的用于溶解或维持一种或多种蛋白质或肽组分的完整性的裂解缓冲液或溶液的组分包括有机溶剂、水性溶剂或两者。
在其它实例中，可以通过本公开的方法分析的样品可以包括有机溶剂、洗涤剂和/或用于改善蛋白质或肽的可溶性或稳定性的试剂中的至少一种。样品中可以包括的示例性洗涤剂包含但不限于曲拉通X-100、曲拉通X-114、NP-40、吐温80、吐温20、CHAPS和SDS中的一种或多种。在一些实施例中，所述样品可以包括洗涤剂，例如但不限于5％曲拉通X-100、5％曲拉通X-114、5％NP-40、5％吐温80、5％吐温20、5％CHAPS、5％S DS。
通过本公开的方法测定其浓度的蛋白质可以是多肽、糖肽、多聚蛋白质、磷蛋白、任何翻译后修饰的蛋白质及其组合。在本公开的方法的一些实施例中，测定其浓度的肽是三个氨基酸或更长。因此，样品可以含有一种或多种上述类型的肽或蛋白质。
通过本公开的方法，可以检测到的蛋白质或肽的浓度为20μg/ml到2000μg/ml。
在一些实施例中，可以用于通过本方法检测蛋白质或肽浓度的样品体积为约5μl到约20μl、约5μl、约10μl到20μl、约15μl到20μl和约200μl。
包括多种蛋白质或肽的样品可以用于通过本方法的蛋白质或肽浓度测定。
本公开的方法可以进一步包括对其浓度通过一种或多种方法进一步测定的所述蛋白质或肽进行分析，所述一种或多种方法包含色谱、电泳、免疫测定、质谱、核磁共振(NMR)或IR。
试剂盒：
本公开还描述了用于实施本文讨论的方法的试剂盒和/或含有本文描述的组合物的试剂盒。在一个实施例中，本公开还提供了试剂盒，其包括：1)组合物，其包括乙腈和具有或包括下述通式(I)的试剂：
Figure BDA0002371080020000341
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地为烷基，包含但不限于C1-C6直链或支链烷基或C6-C20芳基、烷基芳基或芳基烷基，例如甲基(-CH3)、乙基(-CH2CH3)、丙基(-CH2CH2CH3)、丁基(-CH2CH2CH2CH3)或苯基(-C6H5)；R3、R4、R5和R6各自还另外独立地选自由以下组成的群组：氢(H)、钠(Na+)的磺酸(-SO3 -)盐、钾(K+)的磺酸(-SO3 -)盐、锂(Li+)的磺酸(-SO3 -)盐、钠(Na+)的膦酸(-PO3 -)盐、钾(K+)的膦酸(-PO3 -)盐、锂(Li+)的膦酸(-PO3 -)盐、钠(Na+)的羧酸(-CO2 -)盐、钾(K+)的羧酸(-CO2 -)盐和锂(Li+)的羧酸(-CO2 -)盐；其中当R5和R6是苯基(-C6H5)时，所述苯基(-C6H5)可以另外独立地具有附接到其的分子，所述分子选自由以下组成的群组：钠(Na+)的磺酸(-SO3 -)盐、钾(K+)的磺酸(-SO3 -)盐、锂(Li+)的磺酸(-SO3 -)盐；钠(Na+)的膦酸(-PO3 -)盐、钾(K+)的膦酸(-PO3 -)盐、锂(Li+)的膦酸(-PO3 -)盐、钠(Na+)的羧酸(-CO2 -)盐、钾(K+)的羧酸(-CO2 -)盐和锂(Li+)的羧酸(-CO2 -)盐；并且其中所述试剂以水合((I)H2O)或非水合形式存在；和2)铜；每种成分包含在一个或多个单独容器中。
在本公开的试剂盒的一些实施例中，所述式(I)的试剂的浓度范围为约0.01M到约0.1M；乙腈的浓度范围为约5％-50％；并且铜的浓度范围为约0.25mM到约0.5mM。
本公开的试剂盒中包括的组合物可以进一步包括一种或多种成分，包含酒石酸盐(选自酒石酸钠、酒石酸钾)、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钾钠和一种或多种缓冲液，所述缓冲液选自3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、硼酸盐、碳酸盐-碳酸氢盐、4-(环己基氨基)-1-丁磺酸(CABS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、N-三(羟甲基)甲基-4-氨基丁磺酸(TABS)4-(N-吗啉代)丁磺酸(MOBS)2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)、N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)哌嗪-1,4-双(2-羟基丙磺酸)二水合物、哌嗪-N,N'-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)。
在本公开的试剂盒的一些实施例中，酒石酸盐的浓度为约5.7mM到约22.7mM，碳酸氢钠、碳酸氢钾或碳酸氢钾钠的浓度为约0.01到0.2M。本公开的试剂盒的所述组分的pH在使用中为约11-12.2。
在一些实施例中，本公开的试剂盒进一步包括一种或多种终止溶液，用于阻止荧光信号(或比色信号)超过可检测信号水平，所述终止溶液包括乙酸、柠檬酸、抗坏血酸、甲酸、盐酸或硫酸。终止溶液将包装在所述试剂盒中的单独容器中。
在一些实施例中，本公开的试剂盒进一步包括一种或多种用于增强荧光发射的试剂。示例性信号增强剂包含一种或多种金属螯合剂，例如但不限于EDTA、IDA、NTA和TED。如果需要信号增强，增强剂将包装在所述试剂盒中的单独容器中，以供使用。
在本公开的试剂盒的一些实施例中，一种或多种终止溶液和一种或多种信号增强剂可以一起包装在单独容器中。
试剂盒的试剂和组分可以包括在一个或多个合适的容器中。容器通常可以包括至少一个可以将组分置于其中并且优选适当地等分的小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器装置。如果试剂盒中有一种以上组分，则它们可以包装在一起(如果合适)，否则所述试剂盒通常将含有可以将另外的组分分开地置于其中的第二、第三或其它另外的容器。然而，在一些实施例中，组分的某些组合可以一起包装，包括在一个容器装置中。试剂盒还可以包含用于容纳一种或多种本文所阐述的组合物的装置和用于商业销售的严密封闭的任何其它试剂容器。此些容器可以包含将所需的小瓶保留在其中的注塑或吹塑塑料容器。
试剂盒的一些组分以一种和/或多种液体溶液形式提供。液体溶液可以是非水溶液、水溶液，并且可以是无菌溶液。
试剂盒的组分也可以作为干粉提供。当试剂和/或组分作为干粉提供时，可以通过加入合适的溶剂来使粉末复原。可以预见，也可以在另一容器装置中提供合适的溶剂。试剂盒还可以包括用于容纳无菌的药学上可接受的缓冲液和/或其它稀释剂的容器装置。
本公开的试剂盒还可以包含使用试剂盒组分的说明书，并且还可以具有使用试剂盒中未包含的任何其它试剂的说明书。说明书可以包含可以实施的变化。
实例
根据以下实例，可以进一步理解本教导的各个方面，这些实例不应被解释为以任何方式限制本教导的范围。
实例1
用于使用比色检测进行快速测定的组合物和方法
如下所述制备本公开的示例性组合物，并根据本公开的示例性方法进行测试，所述方法包括以下步骤：(a)将样品与乙腈、具有通式(I)的试剂和铜合并以形成混合物；(b)在足以形成有色络合物的条件下温育混合物；和(c)在450nm到500nm下测量有色络合物的吸光度作为样品中蛋白质或肽浓度的直接指示。通过在室温下并且以不同时间间隔(5分钟到25分钟)温育混合物(在方法的步骤(b)中)来测试本公开的示例性组合物。
使用各种浓度(范围为2mg/mL到0.125mg/mL)的BSA标准品生成标准蛋白质浓度校准曲线。如下所述，将BSA标准品在本公开的示例性组合物中于室温下以不同时间间隔(5、10、15、20和25分钟)温育。
通过将50份试剂A加入1份试剂B来制备本公开的示例性组合物(在本文中被称为工作试剂)。试剂A和试剂B的组分列于以下表1中。试剂B组合物在工作溶液中为1.6mg/mL。
表1：根据当前公开的组合物的一个实例的试剂A和试剂B的示例性组分
试剂A 试剂B
0.2M CAPS缓冲液 80mg/mL硫酸铜
0.2M碳酸氢钠
0.8mg/mL酒石酸钠
0.01M浴铜灵二磺酸
10％乙腈
pH 11.8
所述测定在微孔板上进行。标准品一式三份加入。表2中描述了用于所述方法的条件。
表2：使用的条件和参数
Figure BDA0002371080020000381
图1示出了上述示例性方法的结果，其描绘了在室温下不同时间点(从5分钟开始，到25分钟)的针对如上所述的本公开的示例性组合物获得的BSA校准曲线。数据表现出线性曲线，斜率随温育时间增加而增加。使用本方法和本组合物早在5分钟便检测到吸光度。
在此处和本公开中的实验中，尽管使用自动板读取仪进行的自动吸光度读取的速度和便利性都很理想，但也可以可替代地使用在比色皿中测量的反应混合物的吸光度测量。
实例2
二辛可宁酸测定(BCA)与本方法和组合物的比较
使用各种浓度(从2mg/mL开始，低至0.025mg/mL)的BSA标准品生成校准曲线，以将使用当前公开的组合物和试剂盒的当前公开方法与先前的Thermo Scientific PierceBCATM蛋白质测定试剂盒(本文被称为“BCATM商业方法”或“BCATM”)进行比较。
如前所述，BCATM蛋白质测定组合了熟知的由碱性介质中的蛋白质进行的Cu2+到Cu1 +的还原和由二辛可宁酸进行的具有高敏感度和选择性的亚铜阳离子(Cu1+)的比色检测。第一步是在碱性环境中使铜与蛋白质螯合以形成浅蓝色络合物。在本反应(被称为缩二脲反应)中，含有三个或更多个氨基酸残基的肽在含有酒石酸钾钠的碱性环境中与铜离子形成有色螯合络合物。在显色反应的第二步中，二辛可宁酸(BCA)与在第一步中形成的还原(亚铜)阳离子反应。深紫色反应产物由两个BCA分子与一个亚铜离子螯合产生。BCA/铜络合物是水溶性的，并且随着蛋白质浓度的增加，在562nm下表现出强线性吸光度。BCA试剂的敏感度(检测下限)比第一反应的淡蓝色高大约100倍。导致BCA颜色形成的反应受到蛋白质的氨基酸序列中的四个氨基酸残基(半胱氨酸或胱氨酸、酪氨酸和色氨酸)的强烈影响。然而，与考马斯染料结合法不同，通用肽主链也有助于颜色形成，从而有助于最小化由蛋白质组成差异引起的可变性。
对于传统BCATM和当前公开的方法，通过根据表1和3将50份试剂A加入1份试剂B来制备每种方法的工作试剂。关于本方法的试剂A和试剂B的示例性组合物，参见表1。关于传统BCATM法的试剂A和试剂B的组分，参见表3。所述方法在微孔板上进行。标准品一式三份加入。表4中描述的条件用于每种测定。
表3：传统BCATM法的试剂A和试剂B的组分
试剂A 试剂B
0.161M碳酸钠 40mg/mL硫酸铜
0.107M碳酸氢钠
1.6mg/mL酒石酸钠
10mg/mL二辛可宁酸
pH 11.2
表4：用于每种测定的条件和参数
BCA<sup>TM</sup> 本方法
标准品/样品体积 25μL 20μL
工作试剂体积 200μL 200μL
温育温度 37℃ 室温(范围为约18℃到约26℃)
温育时间 30分钟 5分钟
读取板的吸光度 562nm 480nm
图2描绘了使用BCA和本方法(其在本文中被称为当前方法)针对BSA获得的校准曲线。数据表现出线性曲线，两种测定的BSA浓度均增加。然而，在图2中，本方法的曲线是在室温下5分钟内获得的。相比之下，传统BCATM法需要在37℃下温育30分钟才能获得相似的曲线。从两种测定获得的曲线均具有极端线性(R2为0.99)。本方法和组合物提供了相较于本领域中使用的传统BCATM测定的快速测定。
实例3
相较于传统BCATM和BCATM组合物的通过本方法和本组合物进行的裂解物蛋白质浓度测定
通过传统BCATM和使用示例性当前组合物的示例性本方法来测定裂解物的未知浓度。用于读取板的条件(例如，样品体积、温育时间和温度、吸光度)与表4中描述的那些相同。在两种方法中，均使用BSA校准曲线测定裂解物蛋白质的浓度。
图3示出了使用两种测定(实例2中描述的传统BCATM测定和使用当前描述的组合物的实例的示例性本方法)针对34种不同裂解物获得的浓度相似性。每种裂解物的蛋白质浓度使用BSA作为标准品计算，并使用表4中所述的条件使用图3中所示的传统BCATM和本方法进行测定。使用本方法在室温下仅需5分钟便获得了未知样品的非常相似的浓度。相比之下，传统BCATM法在37℃下需要30分钟才能获得相似的结果。使用测定获得的浓度之间的平均％CV为5.4％。配对t检验的p值为0.675(>0.05)，这表示根据本方法和BCATM法获得的浓度在统计学上没有差异。
实例4
通过测量已知蛋白质混合物的浓度进行的测定的准确性
由市售蛋白质制备已知浓度的蛋白质混合物。使用280nm下的吸光度测定具有已知消光系数的蛋白质的浓度(被称为理论蛋白质浓度测定)。然后，将这些蛋白质以各种比例混合，以基于280nm下的吸光度值生成具有已知浓度的蛋白质混合物。使用与表4中所述相同的条件，通过传统BCATM和本方法测定这些蛋白质混合物的浓度。然后，将使用BCATM和示例性本方法测定的蛋白质混合物的浓度与理论蛋白质浓度(其以280nm下的吸光度测定)进行比较。以测定每种测定的蛋白质浓度与理论值的接近程度。结果描绘在图4中。
图4描绘了与通过传统BCATM测定和示例性当前方法获得的蛋白质浓度测定的比较以及与理论蛋白质浓度计算的进一步比较。紫色条表示使用传统BCATM测定获得的浓度，橙色条表示使用本方法获得的浓度，灰色条表示基于其280nm下的吸光度的蛋白质混合物的理论蛋白质浓度。来自图4的数据表明，通过两种测定获得的浓度接近于蛋白质混合物的理论浓度。对于BCATM测定，相对于理论浓度获得的％CV为18.6。对于本方法，相对于理论浓度获得的％CV为13.7。
实例5
本方法和组合物提供了快速结果
将在示例性本方法中于室温下以不同时间(1分钟到5分钟)使用的示例性当前调配物与传统BCATM测定进行比较，后者需要30分钟并在37℃下温育。
使用各种浓度(从2mg/mL开始，低至0.125mg/mL)的BSA标准品生成本方法的校准曲线，本方法通过以不同时间温育工作试剂以及BSA标准品进行。对于传统BCATM和当前公开的方法，通过根据表1和3将50份试剂A加入1份试剂B来制备每种方法的工作试剂。关于本方法的试剂A和试剂B的示例性组合物，参见表1。关于传统BCATM法的试剂A和试剂B的组分，参见表3。所述测定在微孔板上进行。标准品一式三份加入。以下条件用于表5中描述的测定。
表5：用于本方法和组合物的条件和参数：
本方法
标准品/样品体积 20μL
工作试剂体积 200μL
温育温度 室温
温育时间 1分钟、2分钟、3分钟、4分钟和5分钟
读取板的吸光度 480nm
图5描绘了在室温下在不同时间点(从1分钟开始，到5分钟)针对如上所述的示例性本方法获得的BSA校准曲线。数据表现出线性曲线，斜率随温育时间增加而增加。还生成使用传统BCATM的曲线作为对照(37℃，30分钟温育)以与本方法进行比较。注意：用于使用本方法生成上述数据的样品体积(20μL)小于用于传统BCA的体积(25μL)。
实例6
时间和温度相同的温育条件下的本方法与传统BCATM的比较
使用各种浓度(从2mg/mL开始，低至0.125mg/mL)的BSA标准品生成示例性本方法和传统BCATM法的校准曲线。
对于传统BCATM和当前公开的方法，通过根据表1和3将50份试剂A加入1份试剂B来制备每种方法的工作试剂。关于本方法的试剂A和试剂B的示例性组合物，参见表1。关于传统BCATM法的试剂A和试剂B的组分，参见表3。
图6示出了在室温下5分钟的两种测定的通过使用相同的温育时间和温度而生成的曲线。图6表明，在温育时间和温度相似的条件下，与传统BCATM法相比，使用本方法获得的信号增加70％。
实例7
乙腈浓度的影响
测试了具有不同浓度的乙腈的本公开的不同示例性组合物和调配物。用如下所述的不同的乙腈浓度分别制备本公开的两种不同的示例性组合物(由于使用了不同的缓冲液(碳酸钠或CAPS缓冲液)，因此其在本文中被称为“缓冲体系A”和“缓冲体系B”)，以测试本公开的一些示例性组合物的功效。总共测试了本公开的六种不同的示例性组合物，即分别具有0％、10％和30％乙腈的缓冲液A的三种示例性组合物以及分别具有0％、10％和25％乙腈的缓冲液B的三种示例性组合物，如下所示：
缓冲液A：碳酸钠(0.32M)、碳酸氢钠(0.11M)、酒石酸钠(0.8mg/mL)、乙腈(0％、10％、30％)
缓冲液B：CAPS缓冲液(0.2M)、碳酸氢钠(0.2M)、酒石酸钠(0.8mg/mL)、乙腈(0％、10％、25％)
通过改变BSA的浓度来测试上述组合物以观察增加乙腈对480nm下的吸光度的影响。
图7示出了针对使用三种不同乙腈浓度的缓冲液A的本方法获得的BSA校准曲线。不同浓度的BSA蛋白质以20μL加入板。工作试剂按照示例性本方法方案制备，并以200μL/孔加入。板在室温下温育5分钟。将480nm下的吸光度相对于BSA浓度绘图。数据表明，随着调配物中乙腈浓度的增加，吸光度强度也增加。具有0％乙腈的调配物与具有25％乙腈的调配物之间的信号平均增加22.3％。
图8示出了针对使用三种不同乙腈浓度的缓冲液B的本方法获得的BSA校准曲线。不同浓度的BSA蛋白质以20μL加入板。工作试剂按照示例性本方法方案制备，并以200μL/孔加入。板在室温下温育5分钟。将480nm下的吸光度相对于BSA浓度绘图。数据表明，随着调配物中乙腈浓度的增加，吸光度强度也增加。具有0％乙腈的调配物与具有30％乙腈的调配物之间的信号平均增加22.4％。
实例8
本方法的荧光与吸光度检测模式
使用不同浓度(1mg/mL到0.125mg/mL)的BSA标准品生成校准曲线。如实例1中所述，通过将50份试剂A加入1份试剂B来制备示例性本方法的工作试剂。吸光度测定在微孔板上进行，并且荧光测定在Qubit 3.0荧光计仪器上进行。
表6：用于每种测定的条件和参数
Figure BDA0002371080020000441
由市售蛋白质制备六种已知浓度的蛋白质混合物。使用280nm下的吸光度测定具有已知消光系数的蛋白质的浓度。然后，将这些蛋白质以各种比例混合以获得具有已知浓度(实际或理论浓度)的蛋白质混合物。使用表6中所述的条件，使用使用吸光度和荧光模式的本方法测定这些蛋白质混合物的浓度。使用根据两种模式使用BSA标准品生成的标准曲线，测定两种测定的蛋白质混合物的浓度。然后，将由此获得的浓度进行比较，以测定它们彼此之间的接近程度。
图9示出了与通过两种模式获得的浓度的比较。橙色条表示使用吸光度模式获得的浓度，红色条表示使用荧光模式获得的浓度。上面的数据表明，通过两种模式获得的浓度彼此接近。获得配对t检验的p值为0.326(>0.05)，表明两个值在统计学上彼此没有显著差异。因此，根据一个实施例，本公开提供了适于在两个不同的仪器平台(荧光计和分光光度计)上以相同功效进行测定的组合物和方法。
实例9
用于使用荧光测定检测的快速方法的组合物和方法
如下所述制备本公开的示例性组合物，并根据本公开的示例性方法进行测试，所述方法包括以下步骤：(a)将样品与乙腈；以及具有通式(I)的试剂和铜组合以形成混合物。(b)在足以形成有色络合物的条件下温育混合物；和(c)在第一波长下测量由有色络合物激发的荧光变化，并且在第二波长下测量发射，其中所测量的荧光为样品中蛋白质或肽浓度的指示。
通过将混合物在室温下温育5分钟并通过荧光测定法测量来测试本公开的示例性组合物。如实例1中所述，通过加入49份试剂A和1份试剂B来制备示例性组合物(被称为工作试剂)。根据表7中概述的条件进行反应，并且在QubitTM荧光计仪器上读取荧光。
表7：使用的条件和参数：
Figure BDA0002371080020000451
通过将浓度为1mg/mL的BSA与本方法的工作试剂混合来生成荧光信号，并使用表7中的参数进行测定。然后，在温育5分钟后，加入50μL终止溶液来终止反应，所述终止溶液含有1M盐酸、0.16M硫酸、0.1M甘氨酸pH 2.0、0.1M甘氨酸pH 2.8或水。在绿色和红色光谱中并且在1小时过程内的各个时间点监测到发射荧光。
图10、图11A和图11B描绘了比较用于测定的几种终止溶液的终止效力的图，读取了如由Qubit仪器检测到的绿色(A)和红色(B)光谱的结果。本文中使用的所有终止溶液均能防止信号从荧光发射增加到高于检测仪器的可检测范围的信号水平。与未处理或用水处理的样品相比，使用终止溶液提供了一种更有效的荧光测量方式。盐酸在红色光谱和绿色光谱中均表现出最佳的信号抑制。
在一些实施例中，当前方法不是终点测定。只要反应混合物中仍然存在尚未从Cu2+还原为Cu1+的Cu2+，样品蛋白质就会继续还原Cu2+，直到反应混合物中的所有Cu2+耗尽。鉴于此，如果将反应混合物放置较长时间，信号将随着时间而继续增加。以固定时间(例如，本实例中的5分钟)或本方法允许的实验人员选择的任何时间(例如，少于5分钟，即5、4、3、2或1分钟或少于1分钟)使用反应混合物中的终止溶液可防止如上所述的信号增加，所述时间应足以测量本文所述的样品蛋白质浓度。
此外，由于本方法极其快速，因此如果具有多个待测试的样品(例如，15个样品)并且以单管形式读取样品(如在当前使用的QubitTM平台中)，则在由实验人员读取之前，#1样品可能温育5分钟，而样品#15可能温育5分钟以上。为了避免必须对测定进行完美计时，可以将所有样品温育5分钟(或实验人员优选的其它任何时间，5分钟或少于5分钟)，然后通过加入如本文所述的终止溶液来同时终止测定，以防止由于一个样品相对于另一样品(两者将进行比较以用于蛋白质或肽浓度测定)的信号增加而导致的测定漂移，所述终止溶液包含盐酸、硫酸(如本实例所述)或以下实例中所述的乙酸或甲酸或柠檬酸等中的任何一种。
此外，如果在示例性时间5分钟(或实验人员选择的其它时间)内读取标准蛋白质/肽曲线样品，则还必须以相同的5分钟温育时间读取测试样品，否则测试样品将表现出人为增高的蛋白质浓度值。针对标准样品和测试样品以固定温育时间使用如本公开所述的终止溶液可以得到准确的结果。
实例10
使用金属螯合剂的信号增强
通过加入49份试剂A和1份试剂B制备实例1中所述的工作试剂。根据表8中概述的条件进行反应，并且在Qubit仪器上读取荧光。
表8：用于测定的条件和参数
Figure BDA0002371080020000471
金属螯合剂(例如，次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、亚氨基二乙酸(IDA)或三羧甲基乙二胺(TED))可以用作信号增强剂。在本实例中测试了其中的NTA和EDTA。
通过将浓度为1mg/mL的BSA与本方法的工作试剂混合来生成荧光信号，并使用表8中的参数进行测定。在温育5分钟后，加入50μL终止溶液，所述终止溶液含有10mM EDTA、1mMEDTA、10mM NTA或1mM NTA。在1小时过程内的各个时间点监测到红色发射荧光。
图12描绘了比较用于测定的几种终止溶液的效力的图。溶液均未防止信号增加，但增强了信号输出。EDTA在两种浓度下均提供一定程度的信号增强，而NTA仅在较高浓度下提供信号增强。
实例11
酸终止的替代浓度
用于荧光测量的终止溶液：如实例1中所述，通过加入49份试剂A和1份试剂B来制备工作试剂。根据表1中概述的条件进行反应，并且在Qubit仪器上读取荧光。
表9：用于测定的条件和参数
Figure BDA0002371080020000481
通过将浓度为1mg/mL的BSA与本方法的工作试剂混合来生成荧光信号，并使用表9中的参数进行测定。然后，在温育5分钟后，加入50μL终止溶液来终止反应，所述终止溶液含有1、2、4或6M盐酸或水。在红色光谱中并且在1小时过程内的各个时间点监测到发射荧光。
图13中的曲线比较了几种盐酸终止溶液的效力。在所有反应中，观察到荧光信号的抑制，并且在最高浓度(4和6M)下，观察到信号的降低。
实例12
终止溶液的浓度和体积的优化
如实例1中所述，通过加入49份试剂A和1份试剂B来制备用于本方法的示例性工作试剂。根据表10中概述的条件进行反应，并且在Qubit仪器上读取荧光。
表10：用于测定的条件和参数
Figure BDA0002371080020000491
如实例1中所述，通过将浓度为1mg/mL的BSA与工作试剂混合来生成荧光信号，并使用表10中的参数进行测定。然后，在温育5分钟后，加入50、100或200μL终止溶液来终止反应，所述终止溶液含有3M盐酸、2M硫酸或1M硫酸。在红色光谱中并且在1小时过程内的各个时间点监测到发射荧光。
图14A和14B示出了多种酸浓度和体积的比较。结果表明，使用多种酸性溶液均可以实现有效的终止。终止反应的能力取决于酸的类型和加入反应的酸的总量。例如，在加入100μL 2M硫酸溶液或200μL 1M硫酸溶液后，反应表现出类似的在60分钟过程内的信号变化
实例13
乙酸作为终止溶液
如实例1中所述，通过将49份试剂A加入1份试剂B来制备示例性工作试剂。根据表11中概述的条件进行反应，并且在Qubit仪器上读取荧光。
表11：用于测定的条件和参数
Figure BDA0002371080020000492
通过将浓度为1mg/mL的BSA与工作试剂混合来生成荧光信号，并使用表11中的参数进行测定。然后，在温育5分钟后，通过加入100μL终止溶液来终止反应，所述终止溶液含有8M尿素、6胍、0.5M偏高碘酸钠、2M氢氧化钠或2M乙酸。在红色光谱中并且在1小时过程内的各个时间点监测到发射荧光。
图15中的图比较了几种终止溶液的不同效力。所述图表明，在那些测试的终止溶液中，唯一起作用的终止溶液是乙酸溶液。
实例14
乙酸、甲酸和柠檬酸作为终止溶液
如实例1中所述，通过加入49份试剂A和1份试剂B来制备用于本方法的示例性工作试剂。根据表12中概述的条件进行反应，并且在Qubit仪器上读取荧光。
表12：用于测定的条件和参数
Figure BDA0002371080020000501
通过将浓度为1mg/mL的BSA与本方法的工作试剂混合来生成荧光信号，并使用表12中的参数进行测定。然后，在温育5分钟后，加入100μL终止溶液来终止反应，所述终止溶液含有2M甲酸、2M柠檬酸或2M乙酸。在红色光谱中并且在1小时过程内的各个时间点监测到发射荧光。
图16中的图比较了乙酸、甲酸和柠檬酸的终止溶液的不同效力。所述图表明，尽管所有三种溶液均抑制信号增加，但甲酸和乙酸作为终止溶液相对更有效。
实例15
快速荧光测定
分析了用于本公开的方法的荧光信号的起始时间线。如实例1中所述，通过将49份试剂A加入1份试剂B来制备本方法的示例性工作试剂。根据表13中概述的条件进行反应，并且在Qubit仪器上读取荧光。
表13：使用的条件和参数：
Figure BDA0002371080020000511
通过将浓度为1mg/mL的BSA与本方法的工作试剂混合来生成荧光信号，并使用表13中的参数进行测定。在红色光谱中并且在5分钟过程内从每15秒增量的温育0分钟开始监测到发射荧光。
图17的图示出了通过荧光计进行的荧光信号检测的起始时间线。可以看出，甚至早在反应开始15秒便检测到荧光信号。在本方法的实施例中，由于在样品中存在蛋白质，来自反应的荧光信号是在将工作试剂与蛋白质混合之后立即生成的，并且持续增加直到5分钟时程结束。因此，所述方法的方法、组合物和试剂盒可有效地生成快速蛋白质/肽浓度测定(即瞬时、15秒、30秒、45秒、少于1分钟和1-5分钟(包含其间的时间范围))。
实例15
另外的示例性组合物
已经示出如本公开中描述的几种示例性组合物可用于本文所述的示例性方法中的蛋白质/肽定量。除了以上实例中描述的一些示例性组合物之外，使用本方法的实施例测试了另外的示例性组合物以测定蛋白质浓度。表14、15和16概述了根据本实施例的3种不同的示例性组合物。
表14：一种示例性组合物
试剂A 试剂B
0.043M碳酸钠 80mg/mL硫酸铜
0.193M碳酸氢钠
0.8mg/mL酒石酸钠
0.01M浴铜灵二磺酸
25％乙腈
dH 12.2
表15：一种示例性组合物
试剂A 试剂B
0.03M硼酸盐缓冲液 80mg/mL硫酸铜
0.2M碳酸氢钠
0.8mg/mL酒石酸钠
0.01M浴铜灵二磺酸
10％乙腈
pH 11.85
表16：一种示例性组合物
试剂A 试剂B
0.03M硼酸盐缓冲液 80mg/mL硫酸铜
0.2M碳酸氢钠
0.8mg/mL酒石酸钠
0.01M浴铜灵二磺酸
10％乙腈
pH 11.85
使用使用如以上表3中所述的BCATM调配物的传统BCATM法并针对使用分别在表14、15和16中所述的每种示例性组合物调配物的示例性本方法来生成BSA标准曲线；使用各种蛋白质浓度(从2mg/mL开始，低至0.125mg/mL)的BSA标准品生成BCATM和示例性本方法的校准曲线。
如针对BCATM法的表3中所述并且如针对本方法的表14、15和16中所述，通过将50份试剂A加入1份试剂B来制备工作试剂。所述测定在微孔板上进行。表17中描述的条件用于每种测定。
表17：用于每种测定的条件和参数
BCA<sup>TM</sup> 本方法(使用不同的调配物)
标准品/样品体积 25μL 20μL或25μL
工作试剂体积 200μL 200μL
温育温度 37C 室温
温育时间 30分钟 5分钟
读取板的吸光度 562nm 480nm
图18描绘了针对使用BCATM法的BSA标准品和本方法的三种不同调配物(在图18中描述为Carb-C、硼酸盐-E和CAPS-A)获得的校准曲线。数据表现出线性曲线，两种测定的BSA浓度均增加。
本文示出和描述的实施例仅是具体实施例，并且不以任何方式进行限制。因此，在以下权利要求的范围内，可以在不背离本发明的精神的情况下对那些实施例进行各种改变、修改或更改。所引用的参考文献明确地通过引用整体并入本文。
本文公开的每个实施例可以与公开的任何其它实施例一起使用或以其它方式组合。任何实施例中的任何元件都可以在任何实施例中使用。尽管已经参考具体实施例描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，可以进行各种改变，并且可以用等同物代替其元件。另外，可以在不背离本发明的基本教导的情况下进行修改。

Claims (49)

1.一种用于测定样品中蛋白质或肽浓度的方法，其包括：
(a)通过将所述样品与以下合并来形成混合物：
(i)铜；
(ii)乙腈；和
(iii)包括下述通式(I)的试剂：
Figure FDA0002371080010000011
其中，
R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地为烷基，包含但不限于C1-C6直链或支链烷基或C6-C20芳基、烷基芳基或芳基烷基，例如甲基(-CH3)、乙基(-CH2CH3)、丙基(-CH2CH2CH3)、丁基(-CH2CH2CH2CH3)或苯基(-C6H5)；
R3、R4、R5和R6各自还另外独立地选自由以下组成的群组：氢(H)、钠(Na+)的磺酸(-SO3 -)盐、钾(K+)的磺酸(-SO3 -)盐、锂(Li+)的磺酸(-SO3 -)盐、钠(Na+)的膦酸(-PO3 -)盐、钾(K+)的膦酸(-PO3 -)盐、锂(Li+)的膦酸(-PO3 -)盐、钠(Na+)的羧酸(-CO2 -)盐、钾(K+)的羧酸(-CO2 -)盐和锂(Li+)的羧酸(-CO2 -)盐；
其中当R5和R6是苯基(-C6H5)时，所述苯基(-C6H5)可以另外独立地具有附接到其的分子，所述分子选自由以下组成的群组：钠(Na+)的磺酸(-SO3 -)盐、钾(K+)的磺酸(-SO3 -)盐、锂(Li+)的磺酸(-SO3 -)盐；钠(Na+)的膦酸(-PO3 -)盐、钾(K+)的膦酸(-PO3 -)盐、锂(Li+)的膦酸(-PO3 -)盐、钠(Na+)的羧酸(-CO2 -)盐、钾(K+)的羧酸(-CO2 -)盐和锂(Li+)的羧酸(-CO2 -)盐；并且
其中所述试剂以水合((I)H2O)或非水合形式存在；
(b)在足以形成有色络合物的条件下温育所述混合物；和
(c)在第一波长下测量由所述有色络合物激发的荧光变化，并且在第二波长下测量发射，其中所测量的荧光为所述样品中蛋白质或肽浓度的指示，或者通过在450到500nm下测量所述有色络合物的吸光度作为所述样品中蛋白质或肽浓度的直接指示。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一波长在450nm到约480nm之间。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二波长在660nm到约730nm之间或在510nm到约580nm之间。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述荧光变化通过荧光计测定，并且其中所述有色络合物的所述吸光度通过分光光度计或自动微孔板读取仪测量。
5.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括，通过将步骤(c)中测量的所述荧光或吸光度与至少一种含有已知浓度的蛋白质或肽的对照标准样品的测量荧光或吸光度进行比较来测定所述样品中的蛋白质或肽浓度。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述对照标准样品是蛋白质、肽、肽混合物或蛋白质消化物。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述铜提供Cu2+离子源。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述铜包括在硫酸铜(II)、溴化铜(II)、氯化铜(II)、氟化铜(II)、高氯酸铜(II)、钼酸铜(II)、硝酸铜(II)、氢氧化铜(II)、四氟硼酸铜(II)中。
9.根据权利要求1所述的方法，其中以体积/体积％测量的所述乙腈的浓度为5％、10％、15％、20％、25％、30％。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品进一步与酒石酸盐合并。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品进一步与碳酸氢钠合并。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品进一步与缓冲液合并，所述缓冲液选自由以下组成的群组：3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、硼酸盐、碳酸盐-碳酸氢盐、4-(环己基氨基)-1-丁磺酸(CABS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、N-三(羟甲基)甲基-4-氨基丁磺酸(TABS)4-(N-吗啉代)丁磺酸(MOBS)2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)、N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)哌嗪-1,4-双(2-羟基丙磺酸)二水合物、哌嗪-N,N'-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述混合物的pH范围为约11-12.2。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述温育在约18℃到约26℃的室温下进行。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述有色络合物形成，并且可以在少于25分钟内、少于10分钟内、5分钟内、少于5分钟内、4分钟内、3分钟内、2分钟内、1分钟内、少于1分钟内、45秒内、30秒内、15秒内或瞬时通过比色法或以荧光发射的形式测量。
16.根据权利要求1所述的方法，其中可以检测到的蛋白质或肽的浓度为20μg/ml到2000μg/ml。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包括多种蛋白质或肽。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述包括通式(I)的试剂包括：
Figure FDA0002371080010000031
并且是以上的水合物或非水合物形式。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述通式(I)的试剂包括：
Figure FDA0002371080010000041
并且是以上的水合物或非水合物形式。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述通式(I)的试剂包括：
Figure FDA0002371080010000042
并且是以上的水合物或非水合物形式。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述通式(I)的试剂包括：
Figure FDA0002371080010000043
并且是以上的水合物或非水合物形式。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品在水性溶剂、有机溶剂及其组合中。
23.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括通过一种或多种方法分析所述蛋白质或肽，所述一种或多种方法包含色谱、电泳、免疫测定、质谱、核磁共振(NMR)或红外光谱(IR)。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包括有机溶剂、洗涤剂、用于改善蛋白质或肽可溶性或稳定性的试剂中的至少一种。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述洗涤剂是曲拉通(Triton)X-100、曲拉通X-114、NP-40、吐温(Tween)80、吐温20、CHAPS和SDS中的一种或多种。
26.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在步骤(b)之后并且在步骤(c)之前加入终止溶液。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述终止溶液包括乙酸、柠檬酸、甲酸、盐酸或硫酸中的一种或多种。
28.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在步骤(b)之后并且在步骤(c)之前加入增强剂。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述增强剂包括金属螯合剂次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、亚氨基二乙酸(IDA)或三羧甲基乙二胺(TED)。
30.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在步骤(b)之后并且在步骤(c)之前加入终止溶液和增强剂。
31.一种组合物，其包括：
乙腈；和
具有通式(I)的试剂：
Figure FDA0002371080010000051
其中，
R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地为烷基，包含但不限于C1-C6直链或支链烷基或C6-C20芳基、烷基芳基或芳基烷基，例如甲基(-CH3)、乙基(-CH2CH3)、丙基(-CH2CH2CH3)、丁基(-CH2CH2CH2CH3)或苯基(-C6H5)；
R3、R4、R5和R6各自还另外独立地选自由以下组成的群组：氢(H)、钠(Na+)的磺酸(-SO3 -)盐、钾(K+)的磺酸(-SO3 -)盐、锂(Li+)的磺酸(-SO3 -)盐、钠(Na+)的膦酸(-PO3 -)盐、钾(K+)的膦酸(-PO3 -)盐、锂(Li+)的膦酸(-PO3 -)盐、钠(Na+)的羧酸(-CO2 -)盐、钾(K+)的羧酸(-CO2 -)盐和锂(Li+)的羧酸(-CO2 -)盐；
其中当R5和R6是苯基(-C6H5)时，所述苯基(-C6H5)可以另外独立地具有附接到其的分子，所述分子选自由以下组成的群组：钠(Na+)的磺酸(-SO3 -)盐、钾(K+)的磺酸(-SO3 -)盐、锂(Li+)的磺酸(-SO3 -)盐；钠(Na+)的膦酸(-PO3 -)盐、钾(K+)的膦酸(-PO3 -)盐、锂(Li+)的膦酸(-PO3 -)盐、钠(Na+)的羧酸(-CO2 -)盐、钾(K+)的羧酸(-CO2 -)盐和锂(Li+)的羧酸(-CO2 -)盐；并且
其中所述试剂以水合((I)H2O)或非水合形式存在。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述通式(I)的试剂选自由以下组成的群组：
Figure FDA0002371080010000061
和以上的水合物或非水合物形式、
Figure FDA0002371080010000062
和以上的水合物或非水合物形式、
Figure FDA0002371080010000063
和以上的水合物或非水合物形式以及
Figure FDA0002371080010000071
和以上的水合物或非水合物形式。
33.根据权利要求31所述的组合物，其中所述式(I)的试剂的浓度为约0.01M到0.1M；并且乙腈的浓度为约5％-50％。
34.根据权利要求31所述的组合物，其进一步包括浓度范围为约5.7mM到约22.7mM的酒石酸盐。
35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述酒石酸盐是酒石酸钠、酒石酸钾、酒石酸钾钠。
36.根据权利要求31所述的组合物，其进一步包括碳酸氢钠或碳酸氢钾。
37.根据权利要求31所述的组合物，其进一步包括缓冲液，所述缓冲液选自由以下组成的群组：3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、硼酸盐、碳酸盐-碳酸氢盐、4-(环己基氨基)-1-丁磺酸(CABS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、N-三(羟甲基)甲基-4-氨基丁磺酸(TABS)4-(N-吗啉代)丁磺酸(MOBS)2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)、N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)哌嗪-1,4-双(2-羟基丙磺酸)二水合物、哌嗪-N,N'-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)。
38.根据权利要求31所述的组合物，其进一步包括铜。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述铜包括在硫酸铜(II)、溴化铜(II)、氯化铜(II)、氟化铜(II)、高氯酸铜(II)、钼酸铜(II)、硝酸铜(II)、氢氧化铜(II)、四氟硼酸铜(II)中。
40.根据权利要求31所述的组合物，其中铜的浓度为约0.25mM到约0.5mM。
41.根据权利要求31所述的组合物，其中所述pH为约11-12.2。
42.一种试剂盒，其包括：
1)组合物，其包括乙腈和具有通式(I)的试剂：
Figure FDA0002371080010000081
其中，
R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地为烷基，包含但不限于C1-C6直链或支链烷基或C6-C20芳基、烷基芳基或芳基烷基，例如甲基(-CH3)、乙基(-CH2CH3)、丙基(-CH2CH2CH3)、丁基(-CH2CH2CH2CH3)或苯基(-C6H5)；
R3、R4、R5和R6各自还另外独立地选自由以下组成的群组：氢(H)、钠(Na+)的磺酸(-SO3 -)盐、钾(K+)的磺酸(-SO3 -)盐、锂(Li+)的磺酸(-SO3 -)盐、钠(Na+)的膦酸(-PO3 -)盐、钾(K+)的膦酸(-PO3 -)盐、锂(Li+)的膦酸(-PO3 -)盐、钠(Na+)的羧酸(-CO2 -)盐、钾(K+)的羧酸(-CO2 -)盐和锂(Li+)的羧酸(-CO2 -)盐；
其中当R5和R6是苯基(-C6H5)时，所述苯基(-C6H5)可以另外独立地具有附接到其的分子，所述分子选自由以下组成的群组：钠(Na+)的磺酸(-SO3 -)盐、钾(K+)的磺酸(-SO3 -)盐、锂(Li+)的磺酸(-SO3 -)盐；钠(Na+)的膦酸(-PO3 -)盐、钾(K+)的膦酸(-PO3 -)盐、锂(Li+)的膦酸(-PO3 -)盐、钠(Na+)的羧酸(-CO2 -)盐、钾(K+)的羧酸(-CO2 -)盐和锂(Li+)的羧酸(-CO2 -)盐；并且
其中所述试剂以水合((I)H2O)或非水合形式存在；和
2)铜；
每种成分包含在一个或多个单独容器中。
43.根据权利要求42所述的试剂盒，其中所述组合物进一步包括一种或多种成分，包含酒石酸盐(选自由以下组成的群组：酒石酸钠、酒石酸钾)、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钾钠和一种或多种缓冲液，所述缓冲液选自由以下组成的群组：3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、硼酸盐、碳酸盐-碳酸氢盐、4-(环己基氨基)-1-丁磺酸(CABS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、N-三(羟甲基)甲基-4-氨基丁磺酸(TABS)4-(N-吗啉代)丁磺酸(MOBS)2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)、N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)哌嗪-1,4-双(2-羟基丙磺酸)二水合物、哌嗪-N,N'-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)。
44.根据权利要求42所述的试剂盒，其中所述式(I)的试剂的浓度为约0.01M到约0.1M；乙腈的浓度为约5％-50％，铜的浓度为约0.25mM到约0.5mM。
45.根据权利要求43所述的试剂盒，其中酒石酸盐的浓度为约5.7mM到约22.7mM，碳酸氢钠、碳酸氢钾或碳酸氢钾钠的浓度为约0.01-0.2M。
46.根据权利要求42所述的试剂盒，其进一步包括包装在单独容器中的一种或多种终止溶液，所述终止溶液包括乙酸、柠檬酸、甲酸、盐酸或硫酸。
47.根据权利要求42所述的试剂盒，其进一步包括包装在单独容器中的信号增强剂，所述信号增强剂包括金属螯合剂，所述金属螯合剂选自包含次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、亚氨基二乙酸(IDA)或三羧甲基乙二胺(TED)。
48.根据权利要求42所述的试剂盒，其进一步包括一起包装在单独容器中的一种或多种终止溶液和一种或多种信号增强剂。
49.根据权利要求42所述的试剂盒，其中所述组合物的所述pH在使用中为约11-12.2。
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