JPS61224999A - セルロプラスミンの活性測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 ゛本発明は体液中のセルロプラスミンの測定方法に関す
るものである。

セルロプラスミンは生体内の銅タンパク質で銅の貯蔵、
運搬や２価の鉄イオンを酸化し、トランスフェリンに結
合しゃすくさせるといった働きがある。血清または゛血
漿中のセルロプラスミンの量は、ウィルソン病やネフロ
ーゼ症候群、または妊娠、肝疾患、癌および感染症等で
変動するといわれ、これらの診断に有用性が有り、臨床
検査の分野で測定されている。

（ロ）従来の技術 セルロプラスミンの従来の測定法としては、抗原抗体反
応を利用した５ＲＩＤ法（−元免疫拡散法）や、セルロ
プラスミンのジアミンオキシダーゼとしての反応を利用
した、パラフェニレンジアミンの酸化により生成する色
素を測定する方法（以下パラフェニレンジアミン法と略
す）等が知られている。（文献としては、（エフ、ダブ
リウウ、サンダーマン、ジュニア、アンド、ショウゾウ
、ノモト、クリニカルケミストリー、ｖｏｌ、１６　Ｎ
ｏ、１１．９０３〜９１０（１９７０）（Ｆ。

１ｆ、Ｓｕｎｄｅｒｍａｎ、Ｊｒ、ａｎｄ　　５ｈｏｚ
ｏ　　Ｎｏｍｏｔｏ、Ｃ１１ｎｉｃａｌＣｈｅＩＩｌｉ
ｓｔｒｙ、　ｖｏｌ、　１６ＮｏＬｉ、９０３〜９１０
（１９７０）））（ハ）発明が解決しようとする問題点 しかしながら、５ＲＩＤ法は高価な抗体を使用し、また
測定値を得るのに２４時間から４８時間を要し、自動分
析に適用しにくい等の欠点を有している。一方パラフェ
ニレンジアミン法は検体が１００μｌと多量に必要な事
や調製した反応試薬が非常に不安定である等の欠点を有
している。

（ニ）問題点を解決するための手段および作用そこでセ
ルロプラスミンの新しい測定方法、詳細には活性測定方
法を確立すべく、セルロプラスミンのオキシダーゼ活性
について鋭意研究を行ったところ、特願昭５９−２５２
４５５のような新しい発色剤を使用する測定方法を発明
した。この発明は、４−アミノピラゾロン誘導体と、ア
ニリンまたはその誘導体またはこれらの塩類とを発色剤
として使用するセルロプラスミンの測定方法及び、４−
アミノピラゾロン誘導体と、フェノールまたは、フェノ
ール誘導体とを発色剤として使用するセルロプラスミン
の測定方法及び、ベンゾチアゾリノンヒドラゾン誘導体
またはその塩類と、アニリンまたはその誘導体またはこ
れらの塩類とを発色剤として使用するセルロプラスミン
の測定方法を内容とするものである。そして、さらに体
液中のセルロプラスミンの測定方法における反応の活性
化剤について研究を行ったところ、従来セルロプラスミ
ンの阻害剤として報告されていたクロールイオンは反応
試薬への添加により、高浪度ではたしかにセルロプラス
ミンの反応を阻害するが、低濃度ではむしろ反応の活性
化をトチ″ることを見出だした。この微量のクロールイ
オンの添加により発色感度は１割〜１．５割上昇した。

又、金属イオンについては、２価のカルシウムイオン、
２価のマグネシウムイオン、２価のマンガンイオン、お
よび２価のニッケルイオンが、反応試薬への添加により
、試薬盲検の吸光度を上昇させることなく、検体の発色
感度を１割〜１．５割上昇させることも見出だした。ま
た、２価の銅イオンや３価の鉄イオンが反応試薬への添
加により、若干、試薬盲検の上昇はあるものの、同様に
検体の発色感度を上昇させることもなく見出だした。

また、シクロデキストリン（以下ＣＤと略す。）類、す
なわち、α−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤの反応試薬への
添加によっても、試薬盲検の上昇をきたすことなく、検
体の発色感度が１割程度上昇することも見出だした。

従って、これらの物質をセルロプラスミンのオキシダー
ゼ活性測定のための反応試薬中に添加することにより、
添加しない場合に比べ検体の発色感度が１割〜３割上昇
し、その結果として、検体量を少なくできたり、反応時
間を短くすることができたり、さらに検量線の直線性が
向上するといった、臨床検査上、有用なセルロプラスミ
ンの測定方法を知見した。本発明は、この知見に基づい
て発明されたものであり、すなわち、セルロプラスミン
のオキシダーゼ活性の測定において、反応試薬中に活性
化剤として、クロールイオンを添加する測定方法、及び
金属イオンを添加する測定方法、及びシクロデキストリ
ン類を添加する測定方法を提供する。

以下、各種添加物とその使用濃度について説明する。

（ａ）　　クロールイオン 添加するクロールイオンは反応試薬の緩衝液調製時に塩
酸として加えても良いし、塩化ナトリウム、塩化カリウ
ムといった、塩として加えても良い。この時クロールイ
オンと対をなす陽イオンはセルロプラスミンを阻害しな
いものであれば良い。。

添加する濃度については、検体とする血清中に約１０５
ａ＋Ｍのクロールイオンが含まれているので、例えば、
血清２０μｌに反応試薬２．０ｍｌを加えるとすると、
検体からの分として約り、ＱｍＭ含まれることになる。

従って、このことを考慮して添加すれば良い。検体と反
応試薬が加わった状態で（以下、反応状態と略す。）　
０．５ｍＭ〜２０ｍＭの範囲で使用でき、発色感度の点
では、１．５ｍＭ〜１５ｍＭが望ましく、２ｍＭ〜ｆＱ
ｍＭが特に望ましい。

（ｂ）２価のカルシウムイオン 添加するカルシウムイオンは、セルロプラスミンを阻害
しない陰イオンと対をなす塩として加えればよい。酢酸
カルシウムとして添加するのが望ましい。

添加する濃度は検体とする血清中に約２゜５ＩＩＩＭ含
まれることを考慮して、反応状態で、１０μＭ〜ｌｏＯ
ｍＭの範囲で使用でき、発色感度の点では、７５μｍ〜
５０ｍＭが望ましく、１００μＭ〜２０ｍＭが特に望ま
しい。

（ｃ）２価のマグネシウムイオン 添加するマグネシウムイオンは、セルロプラスミンを阻
害しない陰イオンと対をなす塩として加えればよい。酢
酸マグネシウムとして添加するのが望ましい。

添加する濃度は、反応状態で５μＭ〜１００ｍＭの範囲
で使用でき、発色感度の点では６０μＭ〜２０ｍＭが望
ましい。

（ｄ）２価マンガンイオン 添加するマンガンイオンは、セルロプラスミンを阻害し
ない陰イオンと対をなす塩として加えればよい。酢酸マ
ンガンとして添加するのが望ましい。

反応試薬へ添加する濃度は、１０μＭ〜１０ｍＭの範囲
で使用でき、発色感度の点では、５０μＭ〜５ｍＭが望
ましい。

（ｅ）２価のニッケルイオン 添加するニッケルイオンは、セルロプラスミンを阻害し
ない陰イオンと対をなす塩として加えれば良い。酢酸ニ
ッケルとして添加するのが望ましい。

反応試薬へ添加する濃度は、ｌμＭ〜１ｍＭの範囲で使
用でき、発色感度の点では１μ輩〜１００μＭが望まし
い。

（ｆ）２価の銅イオン 添加する銅イオンは、セルロプラスミンを阻害しない陰
イオンと対をなす。塩として加えればよい。酢酸銅とし
て添加するのが望ましい。

反応試薬へ添加する濃度は、１μＭ−１００μＭの範囲
で使用でき、発色感度及び試薬盲検の上昇とい９た点か
らは、５μＭ〜２５μＭが望ましい。

（ｇ）３価の鉄イオン 添加する鉄イオンは、セルロプラスミンを阻害しない陰
イオンと対をなす塩として加えれば良い。硫酸鉄として
添加することができる。

反応試薬へ添加する濃度は、ｌＯｎＭ〜１０μＭの範囲
で使用でき、発色感度及び試薬盲検の上昇といった点か
らは、０．１μＭ〜５μＭが望ましい。

（ｈ）　　シクロデキストリン類 添加するシクロデキストリンは、α−ＣＤでも、β−Ｃ
Ｄでも、γ−ＣＤでも良い。

反応試薬へ添加する濃度は０．０１％からそれぞれの溶
解限度までの範囲で使用でき、発色感度の点では０．１
％から、それぞれの溶解限度までが望ましい。

以下にセルロプラスミンの活性または濃度の計算方法に
ついて説明する。

セルロプラスミンの活性または濃度は検体の吸光度と同
様に操作した標準物質の吸光度より計算することができ
る。

また生成する発色物質のモル吸光係数より活性値を求め
る事もできる。

（ホ）実施例 以下、本発明の実施例について説明する。

実施例（１） 反応試薬 ０．３Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４，７５ ２ｄソデイウム・Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシス
ルホプロピル） −ｍ−トルイジン（以下、ＴＯＯ３と 略す。） ２ｍＭ　４−アミノアンチピリン ２．５ｆｆ１Ｍ塩化ナトリウム １．０ｍＭ酢酸カルシウム １．０％　β−シクロデキストリン 反応停止液 ０．５Ｍクエン酸緩衝液ｐｎｅ、ｓ １５ＩＩＩＭアジ化ソーダ ０．３％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００ 反応試薬２．０ｍＭに検体２０μｌを加え、３７℃で正
確に１０分間反応させ、その後反応停止液１．０ｍＭを
加え、反応を停止させ、生成した色素を、検体の代わり
に精製水２０μｌを加え、同様に操作した試薬盲検を対
照にして、波長５５５ｎｍで吸光度測定を行い、活性値
を求める。

実施例（２） 反応試薬 ０．３Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４，７５ ２ｎＭ　、ＴＯＯ３ ２ｍＭ　４−アミノアンチピリン ２．５ｍＭ塩化ナトリウム 反応停止液 ０．５Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６，５ １５＋ｎＭアジ化ソーダ ０．３％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００ 反応試薬２．０＋ａｌに検体２０μｌを加え、３７℃で
正確に１０分間反応させ、その後反応停止液１゜０ｍＭ
を加え、反応を停止させ、生成した色素を、検体の代わ
りに精製水２０μ！を加え、同様に操作した試薬盲検を
対照にして、波長５５５ｎｍで吸光度測定を行い、活性
値を求める。

実施例（３） 反応試薬 ０．３Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４，７５ ガ＋Ｍ　　ＴＯＯ３ ２ｍＭ　４−アミノアンチピリン １、Ｏｄ酢酸カルシウム 反応停止液 ０．５Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６，５ １５ｎ＋Ｍアジ化ソーダ ０．３％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００ 反応試薬２．０ｍＭに検体２０μｌを加え、３７℃で正
確に１０分間反応させ、その後反応停止液１．０ｍＭを
加え、反応を停止させ、生成した色素を、検体の代わり
に精製水２０μｌを加え、同様に操作した試薬盲検を対
照にして、波長５５５ｎｍで吸光度測定を行い、”活性
値を求める。

実施例（４） 反応試薬 ０．３Ｍ酢酸緩衝液りＨ４，７５ ２ｍＭ　ＴＯＯ３ ２ｍＭ　４−アミノアンチピリン １．０％　β−シクロデキストリン 反応停止液 ０．５Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６，５ １５ｍＭアジ化ソーダ ０．３％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００ 反応試薬２．０ｍＭに検体２０μｌを加え、３７℃で正
確に１０分間反応させ、その後反応停止液１．Ｏｍｌを
加え、反応を停止させ、生成した色素を、検体の代わり
に精製水２０μｌを加え、同様に操作した試薬盲検を対
照にして、波長５５５ｎｍで吸光度測定を行い、活性値
を求める。

表１は実施例１と反応試薬に、２　、５ｍＭ塩化ナトリ
ウム、１ｍＭ酢酸カルシウム、１％β−シクロデキスト
リンを含まない試薬との発色感度の比較を示す。

図１は、実施例２におけるクロールイオンの反応状態の
濃度と発色感度の関係を表す。

図２は、実施例３におけるカルシウムイオンの反応状態
の濃度と発色感度の関係を表す。

図３は、実施例４におけるβ−シクロデキストリンの濃
度と発色感度の関係を表す。

表！１図１１図２、図３のように実施例１〜４では反応
試薬へのこれらの物質の添加により発色感度が上昇する
。

実施例（５） 実施例（３）の反応試薬のｌ　、　０ｍＭ酢酸カルシウ
ムの代わりに１．０ＩＩ＋Ｍの酢酸マグネシウムを使用
し、その他は同様の組成とし、同様の操作を行う。

図４は、実施例（５）における、マグネシウムイオンの
反応状態での濃度と発色感度との関係を表す。図のよう
にマグネシウムイオンの添加により発色感度は上昇する
。

実施例（６） 実施例（３）の反応試薬の１．０ｍＭ酢酸カルシウムの
代わりに２．５ｍＭの酢酸マンガンを使用し、その他は
、同様の組成とし、同様の操作を行なう。

図５は、実施例（６）における、マンガンイオンの添加
濃度と発色感度との関係を表す。図のようにマンガンイ
オンの添加により発色感度は上昇する。

実施例（７） 実施例（３）の反応試薬の１．０ｍＭ酢酸カルシウムの
代わりに４０μＭの酢酸ニッケルを使用し、その他は同
様の組成とし、同様の操作を行なう。

図６は鰻実施例（７）におけるニッケルイオンの添加濃
度と発色感度との関係を表す。図のようにニッケルイオ
ンの添加により発色感度は上昇する。

実施例（８） 実施例（３）の反応試薬の１　、０ｍＭ酢酸カルシウム
の代わりに１０μＭの酢酸銅を使用し、その他は同様の
組成とし、同様の操作を行なう。

図７は、実施例（ト））における銅イオンの添加濃度と
発色感度との関係を表す。図のように銅イオンの添加に
より発色感度は上昇する。

実施例（９） 実施例（３）の反応試薬の１．Ｏａ＋Ｍ酢酸カルシウム
の代わりに１μＭの硫酸鉄を使用し、その他は同様の組
成とし、同様の操作を行なう。

図８は、実施例（９）における鉄イオンの添加濃度と発
色感度との関係を表す。図のように鉄イオンの添加によ
り発色感度は上昇する。

実施例（１０） 実施例（４）の反応試薬の１，０％β−シクロデキスト
リンの代わりに１．０％のγ−シクロデキストリンを使
用し、その他は同様の組成とし、同様の操作を行なう。

図９は実施例（ｌＯ）におけるγ−シクロ・デキストリ
ンの添加濃度と発色感度との関係を表す。図のようにγ
−シクロデキストリンの添加により発色感度は上昇する
。

実施例（１１） 実施例（４）の反応試薬の１．０％β−シクロデキスト
リンの代わりに１．０％のα−シクロデキストリンを使
用し、その他は同様の組成とし、同様の操作を行なう。

図１Ｏは、実施例（１１）におけるα−シクロデキスト
リンの添加濃度と発色感度との関係を表す。図のように
αシクロデキストリンの添加により発色感度は上昇する
。

実施例（１２） 反応試薬１　０．３Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４，７５４ｍＭ　
ＴＯＯ８ ２，５ｍＭ塩化ナトリウム １　、０ｍＭ酢酸カルシウム １％　α−シクロデキストリン 反応試薬２　０．３Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４，７５４ｍＭ４
−アミノアンチピリン ２．５ｍＭ塩化ナトリウム １．０ｍＭ酢酸カルシウム １％　α−シクロデキストリン 反応停止液　０．５Ｍクエン酸緩衝液ｐｎｅ、５１５ｍ
Ｍアジ化ソーダ ０．３％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００ 反応試薬１１１．Ｏｍｌとり、　これに検体２０μＩを
加え３７℃で約５分間予備加温し、その後反応試薬２を
１．Ｏｍｌ加え、３７℃で正確に１０分間反応させ、そ
の後反応停止液１．Ｏｍｌを加え反応を停止させ、生成
した色素を試薬盲検を対照にして、波長５５５ｎｍで吸
光度測定を行い活性値を求める。

また、反応試薬２を加えたのち、正確に一定時間後、吸
光度測定のできる臨床検査分野で普及している自動分析
機を使用する時は、反応停止液の使用は必要なく、一定
時間後の吸光度変化を測定することにより活性値を測定
できる。

実施例（１３） 実施例（１２）の反応試薬１の４　ａ＋Ｍ　ＴＯＯ３の
変わりに４ｍＭのソディウム・Ｎ−エチル−Ｎ　−（２
−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリンを使用し
、その他は同様の組成とし、同様の操作を行い、波長５
６５ｎｍで吸光度測定を行う。

実施例（１４） 反応試薬　　　０．３Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４，７５１ｍＭ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２ヒドロ ジエチル）−Ｐ−フェニレ ンシンアミン硫酸塩 ２．５ｍＭ塩化ナトリウム １ｍＭ酢酸カルシウム １％　β−シクロデキス トリノ 反応停止液　０．５Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４，７５１５
ｎｋｌアジ化ソーダ ０．３％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００ 反応試薬２．０ａ＋１に検体５０μｌを加え、２５℃で
正確に１５分間反応させ、その後反応停止液１、’ｏａ
＋１を加え反応を停止させ、生成した色素を試薬盲検を
対照として波長５５０ｎｍで吸光度測定を行い、活性値
を求める。

表２は、実施例（１４）と、反応試薬に２．５ｍＭ塩化
ナトリウム、１ｍＭ酢酸カルシウム、１％β−シクロデ
キストリンを含まない試薬との発色感度を比較したもの
で、添加剤を加えた方が発色感度が高くなっている。

（へ）発明の効果 従って、この発明はセルロプラスミンの反応の活性薬剤
の添加によって、短時間でかつ少量の検体ですむ、操作
が容易な、感度再現性、安定性に優れた測定方法でかつ
自動分析機に適するセルロプラスミンの測定方法を提供
する。

【図面の簡単な説明】

表１、表２、第１図、第２図、第３図、第４図、第５図
、第６図、第７図、第８図、第９図、第１θ図は、本発
明の実施例における発色感度を表す表及び図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）セルロプラスミンのオキシダーゼ活性の測定にお
   いて、反応試薬中に活性化剤として、クロールイオンを
   添加することを特徴とするセルロプラスミンの活性測定
   方法。
2. （２）セルロプラスミンのオキシダーゼ活性の測定にお
   いて、反応試薬中に活性化剤として、金属イオンを添加
   することを特徴とするセルロプラスミンの測定方法。
3. （３）セルロプラスミンのオキシダーゼ活性の測定にお
   いて、反応試薬中に活性化剤として、シクロデキストリ
   ン類を添加することを特徴とするセルロプラスミンの測
   定方法。