JPS6257946B2 - - Google Patents

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JPS6257946B2
JPS6257946B2 JP54051278A JP5127879A JPS6257946B2 JP S6257946 B2 JPS6257946 B2 JP S6257946B2 JP 54051278 A JP54051278 A JP 54051278A JP 5127879 A JP5127879 A JP 5127879A JP S6257946 B2 JPS6257946 B2 JP S6257946B2
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liquid
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solution
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Yasunao Ogawa
Kaoru Ishitobi
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Shionogi and Co Ltd
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Shionogi and Co Ltd
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    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/82Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving vitamins or their receptors
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10TTECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/10Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
    • Y10T436/108331Preservative, buffer, anticoagulant or diluent
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10TTECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]

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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は水性液体とくに体液中におけるアスコ
ルビン酸の検出・測定用の試験片に係る。 づいスコルビン酸(以下VCと記述する)は飲食
料品とくに強化飲食料品、飼料、VC製剤を含む
保健薬などに高濃度で含有されており、これらの
ものの体内摂取時には、体組織、血液中のVC濃
度が上昇し、かつ高濃度での排泄が認められる。 このようにVCが高濃度で共存する状況で、体
液とりわけ尿、血液中の特定の成分を検出・測定
しようとすれば、共存するVCの高い還元能の故
に、前記特定成分の測定値が大巾に影響を受け、
異常な誤差を生じる場合がある。 たとえば特定成分の酸化酸素―ペルオキシダー
ゼ―酸化還元クロモゲン系の検査システムによつ
て体液中のグルコース、ガラクトース、コレステ
ロールまたは尿酸の量を測定するとき、あるいは
過酸化物―クロモゲン系の検査システムによつて
尿中の微量血液を検出・測定するときなど、測定
値に共存VCの存在量に応じた負誤差を与える。 一方、還元法にもとづく検査システムによつて
体液中のグルコース、尿酸などを測定するときに
は、VCの存在量に応じて測定量に正誤差を与え
る。 水性液体中のVC測定法として従来から広く知
られている化学的定量法のひとつにインドフエノ
ールによる比色法または滴定法がある。ところが
共存VCは前記特定成分の測定に先立つて検知・
測定されていることが望ましく、その結果にもと
づいて測定法自体もVCの共存によつては影響を
受けないものに変更する必要があるので、前記比
色ないし滴定法は現実に即したものとは言い難
い。すなわち、共存VCおよび前記特定成分の検
出・測定はともに出来る限り、簡単な操作により
短時間のうちに正確な値が得られるものであるこ
とが要望されており、このようにすることによつ
て特定成分の測定を、その較正を含めて同時に遂
行することも可能となる。 所望されている簡易測定法としては、たとえば
特公昭53−712号公報中に開示されたものが挙げ
られる。この方法はリンモリブデン酸塩が、還元
性物質によつて、モリブデン青を形成する原理に
もとづいており、微量の無機リン定量法として既
知である方法を応用したものである。この方法に
よれば検出可能なVC濃度の範囲は0〜40mg/dl
に限られ、充分ではない。 本発明は水性液体とくに体液中に存在する
VC、の検出・測定を簡単な操作で、短時間にか
つ広い濃度範囲にわたつて、充分な正確さを以て
行う方法に使用する試験片を提供するものであ
り、その要旨は冒頭の特許請求の範囲に記載の通
りである。本発明の主目的はVCの検出・測定に
あることはもちろんであるが、その測定結果にも
とづいて、特定成分の検出方法を選択・変更した
り、その定量値を補正または較正することにもあ
る。そのためには前記特定成分測定部材と、本発
明のVC測定部材とを単一の試験片に並列して備
え、VC測定結果によつて特定成分測定値を較正
して読みとることのできるものも、本発明の実施
態様に含まれる。 記載のキレート錯体中の多価金属は鉄、銅、コ
バルト、ニツケルが挙げられるが、そのうちでも
鉄および銅が好ましい。具体的な高原子価の塩と
しては塩化第2鉄、シユウ酸第2鉄アンモニウ
ム、クエン酸第2鉄アンモニウム、クエン酸第2
鉄、硝酸第2鉄アンモニウム、臭化第2鉄、硫酸
第2鉄アンモニウム、酢酸銅などが挙げられる。 これらの多価金属とキレート錯体を作り得るキ
レート剤としては、エチレンジアミン四酢酸
(EDTA)、トランス―1,2―シクロヘキサンジ
アミンN、N、N′、N′四酢酸(CyHDTA)、ジエ
チレントリアミンN、N、N′、N″、N五酢酸
(DTPA)トリエチレンテトラミンN、N、N′、
N″、N、N〓六酢酸(TTHA)、これらのアル
カリ金属塩などが挙げられる。 有機金属指示薬としては一般に金属イオン比色
分析用有機試薬中、N、N―配位のものすなわ
ち、O―フエナントロリン、バソフエナントロリ
ン、2,2′―ビピリジン(a,a′―ジピリジ
ル)、クプロイン、ネオクプロイン、2,2′,
2″―テルピリジンなどが挙げられる。その他、低
原子価に還元された金属によつて検知可能な吸収
帯を発現し得るそのほかの有機試薬も用いうる。
吸収帯が可視光領域にない場合は紫外または赤外
吸光度によつて定量する。 これらのほか、組成物中には補助成分として反
応条件を規制するための適当なPH値を維持する緩
衝剤、安定化剤、背景色調整色素(背色剤)など
が含まれてよい。 検査操作が簡易である試験片の吸収性担持体と
しては通常の紙、布、フエルト、吸着剤を含む
ことのある微粉末焼結体が挙げられる。 第2金属塩(高原子価の方の)の濃度は0.01モ
ルから0.1モル程度でよく、そのうち0.05モルか
ら0.08モルであることが好ましい。 キレート化剤は通常1モル比以上の濃度で含有
される。キレート化剤不存在の場合はVCに対す
る反応特異性が低下し、光線に対する安定性も低
下する。 緩衝剤は、普通有機酸と無機強塩基との塩が緩
衝目的を達成するのに充分な濃度において使用さ
れる。本反応はPH3〜6.5の範囲で可能である
が、他の還元性物質たとえば尿酸、システイン、
亜硫酸塩、サリチル酸塩、グルタチオン、クレア
チニン、クレアチンなどの影響を完全に防止する
ためには4から5の範囲に維持出来るものである
ことが望ましい。 背色剤としては、適当な食用色素たとえば黄色
4号、青色1号そのほか適当な銅塩などを所望の
検出感度に応じて添加する。 安定化剤としては、普通に用いられているポリ
ビニルピロリドン(PVP)、ヒドロキシプロピル
セルローズ(HPC)およびポリエチレングルコ
ール(PEG)などが用いられるが、これは均色
化の目的をも果たすものである。 次に本発明を実施例によつてより詳細に説明す
る。 例 1 紙(東洋:No.53)を下記組成の第1液に浸漬
し、45℃で90分間真空乾燥させたのち、第2液に
浸漬し、次いで45℃で30分間真空乾燥させて試験
片原反とした。 第1液 CyHDTA 2g 塩化第2鉄 1.2g クエン酸ナトリウム 5.5g クエン酸 1.3g 純 水 57ml 青色1号(0.25W/V%) 2.5ml 第2液 2,2′―ビピリジン 0.4g PVPまたはHPC 0.5g エチルアルコール 10ml シクロヘキサン 30ml 浸漬・乾燥後の試験片原反は低温・遮光下に保
存する。この細片をプラスチツク製シートの一端
に貼付したステツクを作製した。 これをVCを含まない健常人の尿に、VCを下記
濃度で添加して調整した被検液に浸漬して60秒後
の呈色を観察したところ、下記の色調を示した。 記 VC濃度(mg/dl) 色調(H―V/C) 0 5BG―7/6 5 7.5BG―7/3 10 10BG―6/2 20 7.5R―5/2 40 5R―5/4 80 2.5R―4/4 〔JISZ―8721―1964準拠標準色票(日本規格
協会発行)色相―明度/彩度による標示、以下同
様〕 例 2 例1と同様にして作製した試験片によつて同様
の呈色結果を30秒後に得た。この場、第1液とし
て例1のものに換え次記組成の液を使用した。 第1液 TTHA 2g 塩化第2鉄 1.1g クエン酸ナトリウム 4g クエン酸 0.2g 純 水 42ml 青色1号(0.25W/V%) 1.8ml 例 3〜5 例1と同様にして、ただし次記組成の第1液を
用い15秒後に同様の呈色結果を得た。 第1液(例3) DTPA 2g 塩化第2鉄 1.2g クエン酸ナトリウム 5.5g クエン酸 1.2g 純 水 57ml 青色1号(0.25W/V%) 2.5ml 第1液(例4) EDTA―2Na 3.5g シユウ酸第2鉄アンモニウム 3g クエン酸ナトリウム 6g クエン酸 6g 純 水 95ml 青色1号(0.25W/V%) 5ml 第1液(例5) EDTA―2Na 3g クエン酸第2鉄またはそのアンモニウム塩
2g クエン酸ナトリウム 5g 純 水 95ml 青色1号(0.25W/V%) 5ml 例 6、7および8 例1と同様な操作で次記組成の第1液および第
2液を用い試験片を作製した。
【表】 第2液(共通) 2,2―ビピリジンまたはO―フエナントロ
リン(いずれもほぼ同一呈色を与える) 0.2g PVPまたはHPC 0.25g エチルアルコール 20ml 例1と同様な操作による呈色状況(尿中浸漬、
15秒後)は次のとおりであつた。 VC濃度(mg/dl) 色調(H―V/C) 0 5Y―9/6 5 10YR―8/8 10 5YR―7/8 20 2.5YR―7/10 40 10R―6/12 例 9 例1と同様な操作で、但し第1液として、次記
組成のものを用いて、試験片を作製し、続記の尿
中浸漬15秒後の呈色結果を得た。 第1液 EDTA―2Na 3g 硫酸第2鉄アンモニウム 7.1g クエン酸ナトリウム 6g 純 水 95ml 青色1号(0.25W/V%) 5ml 呈色結果 VC濃度(mg/dl) 色調(H―V/C) 0 5BG―7/6 5 7.5BG―7/3 10 10BG―6/2 20 7.5R―6/2 40 5R―5/4 80 2.5R―4/4 例 10 例6〜8と同様な操作で、但し第1液としては
次記組成のものを用いて試験片を作製した。 第1液 EDTA―2Na 4g 塩化第2鉄 2g クエン酸ナトリウム 6.3g クエン酸 3g 酢酸銅(無水) 0.5g 純 水 95ml 同様な操作による呈色状況(浸漬15秒後)は次
のとおりであつた。 VC濃度(mg/dl) 色調(H―V/C) 0 10GY―8/3 0.5 10Y―7/3 1 10YR―7/3 2 10YR―7/2 5 5YR―7/3 10 10R―6/4 20 7.5R―6/6 例 11 例1と同様な操作で、次記の第1液および第2
液を用いて試験片を作製し、続記の呈色結果を得
た。 第1液 酢酸銅(無水) 0.2g EDTA―2Na 0.5g 純 水 20ml 第2液 バソフエナントロリン 0.2g PVPまたはHPC 0.4g エタノール 20ml 呈色1(尿中浸漬15秒後) VC濃度(mg/dl) 色調(H―V/C) 0 5BG―8/3 5 10GY―7/3 10 5GY―7/3 20 2.5GY―7/3 40 7.5Y―4/4 呈色2〔血清中浸漬30秒後、但し血清はハイラ
ンド:コントロール血清1型(Q―PAK
Chemistry control Serum I)を使用〕 VC濃度(mg/dl) 色調(H―V/C) 0 7.5GY―8/3 1 5GY―7/4 4 5YR―7/3 10 7.5R―6/6 例 12 例1と同様な操作で、次記の第1液および第2
液を用いて試験片を作製し、例1に準じた呈色結
果を尿中浸漬15秒後に得た。 第1液 EDTAナトリウム 3g 塩化第2鉄 2g クエン酸ナトリウム 5.6g クエン酸 3g 純 水 94ml 青色1号(0.25W/V%) 5ml 第2液 a,a′―ジピリジル 0.4g ポリビニルピロリドン 0.5g シクロヘキサン 27.5ml エタノール 12.5ml 例 13 例12の操作に準じて、試験片(血清用)を作成
し、続記の呈色結果を得た。この場合血清評価に
適合するよう、背色剤使用量と液性に配慮して、
第1液を次記のものにに換えて用いた。 第1液 EDTAナトリウム 3g 塩化第2鉄 2g クエン酸ナトリウム 10g 純 水 94ml 青色1号(0.25W/V%) 0.3ml 呈色結果(血清中浸漬30秒後) VC濃度(mg/dl) 色調(H―V/C) 0 5Y―8/4 0.5 10YR―8/3 1 7.5YR―8/3 2 5YR―8/4 5 10R―7/6 10 7.5R―6/8 なお本試験片に対する他薬剤の添加による影響
を検討したところ、弗化ナトリウム、蓚酸カリ、
グルタチオン(還元型)、クレアチン、クレアチ
ニンおよびピルビン酸については添加濃度100
mg/dl迄、尿酸およびビタミンEについては同5
mg/dl迄全く影響がないことを確認した。 但しシステインを25mg/dlの濃度で添加すると
VC0.5mg/dl濃度に相当する呈色が観察された。 比較例 キレート化剤を含まない次記組成の対1液と、
例1の第2液を用い、例1と同様な操作によつて
試験片を作製し、続記の呈色結果を得た。 第1液 塩化第2鉄 1g クエン酸 1g クエン酸ナトリウム 3g 純 水 45ml 青色1号(0.25W/V%) 2.5ml 呈色結果(尿中浸漬15秒後) VC濃度(mg/dl) 色調(H―V/C) 0 5G―6/4 5 7.5GY―4/2 10 5Y―5/1 20 10R―4/2 40 7.5R―3/4 得られた試験片は変色し易く、短期間の保存に
も耐えなかつた。また、サルチル酸塩による呈色
が認められた。 参考例 (溶液法による定量例) 0.2gの塩化鉄および0.3gのEDTA・Naを0.3M
クエン酸塩緩衝液(PH5.5)に溶解させて100mlと
したものを第1液とし、また0.5gの2,2′―ビピ
リジンを水に溶解させて100mlとしたものを第2
液とし、これらを暗所に保存しておく。 VC含量の定量に際して、先ず5mlの第1液を
2mlの第2液と混合し、これに被検尿(0.1mlあ
るいは10倍希釈尿1ml)を添加し、0.3Mクエン
酸塩緩衝液(PH5.5)を追加し10mlとする。これ
を遮光下に2分以上放置したのち、この混合、液
の520nmの吸光度を読みとる。 各濃度でVCを含有する標準試料を用いて得ら
れた検量線は: Y=0.097X−0.0014 (ただし、XはVC濃度(mg/dl)を、Yは520nm
の吸光度をあらわす)のとおり、原点付近を通る
完全な直線で、110mg/dl程度のVC濃度迄定量で
きることがわかつた。 定量の同時再現性の変動係数(cv)は1%以
下である。 試料中に存在する他物質による定量阻害、すな
わちVCに対しての特異性(回収率%であらわ
す)は次表に示すとおりであつた。
【表】

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 (イ) エチレンジアミン四酢酸、トランス―
    1,2―シクロヘキサンジアミン―N、N、
    N′、N′―四酢酸、ジエチレントリアミン―
    N、N、N′、N″、N―五酢酸、トリエチレ
    ンテトラミン―N、N、N′、N″、N、N〓
    ―六酢酸およびこれらのアルカリ金属塩から選
    ばれた少なくとも1種のキレート剤とそれぞれ
    +3あるいは2価の状態にある鉄または銅との
    錯体、 (ロ) O―フエナントロリン、バソフエナントロリ
    ン、2,2′―ビピリジン、クプロイン、ネオク
    プロインおよび2、2′、2″−テルピリジンより
    選ばれた少なくとも1種の金属指示薬、 (ハ) 組成物のPHを3〜6.5に維持しうる緩衝剤、 (ニ) 背景調整色素および (ホ) 分散剤 を含む組成物を乾燥状態で吸収性担持体に保持さ
    せた鉄または銅イオンのそれぞれ+2あるいは1
    価の状態における着色錯体の生成を特徴とする還
    元型アスコルビン酸検出用試験片。
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