JPH0510956A - 生体試料中の成分測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 生体試料中の成分の測定法であって、試料中
に混在するキレート性物質（ＥＤＴＡ、クエン酸等）の
影響を回避できる測定法を提供することを目的とする。 【構成】 試料中に混在するキレート性物質により影響
される反応を用いる生体試料中の成分測定法において、
当該反応に関与せず且つ混在するキレート性物質と結合
する金属イオンの存在下に測定を行うことからなる。本
発明の方法によれば、試料中に混在するキレート性物質
の影響を回避することができ、キレート性物質を含有す
る試料であっても、高精度且つ迅速に測定対象物質を測
定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は主として、臨床検査分野
等で利用される生体試料中の成分測定法に関する。より
詳細には、生体試料中に混在するキレート性物質の影響
を回避した生体試料中の成分測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来から、生体試料中の各種成分の測定
（定量及び定性）は、疾病の診断、予後の追跡、定期診
断及び健康診断のスクリーニング検査等に応用されてい
る。そのような臨床検査においては種々の反応を利用し
て生体試料中の各種成分の測定が行われているが、ここ
で利用されている反応の中には、試料中に混在するキレ
ート性物質により影響を受けるものがある。そのような
例として、血清中の重金属の測定が挙げられる。即ち、
血清中の重金属の測定は各種疾患の診断に用いられてお
り、例えば、再生不良性貧血、骨髄形成不全症候群等に
おいては血清鉄が高値に、また鉄欠乏性貧血、出血性貧
血等においては血清鉄が低値となることが知られてい
る。同様に、銅、亜鉛、マグネシウム等の血清中の含量
も各種の疾患と密接な関係を有することが知られてい
る。これら血清中の微量重金属の測定には原子吸光法が
用いられているが、最近では、分子吸光係数の大きいキ
レート発色剤が開発され、比色法により簡便に重金属を
測定できるので、血清中重金属の測定等に多数応用され
ている。

【０００３】このようなキレート発色剤を用いた重金属
の測定は、キレート発色剤と重金属との反応による発
色、吸収波長のシフト、着色度の変化等を利用して重金
属を測定するものである。しかし、生体試料中にはキレ
ート性物質（例えば、クエン酸、リン酸、シュウ酸等）
が混在していることが多く、キレート性物質を含む試料
中の重金属の測定をキレート発色剤を用いた測定法で行
うと、キレート性物質によりキレート発色剤の発色等が
防害されて測定値に誤差を生じる。また、一般的に、キ
レート性物質の混在により反応が遅くなり、測定に長時
間を要し、短時間（３〜５分間程度／試料）に多くの試
料を処理する必要のある自動分析装置には適さない。更
に、血液試料の採取に際し、採取した血液の凝固を防止
するため、通常、抗凝固剤としてＥＤＴＡ（エチレンジ
アミン四酢酸）、クエン酸等を添加する採血法が広く用
いられているが、この場合にも、ＥＤＴＡ、クエン酸等
の強キレート剤の影響を受け、測定値に誤差を生じる。
従って、この方法により採血された試料には、キレート
発色剤を用いる測定方法は使用できない。

【０００４】また、他の例としては、金属要求酵素（酵
素の活性賦活化に、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、
亜鉛等の金属を必要とする酵素）の活性測定や金属要求
酵素を用いた酵素反応系により生体試料中の成分を測定
する場合が挙げられる。これらの場合、酵素の活性賦活
化を図るため、反応試薬に金属を予め添加したり、反応
系に金属を添加することが行われる。しかし、前述のよ
うなキレート性物質を含有する試料においては、添加さ
れた金属がキレート性物質と錯体を形成し、捕捉される
ため、測定値のバラツキを生ずるという問題がある。こ
の問題を回避するために、大過剰の金属を添加すること
が行われているが、大過剰の金属の添加は金属要求酵素
の活性阻害をもたらしたり、また酵素反応共役系を用い
る測定系では他の酵素の活性に影響を及ぼすという問題
がある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、試料中
の成分の測定に際し、試料がキレート性物質を含有する
場合、キレート性物質により影響される反応を用いる測
定法では測定対象成分を測定することはできない。本発
明は上記従来技術の問題点を解消するためになされたも
ので、生体試料中に混在するキレート性物質の影響を回
避し、生体試料中の測定対象成分を高精度且つ迅速に測
定する方法を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記事情に
鑑み、生体試料中に混在するキレート性物質の影響を受
ける反応を用いる測定法において、キレート性物質の影
響を回避する方法を鋭意検討した結果、測定反応には関
与せず且つ試料中に混在すると予想されるキレート性物
質と結合し得る金属イオンを測定時に存在させることに
より、従来測定できなかった抗凝固剤入り試料であって
も、キレート性物質に妨害されることなく、試料中の測
定対象成分を高精度且つ迅速に測定できることを見出し
て、本発明を完成した。即ち、本発明の測定法は、生体
試料中の成分の測定法であって試料中に混在するキレー
ト性物質により影響される反応を用いる測定法におい
て、当該反応に関与せず且つ混在するキレート性物質と
結合する金属イオンの存在下に測定を行うことからな
る。

【０００７】上記の構成からなる本発明において、試料
中に混在するキレート性物質により影響される反応を用
いる測定法としては、例えば、キレート発色剤を用いる
重金属の測定、金属要求酵素の酵素活性の測定、金属要
求酵素を用いた酵素反応系による生体試料中の成分の測
定等が挙げられる。より具体的には、キレート発色剤を
用いる重金属の測定としては、例えば、フェレン−Ｓ、
ニトロソプロピルスルホプロピルアミノフェノール（ニ
トロソ−ＰＳＡＰ）、バソフェナンスロリン、フェロジ
ン、2，4，6-トリピリジル-S-トリアジン等を用いた鉄
の測定、バソカプロインスルホン酸等を用いた銅の測
定、1-(2-ピリジルアゾ)-2-ナフトール（ＰＡＮ）、ジ
チゾン等を用いた亜鉛の測定などが例示される。

【０００８】また、金属要求酵素の酵素活性の測定とし
ては、例えば、酸化還元酵素［例えば、イソクエン酸デ
ヒドロゲナーゼ(E.C.1.1.1.41及び1.1.1.42)等］、加水
分解酵素［例えば、アルカリフォスファターゼ(E.C.3.
1.3.1)等］、リン酸転移酵素［例えば、クレアチンキナ
ーゼ(E.C.2.7.3.2)、ピルビン酸キナーゼ(E.C.2.7.1.4
0)、グルコキナーゼ(E.C.2.7.1.2)、ケトヘキソキナー
ゼ(E.C.2.7.1.3)、6-フォスフォフルクトキナーゼ(E.C.
2.7.1.11)、リボキナーゼ(E.C.2.7.1.15)、キシロキナ
ーゼ(E.C.2.7.1.17)、プロテインキナーゼ(E.C.2.7.1.3
7)等］などの酵素活性測定が例示される。

【０００９】更に、金属要求酵素を用いた酵素反応系に
よる生体試料中の成分の測定としては、上記の金属要求
酵素の酵素反応を利用した有機成分及び無機成分の測定
が挙げられ、例えば、D-グルコースにヘキソキナーゼを
作用させてグルコース-6-リン酸を生成させ、次いでグ
ルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼとNADPとを反応さ
せ、生成するNADPHを測定する血糖値の測定、上記反応
系を用いるマグネシウムの測定、尿素にウレアーゼを作
用させてアンモニアを生成させ、次いでグルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼとNAD(P)を反応させ、生成するNAD(P)H
を測定する尿素窒素の測定などが例示されるが、これら
に限定されるものではない。

【００１０】本発明において使用される、測定反応に関
与せず且つ混在するキレート性物質と結合する金属イオ
ンとしては、試料中に混在するキレート性物質と選択的
に結合するものであれば特に限定されず、混在するキレ
ート性物質により適宜選択することができ、例えば、カ
ルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄
（１価）イオン、スズ（１価）イオン等が好適である。
これらのイオンは、水溶性塩（例えば、塩酸塩、酢酸塩
等）として使用される。金属イオンの使用量は試料中に
混在するキレート性物質の量などにより適宜調整される
が、通常、測定試料液中の金属イオン濃度が0.1mM〜50m
M程度、好ましくは0.2mM〜20mM程度、より好ましくは0.
3mM〜10mM程度となるように調整して用いられる。金属
イオンの使用量が0.1mM未満では添加効果が認められ
ず、また50mMを超えて添加しても問題はないが、その量
までで十分な効果が得られる。

【００１１】本発明の測定法において、上記の金属イオ
ンは測定時に存在しておればよく、測定試薬液に金属塩
を添加してもよく、また血清などの試料に金属塩を添加
してもよく、更に、試薬液と試料の混合時に金属塩を添
加してもよい。好適には、測定試薬液に金属塩を予め添
加しておく方法が挙げられる。本発明の測定法は、測定
に際して上記の金属イオンの存在下に行う以外は従来法
と同様にして行うことができ、例えば、キレート発色剤
を用いる重金属の測定法の場合、適当な溶媒（例えば、
精製水、トリス緩衝液、グリシン緩衝液等）に上記の金
属塩を添加すると共に必要に応じて界面活性剤、還元
剤、安定化剤などを添加した溶液を調製し、この溶液と
血清などの試料(必要に応じて希釈されていてもよい)を
混合し、更にキレート発色剤を含有する試薬液を添加し
た後、所定時間インキュベートし、測定試料液とする。
次いで、常法に準じて比色定量することにより、重金属
を測定することができる。測定は、レートアッセイ法及
びエンドポイント法のいずれの方法にても行うことがで
きる。

【００１２】本発明における生体試料としては、血液、
血清、血漿、尿、髄液等が挙げられ、特に血清及び血漿
を試料とし、キレート発色剤又は金属要求酵素を用いた
重金属の測定、金属要求酵素活性の測定に好適に用いら
れる。また、本発明の測定法は短時間（通常、1〜10分
程度)に測定が終了するので自動分析装置を用いた測定
に好適である。なお、本発明の実施に際しては、測定方
法等に応じて、測定試薬に界面活性剤（例えば、ラウリ
ル硫酸塩、トライトン等）、還元剤(例えば、アスコル
ビン酸、チオグリコール酸等)、安定化剤などの慣用の
添加剤を添加してもよい。

【００１３】

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものでは
ない。 実施例１フェレン−Ｓを用いた血清鉄の測定 以下の組成の試薬液を調製した。 第一試薬 Bis-Tris 100mM ラウリル硫酸リチウム 7.0% トライトンX-405 1.2% チオ尿素 65.7mM アスコルビン酸 0.5% 塩化カルシウム 5mM 酢酸 適量 ｐＨ 6.1 第二試薬 フェレン-S 5mM キレート発色剤としてフェロジンを用いる市販試薬で正
常人血清を測定した際に、測定値が異常を示さなかった
血清検体（４検体）及び異常を示した血清検体（４検
体）を選択した（表１参照）。検体20μlと第一試薬400
μlをキュベット内にとり、5分間37℃で恒温し、5分後
の吸光度(測定波長:600nm)を測定し、次いで第二試薬10
0μlを添加し、37℃で恒温し、5分後再び吸光度を測定
した。対照として、検体のかわりに精製水を用いて同様
の操作を行った。更に鉄標準液（500μg/dl)における吸
光度の変化量を求め、その吸光度変化量から、各血清検
体中の鉄濃度を計算した。なお、比較として、同じ検体
について、塩化カルシウムを添加しない第一試薬を用い
て同様にして測定を行った。更に、キレート発色剤とし
てニトロソ−ＰＳＡＰを用いた市販の試薬にても測定を
行った。その結果を表１に示す。表１に示されるよう
に、塩化カルシウム添加のフェレン-S法(本発明方法)に
よれば、低値を示す検体でも良好な測定値が得られた。

【００１４】

【表１】

【００１５】実施例２不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ）の測定 以下の試薬液を調製した。 第一試薬 Tris 500mM 塩化カリウム 0.5% トライトンX-405 0.2% イミノ二酢酸 1mM チオ尿素 65.7mM 硫酸アンモニウム第一鉄 0.015mM 塩酸ヒドロキシルアミン 36mM 塩化カルシウム 10mM ｐＨ 8.5 第二試薬 フェレン-S 10mM イミノ二酢酸 5mM 塩酸ヒドロキシルアミン 360mM 鉄除去したトランスフェリン（生化学工業製）700mg/dl
を含む生理食塩水に、ＥＤＴＡ・２Ｎａ（キシダ化学
製）を1mMとなるよう添加し、ＵＩＢＣ値が高値の試料
を調製した。この試料をＥＤＴＡ・２Ｎａ1mM溶液で10段
希釈した溶液を試料として用い、検量性の確認を行っ
た。測定は、実施例１と同じ操作で行った。ＵＩＢＣ値
は、あらかじめ過剰の鉄を添加し、その鉄を検体中のト
ランスフェリンがどれだけ取り込めるかを測定するの
で、対照（精製水）より、吸光度がどれだけ減少するか
で測定値とする。この場合、試料中に混在するキレート
性物質（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）により、鉄が余分に取られ
るとＵＩＢＣ値としては大きな値となる。なお、比較と
して、市販の塩化カルシウム無添加のフェレン−Ｓ法、
フェロジン発色法、ニトロソ−ＰＳＡＰ法でも同じ検体
を測定した。その結果を図１に示す。図１において、●
は塩化カルシウム添加フェレン−Ｓ法（本発明方法）、
○は塩化カルシウム無添加フェレン−Ｓ法、□はフェロ
ジン発色法、△はニトロソ−ＰＳＡＰ法を示す。図１か
ら明らかなように、本発明方法は、塩化カルシウム無添
加の方法に比べて良好な検量性を示した。

【００１６】実施例３ヒト血清および血漿ＵＩＢＣ値の測定 実施例２と同じ試薬を使い、実施例２と同様の操作で、
ヒト血清及び血漿を検体にして、ＵＩＢＣ値を測定し
た。その結果を表２に示す。表２に示されるように、他
法では異常を示す検体も、本発明の方法では良好に測定
された。

【００１７】

【表２】

【００１８】実施例４酵素法による血清マグネシウムの測定 以下の試薬液を調製した。 第一試薬 Ｔｒｉｓ 100mM β-ＮＡＤＰ 0.7mM ヘキソキナーゼ 0.45単位/ml グルコース-6-リン酸脱水素酵素 0.75単位/ml ＡＴＰ 12.5mM ｐＨ 8.5 第二試薬 トリス 100mM ブドウ糖 50mM 塩化カルシウム 5mM ｐＨ 8.5 検体として、ＥＤＴＡ・２Ｎａが最高200mg/dlとなるよ
う血清に添加したものを、血清に同用量の精製水を添加
したもので希釈したものを使用した。この検体7μlに第
一試薬を320μl添加し5分間、37℃で恒温し、ついで第
二試薬を80μl加え、1.5分より波長340nmにおける1分間
当たりの平均吸光度変化量を求める。盲検として検体の
変わりに精製水を用いて同様の操作を行う。また、マグ
ネシウム標準液(5mg/dl)についても同様の操作を行い、
その平均吸光度変化量から、検体中のマグネシウム濃度
を計算した。なお、比較として、同じ検体について、第
二試薬から塩化カルシウムを除いた試薬液を用いて、同
様な操作でマグネシウムの測定を行った。その結果を表
３に示す。表３に示されるように、塩化カルシウムを添
加しない試薬を用いる方法はＥＤＴＡ・２Ｎａの影響を
受け、測定値が低下するが、塩化カルシウムを添加した
試薬を用いる方法(本発明方法)では、ＥＤＴＡ・２Ｎａ
の影響を受けず良好な測定値を示した。

【００１９】

【表３】

【００２０】実施例５血清アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性の測定 以下の試薬液を調製した。 第一試薬 エチルアミノエタノール 100mM 塩化マグネシウム 0.65mM 塩化カルシウム 0.45mM 塩酸 適量 ｐＨ 9.9 第二試薬 p-ニトロフェニルリン酸・2ナトリウム 76mM 検体として、実施例４で調製した血清を使用した。この
検体を6μlとり、第一試薬320μlと混和し5分間37℃で
恒温し、ついで、第二試薬を80μl加え、2分後より波長
405nmにおける1分間当たりの平均吸光度変化量を求め
た。盲検として、検体のかわりに精製水を用いて、同様
の操作を行った。測定値は、p-ニトロフェノールの分子
吸光係数より、以下の計算式に基づき、活性値を求め
た。 なお、比較として、同じ検体について、第一試薬から塩
化カルシウムを除いた試薬液を用いて、同様な操作でＡ
ＬＰ活性の測定を行った。その結果を表４に示す。表４
に示されるように、塩化カルシウムを添加しない試薬を
用いる方法はＥＤＴＡ・２Ｎａの影響を受け、測定値が
低下するが、塩化カルシウムを添加した試薬を用いる方
法(本発明方法)では、ＥＤＴＡ・２Ｎａの影響を受けず
良好な測定値を示した。

【００２１】

【表４】

【００２２】

【発明の効果】以上のように、本発明の測定法によれ
ば、試料中に混在するキレート性物質の影響を回避する
ことができるので、キレート性物質を含有する生体試料
においても測定対象成分を高精度で測定することがで
き、更に測定が短時間で終了し、自動分析にも適用する
ことができるという効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の測定法による検量線を示す図である。
図１において、●は塩化カルシウム添加フェレン−Ｓ法
（本発明方法）、○は塩化カルシウム無添加フェレン−
Ｓ法、□はフェロジン発色法、△はニトロソ−ＰＳＡＰ
法を示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生体試料中の成分の測定法であって
   試料中に混在するキレート性物質により影響される反応
   を用いる測定法において、当該反応に関与せず且つ混在
   するキレート性物質と結合する金属イオンの存在下に測
   定を行うことを特徴とする生体試料中の成分測定法。
2. 【請求項２】 試料中の測定対象成分が重金属であ
   る請求項１記載の生体試料中の成分測定法。
3. 【請求項３】 測定法が、キレート発色剤を用いる
   方法又は金属要求酵素を用いる方法である請求項２記載
   の生体試料中の成分測定法。
4. 【請求項４】 測定法が、金属要求酵素の酵素活性
   測定法である請求項１記載の生体試料中の成分測定法。