JPH0356425B2

JPH0356425B2 -

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Publication number: JPH0356425B2
Application number: JP58144200A
Authority: JP
Priority date: 1983-08-05
Filing date: 1983-08-05
Publication date: 1991-08-28
Also published as: JPS6035270A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ヘモグロビンの分解防止方法に関す
るものである。ヘモグロビンは、血液中に約15ｇ／dlの濃度で
存在している分子量67000の蛋白で、その分子中
には４個のヘム部が存在し、このヘム部はプロト
ポルフイリン１分子と鉄１原子より成り立つてい
て、生体内に於いて、酸素及び二酸化炭素の運搬
を司る重要な役割を担つている。このようなヘモグロビンは、しばしば、溶血に
より、赤血球から一部溶け出してしまう。この溶
血の原因としてあげられるものには、(1)物理的溶
血（浸透圧、振とう、温度、音波、輻射線など）、
(2)化学的溶血（非電解質、酸、アルカリ、界面活
性剤、脂肪溶剤など）、(3)生物学的溶血（溶血性
貧血、黄疸性溶血、生体内溶血）などがあり、そ
のほか、臨床化学分析に於ては、水の混入、保存
（運搬）条件及び病的原因が主な原因となつてい
る。溶血の際は、赤血球が破壊されるため、赤血球
内の酸素が溶出し、この酸素に関連した測定項目
に正誤差を与えたり、赤血球から遊離したヘモグ
ロビンから鉄が分離するため血清鉄測定の際に正
誤差を与えたりする。また、ヘモグロビンから鉄
が遊離する際には、ヘモグロビンの極大吸収波長
（λ_nax：415、540、575nｍ）近辺の吸光度が経時
的に減少するので、Rate測定項目に於て上昇法
では負誤差を、減少法では正誤差を与えたりして
いる。更に、溶血性黄疸、溶血性貧血の際は、血
清鉄測定値が重要な診断材料となるが、特に除蛋
白せずに血清鉄を測定する場合、ヘモグロビンよ
り分離した鉄は、この測定に致命的ともいえる正
誤差を与えてしまつている。このように、被検試
料が溶血している時は、それについて得られた測
定値は極めて信頼性が薄くなる場合が多く、この
ことは、被検試料が生体試料であつて測定対象が
体液成分であるような臨床化学分析に於て最も対
象に苦慮していた問題の１つである。本発明者らは、この問題の解決に付き鋭意研究
の結果、ヘモグロビンの安定化剤、即ち、ヘモグ
ロビンのヘム部からの鉄の遊離を防止するヘモグ
ロビンの分解防止剤として、特定の含窒素化合物
又はその塩が特に有効に作用するとの知見を得、
本発明を完成するに至つた。即ち、本発明は、下記一般式、、、、
、、、、、及びから成る群より選
ばれた１種又は２種以上の含窒素化合物又は／及
びその塩をヘモグロビンを含有する溶液中に共存
させることを特徴とする、ヘモグロビンの分解防
止方法の発明である。ピリジン及びその誘導体（式中、Ａは水素原子、塩素原子又は−
CH₂OH基を表わし、Ｑは水素原子又は水酸基
を表わす。）ピリダジンイミダゾール及びその誘導体（式中、Ｅは水素原子、炭素数１〜４の低級ア
ルキル基又は

【式】基を表わし、Ｔは水素原子又は−CH₂CH₂NH₂基を
表わす。）ピラゾール１−フエニル−３−アルキル−５−ピラゾロ
ン（式中、Ｇは炭素数１〜４の低級アルキル基を
表わす。）４−アミノアンチピリン及びその誘導体（式中、Ｘ及びＹは夫々独立して炭素数１〜４
の低級アルキル基を表わし、Phはフエニル基
を表わす。）トリアゾールｏ−トリジン及びその誘導体（式中、Ｌ及びＭは夫々独立して炭素数１〜４
の低級アルキル基を表わす。）トリエタノールアミンＮ（CH₂CH₂OH）₃ ピペラジン及びその誘導体（式中、R¹及びR²は夫々独立して水素原子又
は炭素数１〜４の低級アルキル基を表わす。）チオ尿素上記〜で示される含窒素化合物又はその塩
の具体例としては、例えば３−ヒドロキシピリジ
ン、２−クロロ−３−ヒドロキシピリジン、３−
ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチルピリジン、イ
ミダゾール、１−メチルイミダゾール、ヒスタミ
ン、(E)−３−［４−（１−イミダリルメチル）フエ
ニル］−２−プロペノイツクアシツド・HCl・
H₂O、１−フエニル−３−メチル−５−ピラゾ
ロン、４−アミノアンチピリン、２，５−ジメチ
ルピペラジン、チオ尿素、ピリジン、ピリダジ
ン、ピラゾール、トリエタノールアミン、２−メ
チルイミダゾール、トリアゾール、ｏ−トリジン
などの化合物又はこれらの塩が挙げられる。第１
表に、これらの化合物及びその他の含窒素化合物
によるヘモグロビンの安定化効果を示す。即ち、
これらの化合物をPH6.5のリン酸緩衝液に添加し
て、ヘモグロビンの分解量を測定した結果が、第
１表に示されている。尚、操作法等については後述する。

【表】

【表】 ●ヘモグロビンの分解量の測定［試薬］緩衝液：0.1Mリン酸緩衝液PH6.5、チオグリコー
ル酸0.2％、含窒素化合物又はその塩0.5％発色液：２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ
−スルホプロピル）アミノフエノール15ｍＭ溶
液［操作法］試料（人ヘモグロビン500mg／dl、100mg／dl水
溶液）200μlに、緩衝液2.0mlを加え、室温（25
℃）で10分間放置（この間に検体盲検の吸光度を
測定する。）後、発色液を１滴加えて、室温で更
に15分間放置して750nｍの吸光度を測定する。
鉄標準液の吸光度と対比して鉄の溶出量を求め、
ヘモグロビンからの鉄の溶出量を、ヘモグロビン
の分解防止剤無添加の場合の鉄の溶出量を100と
したときの、これとの相対値で示してある。ヘモグロビンが、グロビン中のヒスチジンのイ
ミダゾール基と、ヘム部の鉄とが結合し成り立つ
ていることは周知の事実であり、ヒスチジンに鉄
の遊離を防止する働きがあるのではないかとの着
想が得られる。しかしながら、第１表から明らか
なように、実際に、ヒスチジンにはヘモグロビン
安定化能力がそれほどなく、むしろ、他の含窒素
化合物又はその塩の方が、ヘモグロビンの安定化
能力を有しているという事実は、実に意想外のこ
とである。即ち、ヒスチジンを添加した場合は、
無添加の場合と比べて約５％の防止力しか示さな
いのに対し、３−ヒドロキシピリジン、イミダゾ
ール、１−メチルイミダゾール、ヒスタミン、(E)
−３−［４−（１−イミダリルメチル）フエニル］
−２−プロペノイツクアシツド・HCl・H₂O又は
１−フエニル−３−メチル−５−ピラゾロンのよ
うな化合物を添加した場合は、無添加の場合に比
べてそのヘモグロビン分解度が約1/10程度に減少
する。また、イミダゾールはまれに緩衝剤として
使われたり、アンモニア（尿素）定量用の発色剤
として使用されることもあるが、これらはヘモグ
ロビンの安定化作用を目的とした本発明とは何ら
関連のもつものではない。第１図には、鉄の発色剤を含む緩衝液中に、ヘ
モグロビンのみを添加した場合、ヘモグロビン及
び血清を添加した場合、血清のみを添加した場合
又はヘモグロビン及びイミダゾールを添加した場
合のヘモグロビンの分解度の測定結果を示してあ
る。PH５〜７の緩衝液中では、ヘモグロビンのみ
を含む緩衝液はPHの高いもの程分解速度が速い
が、血清にヘモグロビンを添加したものは、血清
成分の安定化作用により、PH5.8付近を最大にそ
れ以上のPHでは逆にヘモグロビンの分解度は低下
している。また、ヘモグロビンのみを含む緩衝液
に0.1％イミダゾールを添加したものの分解度を
測定すると、イミダゾールはPHの高い方がより有
効に作用し、PH6.5では無添加に比べ約1/20とな
つている。これらのことから、血清を試料とし且つ測定時
のPHが中性付近である臨床化学分析に於ては、本
発明に係る含窒素化合物中ではヘモグロビン分解
防止能力が比較的低い２，５−ジメチルピペラジ
ンやチオ尿素なども、ヘモグロビンの分解防止の
目的に充分利用し得ることが判る。第２図に、PH6.5に於るイミダゾール添加量と
ヘモグロビンの分解量の関係を示す。イミダゾー
ル0.15％の添加で、無添加に比べ1/10以下に分解
量が低下することがわかる。また、第２表に本発明に係る化合物であるイミ
ダゾール、１−メチルイミダゾール又は３−ヒド
ロキシピリジンによるヘモグロビンの褪色防止効
果を示す。即ち、第２表中の値は、0.1Mトリス
緩衝液に基質溶解剤としてラウリルベンゼンスル
ホン酸ナトリウム1.0％及びトルトンＸ−100（ロ
ームアンドハース社商品名）２％を加え、PHを
8.4とした緩衝液に、所定量のヘモグロビン及び
本発明に係る化合物を添加して、ヘモグロビンの
極大吸収波長である415nｍに於る吸光度の変化
を測定した値を示したものである。

【表】本発明に係る化合物を無添加の場合、この条件
下に於て、ヘモグロビンは界面活性剤の作用もあ
つて徐々に分解し、その吸光度は経時的に減少す
る。従つて、この場合にはヘモグロビンの極大吸
収波長付近の410nｍ、540nｍ又は580nｍ付近で、
上昇法のRate測定を行つた場合には、測定値に
負誤差が生じることになるが、本発明に係る化合
物であるイミダゾールを添加した場合の吸光度の
変化量は、無添加のものに比べ著しく少なく、本
発明の方法によりヘモグロビンの分解に起因する
大幅な負誤差を回避できることを示している。溶血した血清中の鉄含量、不飽和鉄結合能或
は、例えばγ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ、ロイシンアミノペプチターゼ、シスチンアミ
ノペプチダーゼ、アルカリホスフアターゼ、コリ
ンエステラーゼなどの酸素活性を測定するにあた
り、本発明に係る化合物をこれらの測定試液中に
添加することにより、一般検体の測定値を変え
ず、溶血の影響を回避することができる。更に、本発明に係る化合物は、PH５〜12の範囲
に於て適当な酸との組み合わせで緩衝液としても
働き、特に別途の緩衝剤を必要としない場合もあ
る。このように、本発明は、本発明に係る化合物
である特定の含窒素化合物又はその塩の１種又は
２種以上を、従来使用してきた試液中に添加する
のみで、ヘモグロビンから鉄の溶出を防ぐととも
にその吸収の減少を抑え、臨床化学分析特に比色
分析に与える正負の誤差を回避することができ、
斯業に貢献するところ極めて大なるものがある。以下に実施例を示す。実施例１血清鉄の測定［緩衝液］酢酸リチウム2.77ｇ、ラウリル硫酸ナトリウム
５ｇ、イミダゾール0.3ｇを水80mlに溶解し、
HClでPH5.8とし、水で全量100mlとする。使用時
Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム200mgを加える。［発色液］バソフエナントロリンスルホン酸ナトリウム
0.1ｇを水10mlに溶解する。［測定方法］血清試料0.5mlに緩衝液1.5mlを加え、混合して
得た溶液の535nｍの吸光度を測定してこれを検
体盲検とし、次に該溶液に発色試液１滴を加えて
10分間放置後、再び試薬ブランクを対照に535n
ｍの吸光度を測定して、盲検値を差し引き検量線
と対比させて血清鉄濃度を算出する。比較例１血清鉄の測定［緩衝液］実施例１の組成からイミダゾールを除いたも
の。［発色液］実施例１に同じ。［測定方法］実施例１に同じ。参考例１血清鉄の測定（除蛋白法）［第１液］ 0.8N HCl（0.2％チオグリコール酸を含む。）［第２液］ 16％トリクロル酢酸［第３液］バソフエナントロリンスルホン酸ナトリウム
0.001M（酢酸ナトリウム９％、水酸化ナトリウム
6.5％）［測定方法］血清試料1.0mlに第１液1.0mlを加え混合後、水
浴（80〜95℃）で約２分間、加温する。さらに第
２液1.0mlを加え、15分間室温に放置後、15分間
遠心沈澱分離（2500r.p.m.）し、その上清1.5mlを
別の試験管にとる。これに第３液0.5mlを加えよ
く振盪し混合して、Bl（ブランク）を対照に535n
ｍの吸光度を測定し、検量線と対比させて血清鉄
濃度を算出する。実施例１、比較例１及び参考例１による血清鉄
の測定結果（＊印は溶血血清）を次表に示す。

【表】

【表】このように本発明に係る化合物であるイミダゾ
ールを添加することにより、一般検体測定値を変
えずに溶血による正誤差を回避して、除蛋白法と
よい相関を示す測定値が得られること、即ち、本
発明の方法を利用することにより正確に血清鉄の
測定を実施し得ることがわかる。実施例２ γ−グルタミルトランスペプチダーゼの測定［緩衝液］トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン1.21
ｇ、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム１
ｇ、トリトンＸ−100（ロームアンドハース社商品
名）２ｇ、グリシルグリシン0.53ｇ、イミダゾー
ル0.5ｇ、アジ化ナトリウム0.1ｇを水80mlに溶か
して、塩酸でPH8.4とし、水で全量100mlとする。［基質液］Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド285
mgを0.1N硫酸50mlに溶解する。［測定方法］血清試料50μに緩衝液2.0mlを加え、37℃で３
分間加温する。基質液0.5mlを加え、37℃で１分
間加温後、410nｍに於る吸光度の増加を測定し、
周知の方法によりγ−グルタミルトランスペプチ
ダーゼの活性値を算出する。比較例２ γ−グルタミルトランスペプチダーゼの測定［緩衝液］実施例２の組成からイミダゾールを除いたも
の。［基質液］実施例２に同じ。［測定方法］実施例２に同じ。実施例３ γ−グルタミルトランスペプチダーゼの測定［緩衝液］トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン1.21
ｇ、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム１
ｇ、トリエンＸ−100（ロームアンドハース社商品
名）２ｇ、グリシルグリシン0.53ｇ、１−メチル
イミダゾール0.5ｇ、アジ化ナトリウム0.1ｇを水
80mlに溶かして、塩酸でPH8.4とし、水で全量100
mlとする。［基質液］実施例２に同じ。［測定方法］実施例２に同じ。実施例４ γ−グルタミルトランスペプチダーゼの測定［緩衝液］トリヒドロキシメチルアミノメタン1.21ｇ、ラ
ウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム１ｇ、トリ
トンＸ−100（ロームアンドハース社商品名）２
ｇ、グリシルグリシン0.53ｇ、イミダゾール0.5
ｇ、アジ化ナトリウム0.1ｇを水80mlに溶かして、
塩酸でPH8.4とし、水で全量100mlとする。［基質液］実施例２に同じ。［測定方法］実施例２に同じ。実施例２、実施例３、実施例４及び比較例２に
よるγ−グルタミルトランスペプチダーゼの測定
結果を次表に示す。（＊印は溶血血清）

【表】

【表】このように本発明に係る化合物であるイミダゾ
ール、１−メチルイミダゾール又は３−ヒドロキ
シピリジンを添加することにより、一般検体測定
値を変えずに溶血による負誤差を回避できること
がわかる。また、ロイシンアミノペプチダーゼ、シスチン
アミノペプチダーゼ、アルカリホスフアターゼ、
コリンエステラーゼなどの酸素活性測定の場合
も、本発明の方法を利用することにより同様に一
般検体の測定値を変えず溶血の影響を回避するこ
とができる。実施例５不飽和鉄結合能測定（UIBC測定）に於る溶血
（ヘモグロビン）の影響［緩衝液］トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン1.21
ｇ、クエン酸210mg、ブリツジ35 １ｇ、１−メチ
ルイミダゾール0.5ｇ、又は硫酸第一鉄アンモニ
ウムをFeとして100μｇを水80mlに溶解し、塩酸
でPH8.6として、全量を水で100mlとする。使用
時、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム200mgを添加
する。［発色液］２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スル
ホプロピル）アミノフエノール0.1ｇを水10mlに
溶解する。［測定方法］試料溶液として、人血清100ml中にヘモグロビ
ンを各々200、400、600、800、1000mg／dl添加し
たものを用いる。試料溶液200μに上記鉄含有の緩衝液2.0mlを
加え、室温で15分間放置後、750nｍの吸光度で
測定する。次に発色試液を１滴加え混和し、室温
で15分間放置後、再び750nｍの吸光度を測定し、
検体盲検を差し引いて鉄の減少量を求めることに
より不飽和鉄結合能を求める。比較例３不飽和鉄結合能測定に於る溶血（ヘモグロビ
ン）の影響［緩衝液］実施例５の組成から１−メチルイミダゾールを
除いたもの。［発色液］実施例５に同じ。［測定方法］実施例５に同じ。実施例５又は比較例３による不飽和鉄結合能の
測定結果を次表に示す。

【表】このように、不飽和鉄結合能測定に於ても、本
発明に係る化合物である１−メチルイミダゾール
を添加することにより、容易に溶血（ヘモグロビ
ン）の影響を回避できることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、鉄の発色剤を含む緩衝液中に、(1)ヘ
モグロビン（500mg／dl）のみを添加した場合、
(2)ヘモグロビン（500mg／dl）及び血清を添加し
た場合、(3)血清のみを添加した場合、(4)ヘモグロ
ビン（500mg／dl）及びイミダゾールを添加した
場合の夫々に於るヘモグロビンの分解量とPHの関
係を表わしたもので、横軸はPHを、縦軸はFeの
溶出量（μｇ／dl）を夫々表わす。第２図はPH6.5に於るイミダゾール添加量とヘ
モグロビンの分解量の関係を表わしたもので、横
軸はイミダゾール添加量（％）を、縦軸はFeの
溶出量（μｇ／dl）を夫々表わす。（ヘモグロビ
ン500mg／dl水溶液を試料として用いる。）

Claims

【特許請求の範囲】１下記一般式、、、、、、、
、、及びから成る群より選ばれた１種又
は２種以上の含窒素化合物又は／及びその塩をヘ
モグロビンを含有する溶液中に共存させることを
特徴とする、ヘモグロビンの分解防止方法。ピリジン及びその誘導体（式中、Ａは水素原子、塩素原子又は−
CH₂OH基を表わし、Ｑは水素原子又は水酸基
を表わす。）ピリダジンイミダゾール及びその誘導体（式中、Ｅは水素原子、炭素数１〜４の低級ア
ルキル基又は
【式】基を表わし、Ｔは水素原子又は−CH₂CH₂NH₂基を
表わす。）ピラゾール１−フエニル−３−アルキル−５−ピラゾロ
ン（式中、Ｇは炭素数１〜４の低級アルキル基を
表わす。）４−アミノアンチピリン及びその誘導体（式中、Ｘ及びＹは夫々独立して炭素数１〜４
の低級アルキル基を表わし、Phはフエニル基
を表わす。）トリアゾールｏ−トリジン及びその誘導体（式中、Ｌ及びＭは夫々独立して炭素数１〜４
の低級アルキル基を表わす。）トリエタノールアミンＮ（CH₂CH₂OH）₃ ピペラジン及びその誘導体（式中、R¹及びR²は夫々独立して水素原子又
は炭素数１〜４の低級アルキル基を表わす。）チオ尿素２ヘモグロビンを含有する溶液が臨床化学分析
用試液である特許請求の範囲第１項に記載の方
法。３臨床化学分析用試液が、血清鉄、不飽和鉄結
合能、γ−グルタミルトランスペプチターゼ、ロ
イシンアミノペプチダーゼ、Ｌ−シスチンアミノ
トランスペプチターゼ、アルカリホスフアターゼ
又はコリンエステラーゼの分析用試液である特許
請求の範囲第２項に記載の方法。