JPH01127957A - 生物特異的親和反応を利用する均一検定法 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分野及び先行技術〕 本発明は、上述した型の均一検定法に関する。

本方法は、共有結合したランタニドキレートで標識した
反応剤と組み合わされた時間分解蛍光分光法（ｔｉｍｅ
−ｒｅａｏｌｖｅ４　ｆｌｕｏｒｅｓａｅｎｔ　ｓｐｅ
ｏｔｒｏ−ｇｏｏｐｙ）を利用する。ランタニドイオン
をキレート化するキレートの部分は「リガンド」と称さ
れる。標識した反応剤は、生物特異的親和反応（ｂｉｏ
ａｐｅｏｉｆｉａ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｒｅａｏｔｉｏ
ｎ　）に関与する。

本発明は、相互に生物特異的親和性をもつ広く異なった
型の反応剤の対に応用可能である。

通常この親和性は免疫型の親和性である；従って本発明
は、まず免疫化学検定法として説明される。勿論このこ
とは、例えば、タンパク質Ａ−Ｆｏ（ＩｇＧ）　、炭水
化物構造物−レクチン、Ｕ−免疫コンプレックス、Ｃ１
ｑ−免疫コンプレックス、ホルモン−レセプター等のよ
うな抗体−抗原（ハプテン）以外の反応剤の生物親和性
の対を使用することができないという意味ではない。

用語「免疫化学検定法」とは、物質がアナライトとその
免疫学的カウンターパートとの間の免疫反応を用いて検
出されるという意味である。

指示可能な基を有する免疫反応剤を利用することにより
、父系の反応剤を正しく調節することにより、該指示可
能な基が免疫反応の結果生じる抗原−抗体コンプレック
スの部分を形成し、かつコンプレックスを形成している
指示可能な基が反応媒質中存在するアナライトの尺度と
なることが可能である。イムノコンプレックスの形態か
又はその遊離の形態の指示可能な基を測定することによ
り、試料中のアナライトの量の尺度を得ることが可能で
ある。指示可能な基を備えることができる反応剤の例は
、抗原、ハプテン及び抗体である。マーカー基の蛍光性
が、免疫反応において標識した免疫反応剤の関与のため
の変化を受けることがある現象は周知である。蛍光免疫
学的試験の分野の中で、この現象は、一方では均−法、
又一方では非均一性の開発を促した。均−法は、反応媒
質中均−に分布されている標識した免疫反応剤からのマ
ーカー基の信号を測定することよりなる。この測定行程
は、コンプレックス中に存在しない標識した免疫反応剤
（＝遊離標識反応剤）かも、形成された免疫コンプレッ
クス中に存在する標識した免疫反応剤（＝結合型標識反
応剤）を物理的に分離することを先行させるものではな
い。非均一性の場合には、このような分離法がある。か
かる方法には種々の異なった反応及びインキュベーショ
ンの過程がなければならないことがあることは周知であ
る。これらの例は、免疫反応剤の同時添加（混合）又は
予め決められた順序でそれらを添加することである。特
に挙げるべきものは、アナライトと共通のエピトープを
有し、かつ検出可能な基を備えたアナライトアナローブ
が、アナライトの免疫学的カウンターパート上の十分で
ない数の結合部位について競合するようにされる抑制法
（１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　）（＝競合的
方法（ａｏｍｐｅｔｉｔ’ｉｖｅ　ｍｅｔｈｏｄ−）　
）である。常用の均−蛍光免疫法の分野においては、い
わゆるモジュレータ−１即ち、分析の改善される可能性
をもたらす何らかの方式で蛍光信号（ｆｌｕｏｒｅｓｏ
ｅｎｔ　ｓｉｇｎａｌ　）に作用する物質を用いること
が前に知られている（ホフマン及びジエイ、Ｃ１１ｎ、
　Ｃｈｅｍ、　３２　（１９８６）　１６７７〜８１及
びＵＳ−Ａ−４，６４０，８９８）。蛍光免疫学的方法
の全般的調査のためにはヘミレ、Ｉ　（ＣＣ１１ｎＳＣ
ｈｅ、　３１（１９８５）３５９〜７０）参照。

時間分解蛍光分光法と組合わされたランクニドキレート
は、最近の１０年の間に一般的に使用される免疫化学の
手段となった（ヘミレ、■前出）。分光及び量子化学の
データから、ランタニドイオンのうち、Ｄｙ　　Ｓｓｍ
　　ｓＴｂ　　及び５＋　。

Ｅｕ　　かイオン性蛍光を示すので最も適当であり、一
方Ｌａ５Ｇｄ　及びＬｕ’＋は、このような蛍光性を有
しないので全く不適当であると結論された。

予期される実用的利点に謹みて、用いられるランタニド
キレートは、１０μｓより長い崩壊時間をもつ遅延型蛍
光を示すことが一般にｙ■まれていた。不幸なことに、
利用できるランタニドは、免疫化学検定操作の場合に普
通である濃度範囲（＜１０　　Ｍ）でアナライトを検定
するのに有用であるには余りに低い安定性定数（ｌｉｔ
／ｍｏｌ　）を有する。既知の蛍光キレートの他の欠点
は、それらの蛍光が水（これは、勿論、免疫化学検定操
作において常に存在する）によって抑制されるという事
実である。この抑制は、ランクニドイオンが水分子を配
位する強い性能を有するので、吸収された光エネルギー
（励起エネルギー）は、蛍光として放出されず、溶媒に
移されるためである。すべての種類の蛍光法におけるよ
うに、ランクニドキレートからの蛍光信号も、広い範囲
にわたって変動する量で生物試料中に存在する多くの物
質によって影響される。この物質及びリガンドによって
、蛍光の半減期が延長又は短縮することがあり、又蛍光
の強度が増大又は減小する等のことがある。

非力−免疫化学検定の分野の中では、ＤＥＬＦＩＡ”検
定操作（ウオーラツク・オイ、データ、フィンランド）
がこの安定性の問題及び水の問題を解決している。現在
説明されているようなその形彌においては、ＤＥＬＦＩ
Ａ”は、免疫反応剤に共有結合されている非蛍光性ラン
タニド複合体を使用する。ＤＥＬＦＩＡ”操作において
は、ランタートイオンは、そのキレート形成リガンドか
ら放出され、（Ａ）界面活性剤、（ｂ）用いられるラン
タニドキレートがそれによって蛍光を生じるキレート形
成化合物及び（０）協力化合物（ｓｙｎａｒｇｉｓｔｉ
。

ａｏｍｐｏｕｎｄ　）よりなる展開剤（ｄｅｖｅｌｏｐ
ｅｒ　）と共に水性媒室中蛍光を示すようにされる。蛍
光の強度及び半減期は、アナライトだけではなく、その
外ｐＨ，界面活性剤、協力化合物及びキレート形成化合
物に依存する（なかんずくハｈヴアルソンら、Ｊ、　Ｃ
ｈｅｍ、　Ｐｈｙｓ、　４１　（１９６４）　１５７及
び２７５２頁、並びにヘミレら、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｏ
ｈｅｍ、　（１９８４）６３５〜３４３頁参照）。

現在までのデータでは、時間分解蛍光分光法及びランタ
ニドキレートを利用する均一免疫化学法を取扱う若干の
わずかな文献があるのみである。しかし、ランクニドイ
オンを取巻くリガンドの場は、蛍光の強度及び寿命に共
に影響することが示されている（フイリペスキュら、Ｊ
。

Ｐｈｙｓ、　Ｃｈｅｍ、　６Ｂ　（１９６４）　３３２
４　；クロスビーら、Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｐｈｙｓ、３４（
１９６１）７４３及びＪ、　Ｐｈｙｓ。

Ｃｈａｍ、　６６　（１９６２）　２４９３　；並びに
レヴグレンら、　Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ｉｎ　Ｉｍ
ｍｕｎｏａａｓａｙｓ　、コリンスｗｐ編、ジョーン・
ウィリー・アンド・サンズ、チチェスター（１９８５）
２０３　）。従って、均−免疫化学法中マーカー基とし
て用いられる蛍光性ランタニドキレートの物理的性質は
、免疫反応の結果として生じる変化を潜在的に受けるこ
とが予期されてよい。ランタニドイオンを取巻くリガン
ドの場がエネルギー吸収の変化をもたらす時には、エネ
ルギーの移動及び放出に関係する性質に対する効果を予
想することができる。

このことは、ランタニドイオン蛍光の強度及び寿命（半
減期）に影響する。本発明者らは前に、均−法において
マーカー基としてユーロピウム＊ｉキレートを用いる際
若干の成功を収めているので、前述した仮定が正しいこ
とを示した（ソイニＥ、ら、ＵＳ−Ａ−４，５８ス２２
６）。その場合本発明者らは、インシュリンに共有結合
されたキレート形成リガンド（免疫反応剤）を使用し、
このものは、光エネルギーを吸収しキレート型ランタニ
ドイオンに移動させることができないが、きわめて安定
なランタニドキレートを形成する型のリガンドであった
。かくして、共有結合されたりガントプラスランクニド
イオン（Ｅｕ）のキレートは、光エネルギーを吸収しラ
ンタニドイオンに移動させることができる別のリガンド
が存在する場合にのみ蛍光を示した。時間分解蛍光分光
法に関連して均一技術を利用する市販製品の形態のこの
型のランタニドキレートを提供することはまだ可能では
なかった。

ＥＰ−Ａ−１９５，１４３（例１９．６２〜３３頁、並
びに特許請求の範囲２０）は、蛍光性ランタニドキレー
トを用いる均一免疫化学法を記載している。このテキス
トからは、供給源が時間分解蛍光分光法に関係している
かどうかは明らかでない。該実施例は、いずれの普通の
試料中にも存在していてもよいようなすべての妨害成分
の不存在下に実施されたモデル実験に過ぎない。

ソイニらの明細書（ＵＳ−Ａ−４，３７４，６２０）に
おいては、ランタニドキレート標識反応剤とその免疫学
的カウンターパートとの間の免疫反応が蛍光信号に影響
することがあるという一実験的支持はないが−ある仮説
がある。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、本明細貫の導入部において述べた型の
改良均質免疫化学検定を提供することである。本発明を
利用すると、ｉＸｌｏＭより低いアナライト濃度を決定
する場合時間分解蛍光分光法を使用することができる。

不発明の１主要局面によれば、意図された技術分野内で
ランタニドキレートを安定化させる方法が提供されるの
で、アナライトのみが測定可能な遅延型蛍光に影響する
。かくして、この面は、生物試料中に存在する多数の均
質によって出されることがある蛍光に対する負の効果の
中和を包含する。本発明の少なくとも１局面によれば、
ランクニドキレートからの蛍光を水が消光させる（ｑｕ
ｅ−ｎｃｈ）ことを防止する方法が提供される。

発　　明 本発明は、実質的に２つの％敵を有する：（１）　　免
疫反応剤に共有結合されているリガンドは、キレート型
ランクニドイオンに伝達することができる光エネルギー
を吸収することができるべきである（該イオンがその特
性的イオン性蛍光を示すことができるように）。

（１）　　アナライト含有試料から由来しない１種又は
それ以上の蛍光をモジュレータする物質（モジュレータ
−１例えば、タンパク又は界面活性剤）を、生物試料中
変動する値で存在する蛍光に影響する物質によって測定
可能な蛍光が影響されないような量で、又そのような型
のものとして反応媒質に添加しなければならない。その
結果、実際に測定される蛍光は、反応媒質中の、従って
又試料中のアナライトの濃度の実用上の純関数となる。

用語「反応媒質」とは、免疫反応及び蛍光検定が実施さ
れる媒質をいう。添加されろモジュレータ−及びアナラ
イトの外に（試料から集められるその他の物質に関連し
て）、媒質は、標識した免疫反応剤（それはアナライト
アナローブ又はアナライトに対して向けられた抗体であ
ってよい）、緩衝成分等を含有する。免疫反応によって
おこさせる潜在的な蛍光抑制を更に増大させるために、
添加される免疫反応剤の１つは、重金属（例えば鋼又は
クロムイオン）のキレートのような適当なエネルギーア
クセプターを備えていてよい。

ランタニドキレート ランタニドイオン：上述したとおりこれらのイオンは、
Ｅｕ　　Ｓ８ｍ　　ｓＴｂ　　及びＤｙ　　から選択さ
れる。

リガンド：マーカー基としてのランタニドキレートの大
きい潜在性に鑑みて、近年多数の化合物に関する情報が
刊行されている。これら化合物は、前に用いられたベー
タージケトン類に代えて使用することができることが論
じられている。種々の化合物の構造をそれらの光エネル
ギーを吸収しキレート型ランタニドイオンに移動させる
能力に相関せる試みがなされている。どの種類のリガン
ドの改変でも〜又免疫反応剤へのそれらのカップリング
も、明らかに蛍光に影響しやすいために、結果はいくら
かあいまいである。その結果ある化合物が適当であるか
どうかを決定するのに実験的な試みが常に必要である。

分光法の見地からは、リガンドは、２５０〜３９０　ｎ
ｍ　、望ましくは３００〜３５０　ｎｍの範囲の波長に
おいて励起エネルギーを吸収する芳香族構造を含有する
べきであることが見出されている。リガンドは、ランタ
ニドイオンの発光レベルより十分上に励起トリプレット
レベルを有すべきである。能率のよいエネルギー移動の
ために、この芳香族構造は、窒素（例えば、ピリジン−
Ｎ又は芳香族アミン（Ａｒ−ＮＨｚ　）又は酸素（例え
ば、フラン−〇又はフェノール性ヒドロキシル）のよう
なヘテロ原子を有すべきである。

かくして、ヘテロ原子は、芳香族環又は２慮又は３重結
合の共役系の部分であるか、又はそれに直接結合してい
てよい。同時に、次に５又は６員環が形成されるように
、該最初に示したヘテロ原子の１つと共にランタニドイ
オンをキレートすることができる別のへテロ原子がある
べきである。リガンドは、少なくとも６、そして好適に
は少なくとも８又は９のこのようなキレート形成へテロ
原子を有さなければならず、これらは、酸素（例えば、
カルボキシル、スルホネート、ホスフェート、ホスホネ
ート、エーテル、−Ｎ−０、Ｃ−〇）、窒素（例えば、
−級、二級又は三級アミン）、燐（例えば、ホスフィン
又はホスフィンオキシト）及び硫黄（例えば、Ｃ＝８）
のうちから選択されてよい。間↓の構造を有する化合物
及び櫨〆の生物活性化合′吻へのそれらの共有カップリ
ングは、いくつかの特許刊行物及び科学論文に記載され
ている（トラヴエノールーゲネンテク、ダイアグノステ
イクス、ＥＰ−Ａ−１９５，４ｊ　３　；　Ｈ８Ｃリサ
ーチ・デベロップメント・コーポレーション、ＥＰ−Ａ
−１７１９７８；カンカレら、ＢＰ−Ａ−２０へ０４７
；ヒンジヨーら、ＥＰ−Ａ−＋５’８，８７５　；マチ
ス、Ｇら、ＦＲ−Ａ−２，５７０，７０３；並びにベイ
レーら、Ａｎａｌｙｓｔ　１１０（１９８５）６０３〜
４）。特定の群の化合物の例として、それらの３−１４
−又は５−位中置換エチニル基を有し、又２−及び（又
は）６−位上の置換分が、ランタニドイオンと共に、上
に挙げた５−又は６員環を形成するため、ピリジン窒素
から適当な距離においてキレート形成へテロ原子よりな
る２、６−ジ置換ピリジンのようなピリジン類を挙げる
ことができる。その他の例は、本明細書の一部分を構成
する添付特許請求の範囲に含まれている。多くの場合に
は、免疫反応剤へのりガントの複合は、複合体が免疫反
応剤と前記の芳香族環又はこの環に共役しているパイ電
子系との間の少なくとも５つの炭素原子の連鎖よりなる
ようなものであることが重要な重要件である。

モジュレータ− 本発明は、蛍光をモジュレータする物質（モジュレータ
−）が共有結合標識として用いられる蛍光性ランタニド
キレートを安定化しかつ保護するので、ランタニドの蛍
光がアナライトの濃度にのみ依存するという概念を基に
している。

アナライト以外の試料の成分の変動の効果は無視できる
ようになる。

モジュレータ−の量は、試料からの蛍光に影響する物質
の（変動する）量より機能的過剰であるべきである。と
いうのは添加されるモジュレータ−がこのような他の物
質がランタニドキレートに結合し、かくして蛍光信号に
影響するのを、効率よく防止するべきであるということ
にある。しかし、モジュレータ−の過剰が余りに大きい
と、蛍光が実際上アナライトの濃度に無関係であるよう
になるという結果を生じることがあることが挙げられる
べきである。濃度の至適条件は、なかんずモジュレータ
−及びランタニドキレートの相互間の、又標識免疫反応
剤及びその免疫学的カウンターパートの相互間の親和性
定数に依存する。この至適条件は、普通リットルあたり
０１〜１０７のモジュレータ−の０度範囲で見出すこと
ができる。

上西己のことから、モジュレータ−とキレート形成リガ
ンドとの間の共同作業は複雑であることが明らかである
。従って異なったモジュレータ−及びモジュレータ−濃
度を用いる予備実験が至適条件を決定するために必要で
ある。不明細書の実験の部参照。

本発明者らが現在までに行なった実験においては、遊離
の標識免疫反応剤からの蛍光強度を増強するモジュレー
タ−を使用することが好適であった。通常免疫反応は、
次に蛍光の派別を招来し、かくしてこの型のモジュレー
タ−は、遊離標識反応剤の量を測定する可能性を生じて
いる。標識された反応剤がアナライトと共通のエピトー
プを有するアナライトアナローブである場合には、又そ
の量がエピトープに対して向けられる免疫学的カウンタ
ーパートについて競合しなければならないように選ばれ
る（即ち、十分でない量のカウンターパート）場合には
、アナライト濃度の増大が蛍光の増強を生じる。

本発明の他の実施の態様においては、蛍光を減小させる
モジュレータ−を選択することが可能であることがある
。

適当なモジュレータ−の例は、タンパク質、並びに界面
活性剤のような高分子物質である。

タンパク質が、特に低分子化合物の場合には、芳香族構
造に結合することができるという事実は周知である。そ
の例としてはアルブミンおよびグロブリンがある。タン
パク質のランタニドキレートとの結合は、好適には非免
疫化学的性質のものであるべきであるが、このことは必
須のことではない。ここで重要なことは、タンパク質が
利用されるべきアナライトのエピトープに余り強く結合
してはならないということである。

血清試料は大量のアルブミンを含有しているという事実
に鑑みて、添加されるアルブミンの濃度は、試料からの
アルブミンの濃度の２〜１０倍より高いことが、アにプ
ミンをモジュレータ−として用いられる場合、一般に血
清試料に対する重要件であり、絶対量は、反応媒質が試
料と混合される時に試料が希釈される程度に依存する。

当該技術熟練者に役に立つことは、血清中の全タン／（
り質含攪が４〜７％であるという知見である。

界面活性剤は、疎水性末端及び親水性末端を有する化合
物である。それらは表面張力を低下させ、十分高濃度で
存在する時には、ミセルを形成する。本発明においてモ
ジュレータ−として使用される界面活性剤は、非イオン
系又はイオン系（陰イオン系、陽イオン系及び両性のも
の）の中で選択されてよい。それらの分子１１は、１０
００又は５０００ダルトンを超えていてもよい。

高分子界面活性剤は、より有効に水の消光効果（ｑｕｅ
ｎｃｈｉｎｇ　ｅｆｆｅｏｔ　）を防止しうろことであ
る。

界面活性剤の濃度は、ミセル形成の臨界濃度を超えるこ
とが実用的であることが多い。

試　　料 本発明の背景から使用することができる試料は、普通免
疫化学検定において使用されるものと同じである。例と
して尿、血清、Ｃ３Ｆ（シアニド感受性因子）、リンパ
液等を挙げることができる。本発明の最大の利点が、大
量かつ大きく変動するタンパクを含有する試料、例えば
血清及び血しようの場合に得られる。

反応媒質への他の添加物 反応媒質の…は、免疫化学検定において普通用いられる
ような範囲内である。余シに低い−は、ランタニドキレ
ートの解離をおこす傾同があるので避けるべきである。

実際上は、声は６〜９の範囲にあるべきである。当該技
術熟練者は、用いられるべき抗原−抗体の対について、
又ある系の螢光がどのように声によって影響されるかに
関して至適の困の選び方を知っている。

反応媒質は、それ自体既知の方式で至適…に緩衝化され
る。キレート形成リガンドを除き、強いコンプレックス
形成剤は、標識された反応剤からランタニドイオンの解
離を促進するので避けるべきである。

アナライト 本発明は、生物特異的親和反応に関与することができる
生物活性有機化合物のいずれの知見に対しても潜在的に
応用することができる。現在まで得られた結果は、本発
明は、へブテンその他の低分子物質、例えば５０００ダ
ルトンより低い分子量を有するものに対して最も適当で
あることが示されている。例は、例えばステロイドのよ
うに、非ペプチド構造を有することが多いホルモンであ
る。抗原及びハプテンに対して競合技術を用いる仁とが
好適である。特に１０−４モル／リットルより低いアナ
ライト赤度の場合に大きな利点が得られる。

ＤＥＬＦＩＡの方法論とは異なシ、本発明によシ２種又
はそれ以上のアナライトの非分離同時検定が可能となる
。この型の実施の態様においては、異なった励起又は発
光波長極大を有するランタニドキレートが共有結合標識
として使用される。

本発明は、添付特許請求の範囲によって定義され、いく
つかの最も好適な実施の態様の非限定的実施例を用いて
例示される。得られる化合物の構造は別の頁に記載され
ている。螢光測定はすべて、時間分解原理に従って行な
われた。

例　　１ 活性化チロキシンの製造 スペリン酸のチロキシンとのモノアミドの活性化Ｎ−ヒ
ドロキシフ八へ酸イミドエステルをつ＜シ、螢光性キレ
ートの種々のアミノ誘導体とカップリングさせた。ジサ
クシンイミジルス（レートを、既知の方法（アンダーソ
ンら、Ｊ。

Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　８６（１９６４）１８３９
〜４２、ピルチ及びチエツク、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ
ｅｍ、　２５４（ｊ９７９）３３７５〜８０）に従って
乾燥ジオキチン中Ｎ、Ｎ’−ジクロロへキシルカルボジ
イミドの存在下にスペリン酸及びＮ−ヒドロキシコハク
酸イミドからつくったウアセトンージエチルエーテル中
結晶化させると白色固体（ｍｐ１５９℃）が得られた。

得られた生成物、ジサクシンイミジルスベレートは、次
に乾燥アセトン中、かつトリエチルアミンの存在下にチ
ロキシンと反応させて所望のＮ−ヒドロキシコハク酸イ
ミドエステル（＝活性化チロキシン）を生成させた。

ＩＨ−ＮＭＲ、４００ＭＨｚ　ＳＤＭＦ３０−ｄ６：　
ｊ、０５〜２．０５　（ｍ　、　１０Ｉ（）、２．５９
　（ｓ　、Ｉ　Ｈ）、２．６２　（ｔ　、２Ｈ）、２．
８１（ｓ、４Ｈ）、３．０６（ｄｄ、２Ｈ）、７．０５
（ｓ　ｐ　２Ｈ）、７．７４（Ｓ　、２Ｈ）。

例　　２ 活性化トリヨードチロキシン（Ｔ３）の製造スペリン酸
のトリョードチロニンとのモノアミドのＮ−ヒドロキシ
コへり酸イミドエステル（Ｔ３）を、チロキシンに関し
て説明されたのと類縁の方式で製造した。

例　　３ ステロイドの活性化 コーチゾール及びプロゲステロンからカルボン酸誘導体
のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルを、乾燥アセ
トン中核カルボン酸誘導体とＮ−ヒドロキシコハク酸イ
ミドとの縮合によって得られるが、用いられた縮合剤は
Ｎ、Ｎ’−ジシクロシクロへキシルカルボジイミドであ
った。

カルボン酸誘導体、即ちコーチゾール−３−（０−力ル
ボキシメチル）オキシム及びプロゲステロン−３−（０
−カルボキンメチル）オキシドは、中間体としてり−（
Ｎ−ピロリジル）エナミンを用いて製造された（シャツ
スキーら、５ｔｅｒｏｉｄｓ　２３　（１９７３）、４
９〜６１）。

例　　４ プロゲステロンの標識化 例３からの活性化プロゲステロンを、水−ジオキサン溶
液中リガンド（Ｖ）　（Ｅｕｓ＋　でキレート化）にカ
ップリングさせた。２０°Ｃにおいて５時間撹拌後、生
成物（■）は、アセトンを用いて沈殿させ、ＴＬＣ（溶
離剤としてアセトニトリル−水、４　：　１ｖ／ｖ　）
を用いて精製することができた。

同様にしてリガンド（ｎ）のＴｂ５＋　キレートをプロ
ゲステロンにカップリングさせて俣合体（ＩＸ）を生成
させた。精製は、ＴＬＣ（アセトニトリル−水、４　：
　１ｖ／ｖ　）を用いて行なった。

例　　５ コーチゾールの標識化 例３からの活性化コーチゾールを、リガンド（Ｖ）のＥ
ｕ５＋　キレートとカップリングさせた。

カップリングはジオキサン−水中で実施し、次に生成物
（Ｘ）はＴＬＣを用いて精製された。

同様にしてリガンド（■）のＥｕ’＋　キレートを例３
からの活性化コーチゾールにカップリングさせ、再び同
様にしてリガンドＭのＥｕ５＋　キレートをコーチゾー
ル−２１−ヘミサクシネートにカップリングさせた。得
られた生成物は、夫夫（ＸＩ）及び（ＸＩＩ）であった
。

例　　６ チロキシンの標識化 例１から活性チロキシンをジオキサン−水中でリガンド
（Ｖ）のＥｕ５＋　キレートにカップリングさせ、その
際生成物（ｘｍ）は、ＴＬＣを用いて精製することがで
きた。同様にしてリガンド（Ｉ）のＴｂ３＋キレートを
カップリングさせて生成物（ＸＩＶ）を得た。

例　　７ トリヨードチロニン（Ｔｂ）の標識化 例２からの活性化Ｔ３を、チロキシンについて説明され
たものと同じ方法に従ってリガンドＭのＥｕ３＋キレー
トにカップリングさせた。生成物（ＸＶ）は、ＴＬＣを
用いて精製された。

例　　８ 得られた標識した化合物の相対螢光 標識した化合物の螢光出力に対するタンパク及び界面活
性剤の効果を緩山液（５０ミＩＪモル／リットル　トリ
ス−ＨＣｌ　、　　ｐＨ７，７５，９，９／リットルの
Ｎａ（Ｊ及び０．５１１／リツトルのＮａＮ３含有）中
試藺した。結果は表■にｉし載されている。界面活性剤
の外に、相対螢光Ｋ　２　響する他の因子は、用いられ
る綴衝化イオン及び退はれる…である。

タンパク質は、それらの効果が比較的強力であシ、他の
モジュレータ−の効果を容易に超えることがある故に、
この背景からきわめて特殊なものである。従って、例え
ば血しよう、血清、尿素及び同様の試料中アナライトに
ついての検定の場合のように、系がタン白質を含有する
場合には、螢光信号のモジュレーシヨンは好適にはタン
パク質を用いて実施される。

例　　９ 複合体の螢光に対するタンパク質濃度の効果タンパク質
濃度の関数としての複合体（Ｘ）、ＣＸｍ’）　、（Ｘ
ＩＶ）及び（Ｗ）における螢光の増大を図１に示す。複
合体は、添加されたタン白質に対して異なった程度の親
和性を示したが、０．５〜２％（Ｗ／Ｖ　）の世がほぼ
最大の分光を生じるのに十分であった。

例　　１０ 標識したチロキシン（ＸＩＩＩ）からの螢光に対するモ
ノクローナル抗チロキシン抗体の抑制効果モノクローナ
ル抗チロキシン抗体を涼識したチロキシン０ＧＴＩ）と
共にインキュベートし、インキュベーションは、コへり
酸緩衝液（０，１モル／リットル、ｐＨ６，ｏ）中２％
ＢＳＡ　（ｗ／ｖ）の存在下に行なった。抗体は、第２
図に示すとおり螢光の抑制をおこした。

例　　１１ チロキシンの用黛−反応曲線 緩衝系及び標識したチロキシンは例１０の場合と同じで
あった。抗体が螢光強度の８０％を抑制するような計の
抗チロキシン抗体を使用した。正常ヒト血清中希釈した
標準２０μ／（０，１０，５０，１００，５００及び１
０００ｎモル／リットル）（Ｔ４を含まない）を、抗体
を含有する検定緩衝液２００μｌ（サクシネート、０．
１モル／リットルｄｉ　６．０．０．９％のＮａＣｌ（
ｗ／ｖ）　、０．２％のメルチオネート、５ｎモル／リ
ットルのＥｕ）＋標識チロキシン及び２％のＢＳＡ　（
ｗ／ｖ）を含有する）に添加した。添加したチロキシン
の関数としての螢光の強度の変化を、＋２０°Ｃにおい
てインキュベーション３０分後に測定した。用量−反応
曲線、第３図参照。

例　　１２ トリョードチロニンの用量−反応曲線 例１１に記載したのと同様にして、トリョードチロニン
について用量−反応曲線をつくることができた。緩衝液
（０，１Ｍサクシネート、−６，０，２％のＢＳＡ、０
．２％のチオメルサール、２％のグリセロールを含有す
る）２００μＪ、１ｎＭのＥｕ’十標識トリョードチロ
ニン（ＸＶ）及び多クローン性抗Ｔ３抗体を、Ｔ５４ａ
準２０μｌと共にインキュベートした。インキュベーシ
ョンを、室温において１時間進行させた。添加したＴ３
の虚の関数として螢光の強度を測定することによって用
は一反応曲線をつくることができた。

例　　１６ コーチゾールの用量−反応曲線 Ｔ４及びＴ３を用いるｔｌｉｌの例とｔｕＨの方式で、
Ｅｕ５＋　ＩＪＩ合体（Ｘ）　、（ＸＩ）及び（ＸＩ［
）を介してコーチゾールについて、均−系の場合の用量
−反応曲線をつくった。用いた緩衝系は次のとお勺であ
った：　トリス−ａｃｒｅ　ＭＵ液、５ミリモル／リッ
トル、…乙７５．９．Ｆ／リットルのＮａＣ１、０，５
１／リツトルのＮａＮ５及び５ｇ／リットルのＢＳＡを
含有する、或いはフタレート慢衝液、０．１モル／リッ
トル、ｐＨ５，５，９Ｉｉ／リツトルのＮａＣｌ及び５
１１／　’ＪットルのＢＳＡを含有する。Ｅｕ５＋標識
コーチゾールの濃度は、１〜１０ｎモル／リットルの間
で変動した。インキュは−ション＋２０°Ｃにおいて１
５〜２０分間。

例　　１４ Ｃｕ２＋及びＣｒｓ＋　による抗Ｔ４抗体の標、’（２
Ｊ化２官能性キレート形成試架、ｐ−インシアネートベ
ンジル−〇ＴＴＡを用いてｔ、７　ｆ＃ｔ、た抗Ｔ４Ｉ
ｇＧを夫々Ｃｕ２＋又はＣｒ’十で椋賀した（更にＥＰ
−Ａ−１５９，６７６ｔ）照）ｏｅ＞＝ｓ化は、Ｃｕ２
＋　又はＣｒ３＋でキレートを形成した試薬１００倍モ
ル過剰を用いて炭酸緩衝液、５０ミリモル／リットル、
ｐＨ９，８中実施された。標識した抗体は、ゲルｐ過（
セファデックスＧ５０．１．５Ｘ５０α）を用いて出発
物質から精製された。

例　　１５ Ｃｕ２＋又はＣｒＡ＋へのエネルギー移動を用いる標識
したチロキシンからの螢光の抑制 アナライトへの抗体結合のための螢光の抑制は、適当な
エネルギーアクセプター、例えば抗体に結合した重金属
を介して増強することができた。螢光の増大は、Ｅｕ３
＋ｌＪ識Ｔ４を、他のタン白を何も含有しない砂衝液中
非標、熾抗体で滴定にかけた時観察することができた（
図５）。

この増大は、Ｃｒｓ＋標識又はＣｕ、２＋ｔ’Ｊ　減抗
体を用いた場合部分的に抑えることができた（第５図）
。

例　　１６ 尿中エストロン−３−グルクロニドの検定優先権の年の
間に本発明はこのアナライトに応用された。モジュレー
タｍ：ＢＳＡ　５９／リツトル。

図面の説明 第１図：タン・ξり質濃度（ＢＳＡ）の関数としての若
干のＥｕ３＋及びＴｂ３＋で標識した生物活性化合物の
螢光。試験した複合体は、Ｅｕ３＋　標識コーチゾール
（Ｘ）　（０）、Ｅｕ３＋漂Ｍ　Ｔ４　（＞皿）（ロ）
、Ｔｂ３＋標識Ｔ４（ＸｉＶ）（冒）、並びにＥ＋１３
＋　標’ｆ２　Ｔ３（ＸＶ）（・）であった。複合体の
濃度は約１０ｎモル／リットルであった。

第２図：抗Ｔ４抗体希釈曲線。抗Ｔ４抗体洗よるＥｕ３
＋標識Ｔ４　（Ｘｍ）の滴定によって得られた抑制。滴
定は、コハク酸緩衝液（０，１モルフ／リット〜ル、ｐ
Ｈ６，０，１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡの存在下行なわれた
。

第６図：均−Ｔ４ＴＲ−ＦＩＡ　　（−時間分解螢光免
疫検定）の用量−反応曲線。

第４図：均−Ｔ３ＴＲ−ＦＩＡの用量−反応曲線。

第５図：タンパク質を含有しない緩衝液中Ｅｕ”標識Ｔ
４　（Ｘ［Ｉ）からの螢光に対する非凛識（・）、Ｃｕ
２＋標識（０）及びＣｒｓ＋標識（△）抗体の効果。

化合物（Ｉ）ないしく■） Ｉ　　　　　ＨＣ０ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２ＩＩ　　　
　ＨＣＨ２ＣＨ２ ＩＩＩ　　　　ＮＨ２Ｈ ＩＶ　　　　ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ Ｖ　　　　ＮＨ２Ｃ０ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２ＶＩ　　　　
ＮＨ２Ｃ０ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２
ＮＨ２Ｖ［Ｉ　　　　ＯＨＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２

【図面の簡単な説明】

第１図はタンパク質濃度（ＢＳＡ）の関数としての若干
のＥｕｓ＋及びＴｂ３＋で標識した生物活性化合物の螢
光を示すもので、試験した複合体は、Ｅｕ”標識コーチ
ソール（Ｘ）（０）、Ｅｕ３＋標識Ｔ４（ＸＩＩＩ）　
（ロ）、Ｔｂ３＋標識Ｔ４（ＸｒＶ）　（■）、並ヒニ
Ｅｕ３＋　標識Ｔ５　（ＸＶ）　（・）であった。複合
体の濃度ハ約１０　ｎモル／リットルであった。 第２図は抗Ｔ４抗体希釈曲線を示す。抗Ｔ４抗体による
Ｅｕ３＋標識Ｔ４（Ｘｍ）の滴定によって得られた抑制
を示すもので滴定は、コハク酸緩衝液（０，１モル／リ
ットル、ｐＨ６，０，１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡの存在下
行なわれた。 第３図は均−Ｔａ　ＴＲ−ＦＩＡ　（−時間分解螢光免
疫検定）の用量−反応曲線を示す。 第４図は均−Ｔｓ　ＴＲ−ＦＩＡの用量−反応曲線を示
す。 第５図はタンパク貿を含有しない緩衝夜中Ｅｕｓ＋標識
Ｔ　ａ　（Ｘｍ）からの螢光に対する非標識（’）、Ｃ
ｕ２＋標識（０）及びＣｒ５＋標識（△）抗体の効果を
示す。 特許出願人　　ヴ　ア　ラ　り　・　オ　イ外２名 ＦＩＧ、３ ０００ｎ／ｌ ＦＩＧ、５ １ｏｇ　ｃｐｓ μ９ 抗−Ｔ４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）水性反応媒質中時間分解蛍光分光法を用い、かつラ
   ンタニドキレートで標識された生物特異的親和性反応剤
   によって実施され、イオン性蛍光を示すランタニドイオ
   ンが反応剤に共有結合されているリガンドによってキレ
   ートが形成される、生物試料中の物質（アナライト）の
   含量を決定する均一生物特異性親和検定法であって、ラ
   ンタニドイオン及び共有結合しているリガンドによって
   形成されたランタニドリガンドが蛍光を示すこと、並び
   に媒質から測定されるランタニド蛍光がその中のアナラ
   イトの濃度の実用上の純関数になるようにランタニドキ
   レートを安定化させるモジュレーターが添加されること
   を特徴とする方法。 ２）検定されるアナライトが反応媒質中１０＾−＾４Ｍ
   より低い濃度を有する請求項１記載の方法。 ３）ランタニドキレートがＥｕ＾３＾＋、Ｔｂ＾３＾＋
   、Ｓｍ＾３＾＋又はＤｙ＾３＾＋であり、又キレートの
   キレート形成リガンドが遊離電子対を有するヘテロ原子
   を含有する構造を有し、該ヘテロ原子が窒素、酸素、燐
   、硫黄よりなる群から選択され、かつ遊離電子対がパイ
   結合の共役系に非局在化されることができる請求項１又
   は２記載の方法。 ４）モジュレーターがグロブリン又はアルブミンのよう
   なタンパク質である請求項１〜３のいずれか記載の方法
   。 ５）モジュレーターがアルブミンである請求項１〜４の
   いずれか記載の方法。 ６）モジュレーターが陰イオン系、陽イオン系、中性及
   び両性界面活性剤よりなる群から選択される界面活性剤
   である請求項１〜５のいずれか記載の方法。 ７）選ばれるモジュレーターがキレートを水の配位に対
   して安定化し、それによって蛍光を増強する請求項１〜
   ６のいずれか記載の方法。 ８）選ばれるモジュレーターが、該アナライトが存在し
   て検定されるべき試料中に変動する量で存在する、蛍光
   に影響する物質に対してキレートを安定化するようなも
   のである請求項１〜７のいずれか記載の方法。 ９）蛍光ランタニドキレートで標識した反応剤がハプテ
   ンである請求項１〜８のいずれか記載の方法。