JP4819223B2 - 発光マーカーとして使用するためのフタルアミド−ランタニド錯体 - Google Patents

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Description

【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、1999年2月18日に出願されたアメリカ合衆国仮特許出願シリアル番号第60/120,881号の優先権を主張する。本出願はまた、1999年2月18日に出願されたアメリカ合衆国仮特許出願シリアル番号第60/120,600号と、それと同じ日に出願されて弁理士ドケットの番号02307V-093310USを有するアメリカ合衆国仮特許出願シリアル番号第 にも関係している。これら明細書それぞれの全体が、参考としてこの明細書に実際上組み込まれている。
【０００２】
連邦政府の支援を受けた研究開発としてなされた発明に対する権利の宣言
この仕事の一部は、アメリカ合衆国国立衛生研究所（DK32999）およびアメリカ合衆国エネルギー局（DEAK0376F00098）からの資金援助を受けた。アメリカ合衆国政府は、この明細書に開示されているテーマに関する権利を持つことができる。
発明の背景
研究および診断用混合物に含まれる分析物としての化学物質、生化学物質、生物物質を検出して定量化するための迅速で極めて特異的な方法が、これまでも要求されてきたし、現在もますます要求されるようになっている。特に価値のある方法は、少量の核酸、ペプチド、調合薬、代謝産物、微生物や、診断上意味のあるその他の物質を測定するための方法である。そうした物質の具体例としては、小分子生物活性物質（例えば、麻薬や毒物、治療目的で投与される薬物、ホルモン）、病原性微生物、ウイルス、抗体、酵素、核酸などがあるが、これらのうち、特に病気に関係するものが挙げられる。
【０００３】
個々の分析物が存在していることは、多くの生化学系および生物系を特徴づけている高度な特異性を利用した結合方法によって確認できることがしばしばある。頻繁に利用される方法は、例えば、抗原−抗体系、核酸ハイブリダイゼーション技術、タンパク質−リガンド系に基づいている。これらの方法では、診断上の価値がある錯体の存在は、一般に、相互作用する１つ以上の物質に結合させた観察可能な“標識”の存在または不在によって示される。選択した特異的標識法によって、興味の対象である分析物を検出するための特定の系が有効かつ万能であることが明らかになることがしばしばある。好ましい標識は、安価かつ安全であり、幅広い化学物質、生化学物質、生物物質に対し、これら物質の重要な結合特性を大きく変えることなく効率的に結合させることができる。標識は、極めて特徴的な信号を発するべきであり、自然界にはほとんど存在していないもの、好ましくはまったく存在していないものでなくてはならない。標識は、数ヶ月の時間スケールにわたって水性系において安定かつ検出可能なものでなくてはならない。標識の検出は、迅速になされ、感度がよく、再現性があり、高価で特殊な設備や従事者を保護するための特別な注意を必要としないことが好ましい。標識の定量化は、分析する混合物の温度や組成といった変数には比較的影響されないことが好ましい。
【０００４】
さまざまな標識がこれまでに開発されており、そのそれぞれに特有の利点と欠点がある。例えば、放射性標識は極めて万能で、非常に低濃度でも検出することができる。しかし、そうした標識は高価で害をもたらすため、使用にあたっては洗練された装置と訓練を受けた従事者を必要とする。したがって、非放射性標識、中でも分光法、スピン共鳴法、発光法で観測できる非放射性標識や、そうした標識分子を産生する酵素などの反応性物質が大いに注目されている。
【０００５】
発光分光法で検出可能な標識は特に興味深い。というのも、そうした標識が従来技術において多数知られているからである。さらに、文献には、誘導化して他の分子に容易に結合させることのできる発光標識の合成法を多数見つけることができる。しかもそうした発光標識は市販されてもいる。
【０００６】
多くの発光標識は、直接検出できるだけでなく、隣接する二次的発光ラベルの発光を消滅させるようにも機能する。発光化学種の発光消滅は、クエンチャーと発光体の間の距離と相互作用の大きさに依存するため、分子の立体配置および結合や、他の相互作用の高感度プローブとなる。レポーターとクエンチャーのペアを利用した優れた具体例は、核酸の検出と分析において見られる。
【０００７】
別の検出法は時間分解発光測定法であり、この方法は理論上は放射能写真撮影法よりも高感度である。この方法では、放射能の寿命が長いキレート化したランタニド金属を、興味の対象となる分子に結合させる。パルス励起とゲート式検出系を組み合わせると、寿命の短い背景放射からの効果的な識別が可能になる。例えばこの方法を用いると、ユーロピウムで標識した抗体を通じてDNAハイブリッドの検出と定量化を行なうことができる（シヴァネン他、Nucleic Acids Research、第14巻、1017〜1028ページ、1986年）。さらに、ビオチニル化したDNAが、ユーロピウムで標識したストレプトアビジンを用いた微小滴定ウエルの中で測定されている（ダーレン、Anal. Biochem.、第164巻、78〜83ページ、1982年）。しかしこういったタイプのアッセイの１つの欠点は、洗浄により標識をプローブから離し、その発光を増強溶液中で発達させねばならないことである。さらに別の欠点は、発生する発光がわずかにナノ秒（ns）の期間しか持続しないという事実である。この時間は、標識した分子を十分に検出し、背景の発光から識別するには短すぎて一般には受け入れられない。
【０００８】
予想可能な実際的な利点に関しては、使用するランタニド・キレートの発光崩壊時間が延長して10μsを超えることが望まれていた。既知の発光性キレートの多くにおける発光は、水によって抑制される傾向がある。水は、一般に、アッセイ系、特にイムノアッセイ系の中に存在しているため、水の存在下で発光が抑制されるランタノイド錯体は、多くの用途において、いくぶん好ましからぬもの、または非実用的なものと見なされている。さらに、発光崩壊時間が短いことは、これら化合物の欠点と見なされている。この抑制は、ランタニド・イオンが水分子を配位結合させやすい傾向を有することに起因する。ランタニド・イオンが水分子を配位結合させたとき、吸収された光エネルギー（励起エネルギー）は、発光として放出されるというよりは、錯体から溶媒に移動する。
【０００９】
したがって、ランタニド・キレート、中でも、優れた発光特性を有していて配位が飽和したキレートは、大いに望ましい。水の存在下で意にかなう発光を示す、配位が不飽和のキレートも好ましい。分析物の１つ以上の要素と共役できるように誘導化したそのようなキレートは、さまざまなアッセイ形式で利用される。本発明により、そのような化合物と、それら化合物を利用したアッセイが提供される。
発明の要約
発光マーカー（蛍光マーカーおよびリン光マーカーを含む）は、科学、医学、工学において幅広い用途がある。多くの場合、これらマーカーは、放射性標識、クロモゲン、放射線非透過染料などと競合してこれらに置き換わる。さらに、発光測定装置が改良されたため、測定感度が向上し、定量的解析が可能となった。
【００１０】
時間分解発光分光法と組み合わされたランタニド・キレートは、一般に受け入れられている免疫化学ツールである。現在のところ、好ましいランタニド・イオンとしては、Dy3+、Sm3+、Tb3+、Er3+、Eu3+、Nd3+、Yb3+が挙げられる。他のランタニド・イオン、例えばLa3+、Gd3+、Lu3+は有効だが、上記のものほど好まれてはいない。
【００１１】
本発明により、極度に発光し、発光アッセイ系において有効な発光マーカーおよび発光プローブとして望ましい多くの特徴を有するランタニド錯体が提供される。利点としては、1）リガンドが、キレート剤および発色団／エネルギー伝達装置の両方として機能すること；2）この錯体のランタニド・イオンの発光の量子収率が、ミセルやフッ化物などを外部から添加しなくても水中において非常に高いこと：3）これら錯体が水中において安定性が高く、溶解性が大きいこと；4）安価な出発材料を用いて極めて簡単に合成できること；5）これら発光プローブを例えば免疫活性剤または固体基質（例えばポリマー）に結合させるための多くの誘導体に容易にアクセスできることが挙げられる。
【００１２】
本発明により、構造内にヒドロキシイソフタミジル酸部分を含む新しいタイプのランタニド錯体リガンドと、これらリガンドの発光性金属錯体が提供される。本発明の化合物は、ヒドロキシイソフタミジルアミドをベースにした二座配位子、三座配位子、およびそれよりも多くの座を有する配位子のリガンドを含んでいる。本発明の化合物は簡単に調製でき、高収率である。
【００１３】
そこで本発明の第１の側面によれば、ランタニド系列の金属イオンと、少なくとも１つのフタルアミジル部分を含む錯化剤とを含む発光性ランタニド金属キレートが提供される。
【００１４】
本発明の第２の側面によれば、以下の化学式（I）の構造を有する化合物が提供される。
【００１５】
【化２１】
Figure 0004819223
【００１６】
この化学式（I）において、R1、R2、R4、R5、R6、R7、R10、R20は互いに独立であり、H、アルキル基、置換されたアルキル基からなるグループの中から選択し、R2、R4、R5、R7のうちの2つ以上と、R3が置換されたアルキル基であるときのR3の置換基は、少なくとも1つのリンカー部分が結合することによって少なくとも1つの環を形成することができる。R3、R8、R9は互いに独立で、アルキル基、置換されたアルキル基、アリール基、置換されたアリール基からなるグループの中から選択する。R11、R12、R13、R21、R22、R23は互いに独立で、アルキル基、置換されたアルキル基、H、−NR14R15、−NO2、−OR16、−COOR17の中から選択し、R14、R15、R16、R17は互いに独立で、H、アルキル基、置換されたアルキル基からなるグループの中から選択し、R12は、R11、R13、またはその両方と環を作ることも可能であり、R22は、R21、R23、またはその両方と環を作ることも可能である。それぞれの環は互いに独立で、環式アルキル基、置換された環式アルキル基、アリール基、置換されたアリール基、ヘテロアリール基、置換されたヘテロアリール基、ヘテロシクリル基、飽和ヘテロシクリル基からなる環システムのグループの中から選択する。Q1は−OR18であり、Q2は−OR19であり、ここにR18とR19は互いに独立で、H、酵素により変化しやすい基、加水分解により変化しやすい基、単一の負電荷の中から選択する。aは0または1であるが、aが0のときにはN2'が共有結合によってカルボニル基2'に直接結合するという条件がつく。zは0または1であるが、zが0のときにはN1'が共有結合によってカルボニル基1'に直接結合するという条件がつく。
【００１７】
本発明により、リガンドとランタニド錯体に加え、多くの方法、例えば本発明の化合物を利用するアッセイも提供される。本発明のアッセイでは、この明細書に記載した化合物の発光を利用してアッセイの対象を検出することが好ましい。本発明の方法により、放射性核種を使用せずに例えばごく微量の小分子生物活性材料と生体分子を検出することができる。
本発明の詳細な説明と好ましい実施態様
略号
この明細書で用いる“PL”は、フタルアミジルから誘導された本発明のリガンドを意味する。“PL”には、自由状態の本発明のリガンドと、１つまたはそれ以上の金属イオンを配位した状態の本発明のリガンドの両方が含まれる。“PL”にはさらに、１つまたはそれ以上のフタミジル基を１つまたはそれ以上のサリシルアミジル基と組み合わせて含むリガンド（“PSL”）も含まれる。
定義
この明細書で用いるすべての科学技術用語は、別に定義するのでなければ、一般に、本発明が属する分野の当業者が共通して理解しているのと同じ意味で用いる。一般に、この明細書で用いる用語と、以下に記載する分子生物学、有機化学、核酸化学における実験法およびハイブリダイゼーションは、従来技術において周知であり、一般的に用いられているものである。核酸とペプチドの合成には標準的な方法を用いる。一般に、酵素反応と精製のステップは、生産者の指定に従って実行される。技術や方法は、一般に、従来法やさまざまな一般的な参考文献（一般的なものとして、サムブルック他、『分子クローニング：実験室マニュアル』、第2版、1989年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州を参照のこと。この文献は、この明細書に参考として組み込まれている）の記載に従って実行する。そうした参考文献は、この明細書全体を通じて現われる。この明細書で用いる用語、分析化学、および以下に記述する有機合成における実験方法は、従来技術において知られていて使用されているものである。標準的な方法、またはその変形法を、化学的合成および化学的分析で用いる。
【００１８】
この明細書で用いる“分析物”とは、診断テストを行なう対象となる任意の化合物または分子、例えばバイポリマーまたは小分子生物活性物質のことを意味する。分析物としては、例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝産物、遷移状態のアナログ、補因子、インヒビター、薬物、染料、栄養物、成長因子などが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【００１９】
この明細書で用いる“エネルギー移動（転移）”は、発光基の発光放射を発光変更基によって変えるプロセスのことを意味する。発光変更基が発光消滅基である場合には、発光基からの発光放射が減衰する（クエンチされる）。エネルギー移動は、発光共鳴エネルギー移動、または直接エネルギー移動を通じて起こる可能性がある。これら２つの場合のエネルギー移動の正確なメカニズムは異なっている。この明細書におけるエネルギー移動には、メカニズムの異なる現象がすべて含まれる。
【００２０】
この明細書で用いる“エネルギー移動ペア（転移対）”は、エネルギー移動に関与する任意の2つの分子のことを意味する。典型的には、一方の分子が発光基として機能し、他方の分子が発光変更基として機能する。本発明において好ましいエネルギー移動ペアは、本発明の発光基と発光消滅基を含んでいる。この明細書では、エネルギー移動ペアの個々の要素は何であってもよい。必要なのは、個々の要素間の距離がある臨界的な量だけ変化したときに、エネルギー移動ペア全体としての分光特性が測定可能な何らかの変化を示すことである。
【００２１】
“エネルギー移動ペア”は、内部でエネルギー移動が起こる単一の錯体を形成する分子群のことを指すのに用いる。このような錯体は、例えば、2つの発光基（互いに異なっていてもよい）と1つの発光消滅基、または2つの発光消滅基と1つの発光基、または複数の発光基と複数の発光消滅基を含んでいてもよい。複数の発光基および／または複数の発光消滅基が存在している場合には、個々の基は互いに異なっていてもよい。
【００２２】
この明細書で用いる“発光変更基”は、発光基からの発光放射を何らかの方法で変えることのできる本発明の分子のことを意味する。一般に発光変更基は、あるエネルギー移動メカニズムを通じてこれを実現する。発光変更基が何であるかに応じ、発光放射は多くの変更を受ける。変更としては、例えば、減衰、完全な消滅、増大、波長のシフト、偏光のシフト、発光寿命の変化などがあるが、これだけに限定されるわけではない。発光変更基の一例は、発光消滅基である。
【００２３】
“発光共鳴エネルギー移動”すなわち“FRET”は、FETとも表現することができ、励起した発光基から放射された光の少なくとも一部が本発明の発光変更基によって吸収されるエネルギー移動現象のことを意味する。発光変更基が発光消滅基である場合には、その基は、吸収された光の実質的な一部を異なる波長の光としては放射せず、熱として散逸することが好ましい。FRETは、発光基の発光スペクトルと発光消滅基の吸収スペクトルの間の重なりに依存して変化する。FRETはまた、発光消滅基と発光基の距離にも依存して変化する。
【００２４】
“部分”は、別の部分に結合する分子の官能基を意味する。
【００２５】
この明細書で用いる“核酸”は、DNA、RNA、一本鎖のハイブリダイゼーション・モチーフ、二本鎖のハイブリダイゼーション・モチーフ、より集合したハイブリダイゼーション・モチーフや、これらを化学的に修飾した任意のもののことを意味する。修飾としては、核酸リガンドの塩基または核酸リガンド全体に対して電荷、偏光可能性、水素結合、静電相互作用、流動性を付加する化学基を提供する修飾が挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。そのような修飾の具体例としては、ペプチドや核酸のホスホジエステル基の修飾（例えば、モノチオリン酸塩、ホスホン酸メチル）、2'位の糖修飾、5位のピリミジン修飾、8位のプリン修飾、環外アミンの修飾、4-チオウリジンの置換、5-ブロモ-ウラシルまたは5-ヨード-ウラシルの置換；骨格の修飾、メチル化、普通でない塩基対の組み合わせ（例えばイソ塩基であるイソシチジンとイソグアニジンの組み合わせ）などが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。修飾には、例えばPL、発光体、または他の部分を3'末端や5'末端にかぶせる修飾も含まれる。
【００２６】
この明細書で用いる“発光消滅基”は、発光基が放射する光の少なくとも一部を減衰させることのできる本発明の任意の発光変更基のことを意味する。この減衰のことを、この明細書では“クエンチング”と呼ぶ。したがって、発光消滅基の存在下における発光基の発光は、予想よりも弱い放射信号となるか、まったく放射信号がない状態になる。クエンチングは、典型的には、発光基と発光消滅基の間のエネルギー移動を通じて起こる。
【００２７】
“ペプチド”とは、モノマーがアミノ酸であり、アミド結合を通じて互いに結合しているポリマーのことを意味する。ペプチドは、ポリペプチドとも呼ばれる。アミノ酸がαアミノ酸である場合には、L-光学異性体またはD-光学異性体のいずれかを用いることができる。さらに、自然界に存在していないアミノ酸、例えばβ-アラニン、フェニルグリシン、ホモアルギニンも含まれる。遺伝子にコードされていないがよく出会うアミノ酸も、本発明で用いることができる。本発明で用いるすべてのアミノ酸は、D-光学異性体とL-光学異性体のいずれでもよい。一般に、L-光学異性体のほうが好ましい。さらに、他のペプチド様物質も、本発明において有用である。一般的な概説として、B. ワインシュタイン編、『アミノ酸、ペプチド、タンパク質の化学と生化学』（マルセル・デッカー社、ニューヨーク、1983年）の中のスパトラ, A.F.が書いている267ページを参照のこと。
【００２８】
“アルキル”という用語は、この明細書では、一般に約1〜30個の炭素原子、好ましくは4〜20個の炭素原子、さらに好ましくは6〜18個の炭素原子を持つ、枝分かれした、または枝分かれしていない、飽和または不飽和の一価の炭化水素基のことを意味する。アルキル基が1〜6個の炭素原子を持つ場合には、“低級アルキル”と呼ばれる。適切なアルキル基としては、例えば、1つまたはそれ以上のメチレン基、メチン（methine）基、および／またはメチン（methyne）基を含む構造が挙げられる。枝分かれした構造は、i-プロピル、t-ブチル、i-ブチル、2-エチルプロピルなどに似た枝分かれモチーフを有する。この明細書では、“置換されたアルキル”や“環式アルキル”もアルキルという用語に含まれる。
【００２９】
“置換された（置換型）アルキル”とは、低級アルキル、アリール、アシル、ハロゲン（すなわちアルキルハロ、例えばCF3）、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、チオアミド、アシルオキシ、アリールオキシ、アリールオキシアルキル、メルカプト、チア、アザ、オキソ、飽和環式炭化水素と不飽和環式炭化水素、複素環などの中の1つまたはそれ以上の置換基を含む、すぐ上で説明したアルキルのことを意味する。これらの基は、アルキル部分の任意の炭素または置換基に結合させることができる。さらに、これらの基は、アルキル鎖から飛び出した状態、またはアルキル鎖と一体化した状態が可能である。
【００３０】
この明細書では、“アリール”という用語は、芳香族置換基のことを意味する。芳香族置換基は、単一の芳香環でも複数の芳香環でもよく、後者は、互いに融合した、共有結合した、またはメチレン部分またはエチレン部分などの共通の基に結合した、複数の芳香環である。共通の結合基としては、ベンゾフェノンなどの中のカルボニル基も可能である。芳香環としては、特にフェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェニルメチル、ベンゾフェノンが挙げられる。“アリールアルキル”や“置換されたアリール”も“アリール”という用語に含まれる。
【００３１】
“置換されたアリール”とは、低級アルキル、アシル、ハロゲン、アルキルハロ（例えばCF3）、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、フェノキシ、メルカプトや、芳香環と融合した、共有結合した、またはメチレン部分またはエチレン部分などの共通の基に結合した飽和環式炭化水素と不飽和環式炭化水素などの中の1つまたはそれ以上の置換基を含む、すぐ上で説明したアリールのことを意味する。結合基としては、シクロヘキシルフェニルケトンなどの中のカルボニル基も可能である。“置換されたアリール”という用語には、“置換されたアリールアルキル”も含まれる。
【００３２】
この明細書で用いる“アリールアルキル”という用語は、“アリール”の部分集合のうち、アリール基がこの明細書に定義したアルキル基によって他の基に結合したもののことを意味する。
【００３３】
“置換されたアリールアルキル”は、“置換されたアリール”の部分集合のうち、置換されたアリール基がこの明細書に定義したアルキル基によって他の基に結合したもののことを意味する。
【００３４】
“アシル”という用語は、ケトン置換基、すなわち−C（O）R（ここにRは、この明細書に定義したアルキルまたは置換されたアルキル、アリールまたは置換されたアリールである）のことを意味する。
【００３５】
“ハロゲン”という用語は、この明細書では、フッ素原子、臭素原子、塩素原子、ヨウ素原子のことを意味する。
【００３６】
“ヒドロキシ”という用語は、−OHという基のことを意味する。
【００３７】
“アミノ”という用語は、−NRR'（ここにRとR'は互いに独立で、H、アルキル、アリール、またはこれらの置換されたアナログである）に対して用いる。“アミノ”には、第2アミンおよび第3アミンを指す“アルキルアミノ”と、RC（O）NR'で表わされる“アシルアミノ”が含まれる。
【００３８】
“アルコキシ”という用語は、この明細書では、−ORという基（ここにRは、アルキル、またはその置換されたアナログである）のことを意味する。適切なアルコキシ基としては、例えばメトキシ、エトキシ、t-ブトキシなどが挙げられる。
【００３９】
“アリールオキシ”という用語は、この明細書では、酸素原子を通じて他の基に直接結合した芳香基を意味する。この用語には、上に説明したように芳香基が“置換されたアリール”で置換された“置換されたアリールオキシ”部分が含まれる。アリールオキシ部分の具体例としては、フェノキシ、置換されたフェノキシ、ベンジルオキシ、フェネチルオキシなどが挙げられる。
【００４０】
この明細書で用いる“アリールオキシアルキル”とは、酸素原子を通じてこの明細書に定義したアルキル基に結合した芳香基のことを意味する。“アリールオキシアルキル”という用語には、上に説明したように芳香基が“置換されたアリール”で置換された“置換されたアリールオキシアルキル”部分が含まれる。
【００４１】
この明細書では、“メルカプト”という用語は、一般構造−S−R（ここにRは、H、この明細書に説明したアルキル、アリール、または複素環である）を有する部分のことを意味する。
【００４２】
“飽和環式炭化水素”という用語は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロフェニルなどの基と、これら構造の置換されたアナログのことを意味する。これら環式炭化水素は、単一環構造でも複数環構造でもよい。
【００４３】
“不飽和環式炭化水素”という用語は、少なくとも1つの二重結合を有する一価の非芳香基、例えばシクロペンテン、シクロヘキセンなどと、これらの置換されたアナログのことを意味する。これら環式炭化水素は、単一環構造でも複数環構造でもよい。
【００４４】
“ヘテロアリール”という用語は、この明細書では、芳香環の1つまたはそれ以上の炭素原子が、窒素、酸素、または硫黄などのヘテロ原子で置換された芳香環のことを意味する。ヘテロアリールは、単一の芳香環、複数の芳香環、あるいは、1つまたはそれ以上の非芳香環に結合した1つまたはそれ以上の芳香環のことを意味する。複数の環を有する構造では、環として、互いに融合した環、共有結合した環、またはメチレン部分またはエチレン部分などの共通した基に結合した環が可能である。共通した結合基としては、フェニルピリジルケトンなどの中のカルボニル基も可能である。この明細書では、チオフェン、ピリジン、イソオキサゾール、フタルイミド、ピラゾール、インドール、フランなどの環、またはこれら環のベンゾ融合アナログが、“ヘテロアリール”という用語に含まれる。
【００４５】
“ヘテロアリールアルキル”は、“ヘテロアリール”の部分集合のうち、この明細書で定義したアルキル基がヘテロアリール基を別の基に結合しているものを意味する。
【００４６】
“置換されたヘテロアリール”とは、ヘテロアリール核が、低級アルキル、アシル、ハロゲン、アルキルハロ（例えばCF3）、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、メルカプトなどの官能基1つまたはそれ以上で置換された、すぐ上で説明したヘテロアリールのことを意味する。したがって、チオフェン、ピリジン、イソオキサゾール、フタルイミド、ピラゾール、インドール、フランなどの複素芳香環の置換されたアナログ、またはこれら環のベンゾ融合アナログが、“置換されたヘテロアリール”という用語に含まれる。
【００４７】
“置換されたヘテロアリールアルキル”とは、上に説明した“置換されたヘテロアリール”の部分集合のうち、この明細書で定義したアルキル基がヘテロアリール基を別の基に結合しているものを意味する。
【００４８】
“複素環”という用語は、この明細書では、1〜12個の炭素原子と、窒素、硫黄、または酸素の中から選択した1〜4個のヘテロ原子とを環内に有する単一の環または複数の融合環を含む、飽和または不飽和の一価の非芳香基のことを意味する。そのような複素環としては、例えば、テトラヒドロフラン、モルフォリン、ピペリジン、ピロリジンなどが挙げられる。
【００４９】
“置換された複素環”という用語は、この明細書では、“複素環”の部分集合のうち、複素環の核が、低級アルキル、アシル、ハロゲン、アルキルハロ（例えばCF3）、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、メルカプトなどの官能基1つまたはそれ以上で置換されたものを意味する。
【００５０】
“複素環アルキル”という用語は、“複素環”の部分集合のうち、この明細書で定義したアルキル基が複素環式基を別の基に結合しているものを意味する。
序論
本発明により、フタルアミジルをベースとしたリガンド（“PL”）の金属キレート、特にランタニド系列のキレートに基づいた一連の発光プローブが提供される。本発明の他の化合物は、単一のリガンド内にフタミジル部分とサリシルアミジル部分の両方を含んでいる（“PSL”）。本発明の化合物は、光を放射する。あるいは本発明の化合物は、レポーター発光体から放射された光を吸収するのに用いることができる。本発明の発光体は、溶液アッセイにおける小分子として用いることができる。あるいは本発明の発光体は、分析物に結合させる標識、または分析物と相互作用する化学種または分析物の検出および／または定量化を可能にする化学種に結合させる標識として用いることができる。
【００５１】
発光標識は、取り扱いに注意がほとんど不要で、ハイ・スループットの可視化技術（コンピュータを含む統合システムで解析を行なうための、画像ディジタル化を含む光学的解析技術）と相性がよいという利点がある。好ましい標識は、典型的には、高感度、高安定性、低いバックグラウンド、長い寿命、低い環境感度、標識する際の高い特異性といった特徴のうちの1つまたはそれ以上を有する。
【００５２】
本発明の発光体は、他の発光体またはクエンチャーとともにエネルギー移動プローブの要素として用いることができる。多くの発光標識は、本発明のPLおよびPSLと組み合わせると有効である。そうした標識の多くは市販されており、例えば、シグマ・ケミカル・カンパニー（セントルイス、ミズーリ州）、モレキュラー・プローブズ社（ユージーン、オレゴン州）、R&Dシステムズ社（ミネアポリス、ミネソタ州）、ファルマシアLKBバイオテクノロジー社（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）、クロンテック・ラボラトリーズ社（パロ・アルト、カリフォルニア州）、ケム・ジーンズ・コープ、アルドリッチ・ケミカル・カンパニー（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）、グレン・リサーチ社、ジブコBRLライフ・テクノロジーズ社（ゲサーズバーグ、メリーランド州）、フルカ・ケミカ−バイオケミカ・アナリティカ社（フルカ・ヘミーAG、ブーフス、スイス）、アプライド・バイオシステムズ社（フォスター・シティ、カリフォルニア州）のほか、当業者に知られている他の多くの供給源から入手することができる。さらに、当業者であれば、個々の用途に用いる適切な発光体の選択法を知っているであろうし、そうした発光体が市販品としては容易に入手できない場合には、必要な発光体を新たに合成したり、市販されている発光化合物を合成過程において変化させて望む発光標識にしたりすることができよう。
【００５３】
小分子発光体に加え、自然界に存在する発光タンパク質およびそうしたタンパク質の遺伝子工学によるアナログが、本発明のPLおよびPSLにとって有効である。そのようなタンパク質としては、例えば、刺胞動物門の緑色発光タンパク質（ウォード他、Photochem. Photobiol.、第35巻、803〜808ページ、1982年；レヴィン他、Comp. Biochem. Physiol.、第72B巻、77〜85ページ、1982年）、ビブリオ属のフィスケリ系統からの黄色発光タンパク質（ボールドウィン他、Biochemistry、第29巻、5509〜5515ページ、1990年）、焔色植物シンビオジニウム種からのペリジニン−クロロフィル（モリス他、Plant Molecular Biology、第24巻、673〜677ページ、1994年）、シネコッカスなどの海洋性シアノバクテリアからのフィコビリタンパク質、例えばフィコエリスリンやフィコシアニン（ウィルバンクス他、J. Biol. Chem.、第268巻、1226〜1235ページ、1993年）などが挙げられる。
【００５４】
本発明の化合物は、プローブとして、特定のイオンを他の溶質から分離するためのツールとして、マイクロスコピー、酵素学、臨床化学、分子生物学、医学におけるプローブとして用いることができる。本発明の化合物は、光力学療法などの療法における治療薬として、また磁気共鳴イメージングなどの画像形成法における診断剤としても有効である。さらに、本発明の化合物は、光の光学的増幅剤、導波管などの要素としても有効である。本発明の化合物はさらに、通貨またはそれ以外の譲渡可能な証券の印刷などに用いるインクや染料の中に組み込むこともできる。
【００５５】
本発明の化合物は、従来技術で公知の任意の方法、例えば光や電気化学エネルギーなどで励起することによって発光させることができる（例えば、クルマラ他、Analytica Chimica Acta、第386巻、1ページ、1999年を参照のこと）。発光は、本発明のキラル化合物の場合には、円偏光させることができる（例えば、リール他、Chem. Rev.、第86巻、1ページ、1986年を参照のこと）。
【００５６】
以下の項で説明する化合物、プローブ、方法は、一般に、本発明の化合物と、その化合物を用いることのできる方法の代表である。以下の説明は、本発明の中から選択した側面および実施態様を例示することを目的としたものであり、その説明が本発明の範囲を制限すると解釈してはならない。
化合物
本発明により、フタルアミジルをベースとしており、構造内に少なくとも1つのフタルアミジル部分を含む一連の金属キレート・リガンド（“PL”）が提供される。これらPL化合物は、構造内に、1つまたはそれ以上のフタルアミジル部分とともに1つまたはそれ以上のサリシルアミジル部分も含むことができる。
【００５７】
本発明の一側面によれば、発光ランタニド・イオン錯体が提供される。キレート基は、少なくとも1つのフタルアミジル基、好ましくは2〜100個のフタルアミジル基、さらに好ましくは3〜75個のフタルアミジル基、より一層好ましくは4〜50個のフタルアミジル基、それ以上に好ましくは5〜25個のフタルアミジル基を含んでいる。この錯体は、量子収率が少なくとも約0.1であることが好ましい。さらに好ましいのは、この錯体のランタニド・イオンが、ユーロピウム、テルビウム、およびこれらの組み合わせの中から選択した要素となっていることである。
【００５８】
キレート基の少なくとも1つのフタルアミジル基は、1つまたはそれ以上の電子受容基および／または電子供与基で置換することができる。当業者であれば、芳香環に付加されたときにどの置換基が電子受容特性または電子供与特性を有するかを理解しているであろう。本発明のPLに組み込むのが適切な置換基の表は、文献で見つけることができる。例えば、ハメット、J. Am. Chem. Soc.、第59巻、96ページ、1937年；ジョンソン、『ハメット方程式』、ケンブリッジ大学出版、ニューヨーク、1973年；ハンシュ他、J. Med. Chem.、第16巻、1207ページ、1973年；ハンシュ他、『化学と生物学における相関解析のための置換基定数』、ワイリー社、ニューヨーク、1979年を参照のこと。
【００５９】
さらに、錯体のフタルアミジル基は、実質的に任意の長さと化学的組成の骨格によって結合させることができる。ただし骨格は、フタルアミジルと他の環が望む金属イオンと錯体を形成する方向を向いている必要がある。錯体を用いる条件下で骨格が安定であることも一般に好ましい。その場合、代表的な骨格としては、例えば、アルキル基、置換されたアルキル基、共役不飽和系、アリール基、ヘテロアリール基、デンドリマー、ポリエーテル、ポリアミド、ポリイミン、バイオポリマーや、これら基の2つ以上を組み合わせた骨格が挙げられる。他の有効な骨格系は、当業者には明らかであろう。
本発明の第2の側面によれば、以下の化学式（I）で表わされる構造を有する化合物が提供される。
【００６０】
【化２２】
Figure 0004819223
【００６１】
化学式（I）において、R1、R2、R4、R5、R6、R7、R10、R20は互いに独立であり、H、アルキル基、置換されたアルキル基からなるグループの中から選択し、R2、R4、R5、R7のうちの2つ以上と、R3が置換されたアルキル基であるときのR3の置換基は、少なくとも1つのリンカー部分が結合することによって少なくとも1つの環を形成することができる。R3、R8、R9は互いに独立で、アルキル基、置換されたアルキル基、アリール基、置換されたアリール基からなるグループの中から選択する。R11、R12、R13、R21、R22、R23は互いに独立で、アルキル基、置換されたアルキル基、H、−NR14R15、−NO2、−OR16、−COOR17の中から選択し、R14、R15、R16、R17は互いに独立で、H、アルキル基、置換されたアルキル基からなるグループの中から選択し、R12は、R11、R13、またはその両方と環を作ることも可能であり、R22は、R21、R23、またはその両方と環を作ることも可能である。それぞれの環は互いに独立で、環式アルキル基、置換された環式アルキル基、アリール基、置換されたアリール基、ヘテロアリール基、置換されたヘテロアリール基、ヘテロシクリル基、飽和ヘテロシクリル基からなる環システムのグループの中から選択する。Q1は−OR18であり、Q2は−OR19であり、ここにR18とR19は互いに独立で、H、酵素により変化しやすい基、加水分解により変化しやすい基、単一の負電荷の中から選択する。aは0または1であるが、aが0のときにはN2'が共有結合によってカルボニル基2'に直接結合するという条件がつく。zは0または1であるが、zが0のときにはN1'が共有結合によってカルボニル基1'に直接結合するという条件がつく。
【００６２】
本発明の錯化剤のフタルアミジル環の数は任意でよいとはいえ、好ましい実施態様では、ｚが0で、一般には錯化剤が3つのフタルアミジル環を有する。
【００６３】
上に説明したように、R3で表わされる骨格は、少なくとも1つのフタルアミジル基を結合させうるように機能化されているのであれば、任意の構造と大きさが可能である。好ましい実施態様では、R3は直線状のC1〜C6炭化水素である。
【００６４】
別の好ましい実施態様として、本発明により、3つのフタルアミジル環を有する化合物が提供される。この化合物は、化学式（I）の構造を持ち、R8が（CH2）P（Pは、1〜5の整数の中から選択する）となっている。R4は第3のフタルアミジル環であり、以下の化学式（II）の構造を有する部分と置換されるアルキル基である。
【００６５】
【化２３】
Figure 0004819223
【００６６】
化学式（II）において、R29、R46、R47はそれぞれ独立で、H、アルキル基、置換されたアルキル基からなるグループの中から選択し、R2、R7、R29のうちの2つまたはそれ以上は、少なくとも1つのリンカー部分によって接続されて少なくとも1つの環を形成することもできる。R31、R32、R33はそれぞれ独立で、アルキル、置換されたアルキル、H、−NR24R25、−NO2、−OR26、−COOＲ27の中から選択し、R24、R25、R26、R27はそれぞれ独立で、H、アルキル基、置換されたアルキル基からなるグループの中から選択し、R32は、R31、R33、またはその両方と環を形成することもできる。それぞれの環は独立であり、環式アルキル、置換された環式アルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ヘテロシクリル、飽和ヘテロシクリルからなる環式系のグループの中から選択する。R3は（CH2）xであり、xは、1〜5の整数の中から選択する。Q3は−OR28である（ここにR28は、H、酵素により変化しやすい基、加水分解により変化しやすい基、単一の負電荷の中から選択する）。この実施態様では、化学式（I）からのzは0である。
【００６７】
別の好ましい実施態様では、本発明の化合物は、大環状構造またはポリ大環状構造である。この実施態様の代表例は、構造中に化学式（I）と（II）に示した部分を含む化合物である。ここに、R2、R7、R29のうちの2つまたはそれ以上は、少なくとも1つのリンカー部分によって接続されて少なくとも1つの環を形成している。さらに好ましいのは、R2、R7、R28のどれもが単一のリンカー部分を含んでいることである。
【００６８】
大環状構造またはポリ大環状構造を形成するのに用いるリンカー部分は、有効な構造であれば実質的に任意の構造を持つことができる、例えば、アルキル、置換されたアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、共役不飽和系、アリール、ヘテロアリール、デンドリマー、ポリエーテル、ポリアミド、ポリイミド、バイオポリマーや、これら基の2つ以上を組み合わせた骨格を持つことができる。しかし現在のところ好ましいリンカーは、以下の化学式（III）を有する。
【００６９】
【化２４】
Figure 0004819223
【００７０】
化学式（III）では、b、e、fは互いに独立な数であり、1〜5の整数の中から選択する。
【００７１】
さらに別の好ましい実施態様として、本発明により、以下の化学式（IV）の構造を有する化合物が提供される。
【００７２】
【化２５】
Figure 0004819223
【００７３】
化学式（IV）では、b、b'、e、e'、f、f'は互いに独立な数であり、1〜5の整数の中から選択する。
【００７４】
さらに別の好ましい実施態様として、本発明により、以下の化学式（V）の構造を有する化合物が提供される。
【００７５】
【化２６】
Figure 0004819223
【００７６】
あるいはさらに好ましい実施態様として、以下の化学式（VI）の構造を有する化合物が提供される。
【００７７】
【化２７】
Figure 0004819223
【００７８】
化学式（V）と（VI）において、R1、R2、R10、Q1は、化学式（I）の化合物に関して説明したのと同じ要素を表わす。化学式（IV）〜（VI）のそれぞれにおいて、置換基（Rn）は実質的に上記のものと同じである。
【００７９】
別の好ましい実施態様として、本発明により、少なくとも4つのフタルアミジル環を有する化合物が提供される。この化合物は、化学式（I）の構造を持っており、R4は、上記の化学式（II）の構造を有する基で置換されたアルキル基である。4番目のフタルアミジル環はR5で表わされ、このR5は、以下の化学式（IX）の構造を有する部分で置換されたアルキル基である。
【００８０】
【化２８】
Figure 0004819223
【００８１】
化学式（IX）において、R39、R40、R45は互いに独立であり、アルキル基と、置換されたアルキル基の中から選択する。R41、R42、R43は互いに独立であり、アルキル、置換されたアルキル、H、−NR34R35、−NO2、−OR36、−COOR37の中から選択する。R34、R35、R36、R37は互いに独立であり、H、アルキル、置換されたアルキルの中から選択する。R42は、R41、R43、またはその両方と環を形成することもできる。それぞれの環は互いに独立であり、環式アルキル、置換された環式アルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ヘテロシクリル、飽和ヘテロシクリルからなる環式系のグループの中から選択する。
【００８２】
別の好ましい実施態様として、本発明により、以下の化学式（X）の構造を有する化合物が提供される。
【００８３】
【化２９】
Figure 0004819223
【００８４】
化学式（X）において、M、N、P、Zは互いに独立な数であり、1〜5の整数の中から選択する。
【００８５】
別の好ましい実施態様として、本発明により、以下の化学式（XI）の構造を有する化合物が提供される。
【００８６】
【化３０】
Figure 0004819223
【００８７】
化学式（XI）の中の置換基（R）は、上記の化学式の中で同じ名前をつけたものと実質的に同じである。
【００８８】
さらに好ましい実施態様として、本発明により、化学式（I）、（II）、（IX）を組み合わせた化合物が提供される。ここにR1、R6、R29、R39はともに単一のリンカー部分を含んでいる。リンカーは、以下の化学式（XII）の構造を有することが好ましい。
【００８９】
【化３１】
Figure 0004819223
【００９０】
化学式（XII）において、b、e、f、g、hは互いに独立な数であり、1〜5の整数の中から選択する。
【００９１】
より一層好ましい実施態様として、本発明により、以下の化学式（XIII）の構造を有する化合物が提供される。
【００９２】
【化３２】
Figure 0004819223
【００９３】
化学式（XIII）において、bとb'は互いに独立な数であり、1〜5の整数の中から選択する。e、e'、f、f'、g、g'、h、h'は互いに独立な数であり、1〜3の整数の中から選択する。化学式（X）〜（XIII）のそれぞれにおいて、置換基（Rn）は、実質的に上記のものと同じである。
【００９４】
より一層好ましい実施態様として、本発明により、以下の化学式（XIV）の構造を有する化合物が提供される。
【００９５】
【化３３】
Figure 0004819223
【００９６】
別の好ましい実施態様では、本発明の化合物の骨格はデンドリマーである。したがって、本発明により、以下の化学式（XV）の構造を有する化合物が提供される。
【００９７】
【化３４】
Figure 0004819223
【００９８】
化学式（XV）において、Dはデンドリマーを表わし、wは、4〜100の整数、好ましくは8〜50の整数の中から選択する。
【００９９】
本発明のPLは、デンドリマーに結合しているか、あるいはデンドリマーの成分が大環状構造に組み込まれている大環状リガンドを形成することもできる。そうした化合物の代表例は、以下の化学式（XVI）の構造を有する。
【０１００】
【化３５】
Figure 0004819223
【０１０１】
ここに、Dとwは上記のものと同じである。当業者には、これら構造のそれぞれにおけるデンドリマーとリガンドを、任意のタイプのスペーサー・アーム、例えばアミン、具体的には本発明の骨格アミンなどによって結合させうることは明らかであろう。
【０１０２】
化学式（XV）と（XVI）の化合物の好ましい実施態様では、デンドリマーは、ポリ（プロピレンイミン）デンドリマーであるが、中でも世代2〜世代10のポリ（プロピレンイミン）デンドリマーであることが好ましい。
【０１０３】
好ましいさらに別の実施態様として、本発明により、ポリ大環状化合物が提供される。本発明のこの実施態様の化合物の代表的な構造は、以下の化学式（XVII）で表わされる。
【０１０４】
【化３６】
Figure 0004819223
【０１０５】
R基
説明をわかりやすくするため、上記の化学式に現われるさまざまなR基（例えばR1、R2、R3など）が何であるかについての説明は、このセクションでまとめて行なう。ここでの説明は、この明細書に記載したそれぞれの化学式に同じように適用することができる。さらに、ここでの説明はいくつかの代表的な化学式に絞って行なうが、それはR基の説明を簡単にするための方便であり、R基の範囲を限定するわけではないことを理解する必要がある。
【０１０６】
化学式（I）と（II）を組み合わせたものと、3つのフタルアミジル環を有する得られた錯化剤を参照すると、以下の説明は、一般に、本発明の任意の化合物および本発明の任意の化合物の任意のR基に関係することがわかる。さらに、この説明は、特にR基のR1、R2、R3、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R29、R46、R47に関するものである。当業者であれば、本発明の化合物に付加的なフタルアミジル環、リンカー基、骨格が含まれている場合には、以下の説明は同様にそれらにも関係する。
【０１０７】
好ましい一実施態様では、1つまたはそれ以上の上記R基は互いに独立であり、H、C1〜C10のアルキル、C1〜C10の置換されたアルキルからなるグループの中から選択する。しかし上記R基は、H、C2〜C6のアルキル、C2〜C6の置換されたアルキルからなるグループの中から選択することがさらに好ましい。
【０１０８】
別の好ましい実施態様では、1つまたはそれ以上の上記R基は互いに独立であり、H、アリール、置換されたアリール、およびこれらの組み合わせからなるグループの中から選択する。
【０１０９】
さらに好ましい実施態様では、1つまたはそれ以上の上記R基は互いに独立であり、Hと、ポリ環式アリール基で置換されたアルキル、好ましくはナフチル基で置換されたアルキルとからなるグループの中から選択する。
【０１１０】
さらに別の好ましい実施態様では、1つまたはそれ以上の上記R基は、Hと第1アルキルアミンからなるグループの中から選択する。第1アルキルアミンは、ω位置にアミン部分を有するC1〜C1のアルキル鎖が好ましく、さらに好ましいのは、ω位置にアミン部分を有するC2〜C6のアルキル鎖である。
【０１１１】
さらに別の好ましい実施態様では、1つまたはそれ以上の上記R基はポリエーテルである。しかしこのR基は、分子量が約60ドルトン〜約10,000ドルトン、より好ましくは約100ドルトン〜約1,000ドルトンのエチレングリコール、エチレングリコールオリゴマー、およびこれらの組み合わせの中から選択することが好ましい。
【０１１２】
ポリエーテルをベースとした代表的な置換基としては以下の構造が挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【０１１３】
【化３７】
Figure 0004819223
【０１１４】
ここに、jは1〜100の整数である。機能化された他のポリエーテルは当業者に公知であり、多くのものが、例えばシアウォーター・ポリマーズ社（アラバマ州）から市販されている。
【０１１５】
別の好ましい実施態様では、1つまたはそれ以上の上記R基は、本発明の化合物を、さまざまな分子および表面からなるグループの中から選択した要素と共役させるための反応基を含んでいる。有用な反応基のうちの代表的なものについては、以下のセクションでより詳しく説明する。有用な反応基に関する補足的情報は、当業者には公知である。例えば、ハーマンソン、『生物共役技術』、アカデミック・プレス、サン・ディエゴ、1996年を参照のこと。
【０１１６】
好ましい一実施態様では、1つまたはそれ以上の上記R基は、ω−カルボキシルアルキル基、ω−カルボキシルが置換されたアルキル基、およびこれらの組み合わせの中から選択するが、より好ましいのは、R基が以下の化学式（VII）で表わされる構造を有することである。
【０１１７】
【化３８】
Figure 0004819223
【０１１８】
化学式（VII）においては、Xは、O、S、NR50の中から選択する。R50は、H、アルキル、置換されたアルキルの中から選択する。Yは、Hと単一の負電荷の中から選択する。jとkは互いに独立であり、1〜18の整数の中から選択する。
【０１１９】
さらに好ましい実施態様では、1つまたはそれ以上の上記R基は、以下の化学式（VIII）で表わされる構造を有する。
【０１２０】
【化３９】
Figure 0004819223
【０１２１】
ここに、Yは化学式（VII）に関して説明したのと実質的に同じである。
【０１２２】
さらに別の好ましい実施態様では、1つまたはそれ以上の上記R基は、1つまたはそれ以上の上記の基は、を合わせた特性を持つことができる。例えば、ある好ましいR基は、ポリエーテルの特性と以下の反応基
【０１２３】
【化４０】
Figure 0004819223
【０１２４】
の特性の両方を持っている。なおこの化学式で、jは1〜100の整数である。他の“キメラ”R基としては、糖（例えば反応性ヒドロキシルを備えるポリオール）、アミノ酸、アミノアルコール、カルボキシアルコール、アミノチオールなどが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【０１２５】
さらに好ましい実施態様では、本発明の化合物は、1つの分子上に2つ以上のタイプのR基を有する。例えば1つの分子は、R基としてのポリエーテルと、R基としてのアミンを含むことができる。さまざまな置換基の他の多くの組み合わせは、当業者には明らかであろう。この実施態様における代表的な構造は以下の通りである。
【０１２６】
【化４１】
Figure 0004819223
【０１２７】
ここに、nは0〜6の整数であるが、好ましいのは1〜3である。
【０１２８】
本発明の化合物の構造をいくつか図19に示す。
【０１２９】
具体的には、本発明のランタニド・キレートは、例えば以下の構造1を有する。
【０１３０】
【化４２】
Figure 0004819223
【０１３１】
ここにsは1〜5の整数である。好ましい化合物の具体例を表1に示す。
【０１３２】
【表１】
Figure 0004819223
【０１３３】
表1のすべての化合物について、R'、R''、R'''はHであり、R0とR''''はアミドである。
3（M）Li=2,2-ジメチル-1,3-ジアミノプロパン
5Li=1,5-ジアミノペンタン
TREN=トリス（2-アミノエチル）アミン
2-AMN=2-アミノメチルナフタレン
H22=テトラキス（2-アミノエチル）エチレンジアミン
さらに別の好ましい実施態様では、本発明の化合物は、弱い相互作用（例えばファン・デル・ワールス力）で別の分子と会合し、例えば包接化合物などの化学種を形成する。PLと相互作用する好ましい分子としてはデンドリマー、大環状化合物、シクロデキストリンなどが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
反応性官能基
本発明のいくつかの化合物は、反応性官能基を備えている。反応性官能基としては、例えば、任意のアリール核の任意の位置、または、アリール核に結合したアルキル鎖などの鎖の上の任意の位置、またはキレート剤の骨格上の任意の位置に位置することのできるリンカー・アームの要素などがある。これら化合物は、この明細書では“反応性リガンド”と呼ぶ。反応基がアルキルと結合した場合、または反応基がアルキル核に結合した置換されたアルキル鎖に結合した場合には、その反応基は、アルキル鎖の端部に位置することが好ましい。本発明を実施するのに役立つ反応基と反応のタイプは、一般に、生物共役化学の当業者に知られているものである。本発明の反応性リガンドを用いて利用することが可能な反応のタイプのうちで現在のところ好まれているものは、比較的おとなしい条件で実施される反応である。例えば、親核置換（例えば、アシル・ハロゲン化物および活性エステルと、アミンおよびアルコールの反応）、親電子置換（例えば、エナミン反応）、炭素−炭素多重結合および炭素−ヘテロ原子多重結合への付加（例えば、マイケル反応、ディールス−アルダー付加）などがあるが、これだけに限定されるわけではない。これらの反応およびそれ以外の有効な反応は、例えば、マーチ、『高等有機化学』、第3版、ジョン・ワイリー＆サンズ社、ニューヨーク、1985年；ハーマンソン、『生物共役技術』、アカデミック・プレス、サン・ディエゴ、1996年；フィーニー他、『タンパク質の修飾』、化学の進歩シリーズ第198巻、アメリカ化学会、ワシントンD.C.、1982年に記載されている。
【０１３４】
有効な反応性官能基としては、例えば以下のものがある。
【０１３５】
（a）カルボキシル基とそのさまざまな誘導体で、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、N-ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、酸性ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、p-ニトロフェニルエステル、アルキルエステル、アルケニルエステル、アルキニルエステル、芳香族エステルなどが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【０１３６】
（b）エステル、エーテル、アルデヒドなどに変換することのできるヒドロキシル基。
【０１３７】
（c）ハロアルキル基。この場合には、ハロゲン化物を、例えばアミン、カルボキシル酸塩のアニオン、チオール・アニオン、カルバニオン、またはアルコキシド・イオンなどの親核基でのちに置換することができ、その結果としてハロゲン原子の部位に新しい基が共有結合する。
【０１３８】
（d）ディールス−アルダー反応に関与することのできる、マレイミド基などのジエノフィル基。
【０１３９】
（e）例えばイミン、ヒドラゾン、セミカルバゾン、またはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を通じて、あるいはグリニャール付加またはアルキルリチウム付加などのメカニズムを通じて続けて誘導体化が可能なアルデヒド基またはケトン基。
【０１４０】
（f）続けて例えばアミンと反応させることによりスルホンアミドを形成するためのスルホニルハライド基。
【０１４１】
（g）アシルハロゲン化物との反応によってジスルフィドに変換することのできるチオール基。
【０１４２】
（h）例えばアシル化、アルキル化、または酸化させることができるアミノ基またはスルフヒドリル基。
【０１４３】
（i）例えば環付加、アシル化、マイケル付加などを受けることのできるアルケン。
【０１４４】
（j）例えばアミンやヒドロキシル化合物と反応させることのできるエポキシド。
【０１４５】
（k）核酸の合成において役立つホスホルアミダイトとそれ以外の標準的な官能基。
【０１４６】
反応性官能基は、反応性リガンドを組み立てるのに必要な反応に関与しない、あるいはそうした反応を邪魔しないようなものを選択することができる。また反応性官能基は、保護基を存在させることによって、反応に関与しないようにすることもできる。当業者であれば、ある特定の官能基を保護して、その官能基が、選択した一連の反応条件を邪魔しないようにする方法を知っているであろう。有効な保護基の具体例は、例えば、グリーン他、『有機合成における保護基』、ジョン・ワイリー＆サンズ社、ニューヨーク、1991年を参照のこと。
供与体部分と受容体部分
本発明の化合物の利点の1つは、発光エネルギー移動プローブを構成するのに多彩なエネルギー供与体とエネルギー受容体を利用できることである。PLとともに用いるのが有効な多くの発光体が当業者に知られている。例えば、カルドゥロ他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第85巻、8790〜8794ページ、1988年；デクスター, D.L.、J. of Chemical Physics、第21巻、836〜850ページ、1953年；ホッホシュトラッサー他、Biophysical Chemistry、第45巻、133〜141ページ、1992年；セルヴィン, P.、Methods in Enzymology、第246巻、300〜334ページ、1995年；スタインバーグ, I.、Ann. Rev. Biochem.、第40巻、83〜114ページ、1971年；ストライヤー, L.、Ann. Rev. Biochem.、第47巻、819〜846ページ、1978年；ワン他、Tetrahedron Letters、第31巻、6493〜6496ページ、1990年；ワン他、Anal. Chem.、第67巻、1197〜1203ページ、1995年を参照のこと。
【０１４７】
本発明のクエンチャーと合わせて使用することができる供与体の具体例のリストを表2に示す。ただし、これだけに限定されるわけではない。
表2
FETペアにおける供与体または受容体として選択することのできる適切な部分
4-アセトアミド-4'-イソチオシアナートスチルベン-2,2'ジスルホン酸
アクリジンとその誘導体：
アクリジン
イソチオシアン酸アクリジン
5-（2'-アミノエチル）アミノナフタレン-1-スルホン酸（EDANS）
4-アミノ-N-［3-ビニルスルホニルフェニル］ナフタルイミド-3,5ジスルホン酸塩
N-（4-アニリノ-1-ナフチル）マレイミド
アントラニルアミド
BODIPY
ブリリアント・イエロー
クマリンとその誘導体：
クマリン
7-アミノ-4-メチルクマリン（AMC、クマリン120）
7-アミノ-4-トリフルオロメチルクルアリン（クマラン151）
シアニン染料
シアノシン
4',6-ジアミニジノ-2-フェニルインドール（DAPI）
5',5''-ジブロモピロガロール-スルホナフタレイン（ブロモピロガロール・レッド）
7-ジエチルアミノ-3-（4'-イソチオシアナートフェニル）-4-メチルクマリン
ジエチレントリアミン五酢酸塩
4,4'-ジイソチオシアナートジヒドロ-スチルベン-2,2'-ジスルホン酸
4,4'-ジイソチオシアナートスチルベン-2,2'-ジスルホン酸
5-［ジメチルアミノ］ナフタレン-1-スルホニルクロリド（DNS、ダンシルクロリド）
4-（4'-ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（DABCYL）
4-ジメチルアミノフェニルアゾフェニル-4'-イソチオシアン酸塩（DABITC）
エオシンとその誘導体：
エオシン
イソチオシアン酸エオシン
エリスロシンとその誘導体
エリスロシンB
イソチオシアン酸エリスロシン
エチジウム
フルオレセインとその誘導体
5-カルボキシフルオレセイン（FAM）
5-（4,6-ジクロロトリアジン-2-イル）アミノフルオレセイン（DTAF）
2',7'-ジメトキシ-4',5'-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン（JOE）
フルオレセイン
イソチオシアン酸フルオレセイン
QFITC（XRITC）
フルオレスカミン
IR144
IR1446
マラカイト・グリーン・イソチオシアン酸塩
4-メチルアンベリフェロン
オルト・クレソルフタレイン
ニトロチロシン
パラロザニリン
フェノール・レッド
B-フィコエリスリン
o-フタルジアルデヒド
ピレンとその誘導体：
ピレン
ブチル酸ピレン
スクシンイミジル 1-ピレンブチル酸塩
量子ドット
反応性レッド4（Cibacron（登録商標）ブリリアント・レッド3B-A）
ローダミンとその誘導体：
6-カルボキシ-Ｘ-ローダミン（ROX）
6-カルボキシローダミン（R6G）
リサミンローダミンBスルホニルクロリドローダミン（Rhod）
ローダミンB
ローダミン123
イソチオシアン酸ローダミンX
スルホローダミンB
スルホローダミン101
スルホローダミン101のスルホニルクロリド誘導体（テキサス・レッド）
N,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン（TAMRA）
テトラメチルローダミン
イソチオシアン酸テトラメチルローダミン（TRITC）
リボフラビン
ロゾール酸
ランタニド・キレート誘導体
個々のプローブに適した供与体−受容体のペアを選択するための実践的ガイドが多数、文献に記載されている。例えば以下のような参考文献がある。ペッシェ他編、『発光分光法』（マルセル・デッカー社、ニューヨーク、1971年）；ホワイト他、『発光分析：実践的アプローチ』（マルセル・デッカー社、ニューヨーク、1970年）など。文献には、レポーター−クエンチャーのペアを選択するため、発光分子と発色分子を網羅したリストと、関係する光学特性も記載されている（例えば、バールマン、『芳香族分子の発光スペクトルのハンドブック』、第2版（アカデミック・プレス、ニューヨーク、1971年）；グリフィス、『有機分子の色彩と構造』（アカデミック・プレス、ニューヨーク、1976年）；ビショップ編、『指示薬』（パーガモン・プレス、オックスフォード、1972年）；ホーグランド、『発光プローブと化学物質探索のハンドブック』（モレキュラー・プローブズ社、ユージーン、1992年）；プリングシャイム、『発光と発光』（インターサイエンス・パブリッシャーズ、ニューヨーク、1949年）などを参照のこと）。さらに、分子に付加することのできるすぐに利用可能な反応基を通じて共有結合させるためにレポーター分子およびクエンチャー分子を誘導体化する広範な方法が、文献に記載されている。
【０１４８】
発光体を他の分子や表面に共役させるのに利用できる化学物質の多様性と有効性の実例は、発光体を用いて誘導体化した核酸の調製に関する多くの文献に記載されている。例えば、ホーグランド（上記文献）；ウルマン他、アメリカ合衆国特許第3,996,345号；カンナ他、アメリカ合衆国特許第4,351,760号を参照のこと。したがって、個々の用途においてエネルギー交換ペアを選択し、このペアの要素をプローブ分子、例えば小分子生物活性物質、核酸、ペプチド、またはその他のポリマーに共役させる方法は、当業者には周知である。
【０１４９】
FETペアにおいては、一般に、受容体の吸収帯が供与体の発光帯と実質的に重なっていることが好ましい。供与体（発光体）が、発光共鳴エネルギー移動（FRET）を利用したプローブの要素である場合には、供与体の発光部分と本発明のクエンチャー（受容体）としては、供与体部分が励起されたときに発光共鳴エネルギー移動を起こすような供与体部分と受容体部分を選択することが好ましい。発光体−クエンチャーのペアを選択する際に考慮すべき1つの因子は、そのペアの要素間の発光共鳴エネルギー移動の効率である。供与体部分と受容体部分の間のFRETの効率は少なくとも10％であることが好ましく、この値は少なくとも50％であることがより好ましく、少なくとも80％であることがさらに好ましい。FRETの効率は、この明細書に記載した方法や従来技術で公知の方法を利用して容易に実験で調べることができる。
【０１５０】
供与体−受容体ペアの要素間のFRETの効率は、供与体と受容体が二量体化する能力または相互に密接に会合する能力を変化させることによって調整することもできる。供与体部分と受容体部分が相互に密接に会合することがわかっているのであれば、あるいはそのことを測定できるのであれば、会合の増加または減少は、2つの発光タンパク質の間にあるリンカー部分の長さまたはプローブそのものを調節することによって促進することができる。供与体−受容体ペアが会合する能力は、疎水性相互作用またはイオン相互作用、あるいはプローブ内の構造上の反発力を調節することによって、増加または減少させることができる。したがって、供与体−受容体ペアの会合の原因である分子内相互作用を大きくしたり小さくしたりすることができる。したがって、例えば供与体−受容体ペアの会合は、例えば全体が負電荷の供与体と全体が正電荷の受容体を用いることによって、増やすことができる。
【０１５１】
発光体は、プローブに直接結合させうるだけでなく、間接的な手段によって結合させることもできる。この実施態様では、リガンド分子（例えばビオチン）が、プローブの化学種に共有結合することが好ましい。次にリガンドは、別の分子（例えばストレプトアビジン）と結合する。この別の分子は、本来的に検出可能な分子、または信号系に共有結合している分子である。具体的には、本発明の発光化合物、または非発光化合物を変換することによって発光化合物を生成させる酵素などである。標識として有効な酵素としては、例えば、ヒドロラーゼ、（中でもホスファターゼ、エステラーゼ、グリコシダーゼ）や、オキシドターゼ（中でもぺルオキシダーゼ）が挙げられる。発光化合物としては、すでに説明したように、フルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシル、アンベリフェロンなどが挙げられる。利用可能なさまざまな標識系または信号発生系の概説としては、アメリカ合衆国特許第4,391,904号を参照のこと。
【０１５２】
現在のところ本発明の錯体とともに使用することが好まれている発光体としては、例えばフルオレセインやローダミン染料などのキサンテン染料がある。適切な形態にされた多数のこうした化合物が、フェニル部分上にあって結合部位として、または核酸に結合させるための結合基として用いることができる置換基とともに広く市販されている。好ましい発光化合物の別の一群は、アミノ基をα位置またはβ位置に有するナフチルアミンである。そうしたナフチルアミノ化合物としては、1-ジメチルアミノナフチル-5-スルホン酸塩、1-アニリノ-８-ナフタレンスルホン酸塩、2-p-トイジニル-6-ナフタレンスルホン酸塩が挙げられる。他の供与体としては、3-フェニル-7-イソシアナートクマリン、アクリジン（例えば9-イソチオシアナートアクリジンとアクリジン・オレンジ）；N-（p-（2-ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド；ベンゾオキサジアゾール、スチルベン、ピレンなどが挙げられる。
【０１５３】
説明をわかりやすくするため、以下の説明では、本発明の錯体とその他の発光体を核酸に結合させることに焦点を絞る。核酸プローブに焦点を絞っているが、本発明の錯体を結合させうるプローブ分子の範囲を限定することを意図しているわけではない。当業者であれば、標準的な合成化学の方法またはその変形法を利用して、本発明の錯体を小分子（例えば小分子生物活性剤）、タンパク質、ペプチド、合成ポリマー、固体支持体などにも結合させうることが理解できよう。
【０１５４】
プローブが核酸プローブである一実施態様では、受容体分子はローダミン染料である。PLの誘導体化のためにローダミン部分の内部部位にもアクセス可能であり、その内部部位は特定の目的には有用であるとはいえ、ローダミン部分は、核酸の3'末端または5'末端のいずれかに結合させることが好ましい。ローダミン誘導体をどちらの末端に結合させたとしても、本発明の錯体は、一般に、その反対側に結合させるか、または核酸鎖の内部の位置に結合させることになる。ローダミン受容体は、市販されているアミダイトを用いて導入することが好ましい。本発明のさまざまな供与基も、供与体の反応性誘導体（例えばアミダイト）を用いて導入することが好ましい。また、反応基を含む供与基（例えばイソチオシアナート、活性エステルなど）は、反応部分との反応を通じ、核酸に結合した束縛アームまたはリンカー・アーム（例えばヘキシルアミン）に導入することができる。
【０１５５】
好ましいさらに別の実施態様では、供与体部分は、誘導体化した合成支持体を用いて核酸の3'末端に結合させることができる。例えば、本発明の錯化剤は、錯体のアナログを用いて誘導体化した固体支持体に固定される。誘導体化したそのような固体支持体は当業者には周知であり、その一例は、TAMRA発光体（バイオサーチ・テクノロジーズ社）のアナログを用いて誘導体化した市販の固体支持体を用いて核酸の3'末端に結合させたTAMRA（テトラメチルローダミンカルボキシル酸）誘導体である。
【０１５６】
小分子を核酸に共役させることに関してよく研究されていることが文献からわかるため、当業者には、供与体／受容体ペアを核酸に結合させる他の多くの方法が明らかであろう。例えば、ホスホルアミダイト部分を用いて誘導体化した染料を使用して固相合成を行なうことにより、ローダミンとフルオレセイン染料が核酸の5'-ヒドロキシルに容易に結合する（例えば、ウー他、アメリカ合衆国特許第5,231,191号と、ホッブズ, ジュニア、アメリカ合衆国特許第4,997,928号を参照のこと）。
【０１５７】
さらに詳細に説明するならば、基を核酸の3'末端または5'末端に結合させるためのリンク部分と方法は多数存在している。それらが、例えば以下の文献に記載されている。エクシュタイン編、『核酸とアナログ：実践的アプローチ』（IRLプレス、オックスフォード、1991年）；ツッカーマン他、Nucleic Acids Research、第15巻、5305〜5321ページ、1987年（核酸上の3'-チオール基）；シャルマ他、Nucleic Acids Research、第19巻、3019ページ、1991年（3'-スルフヒドリル）；ジュスティ他、PCR Methods and Applications、第2巻、223〜227ページ、1993年とファング他、アメリカ合衆国特許第4,757,141号（P.E.バイオシステムズ社（カリフォルニア州）から市販されているAminolink TM IIを用いた5'-ホスホアミノ基）；スタビンスキー、アメリカ合衆国特許第4,739,044号（3-アミノアルキルホスホリル基）；アグラワル他、Tetrahedron Letters、第31巻、1543〜1546ページ、1990年（ホスホルアミダイト結合を通じた結合）；スプロート他、Nucleic Acids Research、第15巻、4837ページ、1987年（5-メルカプト基）；ネルソン他、Nucleic Acids Research、第17巻、7187〜7194ページ、1989年（3'-アミノ基）など。
【０１５８】
発光標識を検出する手段は当業者には周知である。例えば発光標識は、発光体を適切な波長の光を用いて励起させ、発生する発光を検出することによって検出を行なうことができる。発光は、写真フィルム、電子検出器（例えば電荷結合素子（CCD）、光電増倍管）などの手段を用いて目で検出することができる。同様に、酵素標識は、酵素にとって適切な基質を提供し、得られる反応生成物を検出することによって検出を行なうことができる。
合成
本発明の化合物は、一般によく知られている合成法を適切に組み合わせることによって合成する。本発明の化合物を合成するのに有効な方法は、関連分野の当業者にとって明らかであると同時に、当業者が利用することもできる。以下の説明は、本発明の化合物を作り上げるのに用いうるさまざまな方法のうちのいくつかを示すためのものであり、本発明の化合物を調製する際に有効な反応または反応系列を制限する意図はない。
【０１５９】
本発明の化合物は、単一の立体異性体または立体異性体の混合物として調製することができる。好ましい実施態様では、この化合物は、実質的に単一の異性体として調製される。異性体に関して純粋な化合物は、異性体に関して純粋な合成中間体を用い、キラル中心における立体化学を不変なままにする反応か、完全に反転させる反応を組み合わせることによって調製する。また、最終生成物または合成経路に沿った中間生成物は、溶解させて単一の立体異性体にすることができる。特定の立体中心を反転させる、あるいは不変なままにするための方法と、立体異性体の混合物を溶解させる方法は、当業者には周知であり、特定の状況において適切な方法を選択する方法も当業者ならば容易に決定することができる。一般的な文献として、例えばファーニス他（編）、『実践的有機化学に関するフォーゲルの百科事典』、第5版、ロングマン・サイエンティフィック・アンド・テクニカル社、エセックス、1991年、809〜816ページ；へラー、Acc. Chem. Res.、第23巻、128ページ、1990年を参照のこと。
【０１６０】
本発明の二面冠複合化剤を合成するための経路の一例を合成経路図1に示す（図1）。脱水条件下でイソフタル酸を2-メルカプトチアゾリンなどの活性基と接触させることによりイソフタル酸誘導体を2つのカルボキシル位置で活性化させ、化合物1を生成させる。活性化したカルボキシル酸誘導体1は、この化合物1を過剰にした条件下で骨格成分と反応させることによりポリアミンなどの骨格に結合させ、化合物2を生成させる。リガンドとなる化合物2は、他の骨格（例えばリンカー）分子と反応させることにより、大環状アナログ3に変換する。骨格分子は、化合物2を生成させるのに用いた骨格と同じでも異なっていてもよい。
【０１６１】
別の合成経路の一例を合成経路図2に示す（図8）。2-メトキシイソフタロイルチアゾリン1を、トリス（2-アミノエチル）アミン（“TRENSAM”）などのポリアミン・リガンドと反応させ、化合物7を生成させる。反応は、リガンドのそれぞれのアミンをアシル化するため、リガンドを極めて希釈した条件下で行なわせる。続いて化合物7をメチルアミンなどのアミンと反応させ、リガンド8を生成させる。
【０１６２】
さらに別の合成経路の一例を合成経路図3に示す（図9）。化合物7（合成経路図2）を反応性アミンとカルボキシル酸基16を含むリンカー・アミンで処理し、化合物17を生成させる。化合物17をメチルアミンなどのアミンと反応させることにより錯化リガンドに変換し、化合物18を生成させる。
【０１６３】
さらに別の合成経路の一例を合成経路図4に示す（図10）。化合物7（合成経路図2）を一端が保護されたジアミン21を用いて化合物23を生成させる。過剰なジアミンを用い、利用可能な反応基のそれぞれが、対応するアミドに変換されるようにする。反応物の濃度や化合物2に対する化合物21のストイキオメトリーなどの条件を変えることによって反応基の変換率を制御できることは、当業者にとっては明らかであろう。
【０１６４】
リンカー・アームは、キレート剤の骨格に結合させることもできる。例えば合成経路図5（図11）において、末端がアミンであるリンカー・アームが骨格と一体化しているようなリンカー・アームを有するキレート剤が調製される。
【０１６５】
上記の合成経路は本発明の実施態様のいくつかを具体的に示すことを目的としたものであり、当業者であれば、不適当な実験手段を用いることなく、本発明のリガンドを生成させる他の多くの合成経路が利用できることがわかるであろう。
【０１６６】
イソフタルアミジル基における置換基とイソフタルアミジル基を結合させる骨格における置換基は、その置換基そのものが、ヒドロキシイソフタミジル基以外のキレート剤を含むことができる。これらキレート剤は、カルボキシル酸塩基またはホスホン酸塩基など、アニオン基を複数含んでいることが好ましい。好ましい実施態様では、これら非PLキレート剤は、ランタニド・キレート剤として機能しうる化合物の中から選択する。別の好ましい実施態様では、キレート剤は、アミノカルボキシル酸塩である（すなわちEDTA、DTPA、DOTA、NTA、HDTAなどと、これらのホスホン酸塩のアナログ、例えばDTPP、EDTP、HDTP、NTPなど）。
【０１６７】
多くの有効なキレート基、クラウン・エーテル、クリプタンドなどが従来技術で知られており、本発明の化合物に組み込むことができる。例えば、マルテル編、『生物学と医学における無機化学』の中のピット他、「過負荷の鉄を処理するためのキレート剤の設計」、アメリカ合衆国化学会、ワシントンD.C.、1980年、279〜312ページ；リンドイ、『大環状リガンド錯体の化学』、ケンブリッジ大学出版、ケンブリッジ、1989年；ドゥガス、『生物有機化学』、シュプリンガー−フェアラーク社、ニューヨーク、1989年や、これら文献に含まれる参考文献を参照のこと。
【０１６８】
以上に加え、当業者は、キレート剤、クラウン・エーテル、シクロデキストリンを他の分子に結合させるさまざまな経路を知っている。例えば、フィーニー他編、『タンパク質の修飾：食品、栄養物、薬理学の側面』の中のミアーズ他、「キレートをタグにしたインビボのタンパク質とポリペプチドの性質」、アメリカ合衆国化学会、ワシントンD.C.、1982年、370〜387ページ；カシナ他、Bioconjugate Chem.、第9巻、108〜117ページ、1998年；ソング他、Bioconjugate Chem.、第8巻、249〜255ページ、1997年を参照のこと。
【０１６９】
別の実施態様では、イソフタルアミジル基における置換基または骨格における置換基は、発光増感剤である。増感剤の具体例としては、ローダミン560、575、590、フルオレセイン、2-キノロン、4キノロン、2-クマリン、4-クマリン、これらの誘導体であるクマリン445、450、490、500、503、4-トリフルオロメチルクマリン（TFC）、7-ジエチル-アミノ-クマリン-３-カルボヒドジドなどのほか、特に、カルボスチリル124（7-アミノ-4-メチル-2-キノロン）、クマリン120（7-アミノ-4-メチル-2-クマリン）、クマリン124（7-アミノ-4-（トリフルオロメチル）-2-クマリン）、アミノメチルトリメチルソラーレン、ナフタレンなどが挙げられる。
【０１７０】
好ましい一実施態様では、増感剤はナフチル部分を含む部分である。
【０１７１】
PLを形成して精製した後、発光ランタニド錯体を、従来技術で知られているさまざまな方法のうちの任意の方法を用いて合成する。方法としては、例えば、キレートの塩をランタニド三ハロゲン化物、ランタニド三酢酸塩などのランタニド塩とともに定温放置する方法がある。
【０１７２】
本発明の化合物は、非共役形の状態で、プローブ、指示薬、分離媒体などとして使用できる。さらに、本発明の化合物は、特異的な標識、プローブ、診断剤および／または治療剤などを生成する多彩な化合物と共役させることができる。本発明の化合物を共役させることのできる化学種の具体例としては、タンパク質、（例えば抗体、酵素、受容体など）、核酸（例えばRNA、DNAなど）、生物活性分子（例えば薬物、毒物など）などの生体分子；ガラス、ポリマー・ビーズ、シート、ファイバー、膜（例えばナイロン、ニトロセルロース）、スライド（例えばガラス、水晶）、プローブなどの固体基質などが挙げられる。
【０１７３】
好ましい実施態様では、本発明の化合物が共役する化学種は、生体分子である。好ましい生体分子は、抗体、核酸、酵素、ハプテン、炭水化物、抗原からなるグループの中から選択した生体分子である。
アッセイと、PLを有するプローブ
別の好ましい実施態様として、本発明により、プローブ分子などの別の分子に束縛されるPLと、このプローブを利用したアッセイが提供される。
アッセイ
以下の説明は、この明細書に記載したアッセイ全般に関係する。この説明は、好ましいいくつかの実施態様を参照して本発明を明らかにすることを目的としたものであり、この説明が、プローブの範囲と、本発明の化合物を用いるアッセイのタイプの範囲を制限すると解釈してはならない。本発明の化合物を用いる他の形式のアッセイは、当業者には明らかであろう。
【０１７４】
特異的な結合反応に基づくアッセイは、さまざまな生物流体および組織サンプルの中の薬物、ホルモン、酵素、タンパク質、抗体、感染媒体などの多彩な物質を検出するのに用いられる。一般に、このアッセイは、分析物と、分析物の認識部分と、検出を可能にする標識からなる。競合アッセイでは、一般に、これら化合物に加えて結合パートナーを利用する。一実施態様では、結合パートナーは、認識部分と相互作用して錯体を形成する分子である。ただしこの錯体は、認識部分と分析物の間で形成される似たような錯体よりは本来的に安定性が劣り、したがって入ってくる分析物によって置換される。
【０１７５】
特異的結合相互作用の結果は直接には観察できないことがしばしばあるため、相互作用が存在していることを明らかにするためのさまざまな発光標識が考案されている。本発明の発光体は、発光分光法により検出するか、あるいは肉眼で検出する。本発明の実施に有効な標識、標識結合操作、標識の検出に関する初歩的な解説は、ポラック他、『免疫細胞化学序説』、第2版、シュプリンガー・フェアラーク社、ニューヨーク、1977年；ハンドブックとカタログを合わせた性格の、ホーグランド著、『発光プローブと化学物質探索のハンドブック』、モレキュラー・プローブズ社、ユージーン、オレゴン州、1996年に記載されている。
【０１７６】
いくつかの実施態様では、アッセイは競合アッセイである。実際には、アッセイの要素（すなわち、認識部分、結合パートナー、分析物）は実質的に任意の化学構造を有することができるが、好ましい実施態様では、認識部分、結合パートナー、分析物は互いに独立で、小分子生物活性剤、生体分子、およびこれらの組み合わせからなるグループの中から選択する。アッセイの要素が生体分子である場合には、その生体分子は、ハプテン、抗体、抗原、炭水化物、核酸、ペプチド、酵素、受容体からなるグループの中から選択することが好ましい。
【０１７７】
競合アッセイの形態では、1つまたはそれ以上の要素を本発明の化合物で標識する。例えば、一実施態様では、結合パートナーを本発明の化合物で標識し、固定化した認識部分からそれが分離したものを、アッセイの液相中に発光が出現することにより検出する。別の競合アッセイの形態では、固定化した酵素を、本発明の化合物と共役した基質と錯体化する。次にこの錯体をアンタゴニストと推定されるものと接触させる。固定化した酵素から発光が移動してアッセイの液相に入ったということは、アンタゴニストと推定されるものによって基質が移動したことを示唆している。これらの実施態様は単に具体例として提示しただけであり、他の多くの競合アッセイの形態において本発明の化合物を利用することでその利点を活用しうることは、当業者には明らかであろう。
【０１７８】
結合を確認することに加え、2つまたはそれ以上の結合パートナー間のアフィニティの大きさを定量化することがしばしば望まれる。そこで、この明細書に開示した化合物をそうしたアッセイのサポートとして利用することも、本発明の範囲に含まれる。
【０１７９】
たいていの場合、存在している分析物の量は、結合が起こった後に、結合パートナー、分析物、または認識部分に固定された標識の量を測定することによって確認する。発光標識を検出して定量化する手段は、当業者には周知である。
【０１８０】
別の好ましい実施態様では、2つまたはそれ以上のアッセイ要素間のアフィニティは、分析物−認識部分錯体、自由状態の分析物、自由状態の結合パートナー、結合パートナー−認識部分錯体、およびこれえらの組み合わせからなるグループの中から選択したものの数量を定量化することによって確認する。
【０１８１】
2つの分子のアフィニティ・データを取り出すためのアッセイの形態は、受容体と結合することが知られているリガンドがアンタゴニストによって受容体に移動するような実施態様を調べることにより理解できる。この形態に関する他の変形例は、当業者には明らかであろう。競合の形態は、当業者には周知である。例えば、アメリカ合衆国特許第3,654,090号、第3,850,752号を参照のこと。
【０１８２】
アンタゴニストの受容体への結合は、その受容体とアンタゴニストに対するリガンドを用いた競合結合法によって調べることができる。結合アッセイは、例えば、96ウエル濾過プレート・アセンブリ（ミリポア・コーポレーション、ベッドフォード、マサチューセッツ州）の中で実施することができる。3つの結合パートナーのうちの1つ（すなわちリガンド、アンタゴニスト、または受容体）は、一般に、ウエルと結合するか、あるいはそのウエルの中に含まれる特定の物質と結合する。
【０１８３】
競合結合のデータは、非線形最小自乗曲線フィッティングを始めとする多くの方法で分析することができる。リガンドが受容体に対するアンタゴニストである場合には、この方法により、アンタゴニストのIC50（平衡時にリガンドの特異的な結合を50％抑制するアンタゴニストの濃度）が得られる。IC50は、チェンとプルーソフの方程式：Ki=IC50/（1+L/Kd）（この式において、Lは競合結合アッセイで使用するリガンドの濃度、Kdはスカッチャード分析によって決定したリガンドの解離定数である）に基づいたアンタゴニストの平衡解離定数（Ki）と関係している。これらアッセイは、特に、マドックス他、J. Exp. Med.、第158巻、1211ページ、1983年；ハンプトン他、『血清学的方法、実験室マニュアル』、APSプレス、セント・ポール、ミネソタ州、1990年に記載されている。
【０１８４】
本発明のアッセイは、溶液中のいくつかの成分または全成分について実施することができる。また、1つまたはそれ以上の成分がアッセイ媒質に実質的に溶けなくてもよい。好ましい実施態様では、認識部分、結合パートナー、分析物からなるグループの中から選択した1つまたはそれ以上の要素を表面に結合させる。有用な表面としては、ガラス、ポリマー・ビーズ、シート、ファイバー、膜（例えばナイロン、ニトロセルロース）、スライド（例えばガラス、水晶）などが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【０１８５】
アッセイは、多彩な方法で実行することができる。当業者であれば、例えば、いつランタニドをキレート化することによって発光体を形成するか、どのアッセイ要素にキレートを結合させるべきかなどを決定する能力を有する。好ましい実施態様では、結合パートナー−認識部分錯体から結合パートナーを分離する前に発光錯体を形成する。別の好ましい実施態様では、結合パートナー−認識部分錯体から結合パートナーを分離した後に発光錯体を形成する。
【０１８６】
結合パートナー−認識部分錯体から結合パートナーを分離した後、分離によって形成される混合物に対してアッセイの残ったステップを実行すること、または混合物の1つまたはそれ以上の成分を除去することができる。好ましい一実施態様では、本発明の方法は、認識部分−結合パートナーのペア、分析物−認識部分のペア、およびこれらの組み合わせからなるグループの中の要素から自由状態の結合パートナーを分離する操作をさらに含んでいる。
【０１８７】
好ましい一実施態様では、本発明のアッセイは、免疫アッセイである。免疫アッセイには、さまざまな化合物や物質（抗原）の特異的抗原決定基と結合することのできる免疫グロブリン（抗体）相互の間の反応が含まれる。別のタイプの反応としては、アビジンとビオチン間の結合、プロテインAと免疫グロブリンの結合、レクチンと糖部分の結合などの反応が挙げられる。例えば、ルーヴァリングに対して発行されたアメリカ合衆国特許第4,313,734号；ツークに対して発行されたアメリカ合衆国特許第4,435,504号；ゴードンに対して発行されたアメリカ合衆国特許第4,452,901号と第4,960,691号；キャンベルに対して発行されたアメリカ合衆国特許第3,893,808号を参照のこと。
【０１８８】
アッセイ技術により、少量の分析物の存在と量の両方を検出することができる。またこのアッセイ技術は、例えば医学的診断や法廷での応用に役立つ。本発明の方法においては、一般に、分析物の検出、または認識部分に分析物が結合したことの検出に、本発明の発光標識を用いる。
【０１８９】
免疫アッセイには、大きく3つのタイプがある。競合結合アッセイの一例では、標識した試薬と標識していない分析用化合物が、結合物質上の部位に結合する際に競合する。サンプル溶液中の分析物の濃度を決定するため、定温放置期間が過ぎた後、結合しなかった物質を洗い流し、その部位に結合した標識された試薬の量を参照量と比較する。
【０１９０】
第2のタイプの免疫アッセイは、サンドイッチ・アッセイとして知られており、一般に、分析物を含むサンプル溶液を、その分析物に対する免疫学的特異性を有する第1の結合物質を含む表面と接触させる操作を含んでいる。次に、第1の結合物質と同じタイプの本発明の化合物を有する結合物質（抗原または抗体）を含む第2の溶液を分析物に添加する。標識された結合物質は、第1の結合物質と結合するすべての分析物と結合することになる。次に、分析物系を洗浄して、分析物と結合しそこなった標識された結合物質を除去すると、残っている標識された物質の量は、普通は結合した分析物の量に比例している。
【０１９１】
第3のタイプの免疫アッセイには凝集反応が含まれている。このタイプのアッセイの具体例は、血液抗体と血清型を決める周知のアッセイである。血清中の抗体と赤血球細胞の表面に提示される抗原との間の免疫相互反応性は、赤血球細胞と抗体の間で三次元的架橋ネットワークが形成されることによってわかる。血清／赤血球細胞混合物が凝集する結果として、肉眼で見ることのできるペレットが形成される。肉眼で見えるのは、分析物の1つまたはそれ以上の要素に結合した本発明の化合物が発光するためである。
【０１９２】
上に列挙したアッセイは、もともとは、酵素と放射性標識物質の間の反応を微小滴定プレートなどの装置内の溶液中で実施するという液相免疫化学法として実施された。最近になって、この方法は、固定化した基質上の溶液中で免疫反応が行なわれるという“固相”アッセイの形態になった。
【０１９３】
これらのタイプのアッセイは、一般に、免疫クロマトグラフィ・タイプの免疫アッセイと呼ばれており、競合アッセイ、サンドイッチ・アッセイ、または凝集アッセイの要点を利用してさまざまな形態に展開することができる。これらアッセイでは、固定化した基質を横断する流れ、または固定化した基質に沿った流れも用いることができる。一般に、大きなタンパク質分析物または抗体を検出するにはサンドイッチ・アッセイが最も有効である。横断流タイプのアッセイは、サンドイッチ・タイプのアッセイで非常に多く用いられてきた。
【０１９４】
本発明の発光物質を用いた免疫クロマトグラフィ・サンドイッチ・免疫アッセイの一例では、多孔性表面と、結合ペアの一方（例えば抗原または抗体）に結合した可視標識としての本発明の化合物とを用いる。多孔性表面は一般に平坦なシートであり、通常はナイロン、ニトロセルロース、グラス・ファイバーなどでできている。典型的な免疫クロマトグラフィの形態では、多孔性表面上のある領域または小範囲は、結合ペアの一方の要素を多孔性膜に直接固定化することによって、またはその要素を、多孔性膜の表面上に固定化された捕獲用粒子（すなわちラテックス、ガラス）上に間接的に結合させることによって、固相捕獲面になる。多孔性膜または捕獲用粒子に対する結合ペアの直接的固定化は、静電相互作用（すなわちイオン電荷の差）、疎水性相互作用、または共有結合を通じて起こる。捕獲用粒子を用いる場所では、多孔性膜に対する捕獲用粒子の固定化は、同じ現象を通じて、または粒子が膜の孔またはファイバーを通じて移動するのを防ぐサイズ排除を通じても起こりうる。他の多くのタイプのアッセイを、本発明の化合物を用いて実施することができる。
【０１９５】
典型的な非競合免疫クロマトグラフィ・アッセイでは、血液、血清、血漿、唾液、尿などの生物流体試験サンプルが十分な量必要であり、対象とする分析物、標識した粒子、捕獲固相の三者間で十分な相互作用が起こるのに十分な濃度の分析物を含んでいなくてはならない。反応速度を増大させるためには、結合ペアのうちで粒子標識した要素の濃度と、多孔性膜または捕獲用粒子の表面の結合ペアの濃度を最適化して、できるだけ特異的結合が起こるようにすると同時に、いかなる非特異的結合もできるだけ起こらないようにする。粒子標識した要素の濃度は、興味の対象である分析物の濃度範囲を通じてプロゾーン現象が起こらない濃度になっている必要がある。そのような濃度最適化は、当業者なら容易にできる。
【０１９６】
免疫クロマトグラフィ・アッセイは、疎水性支持体（例えばマイラー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ガラスなど）を用いて多層化した本発明の物質のストリップまたは層の形態にすることができる。このとき、本発明の1つまたはそれ以上の化合物、または本発明の化合物を用いて機能化した部分は、接着剤などの結合剤を用いて支持体に直接的または間接的に固定する。望むのであれば、免疫反応体同士を接触させると同時に、疎水性の支持体とハウジングを用いて流体相の蒸発を少なくすることができる。
【０１９７】
本発明のこの側面による非競合アッセイの一例では、分析物を溶解させ、堆積させ、微粒子状物質の表面に結合させる。次に微粒子状物質を水和させ、一次抗体と、一次抗体に対して特異的な酵素結合二次抗体に順番に暴露する。このとき、適切なところに洗浄ステップを挿入する。次に、例えば従来技術で周知の基質変換プロトコルに従って酵素レベルを決定すると、並行して実施する標準的操作を参照することにより、一次抗体の量を測定することができる。
【０１９８】
さらに、例えば受容体の結合ドメインは、薬物発見アッセイの急所として役立つ可能性がある。受容体は固定化して、結合ドメインと相互作用することがわかっている薬剤（すなわちリガンド）および試験する特別な薬物または抑制剤の所定量とともに定温放置する。定温放置成分の1つを本発明の化合物で標識する。すると、どれくらいの薬物が受容体と結合し、したがって受容体−リガンド錯体がどれだけ形成されるかを測定することができる。薬物発見アッセイにおけるこのような可能性をこの明細書は考慮しており、これも本発明の範囲に含まれると考えられる。他の重要な点と適切なアッセイの形態は、当業者には明らかであろう。
【０１９９】
本発明の化合物と方法は、核酸とペプチドの配列決定にも用いることができる。発光標識した糖ヌクレオチド・プライマーが、DNA断片を五感による検出を行なうために放射性標識したプライマーの代わりに使用されてきた（スミス他、アメリカ合衆国特許第4,855,225号）。さらに、DNAシークエンシングの産物は、発光性ジデオキシヌクレオチド（プローバー他、アメリカ合衆国特許第5,047,519号）で標識すること、または発光標識をつけたデオキシヌクレオチドを直接組み込むことにより標識すること（ヴォス他、Nucl. Acids Res.、第17巻、2517ページ、1989年）が可能である。本発明の化合物は、これら2つの形態のどちらでも有効である。現在のところ、発光シークエンシング反応を用いると、放射性核種を使用することに付随する問題の多くを回避できる。
【０２００】
上に説明したように、発光錯体は、アッセイの実質的に任意のステップにおいて形成することができる。これは、結合パートナーの移動後に分析混合物の1つまたはそれ以上の成分を除去する実施態様にも同様にあてはまる。好ましい実施態様では、発光錯体は、分離後に形成する。
【０２０１】
本発明の化合物は、混合物中の酵素の存在と量を明らかにするのに用いることができる。例えばいくつかの実施態様では、Q1は酵素によって変化しやすい基であり、この変化しやすい基がヒドロキシイソフタミジル基のフェノールの酸素上に存在していると、ランタニド・イオンの安定な錯体の形成が妨げられることになる。ヒドロキシイソフタミジル・キレートが、変化しやすい基を開裂させることのできる酵素と接触してフェノール酸素アニオンを自由状態にしたとき、この状況が逆転し、安定なランタニド錯体が形成される。上記の実施態様と同様、分析混合物は、アッセイ・プロセス中の任意の時点で酵素と接触させることができる。さらに、反応混合物から1つの成分を分離する場合には（例えば解放された結合パートナー）、その分離された成分および／または残った成分を酵素と接触させることができる。
【０２０２】
Q1が酵素によって変化しやすい基となっている好ましい一実施態様では、この方法は、結合パートナー−認識部分錯体、自由状態の結合パートナー、およびこれらの組み合わせからなるグループの中から選択した1つの要素を酵素と接触させ、酵素によって変化しやすい基を除去する操作をさらに含んでいる。
【０２０３】
酵素によって変化しやすいさまざまな基は従来技術において公知であり、当業者であれば、個々の用途において、酵素によって変化しやすい適切な基を選択することができる。好ましい一実施態様では、酵素によって変化しやすい基は、リン酸塩、硫酸塩、アシル基、グリコシド基からなるグループの中から選択した1つの要素を含んでいる。これらの基を除去することのできる酵素としては、例えばエステラーゼ、ホスファターゼ、グリコシダーゼなどが挙げられる。
【０２０４】
別の好ましい実施態様では、酵素によって変化しやすい基を除去し、続いて発光錯体を形成するという方法を用いて、酵素によって変化しやすい基を除去することのできる酵素の存在を検出する。例えば、1993年10月12日に発行されたドレヴィン他のアメリカ合衆国特許第5,252,462号を参照のこと。
【０２０５】
本発明の化合物は分析する任意の成分に結合させることができるとはいえ、たいていは結合パートナーに結合させる。この実施態様では、本発明の化合物は、フタルイミジル部分、骨格、またはアミド置換基の上の反応基を通じて結合パートナーに結合させることができる。また本発明の化合物は、この化合物の1つまたはそれ以上のヒドロキシイソフタミジル部分の芳香核上の反応基を通じて結合パートナーに結合させることもできる。上で説明したように、当業者には適切な反応基が多数知られており、当業者であれば、個々の用途において、適切に機能化したヒドロキシイソフタミジル・キレートの選択と調製の両方ができる。
【０２０６】
ヒドロキシイソフタミジル・キレートと結合パートナーの間の結合は、アッセイ条件下で安定であることが一般に好ましかろう。結合パートナーと、アミド、アミン、エーテル、尿素などのヒドロキシイソフタミジル・キレートの間には、多くの安定な結合を形成することができる。好ましい一実施態様では、結合パートナーと本発明の化合物の間の結合は、アミド結合、チオアミド結合、チオ尿素結合、カルバミン酸塩結合からなるグループの中から選択した1つの結合である。適切な反応基と結合は、すでに詳しく説明してある。
【０２０７】
一般に、核酸などの標的分子の濃度を決定するためには、プローブと核酸リガンドの一定量をさまざまな量の標的と接触させた参照データをまず最初に得ることが好ましい。それぞれの参照混合物からの発光を利用して、標的の濃度を発光と対比させたグラフまたは表を導く。例えば、a）標的となる自由状態の核酸リガンドにハイブリダイズし、b）5'末端と3'末端が発光基およびPL標識の部位となっているステムループ構造を有するプローブを用いると、そのような参照データを得ることができよう。そのようなプローブは、一定量のプローブと核酸リガンドの存在下では、標的の濃度が増加するにつれて発光が少なくなるという特徴的な発光プロファイルを示す。次に、未知量の標的を含む試験混合物を同じ量の第1の核酸リガンドおよび第2のプローブと接触させ、発光を測定する。次に発光の値を参照データと比較して、試験混合物中の標的の濃度を得る。
多重分析
別の好ましい実施態様では、本発明のクエンチャーを、混合物中の複数の化学種を検出するためのアッセイにおいて用いられる1つまたはそれ以上のプローブの要素として使用する。異なる発光体を有する少なくとも2つのプローブを用いることによって2つまたはそれ以上の化学種を検出するのに用いるアッセイのことを、この明細書では“多重分析”と呼ぶ。PLを用いたそうした多重分析の構成を図20に示す。
【０２０８】
本発明の化合物を含むプローブも、多重タイプの分析およびアッセイを行なうのに役立つ。典型的な多重分析では、2つまたはそれ以上の別々の化学種（または1つまたはそれ以上の領域）を、2つまたはそれ以上のプローブを用いて検出する。その場合、各プローブは異なる発光体で標識する。発光エネルギー移動に基づく好ましい多重分析は、理想的にはいくつかの基準を満たす。発光化学種は、明るくてスペクトル分解能が優れている必要があり、発光化学種と受容体の間のエネルギー移動が十分になくてはならない。
【０２０９】
異なる発光特性を有する本発明のさまざまなPLを用いることができるため、本発明の化合物は多重分析の用途に特に適している。幅広い吸収特性を有するPLを利用することにより、受容体の吸収特性とPLの発光特性が一致しており、スペクトルの重なりが有効なレベルとなるFETプローブを設計することができる。
【０２１０】
FETを用いた2つまたはそれ以上のプローブを同時に使用する方法が従来技術で知られている。例えば、異なる配列特性を有する複数の核酸プローブを用いた多重アッセイが知られている。個体がホモの野生型であるか、ホモの突然変異体であるか、特定の突然変異に関してヘテロであるかを決定するのに発光プローブが用いられてきた。例えば、野生型配列を認識するクエンチされたフルオレセイン分子標識と、突然変異した対立遺伝子を認識するローダミンがクエンチされた別の分子を用いることにより、β−ケモカイン受容体に関して個体の表現型を分類することができる（コストリキス他、Science、第279巻、1228〜1229ページ、1998年）。発光信号だけが存在しているというのは、その個体が野生型であることを示しており、ローダミン信号だけが存在しているというのは、その個体がホモの突然変異体であることを示している。ローダミン信号とフルオレセイン信号の両方が存在していると、ヘテロという診断になる。チャギ他（Nature Biotechnology、第16巻、49〜53ページ、1998年）は、対立遺伝子を識別するために4つの異なる標識分子を同時に使用する方法を記載している。またリー他（BioTechniques、第27巻、342〜349ページ、1999年）は、6つのPCR産物の7色均一検出を記載している。
【０２１１】
本発明のPLは、実質的に任意の化学種を検出および／または定量化するために設計された多重アッセイに用いることができる。化学種としては、例えば、細胞全体、ウイルス、タンパク質（例えば酵素、抗体、受容体）、糖タンパク質、リポタンパク質、細胞より小サイズの粒子、細菌（例えばサルモネラ）、核酸（例えばDNA、RNA、これらのアナログ）、多糖、リポ多糖、脂質、脂肪酸、非生物ポリマー、小さな生物活性分子（例えば毒素、薬物、殺虫剤、代謝産物、ホルモン、アルカロイド、ステロイド）などが挙げられる。
認識部分
この明細書では、“認識部分”という用語は、引力または斥力によって分析物と相互作用することのできる分子のことを意味する。好ましい一実施態様では、認識部分が本発明の化合物と共役する。別の実施態様では、分析物と認識部分が、例えば共有結合、イオン結合、イオン・ペア形成、ファン・デル・ワールス力などによって密に会合したペアを形成する。別の実施態様では、分析物と認識部分が、立体特性が両立しないとか、電荷−電荷の反発、親水性−疎水性相互作用などの反発メカニズムによって相互作用する。一般的な“認識部分”という用語と“分析物”という用語の間には意味の重なりがあると理解されている。ある特定の用途では、1つの化学種が分析物となることが可能であるが、別の用途では、その化学種が認識部分として機能する。いくつかの実施態様では、本発明の化合物が認識部分として機能する（例えば分析物が金属イオンの場合）。
【０２１２】
認識部分は、さまざまな小さな生物活性分子（例えば薬物、殺虫剤、毒素など）、有機官能基（例えばアミン、カルボニル、カルボキシル酸塩など）、生体分子、金属、金属キレート、有機金属化合物の中から選択することができる。
【０２１３】
認識部分がアミンの場合には、その認識部分が、分析物上にあってアミン（例えばカルボニル基、アルキルハロ基）と相互作用することによって反応する構造と相互作用（例えば結合、錯化）することが好ましい。別の好ましい実施態様では、アミンは、興味の対象である分析物上の酸性部分（例えばカルボン酸、スルホン酸）によってプロトンが付加される。
【０２１４】
好ましいいくつかの実施態様では、認識部分がカルボン酸である場合には、その認識部分が例えば錯体化によって分析物（例えば金属イオン）と相互作用することになる。さらに別の好ましい実施態様では、カルボン酸は、分析物上の塩基（例えばアミン）にプロトンを付加する。
【０２１５】
別の好ましい実施態様では、認識部分は薬物部分である。薬物部分としては、臨床用としてすでに受け入れられている薬剤、あるいは用途が実験用であるか活性メカニズムまたは作用メカニズムを研究中の薬物が可能である。薬物部分は、所定の疾病状態において確認されている作用を有することが可能である。あるいは、所定の疾病状態で望ましい作用を示すことが仮定されているだけでもよい。好ましい一実施態様では、薬物部分は、選択した分析物と相互作用する能力をスクリーニングする化合物である。そのようなわけで、本発明において認識部分として役立つ薬物部分には、多彩な薬理学的活性を有する幅広いタイプの薬物からの薬が含まれる。
【０２１６】
役に立ついろいろな種類の薬の中に、例えば、非ステロイド系抗炎症薬（NSAIDS）がある。NSAIDSは、例えば、プロピオン酸誘導体、酢酸誘導体、フェナム酸誘導体、ビフェニルカルボキシル酸誘導体、オキシカムというカテゴリーの中から選択することができる。他のタイプの薬としては、ヒドロコルチゾンなどのステロイド系抗炎症薬；抗ヒスタミン薬（例えばクロルフェニラミン、トリプロリジン）；抗咳薬（例えばデキストロメトルファン、コデイン、カルミフェン、カルベタペンタン）；抗かゆみ薬（例えばメチジリジン、トリメプリジン）；抗コリン作動薬（例えばスコポラミン、アトロピン、ホマトロピン、レボドパ）；抗嘔吐薬（例えばシクリジン、メクリジン、クロルプロマジン、ブクリジン）；食欲抑制薬（例えばベンズフェタミン、フェンテルミン、クロルフェンテルミン、フェンフルラミン）；中枢神経刺激薬（例えばアンフェタミン、メタンフェタミン、デキストロアンフェタミン、メチルフェニデート）；抗不整脈薬（例えばプロパノロール、プロカインアミド、ジソピラミド、キニジン、エンカイニド）；β−アドレナリン遮断薬（例えばメトプロロール、アセブトロール、ベタキソロール、ラベタロール、チモロール）；強心薬（例えばミルリノン、アムリノン、ドブタミン）；抗高血圧薬（例えばエナラプリル、クロニジン、ヒドララジン、ミノキシジル、グアナドレル、グアネチジン）；利尿薬（例えばアミロリド、ヒドロクロロチアジド）；血管拡張薬（例えばジルチアゼム、アミオダロン、イソスプリン、ニリドリン、トラゾリン、ベラパミル）；血管収縮薬（例えばジヒドロエルゴタミン、エルゴタミン、メチルセルジド）；抗潰瘍薬（例えばラニチジン、シメチジン）；麻酔薬（例えばリドカイン、ブピバカイン、クロルプロカイン、ジブカイン）；抗鬱薬（例えばイミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン）；精神安定薬および沈静薬（例えばクロルジアゼポキシド、ベナシチジン、ベンズキナミド、フルラザパム、ヒドロキシジン、ロクサピン、プロマジン）；抗精神病薬（例えばクロルプロチキセン、フルフェナジン、ハロペリドール、モリンドン、チオリダジン、トリフルオペラジン）；殺菌薬（抗菌薬、抗真菌薬、抗原生動物薬、抗ウイルス薬）がある。
【０２１７】
本発明の組成物に組み込むのが好ましい抗微生物薬としては、例えば、β−ラクタム薬の薬理学的に受容可能な塩、キノロン薬、シプロフロクサシン、ノルフロクサシン、テトラシクリン、エリスロマイシン、アミカシン、トリクロサン、ドキシシクリン、カプレオマイシン、クロルヘキシジン、クロルテトラシクリン、オキシテトラシクリン、クリンダマイシン、エタンブトール、イソチオン酸ヘキサミジン、メトロニダゾール、ペンタミジン、ゲンタマイシン、カナマイシン、リネオマイシン、メタシクリン、メテナミン、ミノシクリン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、ミコナゾール、アマンファジンが挙げられる。
【０２１８】
本発明を実施する際に用いられる他の薬物部分としては、抗腫瘍薬（例えば抗アンドロゲン（例えばリュープロリド、フルタミド）、殺細胞剤（例えばアドリアマイシン、ドクソルビシン、タキソール、シクロホスファミド、ブスルファン、シスプラチン、α-2-インターフェロン）、抗エストロゲン（例えばタモキシフェン）、代謝拮抗剤（例えばフルオロウラシル、メトトレキセート、メルカプトプリン、チオグアニン））が挙げられる。
【０２１９】
認識部分は、ホルモン（例えばメドロキシプロゲステロン、エストラジオール、リュープロリド、メゲストロール、オクトレオチド、ソマトスタチン）；筋弛緩薬（例えばシンナメドリン、シクロベンザプリン、フラボキセート、オルフェナドリン、パパベリン、メベベリン、イダベリン、リトドリン、デフェノキシレート、ダントロレン、アズモレン）；抗痙攣薬；骨活性化薬（例えばジホスホン酸塩薬化合物、ホスホノアルキルホスフィン酸塩薬化合物）；エンドクリン修飾薬（例えば避妊薬（例えばエチノジオール、エチニルエストラジオール、ノレシンドロン、メストラノール、デソゲストレル、メドロキシプロゲステロン）、糖尿病の調節薬（例えばグリブリド、クロルプロパミド）、テストラクトンやスタノゾロールなどのアナボリック、アンドロゲン（例えばメチルテストステロン、テストステロン、フルオキシメステロン）、抗利尿薬（例えばデスモプレシン）、カルシトニン）を含むことも可能である。
【０２２０】
本発明では、エストロゲン（例えばジエチルスチルベステロール）、グルココルチコイド（例えばトリアムシノロン、ベタメタゾンなど）、プロゲストーゲン（例えばノルエシンドロン、エチノジオール、レボノルゲストレル）；甲状腺剤（例えばリオチロニン、レボチロキシン）または抗甲状腺剤（例えばメチマゾール）；抗高プロラクチン薬（例えばカベルゴリン）；ホルモン抑制剤（例えばダナゾール、ゴセレリン）、分娩促進剤（例えばメチルエルゴノビン、オキシトシン）、プロスタグランジン（例えばミオプロストール、アルプロスタジル、ジノプロストン）も使用することができる。
【０２２１】
他の有用な認識部分としては、免疫調節薬（例えば抗ヒスタミン、マスト細胞安定剤であるロドクサミドおよび／またはクロモリン）、ステロイド（例えばトリアムシノロン、ベクロメタゾン、コルチゾン、デキサメタゾン、プレドニソロン、メチルプレドニソロン、クロベタゾール）、ヒスタミンH2アンタゴニスト（例えばファモチジン、シメチジン、ラニチジン）、免疫抑制剤（例えばアザチオプリン、シクロスポリン）などが挙げられる。スリンダック、エトドラック、ケトプロフェン、ケトロラックなどの抗炎症活性を有する基も使用される。本発明において用いられる他の薬は、当業者には明らかであろう。
【０２２２】
上に列挙した分子およびその他の分子は、当業者に周知の方法を用いて本発明の化合物や固体基質などに結合させることができる。さまざまなガイドを、例えば生物共役化学とドラッグ・デリバリーの分野の文献の中に見つけることができる。例えば、利用可能なアミンを含む薬を扱うことになった当業者は、さまざまなアミン誘導化反応の中から選択を行ない、機能化が適切になされたパートナー（例えばカルボン酸を末端に有するチオール）を有機層のために配置し、望むカップリングが起こるように選択した条件下（例えば脱水剤、具体的にはジシクロヘキシルカルボジイミドなど）で、そのパートナーを反応させることができよう。例えば、フィーニー他編、『タンパク質の修飾：食品、栄養物、薬理学の側面』、アメリカ化学会、ワシントンD.C.、1982年、370〜387ページ；ダン他編、『ポリマー薬とドラッグ・デリバリー系』、アメリカ化学会、ワシントンD.C.、1991年を参照のこと。
【０２２３】
認識部分がキレート剤、クラウン・エーテル、またはシクロデキストリンである場合には、ホスト−ゲスト化学反応が認識部分と分析物の間の相互作用を支配することになろう。ホスト−ゲスト化学反応を用いると、認識部分−分析物の特異性の大部分を本発明の化合物またはアッセイに工学的に組み込むことができる。特定の化合物に結合させるのにこれら化合物を用いることは、当業者には周知である。例えば、マルテル編、『生物学と医学における無機化学』の中のピット他、「過負荷の鉄を処理するためのキレート剤の設計」、アメリカ合衆国化学会、ワシントンD.C.、1980年、279〜312ページ；リンドイ、『大環状リガンド錯体の化学』、ケンブリッジ大学出版、ケンブリッジ、1989年；ドゥガス、『生物有機化学』、シュプリンガー−フェアラーク社、ニューヨーク、1989年や、これら文献に含まれる参考文献を参照のこと。
【０２２４】
さらに、当業者であれば、キレート剤、クラウン・エーテル、またはシクロデキストリンを他の分子に結合させるのに多数の経路を利用することができる。例えば、フィーニー他編、『タンパク質の修飾：食品、栄養物、薬理学の側面』の中のミアーズ他、「キレートをタグにしたインビボのタンパク質とポリペプチドの性質」、アメリカ合衆国化学会、ワシントンD.C.、1982年、370〜387ページ；カシナ他、Bioconjugate Chem.、第9巻、108〜117ページ、1998年；ソング他、Bioconjugate Chem.、第8巻、249〜255ページ、1997年を参照のこと。
【０２２５】
好ましい別の一実施態様では、認識部分が、興味の対象である分析物との間で包接化合物を形成する。特に好ましい一実施態様では、認識部分は、シクロデキストリンまたは修飾されたシクロデキストリンである。シクロデキストリンは、多数の微生物によって産生される一群の環式オリゴ糖である。シクロデキストリンは、篭の形をした環式構造を有する。この形になっているため、シクロデキストリンは、多種類の分子を内部空間に収容することができる。例えば、スゼートリ、『シクロデキストリンとその包接化合物』、アカデミアイ・クラド、ブダペスト、1982年；ベンダー他、『シクロデキストリンの化学』、シュプリンガー−フェアラーク社、ベルリン、1978年を参照のこと。
【０２２６】
シクロデキストリンは、薬物、殺虫剤、除草剤、化学兵器などのさまざまな生物活性分子との間で包接化合物を形成することができる。テンジャルラ他、J. Pharm. Sci.、第87巻、425〜429ページ、1998年；ツグール他、Pharm. Dev. Technol.、第3巻、43〜53ページ、1998年；アルバーズ他、Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst.、第12巻、311〜337ページ、1995年を参照のこと。重要なことだが、シクロデキストリンは、包接化合物内の化合物の個々のエナンチオマーを識別することができる。したがって、好ましい一実施態様として、本発明により、エナンチオマー混合物の中の特定のエナンチオマーを検出する方法が提供される。コッペンホーファー他、J. Chromatogr.、第A793巻、153〜164ページ、1998年を参照のこと。
【０２２７】
シクロデキストリンまたは他の任意の認識部分は、本発明の化合物や固体支持体などに、直接に、またはスペーサー・アームを介して結合させることができる。ヤマモト他、J. Phys. Chem.、第B101巻、6855〜6860ページ、1997年を参照のこと。シクロデキストリンを他の分子に結合させる方法は、クロマトグラフィおよび薬理学の当業者には周知である。スリーニヴァサン, Ｋ.Ｊ.、Appl. Polym. Sci.、第60巻、2245〜2249ページ、1996年を参照のこと。
【０２２８】
別の実施態様では、認識部分は、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）またはジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）などのポリアミノカルボキシル酸塩キレート剤である。これら認識部分は、例えば市販されている二無水物（アルドリッチ・ケミカル社、ミルウォーキー、ウィスコンシン州）を用いて、例えば本発明の化合物の要素、固体支持体の要素、またはスペーサー・アームの要素のうち、末端にアミンを有する任意の要素に結合させることができる。
【０２２９】
さらに好ましい実施態様では、認識部分は、タンパク質、核酸、ペプチド、抗体などの生体分子である。本発明を実施するのに有効な生体分子は、任意の供給源から得ることができる。生体分子は、天然の供給源から単離することや、合成によって生産することができる。タンパク質は、天然のタンパク質または突然変異したタンパク質である。突然変異は、化学的突然変異誘発、位置指定突然変異誘発、または当業者に知られている他の突然変異誘起法により起こす。本発明を実施するのに有効なタンパク質としては、酵素、抗原、抗体、受容体などが挙げられる。抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。ペプチドと核酸は、天然の供給源から単離することも、一部または全部を合成することもできる。
【０２３０】
認識部分がタンパク質または抗体である実施態様では、タンパク質を、そのタンパク質の表面で利用できる任意の反応性ペプチド残基を用いて、本発明の化合物、固体支持体、または架橋剤に結合させることができる。好ましい実施態様では、反応基は、アミンまたはカルボン酸塩である。特に好ましい実施態様では、反応基は、リシン残基のε−アミン基である。
【０２３１】
認識部分が抗体である場合には、認識部分を用いて分析物を認識することができる。分析物は、タンパク質、ペプチド、核酸、糖のほか、薬物、除草剤、殺虫剤、工業用化学薬品、化学兵器などの小さな生物活性物質である。特定の分子に対する抗体を作る方法は、当業者には周知である。フェンらに対して1992年9月15日に発行されたアメリカ合衆国特許第5,147,786号；スタンカーらに対して1994年8月2日に発行されたアメリカ合衆国特許第5,334,528号；アル−バヤティ, M.A.S.に対して1997年11月11日に発行されたアメリカ合衆国特許第5,686,237号；ヘスらに対して1996年11月12日に発行されたアメリカ合衆国特許第5,573,922号を参照のこと。表面に抗体を結合させる方法も従来技術で知られている。ドゥラマルシュ他、Langmuir、第12巻、1944〜1946ページ、1996年を参照のこと。
【０２３２】
認識部分は、上に説明した従来技術で知られている多数の結合法のうちの任意の方法を用いて本発明の化合物に共役させることができる。一実施態様では、認識部分を、芳香族ヒドロキシイソフタミジルの核、骨格、またはアミド置換基の上にある基を通じて、ヒドロキシイソフタミジル・キレートに直接結合させる。別の一実施態様では、反応性二機能架橋剤をPL上の反応基に結合させる。続いてこの共役体を、架橋成分の表面の反応基と認識部分の表面の相補的反応基を通じて、認識部分と結合させる。多数の有効な架橋剤が市販されている（ピアース社、ロックフォード、イリノイ州）。また架橋剤は、従来技術で公知の方法を用いて合成することもできる。また、ヒドロキシイソフタミジル・キレートを認識部分に結合させる前に認識部分と架橋剤を結合させることもできる。
分析
本発明の材料と方法を利用することで、検出可能な認識成分と相互作用する分析物、又は分析物類を検出することができる。分析物及び認識成分間の相互作用は共有結合、イオン結合、水素結合、ヴァンデルワールス相互作用、反発電気相互作用、引っぱり電気相互作用及び疎水性／親水性相互作用を含む物理化学的相互作用でよい。
【０２３３】
好適実施態様では、相互作用はイオン相互作用である。本実施態様では、酸、塩基、金属、又はイオン結合リガンドが分析体である。更に別の好適実施態様では、相互作用は水素結合相互作用である。特に好適な実施態様では、核酸と相補配列を有する核酸とのハイブリダイゼーションが検出される。別の好適実施態様では、相互作用は酵素又は受容体とそれに結合する小分子又はペプチド間のものである。
【０２３４】
別の実施態様では、分析物は所望分析物導入前に認識成分に関し、認識成分と結合させられる別作用物質と競合する。本実施態様では、これは前結合作用物質を分析物が交換する工程又は結果であり、これば発明の化合物から検出レベルの蛍光を生じせしめる。認識成分と分析物の好適組み合わせは、当業者にとって明らかである。
【０２３５】
本好適実施態様では、分析物は酸、塩基、有機イオン、無機イオン、医薬品、除草剤、殺虫剤及び生物分子より成るグループから選択されたメンバーである。これら作用物質は実用可能な場合、蒸気又は液体として検出できる。これら作用物質は構造的に無関係な化合物の混合体、立体異性体のラセミ混合体、立体イソマーの非ラセミ混合体、ジアステレオマー混合体、位置イソマーの混合体として、又は純粋化合物として存在できる。混合体ないにある他物質からの干渉なしに特定の所望分析体を検出する装置及び方法は発明の範囲内である。
【０２３６】
本質的に非酸性及び非塩基性（例えば第４アルキルアルミニウム塩）は、発明の標識認識成分により検出できる。例えば本発明ではイオン交換特性を持つPL-標識認識成分が有用である。具体例はナトリウムの様な金属イオンに関してはドデシルトリメチルアンモニウム陽イオンの様な陽イオン交換体である。有機イオンと包含複合体を形成する認識成分も利用できる。例えばクラウンエーテル及びリクプタンドは４級アンモニウム陽イオンの様な有機イオンとの包含複合体形成に利用することができる。
【０２３７】
金属イオン及び錯イオン（例えばSO4 -2、PO4 -3）もまたPLs及び発明の方法を利用し検出できる。金属イオンは例えば発明の化合物に結合するPLsまたはキレート剤によるそれらの錯体形成又はキレート化によって検出できる。本実施態様では認識成分は単純な１価成分（例えばカルボキシレート、アミン、チオールル）又はより構造的に複雑な作用物質（例えばエチレンジアミンペンタ酢酸、クラウンエーテル、アザクラウン、チアクラウン）でもよい。
【０２３８】
錯体無機イオンは、それらの持つリガンド−金属複合体中金属イオンへの結合に関するPLsとの競合能力より検出できる。リガンドがPLに結合し、金属及び錯イオン間の錯体に比べ小さい熱力学的安定定数を有する金属錯体を形成する場合、錯体イオンは固定ガンドからの金属イオンの解離を誘導するだろう。金属イオンがランタニドと錯体形成する場合には、蛍光が検出されるだろう。金属イオンとリガンドとの間に形成された化合物の安定化定数を決定する方法は当業者公知である。これら安定性定数を利用し、特定イオンに特異的なキレート化合物を製造することができる。Martell、A.E.,Motekaitis, R.J.,DETERMINATION AND USE OF STABILITY CONSTANTS, 2d Ed., VCH Publishers, New York 1992.
好適実施態様では、特定金属イオンに対する分析体の親和性は、その特定金属イオンを含む発明の化合物を利用し探索される。金属イオンは一般には少なくとも１つ、分析体が結合できる空の配位位置を持っていなければならない。あるいは、金属と金属固定化作用物質との間に結合の少なくとも１つは分析体存在下に、分析体により固定化作用物質の少なくとも１つの結合が置換できる程度に十分不安定でなければならない。分析体と金属イオン間の相互作用は、例えばUV/Vis及び蛍光分光法を含む当分や既知の複数の方法により検出できる。
【０２３９】
分析体及び認識成分のその他実施態様は当業者にとって明瞭である。
【０２４０】
プローブ
発明は例えば標的種に結合したPL成分、標的種に関するリガンド（例えば核酸、ペプチド等）、小分子（例えば薬物、殺虫剤等）等を含むプローブを提供する。
【０２４１】
核酸プローブ
発明のPLｓは核酸プローブとの組み合わせに有用であり、それらは例えば5’-ヌクレアーゼアッセイ、ストランド置換増幅法（SDA）、核酸配列ベース増幅法（NASBA）、ローリングサークル増幅法（RCA）及び液相又は固相（例えばアレー）アッセイ中の標的の直接検出を含む各種DNA増幅／定量法に於ける検出作用物質の成分として利用できる。更に、PL-由来の核酸は例えば分子ビーコン、スコルピオンプローブ、サンライズプローブ、立体構造支援プローブ、ライトアッププローブ及びTaqManTMプローブを含む、実質的フォーマットのプローブに利用できる。
【０２４２】
即ち別の観点では、本発明は核酸標的配列の検出に関する方法を提供する。方法は：(a)標的配列に検出用核酸を接触させること；(b)標的結合配列を標的配列にハイブリダイゼーションさせ、それによって検出用核酸の立体構造を変化させ、蛍光パラメータに変化を生じさせること；及び(c)蛍光パラメータ中の変化を検出し、それにより核酸標的配列を検出すること、を含む。
【０２４３】
ここに記載の方法では、特記ない限り、好適検出用核酸は単鎖型標的結合配列を含む。結合配列はこれに結合した：i）蛍光体；及びii)発明のPLを有する。更に好ましくは、相補的配列にそれをハイブリダイゼーションする前に、検出用核酸は蛍光団が励起された時、蛍光エネルギーが蛍光団とPLの間を移動できる様な立体構造にある。更に、本節に記載の各方法では、蛍光の変化は標的配列の存在の指標として検出され、蛍光の変化はアルタイムに好ましく検出される。
【０２４４】
別の観点では、発明は核酸標的配列の存在を検出する別の方法を提供する。この方法は：(a)標的配列に、単鎖型標的結合配列及び標的結合核酸の5’側に標的結合配列に分子内関連二次構造を具備する検出用核酸にあって、前記標的配列の少なくとも一部が標的配列とのハイブリダイゼーションに利用可能な単鎖型テールを形成する検出用核酸をハイブリダイゼーションさせること；(b)プライマー延長反応において、分子間結合二次構造を鋳型に利用して相補鎖を合成し、それにより分子間結合二次構造を解離して、蛍光パラメータに変化を生じせしめること；(c)蛍光パラメータの変化を検出し、それにより核酸標的配列を検出すること、を含む。
【０２４５】
本法では、特記ない限り、本節記載の他の方法、検出用核酸は実質的にいずれの分子間結合二次構造の形を取ることができるが、この構造は好ましくはヘアピン、ステム−ループ構造、シュードノット、３重螺旋及び立体構造的に支持された構造より選択されるメンバーである。更に、分子間塩基対合二次構造は、標的結合配列部分を好ましく含む。更に、分子間結合二次構造は、全体又は部分的に単鎖型エンドヌクレアーゼ認識部位を好ましく含む。
【０２４６】
相補鎖はこれら鎖を調製に関する当業者公知の方法により調製することができるが、標的増幅反応に於いて好ましく合成され、より好ましくは検出用核酸を鋳型として用いる標的配列の延長により合成される。
【０２４７】
別の観点では、発明は標的配列の増幅を検出する方法を提供する。方法は、以下の段階を含む増幅反応の利用を含む：(a)標的配列と検出用配列をハイブリダイゼーションさせること。検出用核酸は単鎖型標的結合配列及び標的結合配列の5’にある分子内結合構造体を含む。少なくとも標的配列の一部は標的配列へのハイブリダイゼーションに利用できる、単鎖型テールを形成する；(b)標的配列常にハイブリダイズした検出用核酸を、ポリメラーゼを利用して延長し検出用核酸延長産物を産生し、検出用核酸延長産物を標的配列から分離すること；(c)プライマーを検出用核酸延長産物にハイブリダイズし、ポリメラーゼによりプライマーを延長して、分子間結合二次構造を直線化し、蛍光パラメータに変化を生じせしめ；そして(d)蛍光パラメータ内の変化を検出して、それにより標的配列を検出すること。
【０２４８】
更に別の観点では発明は第１核酸と第２核酸がハイブリダズしたか確認する方法を提供する。この方法では、第１核酸が発明によるPLを含む、方法は：(a)第１核酸を第２核酸と接触せしめること；(b)第１核酸、第２核酸及びその組み合わせより選択されたメンバーの蛍光特性の変化を検出し、それによりハイブリダイゼーションの生起を確認すること、を含む。
【０２４９】
PL及び蛍光団の両方を持つプローブが利用できるか、又は１またはそれ以上の核酸はPL又は蛍光団単独で標識することができる。PLで単独標識された核酸がプローブの時、第１及び第２核酸間の相互作用は、元の核酸蛍光の消光を観察すること、より好ましくは第２核酸に結合した蛍光団の蛍光の消光を観察することで検出できる。
【０２５０】
核酸増幅、検出及び定量化を探るために設計された化学種内に於けるそれらの一般的利用に加え、このPLsは現在知られている、又は今後発見される核酸フォーマットに実質的に利用できる。例えば発明のPLsはTaqmanプローブ（Heldら、Genome Res. 6; 986-994(1996), Hollandら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280(1991), Leeら、Nucleic Acids Res. 21:3761-3766(1993)）、分子ビーコン（Tyagiら、Nature Biotechnology 14:303-308(1996), Jayasenaら、米国特許第5,989,823号、1999年、11月23日発行）、スコーピオンプローブ（Nazarenkoら、Nucleic Acids Res. 25:2516-2521(1997)）、立体構造支援プローブ（Cook、R., 同時係属出願され共に譲渡された米国仮出願60/138,376号、1999年６月９日出願）、ペプチド核酸（PNA）ベースライトアッププローブ（Kubistaら、WO97/45539号、1997年12月）、２本鎖特異的DNA色素（Higuchiら、Bio/Technology 10:413-417(1992)、Wittwerら、Bio/Technology 22:130-138(1997)）等の様なプローブモチーフ内に取り込むことができる。本PLsを利用できるこれら及びその他プローブモチーフは、NONISOTOPIC DNA PROBE TECHNIQUES, Academic Press, Inc. 1992にレビューされている。
【０２５１】
発明のプローブでの利用に適した核酸はいずれかの好適サイズであり、好ましくは約10ないし約100ヌクレオチドの範囲であり、より好ましくは約10ないし約80ヌクレオチド、及びさらにより好ましくは約20ないし約40ヌクレオチドである。発明の核酸プローブの正確な配列及び長さは、それが結合する標的ポリヌクレオチドの性質に一部依存する。結合位置及び長さは、具体的実施態様に関し適切なアニーリングと溶融特性を得るために変更することができる。この様な設計選択を行うための指針は多くの当分野公知文献に見ることができる。
【０２５２】
好ましくは、核酸プローブの3’末端ヌクレオチドは核酸ポリメラーゼによる延長がブロックされるか、又は不可能になっている。この様なブロッキングは、結合成分による核酸プローブの3’末端へのドナー又はアクセプター分子の結合により簡便に実施できる。
【０２５３】
核酸はDNA、RNA又はそのキメラ混合体あるいは誘導体もしくは修飾型
を含むことができる。プローブ及び標的核酸は共に、単鎖、２本鎖、３本鎖等として存在できる。分子エネルギー転移ドナー及び分子エネルギー転移アクセプターによる標識に加え、核酸は基本成分、糖成分、又はリン酸主鎖にて放射線標識、マイナーグローブ結合体、挿入作用物質等のその他基により修飾することができる。
【０２５４】
例えば核酸は5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシルメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロキシウラシル、ベータ-D-ガラクトシルクエノシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルクエオシン、5’-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、wyブトキソシン、シュードウラシル、クエノシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシサイク酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-（3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル）ウラシル、（acp3）w、及び2,6-ジアミノプリンを含むグループより選択される修飾塩基成分を少なくとも１つ含むことができるが、これらに限定されることはない。
【０２５５】
別の実施態様では、核酸はアラビノース、2-フルオロアラビノース、キシルロース、及びヘキソースを含むグループより選択される修飾糖成分を少なくとも１つ含むが、これに限定されない。
【０２５６】
更に別実施態様では、核酸はホスホロチオ酸塩、ホスフォロジチオ酸塩、ホスフォルアミドチオ酸塩、ホスホルアミド酸塩、ホスフォルジアミド酸塩、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、及びホルムアセタール又はその類似体を含むグループより選択される修飾型リン酸エステルを少なくとも１つ含むが、これに限定されない。
【０２５７】
発明のホスホジエステル結合した核酸は当業者既知の標準的方法、例えば市販のアミド試薬を利用する自動DNA合成装置（P.E.バイオシステムス社等より市販されている様な）により合成することができる。修飾されたホスホジエステル結合基を持つ核酸は当業者既知の方法により合成することができる。例えばホスホロチオ酸塩核酸はSteinら（Nucl.Acids.Res.16:3209(1998)）の方法により合成することができ、メチルホスホネート核酸はコントロールされた多孔性ガラスポリマー固相を利用し調製することができる（Steinら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:7448-7451(1988))。ホスホジエステル−及び修飾型ホスホジエステル結合核酸のその他方法は当業者には明らかである。
【０２５８】
発明の核酸プローブは幾つかの方法、例えばOzakiら、Nucelic Acid. Research, 20:5204-5214 (1992)；Agrawalら、Nucelic Acid. Research, 18:5419-5423 (1990)；等により合成することができる。発明の核酸プローブは自動DNA合成装置、例えばホスホルアミダイト試薬のような標準的試薬を使用し、P.E.バイオシステムス社（フォスターシティー、カリフォルニア州）モデル392又は394DNA/RNA合成装置により簡便に合成される（例えば以下参考資料中の開示を参照せよ：Bcaucageら、Tetrahedron, 48:2223-2311(1992); Molkoら、米国特許第4,980,460号；Kosterら、米国特許第4,725,677号；Caruthersら、米国特許第4,415,732号；第4,458,066号及び第4,973,679号）。ホスホルチオ酸塩、ホスホルアミド酸塩等の様な非天然型主鎖基を生ずる代替試薬も使用できる。
【０２５９】
自動化核酸合成装置を利用し核酸を合成する場合、安定化成分、エネルギー転移ドナー及びエネルギー転移アクセプター成分は、自動合成中に好ましく導入される。あるいは、これら成分の１またはそれ以上は自動合成工程を開始する前、又は後のいずれでも導入できる。別の例示実施態様では、１又はそれ以上のこれら成分は自動合成終了後に導入される。
【０２６０】
ドナー成分は、好ましくは少なくとも約10ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約15ヌクレオチドPLより離れている。ドナー成分は好ましくはプローブの3’-又は5’-末端ヌクレオチドに結合される。PL成分はプローブの3’-又は5’-末端ヌクレオチドのいずれかにも好ましく結合される。より好ましくは、ドナー及びアクセプター成分はそれぞれプローブの3’-及び5’-、又は5’-及び3’-末端に結合される。
【０２６１】
所望核酸が合成された後は、その上で核酸が合成された固相より核酸を分離し、当業者既知の方法にて処理し存在する保護基を外すことができる（例えば60℃、５時間、濃縮アンモニウム）。塩基感受性基が核酸に結合されている実施態様では（例えばTAMRA）、脱保護はより穏和な条件（例えばブチルアミン：水１：３、８時間、70℃）の利用が好ましいだろう。これら条件は、迅速型脱保護アミダイト（例えばdC-アセチル、dG-dmf）を利用することで促進される。
【０２６２】
支持体からの切断及び脱保護に続き、核酸はクロマトグラフィー、抽出及びゲル精製を含む当業者既知のいずれかの方法により精製される。好適実施態様では、核酸はHPLCを利用し精製される。分離された拡散の濃度及び純度は、分光光度計に於いて260nmの光学密度を測定される。
【０２６３】
ペプチドプローブ
蛍光団及び発明のPLで標識されたペプチド、蛋白質及びペプチド核酸はインビボ及びインビトロいずれの酵素アッセイにも利用できる。
【０２６４】
即ち、別の観点では、本発明はサンプルが酵素を含むか否かの決定に関する方法を提供する。方法は：(a)サンプルとペプチド構築体に接触させること；(b)蛍光団を抽出すること；及び(c)サンプルの蛍光特性を決定し、サンプル中の酵素の存在が蛍光特性に変化をもたらしたか決定すること、を含む。
【０２６５】
発明の実施に有用なペプチド構築体は、以下の特徴を持つものを含む：1)蛍光団；ii)発明のPL；及びiii)酵素の切断認識部位。更に、ペプチド構築体は蛍光団が励起された時に、蛍光団とPLとの間の蛍光エネルギー転移が可能である長さ及び方向、そして立体構造であることが好ましい。
【０２６６】
プローブを用い分解酵素（例えばプロテアーゼ）酵素を検出する場合、蛍光共鳴エネルギー転移の大きさが期待値より小さいことが観察されるが、これが酵素の存在を示す一般的指標である。サンプル中の蛍光共鳴エネルギー転移の大きさは、例えばドナー成分からの蛍光量、アクセプター成分からの蛍光量、アクセプター成分からの蛍光量に対するドナーからの蛍光量の比、又はドナー成分の励起状態寿命の関数として決定することができる。
【０２６７】
アッセイはまた酵素とタンデム構築体間の接触後の第１及び第２時間に於ける蛍光共鳴エネルギー転移の大きさを決定すること、及び蛍光共鳴エネルギー転移の大きさの差を決定することによりサンプル中の酵素量を決定するのに有用である。蛍光共鳴エネルギー転移の大きさの差は、サンプル中の酵素量を反映する。
【０２６８】
アッセイ法は、化合物が酵素の活性を変化するかを決定する、即ちスクリーニングにも利用できる。即ち別の観点では、発明は生物体由来サンプル中の酵素活性量を決定する方法を提供する。方法は：(a)酵素及び化合物を含むサンプルにペプチド構築体を接触せしめ、（ｂ）蛍光団を励起せしめること；及び（c)サンプルの蛍光特性を決定し、サンプル中の酵素活性が蛍光特性に変化をもたらすかを決定すること、を含む。発明のこの観点に有用なペプチド構築体は、上記記載のそれに実質類似している。
【０２６９】
好適実施態様では、サンプルチュの酵素活性量はサンプル中の蛍光共鳴エネルギー転移量の関数として決定され、そしてサンプル中の酵素量と同一量の酵素の持つ標準的活性と比較される。サンプル中の酵素活性量と標準活性間の差は、化合物が酵素の活性を変化させたことを示す。
【０２７０】
本発明が実施可能な代表的酵素は、例えばトリプシン、エンテロキナーゼ、HIV-1プロテアーゼ、プロホルモン変換酵素、インターロイキン-1b-変換酵素、アデノウイルスエンドペプチターゼ、サイトメガロウイルスアッセンブリン、レーシュマノリシン、アミロイド前駆蛋白質に関するβ−セクレターゼ、トロンビン、レニン、アンジオテンシン−変換酵素、カテプシン−Ｄ及びキニノゲナーゼ、及び一般的プロテアーゼが含まれるが、これに限定されない。
【０２７１】
プロテアーゼはアルツハイマー病、高血圧、炎症、アポトーシス、AIDSの様な多くの病気工程に必須の役割を果たす。それらの活性を遮断し、又は増強する化合物は治療薬としての可能性を持つ。ペプチダーゼの正常基質は直鎖状ペプチドであり、また非ペプチド型類自他を政策するための確立した方法が存在していることから、プロテアーゼの活性に影響する化合物はコンビナトリアル化学の天然対象物である。コンビナトリアル化学産生化合物のスクリーニングは通常の酵素アッセイを必要とする。
【０２７２】
プロテアーゼに関する最も一般的なアッセイは、潜在的切断部位を含む短プチド鎖の反対端にあるアクセプターへのドナー蛍光団からの蛍光共鳴エネルギー転移に基づいている（Knight C. G., Methods in Enzymol. 248:18-34 (1995))。蛋白質分解は蛍光団とアクセプターを分離し、その結果ドナー蛍光団の発光強度は増加する。励起プロテアーゼアッセイは、固相ペプチド合成により組み立てられた非天然型発色性アミノ酸を取り込んだ短ペプチド基質を利用する。
【０２７３】
発明のアッセイは希少プロテアーゼの決定及び特徴付けにも有用である。実施態様の一つでは、方法は規定リンカー成分のアミノ酸配列を、無作為に選択されたアミノ酸を含む配列で置換されることを含む。蛍光団及びPLが無作為化ペプチドリンカー成分と結合している蛍光PL-含有プローブのライブラリーは、組換え体工学技術又は合成化学技術を利用し作ることができる。ライブラリーのメンバーをスクリーニングすることは、タンデム蛍光ペプチド構築体のライブラリーメンバーのそれぞれに切断酵素を接触せしめた後、蛍光エネルギー転移の様な切断関連シグナルを測定することで達成できる。蛍光共鳴エネルギー転移量が期待値より小さいことは、酵素により切断されるリンカー配列の存在を指示する。サンプル中の蛍光共鳴エネルギー転移量は、例えばドナー成分からの蛍光量、又はアクセプター成分からの蛍光量に対するドナー成分からの蛍光量の比、又はドナー成分の励起状態寿命の関数として決定できる。
【０２７４】
発明のタンデム構築体では、ドナー及びアクセプター成分はリカー成分を開始接続される。リッカー成分は好ましくはペプチド成分を含むが、その他同様の有機分子成分でも良い。好適実施態様では、リンカー成分は酵素又は所望の切断作用物質に特異的な切断認識部位を含む。タンデム構築体を切断作用物質と混合する場合にはリンカー自体が切断作用物質の切断基質になることから、リンカー成分内にある切断部位は有用である。リンカー成分の切断により蛍光団と発明のPLの分離が起こる。分離はFRET内の変化として測定できる。
【０２７５】
所望切断作用物質がプロテアーゼの場合、リンカーはプロテアーゼの切断認識配列を含むペプチドを具備する。プロテアーゼの切断認識配列は、蛋白質分解性切断の最中にプロテアーゼによって認識される特異的アミノ酸配列である。当分野では多くのプロテアーゼ切断部位が既知であり、その他切断部位をリンカー成分内に含むことができる。例えばMatayoshiら、Science 247:954(1990); Dunnら、Meth. Enzymol. 241:254(1994)；Seidahら、Meth.Enzymol.244:175(1994）；Thornberry, Meth, Enzymol.244:615(1994)；Weberら、Meth.Enzymol.244:175
(1994）；Smithら、Meth.Enzymol.244:412(1994）；Bouvierら、Meth.Enzymol.248:614(1995）、Hardyら、in AMYLOID PROTEIN PRECURSOR IN DEVELOPMENT, AGING, AND ALZHEIMER’S DISEASE,編集Mastersら、pp.190-198（1994）を見よ。
【０２７６】
固相固定化 PL 類似体
発明のPLは実質的にいずれの有用な形態を持つポリマー、生体分子及び個体又は半固体材料上に固定することができる。支持体が固体又は半固体の場合、核酸プローブの固定化に適した好適タイプの支持体の例には、制御多孔性ガラス、ガラスプレート、ポリスチレン、アビジンコーティングポリスチレンビーズ、セルロース、ナイロン、アクリルアミドゲル及び活性化デキストランが含むまれるが、これに限定されるものではない。これら固相はその化学的安定性、官能基導入の容易さ、良く規定された表面域故に好まれている。制御多孔質ガラス（CPG、500Å、1000Å）の様な固相支持体及び非膨潤型高架橋型ポリスチレン（1000Å）が特に好ましい。
【０２７７】
本発明によれば、固相支持体表面は発明のPL又は発明のPLを含む化学種により官能基導入される。例示を明瞭化するために、以下の考察は固相支持体への反応性PLの結合に焦点を当てる。以下の考察は、構造体中に反応性PLを含む化学種を固相支持体に結合する場合や、これら化学種及び反応性PL類似体を他分子及び構造体に結合させる広範な例にも該当する。
【０２７８】
PLはPL上にある反応基と固相支持体表面上にある反応基、又は固相支持体に結合したリンカーとの間に結合を形成し、それにより固相支持体を１またはそれ以上のPL類似体で誘導化することで固相支持体に好ましく結合される。固相支持体及びPL間の結合は好ましくは共有結合であるが、イオン、供与、及びその他同様の結合も有用である。本発明の実施に利用できる反応基は上記詳細に論じられるが、例えばアミン、ヒドロキシル基、カルボン酸、カルボン酸誘導体、アルケン類、スルフヒドリル類、シリコキサン類等を含む。
【０２７９】
本発明の実施に好適な多くの固相支持体が市販されており、例えばペプチド合成樹脂、結合アミノ酸及び／又はペプチド有り又は無しのペプチド合成樹脂（例えばアルコキシベンジルアルコール樹脂、アミノメチル樹脂、アミノポリスチレン樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂等（Bachem））、官能化制御多孔質ガラス（BioSearch Technologies, Inc)、イオン交換媒体（Aldrich）、官能化膜（例えば-COOH膜、アサヒケミカル社、アサヒガラス社及びトクヤマソーダ社）等が含まれる。
【０２８０】
更に、適当な固相支持体が市販されていない場合には、固相支持体表面の官能化には様々なタイプの反応が利用できる。例えばポリプロピレンの様なプラスチックで作られた支持体は、クロム酸酸化し、続いてヒドロキシル化又はアミノメチル化表面に変化することで表面を誘導化できる。次に官能化された支持体を、例えばPL活性型エステル、塩酸及びスルホネートエステルの様な補完的活性を持つPLと反応する。高度架橋型ジビニルベンゼンはクロロメチル化及び続く官能基操作により表面を誘導化することができる。更に、官能化基質は腐食された、還元型ポリテトラフルオロエチレンより作ることができる。
【０２８１】
支持体がガラスの様なシリカ含有材料から構築される場合、表面のSi-OH、SiO-H及び／又はSi-Si基を官能化試薬と反応せしめることで誘導化できる。
【０２８２】
好適実施態様では、基質はガラスより作られ、ガラス表面への反応基の共有結合は、以下の様なシリコン修飾試薬により基質表面上の基を変換することで達成される：
（ＲaＯ）3−Ｓｉ−Ｒb−Ｘa （２）
式中Raはメチル又はエチルの様なアルキル基であり、ＲbはシリコンとＸa間の結合基であり、Ｘaは反応基又は保護された反応基である。提示されたアルコキシ基以外にハロゲン又はその他遊基を有するシラン誘導体もまた本発明に有用である。
【０２８３】
別好適実施態様では、固相支持体の官能化に使用される試薬は、各試薬分子当たり１より多い反応基を提供する。以下の化合物の様な試薬を使用すれば、基質表面上にある各反応部位は、本質に於いて２又はそれ以上の官能基に“増幅”される：
（ＲaＯ）3−Ｓｉ−Ｒb−（Ｘa）n （３）
式中Ｒaはアルキル基（例えばメチル、エチル）であり、ＲbはシリコンとＸa間の結合基であり、Ｘaは反応基又は保護された反応基であり、ｎは２ないし50の間、より好ましくは２ないし20の間の整数である。そのシリコン含有基質への結合によるPL増幅は、PL増幅の一般的概念を例示することを目的としている。この増幅法はPL類似体が別分子又は固相支持体に結合している発明の別の観点に等しく応用できる。
【０２８４】
多くのシリコキサン官能化試薬、例えば
１．ヒドロキシルアルキルシリコキサン（ジボランにより官能化されたシリエート表面、H2O2にてアルコールに酸化される）
ａ．アリルトリクロロシラン→→3-ヒドロキシプロピル
ｂ．7-oct-1-エニルトリクロロクロロシラン→→8-ヒドロキシオクチル
２．ジオール（ジヒドキシアルキル）シロキサン（シリエート表面であり、ジオールに加水分解）
ａ．（グリシジルトリメトキシシラン→→（2,3-ジヒドロキシプロピルオキシ）プロピル
３．アミノアルキルシロキサン（中間官能化段階を必要としないアミン）
ａ．3-アミノプロピルトリメトキシシラン→アミノプロピル
４．ダイマー型第２アミノアルキルシロキサン
ａ．ビス（3-トリメトキシシリルプロピル）アミン→ビス（シリルオキシルプロピル）アミン、が利用できる。
【０２８５】
シリコキサン以外の支持体成分が使用されている場合にも、同様の有用官能化試薬類が利用できることは当業者にとって明白である。即ち例えばシリコキサン修飾試薬との関連で上記の如く官能化されたアルキルチオール類は、金属フィルムに結合でき、続いてPLと反応し発明の固定化化合物を生成することができる。
【０２８６】
発明の上記実施態様のＲbに用いられるＲ基には、アルキル、置換型アルキル、アリール、アリールアルキル、置換型アリール、置換型アリールアルキル、アシル、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アルコキシ、アシルオキシ、アリールオキシ、アリールオキシアリル、メルカプト、飽和環式炭化水素、不飽和型環式炭化水素、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、置換型ヘテロアリール、置換型ヘテロアリールアルキル、複素環式、置換型複素環式及び複素環式アルキル基及びその組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【０２８７】
核酸捕捉プローブ
実施態様の一つでは、PLを含む固定化核酸は捕捉プローブとして利用される。核酸プローブは例えばプローブの3’-又は5’-末端ヌクレオチドを固相支持体に結合させることで固相支持体に直接結合できる。しかし、より好ましくはプローブはリンカー（即ちスペーサーアーム、上記）により固相支持体に結合される。リンカーはプローブを固相支持体から離す役割をする。リンカーは最適には約５ないし約30原子の距離であり、より好ましくは約10ないし約50原子の距離である。
【０２８８】
別好適実施態様では、固相支持体はプローブ調製の合成支持体としても利用される。固相支持体と核酸の第１3’-ユニットとの間にあるリンカーの長さと化学的安定性は、支持体に結合した核酸の効率的合成及びハイブリダイゼーションに於いて重要な役割を果たす。リンカーアームは自動合成中に高収率（＞97%）を達成するには、十分な長さを持たなければならない。リンカーに必要とされる長さは具体的に使用する固相支持体に依存するだろう。例えば、高架橋型ポリスチレンを固相支持体に用いる場合、核酸の自動合成中に＞97%の収率を選るためには、一般に６原子長のリンカーで十分である。CPGを固相支持体に利用し自動合成する場合、高収率（＞97%）を得るにはリンカーアームが少なくとも20原子長であることが好ましい。
【０２８９】
固相支持体に固定されたプローブのハイブリダイゼーションでは一般に、プローブが固相支持体から少なくとも30原子、より好ましくは少なくとも50原子離れていることが求められる。この分離を達成するために一般にリンカーは、リンカーと3’-末端との間に位置するスペーサーを含んでいる。核酸合成に関しては、リンカーアームは通常エステル結合により3’-末端の3’-OHに結合され、これは塩基性試薬により切断され、核酸を固相支持体から遊離する。
【０２９０】
当分野では固相子自他への核酸プローブの結合に利用できるであろう各種リンカーが既知である。リンカーは固相支持体に結合したプローブへの標的配列のハイブリダイゼーションに有意な干渉をしない化合物から形成されるだろう。リンカーは、例えば自動合成によりリンカーに容易に付加できるホモポリマー型核酸から形成されるだろう。あるいは、官能化ポリエチレングリコールの様なポリマーがリンカーとして利用できる。この様なポリマーは標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーションを有意に干渉しないため、現時点ではこの様なポリマーはホモポリマー型核酸より好ましい。ポリエチレングリコールは市販されていることや有機及び水性溶媒に可溶性であること、容易に官能化できること、及び核酸合成及び合成後の条件では完全に安定していることから特に好ましい。
【０２９１】
固相支持体、リンカー及びプローブ間の結合は、合成中又は塩基性条件下、高温で塩基保護基を除去する間は切断されないことが好ましい。しかしこれら結合は各種条件下に切断可能な基から選択できる。本好適結合の例には、カルバメート、エステル及びアミド結合が含まれる。
【０２９２】
アクリルアミド固定化プローブ
別の好適実施例では、化学種はアクリルアミドマトリックスの様なマトリックス内に存在しており、そして化学種はPLを有するか、あるいは固定化された化学種の存在がPLを持つプローブにより確認される。好適実施態様では、固定化はモザイクテクノロジー社（Mosaic Technologies）(ケンブリッジ、MA、Rehmanら、Nucleic Acid Research, 27: 649-655(1999)参照)“が発明し販売しているアクリダイト”工程と結びつけ達成される。アクリダイト法はアルケン標識捕捉プローブを重合したポリアクリルアミドネットワーク内に固定化できる。標的混合体を電気泳動条件下に固定化プローブバンドを通過させると、標的核酸は実質定量的に捕捉される。実施態様の一つでは、PLを持つプローブ及び／又は蛍光団はアクリルアミドマトリックス内に固定化され、続いて標的混合体と接触させられる。蛍光プローブを捕捉プローブとして利用することで、標的混合体からのシグナルを即時的に直接検出することができる。
【０２９３】
マイクロアレー
発明は固定化されたPLs及びPLsで官能化された化合物を含むマイクロアレーも提供する。更に、発明はPLsにより官能化されたプローブを利用する、マイクロアレーにパルス呼びかけ信号を送付する方法を提供する。固定化された化学種及びプローブは、小分子、ペプチド、酵素核酸等を含むいずれかの分子から本質的に選択されるが、これらに限定されるものではない。
【０２９４】
多数の固定化核酸より成る核酸マイクロアレーは遺伝子情報生成に関する革命定期道具である、Debouckら、Nature Genetics, 21:48-50(1999)補稿参照。核酸マイクロアレーに結びつけたPLsの利用に焦点をあて以下論ずる。焦点を絞ることは、本発明のこの観点が実行可能である材料の範囲を例示することを意図するのであり、これを制限する意図はない。
【０２９５】
即ち別の好適実施態様では、本発明の化合物はマイクロアレーフォーマットで利用される。PLsまたはPLsを持つ化学種はそれ自体マイクロアレーの成分であるか、またはそれらはマイクロアレーの成分をスクリーニングする道具として利用することができる。
【０２９６】
即ち好適実施態様では、本発明はマイクロアレーをスクリーニングする方法を提供する。方法は、複数のマイクロアレーをPL保有プローブと接触せしめること、及び蛍光領域のマイクロアレーにパルス呼びかけ信号を送ることを含む。蛍光領域はPL保有プローブとマイクロアレー成分間の相互作用の存在を表す指標である。本法の別の型では、マイクロアレーは蛍光が消光された領域に関しパルス呼びかけ信号を送が、この場合もPL保有プローブとマイクロアレー成分との間の相互作用の存在を示している。
【０２９７】
別実施態様では、アレーは呼びかけ信号として固定化されたPL保有FETプローブを含む。本実施態様では、プローブはその標的にハイブリダイズしたとき“オン”される。このようなアレーは容易に調整及び読みとられ、定量データを提供する様に設計できる。PL保有プローブを具備するアレーは発現分析及び臨床的遺伝スクリーニングにとって有用な道具である。
【０２９８】
別の好適実施態様では、固定化されたPL保有プローブはFETプローブではない。この様な形式に基づくマイクロアレーは、プローブと分析体間の相互作用による分析体蛍光の消光を観察することにより、分析体と固定化プローブ間の相互作用の存在を探索するのに利用できる。
【０２９９】
更に好適な実施態様では、マイクロアレーは同一または別種の核酸配列を含むｎ個のプローブを含む。あるいはマイクロアレーは核酸配列に同一及び別種である核酸配列のグループを含むｎ個のプローブの混合体を含むことができる）。好適実施態様では、ｎは２ないし100、より好ましくは10ないし1,000、及びより好ましくは100ないし10,000の数である。更に好適な実施態様では、ｎ個のプローブは基質上にてｎ個の異なる部位に、ｎ個の部位の同一性が確認できる様にパターン化されている。
【０３００】
更に別の好適実施態様では、発明はｎ個のPLを保有するプローブのマイクロアレーを調整する方法を提供する。方法は基質の選択された領域に結合したPL保有プローブを含む。現在、核酸分子の配列の様な生物学的高分子アレーを作成することに関し、各種方法が利用できる。以下考察はPL-保有プローブのマイクロアレーのアッセンブリーに焦点を当てるが、この焦点を当てることは簡潔化のためであり、例示を目的とするもので、これを限定する意図はない。
【０３０１】
PL-保有プローブの整列アレーを基質上に作成する方法の一つは、“ドットブロット”法である。この方法では、真空マニフォールドが複数、たとえば96種類のプローブの水性サンプルを直径3mmのウエルから基質上に移す。プローブはそれを焼成するか、またはUV照射に曝すことで焼多孔性膜上に固定される。この方法の一般的変形は“スロット−ブロット”法であり、ウエルは縦長の卵形をしている。
【０３０２】
プローブの配列アレーの作成に利用される他の方法は、ウエル、たとえばマイクロタイタープレートの96ウエル内に浸漬されたピンのアレーを使い、サンプルのアレーを多孔性膜の様な基質に移す。１アレーは、22×22cmの領域に9216個のスポットのアレーを作るように、交互に膜にスポット付けする様に設計されたピンを含んでいる。Lehrachら、HYBRIDIZATION FINGERPRINTING IN GENOME MAPPING AND SEQUENCING, GENOME ANALYSIS, Vol 1, Deviesら、編集、Cold Spring Harbor Press, pp.39-81(1990)。
【０３０３】
プローブの配列アレーを作成する別の方法は、Pirrungら（米国特許大5,143,854号、1992年発行）及びFodorら（Science、251；767-773（1991））記載の方法に類似している。本法は粒子またはその他基質の分離した別領域に異なるプローブを合成することを含む。本法は比較的短いプローブ分子、たとえば20塩基より短いプローブ分子と共に好ましく利用される。関連方法はSouthernらにより記載されている（Genomics、13：1008-1017（1992））。
【０３０４】
Khrapkoら、DNA Sequence, 1:375-388(1991)は、ポリアクリルアミドの薄層上にDNAをスポット付けすることで核酸マトリックスを作成する方法を記載している。
【０３０５】
基質は光リトグラフ法（Kleinfieldら、J.Neurosci.8:4098-120(1998)）、光エッチング、化学エッチング及びマイクロ接触印刷法（Kumarら、Langmuir 10;1498-511(1994)）の様な技術を利用してもパターン形成できる。基質上にパターンを形成する他技術は、当業者に容易に明らかになるだろう。
【０３０６】
基質上のパターンの大きさと複雑さは、使用する技術の解像度と目的とするパターンによってのみ限定される。例えば、マイクロ接触印刷法は200nmの厚みで基質上に層形成されることを特徴とする。Xia, Y., J. Am. Chem. Sci. 117:3274-75(1995)参照。同様に、光リソグラフ法を利用した場合、１μmの大きさの特徴を持つパターンが作成される。Hickmanら、J.Vac.Sci.Technol.12:607-16(1994)参照。本発明に有用なパターンは、ウエル、容器、仕切、陥凹、ゲート、アウトレット、チャンネル、トラフ、回折格子等の様な機構を含むパターンを含む。
【０３０７】
本好適実施態様では、パターンを利用しプローブを含む複数の近接したウエル、窪み、穴を有する基質を作成する。一般に、これら各基質特性は直立する壁又は仕切により相互に分離され、ウエル間に液体の連絡は無い。即ち、特定のウエル内におかれた粒子又はその他基質は実質的にそのウエル限定される。別の好適実施態様では、パターンは装置間をつなぐチャンネルの生成を許し、これにより分析体又はその他物質は装置に出入りすることができる。
【０３０８】
別の実施態様では、プローブは基質上に直接それらを“印刷”するか、又は“剥離”法を使って固定化できる。剥離法では、パターン化されたレジストが基質上に重層され、有機層がレジストで覆われていない領域に敷かれ、続いてレジストが取り除かれる。本発明の基質との利用に好適なレジストは当業者に既知である。例えばKleinfieldら、J.Neurosci.8:4098-120(1998)参照。フォトレジスト除去後、第１プローブとは異なる構造を持つ第２CAPを、当初レジストで覆われていた領域の基質に結合することができる。この方法を利用し、特性の異なるプローブのパターンを持った基質を作ることができる。同様の基質形態は、所望する特性を持った層を基質上にマイクロ印刷することで得ることができる。Mrkishら、Ann.Rev.Biophys。Biomol.Struct.25:55-78(1996)参照。
【０３０９】
スペーサー基
ここで使用する用語“スペーサー基”とは、PL保有プローブの成分を意味する。スペーサー基はドナー及び／又はアクセプター成分及びその他の基を核酸、ペプチド、又はその他プローブのポリマー性成分に結合する。スペーサー基は親水性（例えばテトラエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ポリエチレングリコール）でも、又はそれらは疎水性（例えばヘキサン、デカン等）でもよい。
【０３１０】
好適実施態様では、固定化構築体は固相支持体反応基とPL類似体の間にスペーサーを含む。リンカーは好ましくはC6-C30アルキル基、C6-C30置換型アルキル基、ポリオール、ポリエーテル（例えば、ポリ（エチレングリコール））、ポリアミン、ポリアミノ酸、多糖類及びその組み合わせから選択される。
【０３１１】
特定実施態様では、柔軟性及びポリマー性成分からの距離を提供する基により、ポリマー性成分に結合されたプローブ成分を有することが有利である。この様なスペーサー基を利用することで、ポリマー性成分に接続された成分の特性は変化する。有益に制御される特性には、例えば疎水性、親水性、表面活動度、核酸からのドナー及び／又はPL成分の距離、及びPLからのドナーの距離が含まれる。
【０３１２】
例示実施態様では、スペーサーはPLの核酸から距離を取るのに利用される。この特性を持つスペーサーには幾つかの利用がある。例えば核酸に過度に接近させて固定されたPLはドナー基と相互作用できず、又は極めて低い親和性で相互作用するだろう。PL自体が立体配置を要求する場合、２成分の接近が立体的に障害されるために消光をもたらす相互作用は有害に弱められるか、又は全く生じなくなるだろう。
【０３１３】
PLを含む構築体を例えば固相支持体に結合させることで固定化する場合、構築体は固相支持体の反応基とPL類似体、又は固相支持体に結合した他のプローブとの間にスペーサーを含むこともできる。
【０３１４】
更に別の実施態様では、発明のプローブに利用されるスペーサー基は、切断されPL、蛍光団、マイナーグローブ結合体、介在成分及びポリマー成分由来の同等物の様な結合成分を放出することができる基と共に提供される。多くの切断可能な基は当分野既知である。例えばJungら、Biochem. Biophys. Acta, 761:152-162(1983); Joshiら、J.Biol.Chem.,265:14518-14525(1990); Zarlingら、J.Immunol., 124:913-920(1980); Bouizarら、Eur. J. Biochem.,155:141-147(1986); Parkら、J. Biol. Chem., 261:205-210(1986); Browningら、J.Immunol.,143:1859-1867(1989)参照。更に広範囲の切断可能な２官能型（ホモ及びヘテロ２官能型の両方）スペーサーアームが例えばPierce社の様な販社から市販されている。
【０３１５】
スペーサー基を利用する例示的実施態様は上記式VII及びVIIIに記載されている。これら式では、Ｒbは安定しているか、又は化学的又は光化学反応により切断できる。例えばエステル又はジスルフィド結合を含むＲb基はそれぞれ加水分解又は還元により切断できる。また例えばニトロベンジル誘導体、フェンアシル基、ベンゾインエステル等の光で切断されるＲb基の利用も本発明の範囲である。他の切断可能な基は当業者に良く知られている。
【０３１６】
キット
別の観点では、本発明は１またはそれ以上の発明のPLs又はPL-保有組成体を含むキットを提供する。実施態様の一つでは、キットは反応性PL誘導体及び別分子に対しこの誘導体を結合させることに関する指示書を含むだろう。別のジッした様では、キットは随意に第２蛍光団又は消光剤によっても標識されているPL-標識核酸及び１又はそれ以上のアッセイ形態での本核酸の利用に関する指示書を含む。キットの別の形態は当業者にとって明らかであり、本発明の範囲内である。
【０３１７】
発明は上記方法を実施するためのキットを提供する。キットは上記組成体のいずれかを含むことができ、随意更に方法を行うための指示書、１またはそれ以上の容器又はコンパートメント（例えばアッセイ成分、核酸、抗体、阻害剤等を保持する）、キット成分を混合するためのロボット装置等の追加成分を含むことができる。
【０３１８】
発明は更にここに開示の方法を実施するための統合システムも提供する。例えば、１実施態様に於けるアッセイ実施では、個々の化合物又は化合物成分の供給は供給源から最終目的場所に液体を移すロボット装置、ロボット装置を制御するコントローラー、ラベル検出器、ラベル検出を記録するデータ保存ユニット、及びウエルを含むマクロタイター皿の様なアッセイ部品により達成される。標識化合物を利用する場合、それはラベル検出器により検出される。
【０３１９】
多くのロボット液体輸送システムが利用可能であるか、又は既存部品より容易い作ることができる。例えばMicrolab2200(Hamilton,Reno、NV)ピペットステーションを使ったZymateXP（Zymark Corporation; Hopkinton, MA)自動化ロボットを使い96ウエルマイクロタイタープレートに平行してサンプルを移し、同時並行して複数の結合反応を準備することができる。
【０３２０】
光学増幅
光シグナルは情報伝達にとって重要である。しかし、光シグナルが光ファイバーを通過する時には常にある程度の減衰が起こるため、一定距離後にシグナルを増幅する必要がある（典型的には50-100km）。通常この目的には電気的増幅装置が使用される。増幅ステーションで光シグナルは電気シグナルに変換され、これが電気増幅器により増幅され、その後増幅された電気シグナルは再び光シグナルに変換される。この方法には、増幅ステーションが光学／電気変換及び電気／光学変換器の持つ多数の部品により複雑になることに加え、システム全体のバンド幅及びビット比が電子部品により制限されるという欠点がある。この様な事情から最近光ファイバー増幅装置、即ち光シグナルを直接増幅し、電気シグナルに変換しない増幅器が開発された。この様な装置は、例えば1999年、11月９日発行のYanらの米国特許第5,982,973号、1999年７月27日発行のKleinermanno米国特許第5,928,222号；Desurvire, Physics Today, 1994年１月、20-27；Sloofら、J.Appl.Phys/83:497(1998)に開示されている。
【０３２１】
即ち別実施態様では、本発明は光伝達及び増幅に関する、発明の化合物を含む基質を提供する。発明の化合物は共有結合、コーティング、浸漬等当分野既知の方法で基質内に取り込ますことができるが、これらに限定されない。
【０３２２】
基質はガラス、有機ポリマー、無機ポリマー及びその組合せを含む、特定の応用に適した材料を含むことができるが、これらに限定されない。
【０３２３】
更に上記の如く、発明の化合物で誘導化された基質により伝達された光を増幅するための方法も提供される。方法は、これら基質内に光を伝達させ、それにより光を増幅させることが含まれる。
【０３２４】
発明の基質及び方法はファイバー光学装置、センサー（例えばKopelmanら、米国特許第5,627,922号；及びPinkelら、米国特許第5,690,894号参照）、ファイバー光学“冷蔵庫”等に利用できる。
【０３２５】
医療応用
発明の化合物は光感作治療（PDT)による悪性腫瘍の治療にも利用できる。更に、発明の錯体は：(1)核磁気共鳴画像装置（MRI)に於ける高コントラストを得るための特定永久磁石イオン；及び(2)シングルフォトン照射断層撮影装置（SPECT)またはポジトロン射出断層撮影装置（PET)に於ける腫瘍撮影及び／又は放射性同位元素伝達放射線治療のための放射活性金属イオンに関するキレート剤として、インビボ及びインビトロで使用される。即ち、適切に放射線標識されたフタルアミドキレート剤はSPECT又はPETを使用する核医学に於いて非侵襲的に画像化できる。例えばMargerumら、米国特許第6,010,681号；及びWoodburnら、米国特許第6,022,526号参照。
【０３２６】
分離
別好適実施態様では、溶液中の特定イオンに関する発明化合物の特異性は、発明の化合物が低い親和性又は特異性を持つイオンを含む他溶液からのこれらイオンの分離に活用できる。好適実施態様では、PLsはランタニドイオンと他との分離に使用される。多くのイオン選択的、又はイオン特異的キレート剤の例が当分野で知られている。例えばIzattら、SYNTHESIS OF MACROCYCLES, Wiley-Interscience, New York, 1987; 及びMartellら、DETERMINATION AND USE OF STABILITY CONSTANTS, 第２版、VCH Publishers, New York, 1992参照。
【０３２７】
本発明の材料、方法及び装置を以下の実施例により更に例示する。これら実施例は例示を目的としており、請求する発明を制限するものではない。
【０３２８】
実施例
実施例１は発明の例示リガンドの合成およびそれら金属錯体の形成を例示する。実施例１の化合物に関する合成略図は図１に示されている。
【０３２９】
実施例２は発明の化合物のＸ線構造決定を詳述する。Ｘ線結晶学データに基づく分子モデルは図４及び図５に記載される。
【０３３０】
実施例３は、発明の例示化合物の分光光度滴定を詳述する。
【０３３１】
実施例４は発明の化合物例の量子収量決定を詳述する。
【０３３２】
実施例５は発明の化合物例の分解ルミネッセンス測定を例示する。
【０３３３】
実施例６は、リガンドH221AM、その類似体及び金属キレートの合成を例示する。実施例６の化合物に関する合成略図は図８に記載される。
【０３３４】
実施例７は、発明のバイキャップドリガンド例及びそれらの金属キレートの合成を例示する。
【０３３５】
実施例８は水溶液中のリガンドH221AMとの錯体の光物理及び安定性特性に関する研究を記載する。
【０３３６】
実施例９はDMSO中のリガンドH221AM及びバイキャップドH221AMとの錯体の光物理及び安定性特性に関する研究を記載する。
【０３３７】
実施例１０はリガンドH221AM−モノ-（N-5-アミノペンチルコハク酸）、18の合成を例示する。このリガンドは、発光ランタニド錯体を抗体の様な免疫活性種に接続させるために設計されている。４つあるヒドロキシイソフタルアミド基の一つはカルボキシル基で終止するリンカーにより置換される。合成略図は図９に示されている。
【０３３８】
実施例１１は、リガンドH22テトラ（6-アミノ-1-ヘキサンアミド）1MA、23の合成を例示する。このリガンドは免疫反応種（例えば抗体）の様な生物分子に発光ランタニド錯体を結合させるために設計されている。４つある2-ヒトロキシイソフタールアミド基は第１アミンにより終止するリンカーで置換される。
【０３３９】
実施例１２は、各種長さの主鎖を持つ発明の化合物の合成を例示する。合成略図は図21に記載されている。
【０３４０】
実施例１
実施例１は発明の例示リガンドの合成及びそれら金属錯体の形成を例示する。実施例１の化合物の合成略図を図１に示す。
【０３４１】
1.1材料と方法
特記ない限り、出発材料は販売会社より得て、追加精製せずに使用した。フラッシュカラムクロマトグラフィーはメルク社（Merck)シリカゲル40-70メッシュを使用し、実施された。微量分析はカリフォルニア大学、化学単科大学、微量分析サービス研究所、バークレーで実施された。マススペクトルはカリフォルニア大学、化学単科大学、マススペクトロメトリー研究所、バークレーにて記録された。1Ｈ及び13ＣＮＭＲスペクトルはAMX300又はAMX400Bruker超伝導フーリエ変換スペクトロメーター又はDRX500Bruker超伝導デジタルスペクトロメーターで記録された。赤外スペクトルはNicolet MagnaIR550フーリエ変換スペクトロメーターを用い測定された。ＵＶ／可視スペクトルはダブルビーム型Perkin-Elmner Lamda 9 UV-可視スペクトロメーターにて記録された。
【０３４２】
1.2 2- メトキシイソフタール酸 - ビス（ 2- メルカプトチアゾライド） (1) の合成
2-メトキシイソフタール酸（0.02mol）、2-メルカプトチアゾリン（0.04mol）及び4-ジメチルアミノピリジン（20mg）を窒素雰囲気下に150mLのCH2Cl2に溶解した。1,3-ジクロヘキシルカルボジイミド（0.04mol)を反応混合液に加えると次第に黄色に変色した。５時間攪拌した後、反応混合液を濾過し、濾液を蒸発、乾燥させ黄色の油を得た。温酢酸エチルから再結晶して、明黄色の微結晶固体を得た。収率；55%。IR（CDCl3フィルム）ν1229、1684、2955cm-1。1H NMR(300MHz, CDCl3, 25℃）；δ3.42（t、J=7.3Hz, 2H, CH2), 3.89(s, 3H, CH3), 4.60(t, J=7.3Hz, 2H, CH2), 7.13(t, J=7.7Hz, 1H, ArH), 7.43(d, J=7.6Hz, 2H, ArH)。13C NMR(400MHz, CDCl3, 25℃): δ29.2, 55.6, 62.9, 123.1, 128.1, 131.9, 154.7, 167.1, 200.8。C15H14N2O3S4/0.25H2Oに関する分析理論値（実測値）：C, 44.70(44.75); H, 3.63(3.53); N, 6.95(6.82)。
1.3 Me 3 （ TRENIAM)- トリス（ 2- メルカプトチアゾライド )(2) の合成
100mLのCH2Cl2に溶解されたトリス(2-アミノエチル）アミン（TREN)(1.7mmol)を600mLのCH2Cl2に溶解された１（15.1mol）に滴下し加えた。反応混合液を蒸発、乾燥させ黄色の油と得た。この油を0-4%のMeOH/CH2HL2を用いたフラッシュシリカクロマトグラフィーにかけ、精製した。溶媒を蒸発させ、黄色の泡体として産物を得た。収率；70%。IR（CDCl3フィルム）ν1635、2939、3386cm-1。1H NMR(500MHz, CDCl3, 25℃）；δ2.83（s、6H、 CH2), 3.42(br t, 6H, CH2), 3.84( s, 9H, CH3), 4.63(br t, 6H, CH2), 7.19(t, J=7.7Hz, 1H, ArH), 7.39(d, J=5.7Hz, 3H, ArH), 7.73(br t, 3H, NH), 8.01(d, J=6.0Hz, 3H, ArH)。13C NMR(500MHz, CDCl3, 25℃): δ29.2, 38.2, 53.6, 55.7, 63.2, 124.4, 127.1, 132.2, 134.1, 155.6, 165.0, 167.3, 201.4, C42H45N7O9S6:に関する分析理論値（実測値）：C, 51.26(51.26); H, 4.61(4.71); N, 9.96(10.09)。
【０３４３】
1.4 Me 3 （バイキャップド TRENSAM)(3) の合成
400mLのCHCl3に溶解された２（7.0mmol)及び400mLのCHCl3に溶解されたTREN(6.9mmol)を、研究用ポンプを使い2800mLのCHCl3が満たされ、機械式オーバーヘッド型スターラーを取り付けた5-Lの丸底フラスコに加えた。混合液を添加中、窒素雰囲気下、〜40℃に加熱した。24時間後、反応混合液を０−10%のMeOH/CH2Cl2勾配にて溶出するシリカカラムで精製した。溶媒を蒸発し、無色のガラス体として産物を得た。収率；46%。IR（CDCl3フィルム）ν1522、1653, 2929cm-1。1H NMR(500MHz, CDCl3, 25℃）；δ3.45（s、24H、 CH2), 3.47(s,9H, CH3), 7.15(t, J=7.7Hz, 3H, ArH), 7.54(br t, 6H, NH), 7.80(d, J=7.7Hz, 6H, ArH)。13C NMR(500MHz, CDCl3, 25℃): δ39.4, 56.2, 62.5, 124.4, 128.2, 133.1, 155.7, 166.1,(+)-FABMS:m/s:773[M++H]。 C39H48N8O9・2MeOH6:に関する分析理論値（実測値）：C, 58.84(58.68); H, 6.74(6.73); N, 13.39(13.19)。
【０３４４】
1.5 H 3 ( バイキャップド TRENSAM) ・ 2HBr(4) の合成
３（0.3mmol）を乾燥、脱気したCH2Hl230mLに溶解した。冷却された溶液にBBr3（42.3mmol)を注射器を使い、窒素雰囲気下に加えた。〜36時間攪拌した後、容器を蒸発させ乾燥し、淡オレンジ色の固体を得た。固体をゆっくりMeOHでクエンチングし、煮沸水100mLに加えた。溶液を3.5時間煮沸、その後冷却すると白色の固体が沈殿した。固体を濾過して集め、オーブンで乾燥させた。収率；80%。1H NMR(300MHz, DMSO-d6, 25℃）；δ3.67（s、24H、 CH2), 6.97( t, J=7.9Hz、3H, ArH), 8.00(d, J=7.8Hz, 6H, ArH), 9.10(br s, 6H, NH。13C NMR(500MHz, DMSO-d6, 25℃): δ36.2, 57.1, 117.6, 118.9, 134.1, 159.6, 169。(+)-FABMS:m/s:731[M++H]。C36H45N8O9Br2:・3H2O：に関する分析理論値（実測値）：C, 45.68(45.81); H, 5.32(5.47); N, 11.84(11.66)。
【０３４５】
1.6 ［ Eu （バイキャップド TRENSAM) 2 ］ Br(DMF)(H 2 O) 10 の合成
４（0.50mmol)をランタニド塩（0.24mmol、Ln(NO3)3又はLnCl3）を加えた5mLのDMSO及び10mLの水に溶解した。懸濁液を固体が全て溶解するまで加熱、環流した（20分）後、過剰のピリジン（0.5mL)を加えた。混合液を５時間還流し、続いて室温まで冷却した。溶液を蒸発、乾燥させ、残査をiPrOHに懸濁、超音波処理し、濾過した。収率：80%。(+)-FABMS:m/s:1612[M++2H]。C75H109N17O29BrEuに関する分析理論値（実測値）：C, 46.13(46.32); H, 5.63(5.65); N, 12.19(12.24)。
【０３４６】
1.7 ［ Tb( バイキャップド TRENSAM)2 ］ + 5 の合成
Eu3+錯体の合成の記載と同一法を使用した。収率：80%。(+)-FABMS:m/s:1619[M++2H]。
【０３４７】
1.8 結果
大型２環式リガンドは、適当なポリ（チアゾライド）中間体を１当量のポリアミンと反応させることで高希釈条件下に合成された（Karpishin ET AL., Am. J. Chem. Soc.115: 182(1993)）。これによりBBr3を用い脱保護される無色の泡体として保護型リガンドを得た。水溶液中にて254nm及び365nmを照射すると、リガンドは強く発光し、青色光を放射した。
【０３４８】
金属錯体の合成はリガンドを水溶液（又はDMSO/水混合体）に懸濁し、続いて適当なランタニド塩を加えることで実施される。約30分間環流した後、過剰の塩基が加えられる（ピリジン又はトリエチルアミン）、そして反応は更に数時間継続される。金属錯体の形成は、水性反応混合液をUVランプで照射する8254nm及び365nm)ことでモニターできる。照射時、Tb3+錯体の反応混合液は青緑色の光を発するが、Eu3+錯体は赤色を発する。何れの色も肉眼で明瞭に見ることができる。化合物を分離、乾燥した後Eu3+及びTb3+錯体いずれの発光も強い輝度を保った。Eu3+又はTb3+を溶液に加えると、リガンドの青色の蛍光が緑又は赤に置換されることから、リガンドから金属イオンへの効率的なエネルギー転移があることが示唆される。配位水は水溶液中の強く発光する、Eu3+(5Do)及びTb3+(5D4)の励起状態を消光させるのに極めて有効であることが知られており、ランタニドカチオンの第１配位球では、水の結合に対しリガンドが良好な保護を提供することが示唆されている（Bunzli, J.-C.G. Luminescent Probe; Bunzli, J.-C. G.とChoppin、G.R.,編集；Elsevier: Amsterdam, 1989, pp245）。
【０３４９】
実施例２
実施例２は発明の例示化合物のX線構造決定を詳述する。X線結晶学データに基づく分子モデルは図４及び図５に記載されている。
【０３５０】
2.1 X線データの収集、構造解析及び改良
全てのX線構造データセットは、SimensSMART Area Detector回折計（SMART, Area-Detector Software Pakage; Siemens Industrial Automation, Inc.: Madison, 1994）により集められた。結晶はパラトン油中に水晶製毛細管上に取り付けられ、回折計上に窒素流中に冷却された。Simens SAOMTソフトウエアーパッケージ（SAINT, SAX Area-Detector INtegration Program v.4.024; Siemens Industrial Automation, Inc.: Madison, 1994）を使いピーク積分を実施した。スペースグループ決定はソフトウエアーXPREPを使い行われた。構造は直接法により解析され、SHELXTLソフトウエアーパッケージ（PC版、SHELXTL．Crystal Structure Analysis Determination Package; Siemens Industrial Automation, Inc.:Madison, 1994）を使用し改良された。全ての水素原子は理論位置に固定され、その熱パラメータは等方性に改良された；全ての非水素原子は非等方性に改良された。
【０３５１】
2.2 結果
過剰のリガンドを利用したランタニド錯体の合成により、ML2錯体を優先的に分離することができた。X線回折に好適な［Eu（バイキャップドTRENSAM)2］+は、アセトンから錯体の湿潤DMF溶液内への核酸により成長した。構造体は金属中心球体周辺のバイキャップ型TRENSAMの２リガンドによる包み込みを示した（図４）。リガンドは相互に約90°のオフセットを持つ、直交様式で金属に接近する。Eu3+金属中心は、２種類のクリプタートそれぞれに由来する３結合単位の２つを利用する８配位体である。Eu3+周囲の配位多面体は、大型２環体の一方から作られるアンチプリズムの各面によって若干変形された、正方−アンチプリズムとして記述することができる（図５）。Kepert、D, L. Inorganic Stereo-chemistry; Springer-Verlag: Berlin, 1982参照。各大型２環体の第３腕はMoO2［バイキャップ型TRENCAM］の様な幾つかの金属-オキソ大型２環式錯体に見られる様な形式では配位しない（Albrecht, M.; Franklin, S.J.; Raymond, K.N.Inorg.Chem.1994, 33, 5785)。非配位型イソフタルアミドリガンドは結合したキレート団の一つとの分子内π-π積重相互作用に関与し、これが溶媒範囲からの金属中心の保護に寄与するだろう。この非配位キレートは、この錯体のUV-Visスペクトル上に低エネルギー位置に出現する２本の主要バンドの１つにも関係するだろう（図２）。スペース充填モデルは、金属イオン周囲に２個のリガンドが合わさることで、溶媒分子によるランタニド金属イオンの励起状態の不活性化に対し非常に効果的な保護を提供することを示唆している。構造体は更に錯体が、各イソフタルアミドキレートのカルボキシルアミド陽子と脱保護型2-ヒドロキシル酸素の間に形成された強力な分子内水素結合に一部依存して安定化されることも示している（Cohen, S.M.; Raymond, K.N.準備中、1998）。
【０３５２】
実施例３
実施例３は発明の例示化合物の分光光度滴定を詳述する。
【０３５３】
3.1 分光光度滴定
バッチ滴定サンプルはMES緩衝液、0.1M KClを含み、KOHにてpH=5.78に調製されたミリポア精製水中に調製された。サンプルは測定前に37℃にて15時間インキュベーションされ、確実に熱力学的平衡状態を得た。リガンド濃度は全サンプルについて2.32×10-5Mであり、EuCl3は０ないし2.2当量の範囲で滴定された。スペクトルは1.0cmの水晶製Suprasilセルを用い、ダブルビーム型Perkin-Elmer Lambda９UV-可視分光光度計にて記録された。サンプルはNaslabRTE-111水槽を利用し、25.0±0.2℃の一定温度に保たれた。データ処理はソフトウエアーパッケージSPECFIT2.1086.1を用いて実施された。
【０３５４】
3.7 結果
Eu3+によるバイキャップ型TRENSAMのバッチ滴定を実施し、これら錯体の溶液挙動及び安定性を評価した。リガンド濃度は一定に保ち、ランタニドイオン量を漸次上げ、一連のサンプルに加えた。この力価測定に関する実験スペクトルは図２Aに示す。スペクトルは、金属濃度の増加に伴い新たなバンドが出現することを示す。実験スペクトルより、二種類の金属錯体、即ち単一吸収帯を持つものと、二重吸収帯を持つ錯体が形成されることが容易分かる。プログラムを用いた特異的因子分析からは、滴定中に３種類の吸収種が存在していることが示された（Gampp, H.； Maeder, M.; Meyer, C.J.:Zuberbuhler, A.D. Talanta 1986, 33, 934)。遊離型リガンドのスペクトルは独立に測定され、金属種に関する理論スペクトル（ML,及びML2は）を図2Bに示した。ML2錯体（過剰なリガンド存在下に独立に合成された）に関する理論及び実測スペクトルを比較から実験データの数学的処理の正確性が更に確認された（図３）。Ln[バイキャップドTRENSAM]n（バイキャップドTRENSAMを持つEu3+のlogβ11及びlogβ12）の安定係数はそれぞれML錯体に関し7.8、ML2錯体に関し14.4であった。これら安定性は蛍光免疫システムでの利用に関し十分である（Bunzli，J．−C．G．Luminescent Probes; Bunzli, G.-C.G.及びChoppin，G.r.,編集.;Elsevier:Amsterdam,1989、pp219）。
【０３５５】
実施例４
実施例４は発明の例示化合物の量子収量決定を詳述する。
【０３５６】
4.1 量子収量決定
バイキャップドTRENSAMを及びTb3+[バイキャップドTRENSAM]n含むサンプル溶液中の量子収量を水中にて、0.05M H2SO4中の硫酸キニーネ（屈折率；1.338、絶対量子収量：0.54）に対し決定された。Meech, S.R.; Phillips, D.C. J.Photochem.1983, 23, 193参照。Eu3+[バイキャップドTRENSAM]n錯体の量子収量は分光光度滴定の溶液を用い決定された（上記参照）（化学量論比、Eu3+[バイキャップドTRENSAM]2錯体に関してはM:L=0.5、そしてEu3+[バイキャップドTRENSAM]錯体に関してはM:L=１）。リガンド励起条件下での測定は励起ビーム中心0.100cmの水晶製Suprasilルミネッセンスセル付きSpexFluoroMax分光蛍光計にて実施された。相対量子収率（Qx/Qr）は式Ｉを用い計算された。
【０３５７】
式Ｉ
Qx/Qr=［Ar(λr)/Ax(λx）］・［I（λr)/I（λx）］・［n2x/n2r］・［Dx/Dr］
記号ｒは対照を表し、ｘはサンプルを表す。式中の残りに用語は以下の様に定義される：Aは励起波長での吸収、Ｉは同一波長での励起光の強度を、ｎは屈折率、そしてＤは積算ルミネッセンス強度である。測定されたサンプルは１×10-3−１×104Mの濃度で調製された。
【０３５８】
実施例５
実施例５は発明の例示化合物の高分解ルミネッセンス測定を例示する。
【０３５９】
5.1 高解像ルミネッセンス測定
高分解ルミネッセンススペクトルは既報の装置セットにより測定された（Bunzli、J.-C.G.;Milicic-Tang、A.Inorg.Chim.Acta 1996, 252, 221）。サンプルは微粉末サンプル（La、Eu、Tb）及び単結晶（Eu)として測定された。水には二回蒸留水を用い；溶液のpHは約6.5であった。ルミネッセンススペクトルは、装置機能に関し補正されたが、励起スペクトラについては補正しなかった。
【０３６０】
5.2 結果
遊離型リガンドバイキャップドTRENSAM及びこのリガンドで形成されたEu3+とTb3+金属錯体は水中では強度の蛍光物質である。図６はそれぞれ320、338及び302nmに於ける［Eu（バイキャップドTRENSAM）2］+、［Tb（バイキャップドTRENSAM）2］+体及び遊離型バイキャップドTRENSAMの水溶液の発光スペクトルを示している。遊離型リガンドバイキャップドTRENSAMの発光スペクトルは、398nm付近を中心とする強く広い蛍光帯を示し、青い光を発光した。しかし、金属イオンの添加により錯体のスペクトルは金属中心ｆ→ｆ転移による細い強いラインを構成した。更に、広いリガンド蛍光帯は金属錯体の添加により完全に消失し、リガンドにより吸収されたUV光が効率的にランタニドイオンの可視的な赤（Eu3+)又は緑（Tb3+)ルミネッセンスに変換されたことが示唆される。
【０３６１】
［Eu（バイキャップドTRENSAM）2］+錯体の結晶サンプルについ高分解、固態測定を実施した。結晶場分割に関する5Do→7Fj転移分析は、7F1レベルが完全に等間隔の、低部位対称性を示す３成分に分割されることを示す。7F2は３成分に分割され、7F4は5-6成分に分割されるが、これらは5Do→7F0の極低強度と結び付いてD2部位対称性を示す（許可転移数：J=０、１，２及び４について０、３、３及び６）。従って、ルミネッセンスデータは、Eu3+周囲の配位ポリへドロンのX線分析が歪んだ平方アンチプリズムとして記述されることを確認した（D4d→D4→D2）。10-4M水溶液の発光スペクトルは、295Kでは実質的に固体サンプルの発光スペクトルと同じ特徴を示し5Do←7F0励起スペクトルは単一の、17243cm-1に中心を持つ広域帯（fwhh=11.9cm-1）を示し、溶液中のEuIII環境が固態中のそれに似ていることを指摘している。
【０３６２】
Eu3+（バイキャップドTRENSAM）n錯体の量子収量は0.1MのKCl、0.05MのES緩衝液を含み、KOHでpH5.78に調製された水の中で決定された。両Eu3+（バイキャップドTRENSAM）n錯体は共にそれぞれEuL及びEuL2錯体について1%及び10％の量子収量を持つ強いルミネッセンス体である。Tb（バイキャップドTRENSAM）2含について水中にて測定された量子収量は少なくとも36%であると決定された。水中の遊離リガンドの量子収量は約９％と測定された。
【０３６３】
これら錯体の量子収量は最近開発された１段階ルミネッセンスアッセイシステムで用いられており、そして水中での量子収率が２％であるポリピリジン錯体に比べ遙かに高い（Mathis, G. Clin. Chem. 1993, 39, 1953; Mathis, G. Clin.Chem.1995, 41, 1391)。更に、強い蛍光性の錯体をTb3+及びEu3+の両方と形成することについてもバイキャップドTRENSAMは特異的である。多くのリガンドでは、研究されている多くのリガンドシステムでは、強いルミネッセンスはTb3+又はEu3+のどちらか一方でのみ観察され、両方については観察されない。この様なルミネッセンスをこのリガンドが両金属イオンと共に生ずる理由を明らかにするには、更に分光学的測定が必要であろう。これら実験は、錯体全体の電気的構造、特にリガンドの供与エネルギーレベルの位置や受け入れ金属軌道の位置を決定するだろう（Petoud, S,; Bunzli, J.-C. G.;Schenk, K.J.;Piguet, C.Inorg. Chem. 1997, 36. 1345）。
【０３６４】
実施例６
実施例６はリガンドH22IAHM、その類似体及び金属キレートの合成を例示する。実施例６の化合物の合成略図を図８に示す。
【０３６５】
6.1 テトラキス（チアゾリン） Me4H22IAM 、 7 の合成
テトラキス(2-アミノエチル）エチレンジアミン（H22)（2.8mmol)を150mLのCH2Cl2に溶解し、これを600mLのCH2Cl2に溶解された１（82.9mmol)に滴下し加えた。反応混合液を蒸発、乾燥させ黄色の油を得た。この油をフラッシュシリカカラムクロマトグラフィー（CH2Cl2の0-15%MeOH勾配）にて精製した。溶媒を蒸発させて黄色の泡体として産物を得た。収率；83.8%。IR（CH2Cl3フィルム）ν1522、1653、2942cm-1。1H NMR(500MHz, CDCl3, 25℃）；δ2.67（s、4H、 CH2), 2.71(t,J=6.2Hz、8H, CH2), 3.39( br t, 8H, CH2), 3.48(s, J=5.8Hz, 8H, CH2), 3.76(s, 12H, OCH3), 4.59(t,J=7.2Hz, 8H,CH2), 7.14(t, J=7.7Hz, 4H, ArH), 7.35(d, J=5.8Hz, 4H, ArH), 7.79(br t, 4H, NH), 7.97(d, J=6.0Hz, 4H, ArH)。13C NMR(500MHz, CDCl3, 25℃): δ29.1, 37.9, 50.6, 53.5, 55.7, 63.1, 124.3, 127.2, 129.1, 132.0, 133.9, 155.6, 164.9, 167.3, 201.4, C58H64N10O12S8:・2H2Cl2:に関する分析理論値（実測値）：C, 47.43(47.45); H, 4.51(4.52）; N, 9.22(9.54)。
【０３６６】
6.2 Me4H221AM.8 の合成
７（1.1mmol)を10mLのCH2Cl2に溶解した。この溶液に1,5mLのメチルアミン水（40重量%）を加え、次いで二相性ミキサーで激しく振盪した。30秒以内に黄色い色が消失した。混合液を蒸発し、乾燥させ、残った残査をフラッシュシリカカラムクロマトグラフィー（CH2Cl2の0-15%MeOH勾配）にて精製した。溶媒を除き、オーブンで乾燥させ白色の泡体として８を得た。収率；84.1%。IR（CDCl3フィルム）ν1539、1652、3296cm-1。1H NMR(500MHz, CDCl3, 25℃）；δ2.74（br m、12H、 CH2), 2.87(d, J=4.5Hz、12H, NCH3), 3.40( br d, 8H, CH2), 3.70(s, 12H, OCH3), 7.02(t, J=7.5Hz, 4H, ArH), 7.50(br d, J=4Hz, 4H, NH), 7.62(d, J=7.5Hz, 4H, ArH), 7.72(d, J=8.0Hz,4H, ArH), 7.83(br t, 4H, NH)。13C NMR(500MHz, CDCl3, 25℃): δ26.6, 37.7, 51.7, 53.3, 63.1, 124.5, 127.4, 128/7, 133/1, 133.5, 155.6, 165.5, 166.2, C50H64N10O12:・2H2Oに関する分析理論値（実測値）：C, 58.13(58.30)；H,6.63(6.59)；N.13.56(13.75)。
【０３６７】
6.3 H 4 H211IAM ・ 2HBr.9 の合成
８(0.9mmol)を40mLの乾燥、脱気したCH2Cl2に溶解した。溶液を氷槽にて冷却し、BBr3（48.0mmol)を窒素雰囲気下、注射器を用い加えた。淡黄色のスラリーを48時間攪拌した後、溶液をゆっくりMeOHにてクエンチングした。混合液を水で希釈し（合計容積100ml)、黄色の色が完全無くなるまで煮沸した。得られた無色の溶液を煮沸して容積を50mLとし、次に冷却して白色固体を得た。産物を濾過して集め、オーブンで乾燥させた。収率；74%。1H NMR(500MHz, DMSO-d6, 25℃）；δ2.81(d, J=4.5Hz, 12H, NCH3), 3.48(br s, 8H, CH2), 3.76(br s, 12H, CH2), 6.92(t,J=4.5Hz, 4H,ArH), 7.97(d, J=7.6Hz, 4H, ArH), 8.02(d, J=7.6Hz, 4H, ArH), 8.87(br s, 4H, NH), 8.97(br s, 4H, NH), 10.09(br s, 4H, OH)。13C NMR(500MHz, DMSO-d6, 25℃): δ26.5, 35.0, 52.9116.6, 118.5, 119.8, 132.0, 134.6, 160.2, 166.9, 169.4, C46H58N10O12Br2:・5H2Oに関する分析理論値（実測値）：C, 46.32(46.34); H, 5.75(5.70); N, 11.74(11.66)。（+)-FABMS:m/s:941[M++H]。
【０３６８】
6.4 ［ Eu(H22IAM) ］ + 、 10 の合成
８（0.09mmol)及びEuCl2・7H2O（0.09mmol、99.999%）を5mLのH2O及び1.5mLのMeOHの混合液中に懸濁させ、加熱した。環流温度では溶液は透明になり、そこで1.4mLのピリジンを加えた。白色の固体が沈殿を開始した。354nmのUV光で照射した時の反応混合液の色は赤色である。反応20時間後、溶媒を減らし、混合液を４℃に冷却する。白色の固体を濾過した後、真空オーブン内にて乾燥し、95mgの産物を集めた。収率81.7%。EuC46H58N10O12・1Br・4H2Oに関する分析理論値（実測値）：C, 44.45(44.67); H, 5.03(5.01）; N, 11.27(11.09)。
【０３６９】
6.5 ［ Tb(H22IAM) ］ + 、 11 の合成
８（0.09mmol)及びEu(NO3)3・6H2O（0.05mmol、99.999%）を11mLのH2O及び2.5mLのMeOHの混合液中に懸濁させた。方法は［ Eu(H22IAM) ］ + の合成の記載に類似していた。C46H52N10O121Br・5H2Oに関する分析理論値（実測値）：C, 43.66(43.70）; H, 4.94(4.97）; N, 11.08(11.20)。
【０３７０】
6.6 ［ La(H22IAM) ］ + 、 12 の合成
８（0.05mmol)及びLaCl2・7H2O（0.05mmol、99.999%）を2.5mLのH2O及び1mLのMeOHの混合液中に懸濁させた。方法は［ Eu(H22IAM) ］ + の合成の記載に類似していた。分離及び乾燥により白色の固体46mgを得た。収率74.8%。LaC46H54N10O12・1Br・4H2Oに関する分析理論値（実測値）：C, 44.92(44.91); H, 5.08(5.09）; N, 11.39(11.15)。
【０３７１】
実施例７
実施例７は例示の発明のバイキャップドリガンド及びその金属キレートの合成を例示する。
【０３７２】
7.1 Me 4 バイキャップド H22IAM 、 13 の合成
400mLのCHCl3に溶解された７（2.3mmol)及び400mLのCHCl3に溶解されたH322アミン(2.2mmol)を研究用ポンプを使って、2800mLのCHCl3で満たされた機械式オーバーヘッド型スターラー付き5-Lの丸底フラスコに加えた。混合液を添加中、窒素雰囲気下、〜55℃に加熱した。〜31時間後、混合液を蒸発、乾燥させ、残査をフラッシュシリカカラムクロマトグラフィー（CH2Cl2中の0−20%のMeOH勾配）にて精製した。溶媒を蒸発し、淡い琥珀色の泡体として産物を得た。この化合物は1H及び13C NMRより２種類の立体イソマーとして存在することが分かった（同時にこれは保護型のバイキャップドH22TAMと共に発見された）。主要イソマーのスペクトルのみ報告する。収率；44.0%。1H NMR(500MHz, CDCl3, 25℃）；δ2.69（br s、32H、 CH2), 2.80(s, 8H, CH3), 3.42(br s,12H, COH3), 7.00(br t, 4H, ArH), 7.53(br t, 8H, NH), 7.65(d, J=7.5Hz, 8H, ArH)。13C NMR(500MHz, CDCl3, 25℃): δ37.9, 51.2, 62.8, 124.4, 128.1, 132.8, 155.4,165.7。
C56H72N12O12・1MeOH・0.5CH2Cl2:に関する分析理論値（実測値）：C, 58.54(58.18); H, 6.58(6.81); N, 14.25(14.16)。 (+)-FABMS:m/s:1106[M++K]。
【０３７３】
7.2 H 4 バイキャップド H22IAM ・ 4HBr,14 の合成
13（0.74mmol）を乾燥、脱気したCH2Hl240mLに溶解した。溶液を氷槽内で冷却し、BBr3（48.0mmol)を注射器を使いN2(g)に加えた。淡黄色のスラリーを24時間攪拌した後、溶液をゆっくりMeOHでクエンチングした。混合液をMeOHで希釈し（合計容積100mL）、黄色の色が殆どなくなるまで煮沸した。得られたスラリーを容積50mLになるまで煮沸し、次に冷却してベイジュ色の固体を得た。この産物を濾過して集め、オーブンで乾燥させた。このリガンドは室温にて未確定の立体構の変化を受け1H及び13C NMRスペクトルは共に広域化した。収率；91%。1H NMR(300MHz, DMSO-d6, 90℃）；δ3.45/3.77（br s、40H、CH2), 6.70( bt t, 4H, ArH), 7.85(br d, 8H, ArH), 8.64(br s, 8H, NH)。13C NMR(500MHz, DMSO-d6, 25℃): δ16.8, 37.0(br), 52.6(br), 109.4, 118.2, 1338.8(br), 159.9, 167.8(br)。C52H68N12O12Br12:・4H2O：に関する分析理論値（実測値）：C, 43.23(42.11); H, 5.30(5.44); N, 11.63(11.26)。(+)-FABMS:m/s:1050[M++H]。
【０３７４】
7.3 Tb ［バイキャップド H22IAM ］、 15 の合成
14（0.50mmol)を5mLのDMSO及び10mLの水に溶解し、これにTb(NO3)3／6H2O（0.24mmol、99.999%）を加えた。懸濁液を加熱環流し（30分）、その後過剰のトリエチルアミン（0.5mL)を加えた。混合液を５時間還流した後、室温まで冷却した。溶液を蒸発させ、水を除き、残った液体をTHFにて希釈して白色の固体を沈殿させた。この固体を濾過して集め、オーブンで乾燥させた。収率：80%。(+)-FABMS:m/s:1203[M++H]。
【０３７５】
実施例８
実施例８は水溶液中でのリガンドH22IAMによる錯体の光物理的及び安定特性に関する研究を記す。
【０３７６】
8.1 低濃度での水溶液測定の条件
ランタニドの加水分解を避けるために、10-7M未満の濃度のランタニド錯体について溶液測定を実施する場合にはリン酸緩衝液を使用することが望ましい。報告の測定は、0.01Mリン酸カリウム緩衝液（8.02mLのK2HPO4＋1.98mLのKH2PO4を1000mLに希釈）でpH=7.4に緩衝化された溶液中にて実施された。リン酸緩衝液は蛍光免疫技術に一般的に用いられている。本緩衝液のpH域は時間分解蛍光免疫アッセイの速的条件及び抗体による標識の条件に適合している。
【０３７７】
リガンドH22IAMの強い青色のルミネッセンスは肉眼で検出できる。最大発光は約425nmにある。化合物の励起スペクトルは、240及び340nmに励起バンドを示し、錯体の励起には後者がより効果的である。最大広域吸収帯は340nmにある。
【０３７８】
図13はミリポア水中、〜10-6MリガンドH22IAMの標準化励起（破線、λan=417nm）及び発光（連続線、λex=350nm）スペクトルである。
【０３７９】
図14はミリポア水、1.000cmセル中での8.2・10-7Mの［Tb（H22IAM）］+のUV/Visスペクトルである。
【０３８０】
錯体［Tb（H22IAM）］+及び［Eu（H22IAM）］+のルミネッセンススペクトル中に、リガンドから生じた有意な発光帯は観察されなかった。この観察は、リガンドから金属への効率的エネルギー転移がEu3+及びTb3+錯体で起きていることを示す。
【０３８１】
図15は、ミリポア水中での［Tb（H22IAM）］+の及び［Eu（H22IAM）］+の標準化発光スペクトルである。［Tb（H22IAM）］+8.2・10-7M、λex=354nm；［Eu（H22IAM）］+〜10-6M、λex=350nm。
【０３８２】
8.2 量子収量
表３は、硫酸キニーネの0.05MH2SO4液（絶対量子収量：0.5460）と比較し測定された、通気ミリポア水中に於ける［Tb（H22IAM）］+8.2・10-7Mの絶対量子収量を示す。サンプル及び参照体は同一吸収及び同一λexにて測定された。溶液は実験48時間前に調製された。溶液Aは光から保護され、溶液Bは48時間室内光に曝された。
表３
溶液 λex/nm Qabs
Ａ ３５４ ０．６０５
Ａ ３１８ ０．６０５１
Ｂ ３５４ ０．５５５７
Ｂ ３１８ ０．５１１１
錯体［Tb（H22IAM）］+で得られた量子収量の最高値から、リガンドからTb3+カチオンに向かって起こるエネルギー転移が極めて効率的であることが示される。
【０３８３】
8.3 寿命
8.2・10-7M、の［Tb（H22IAM）］+溶液中に於けるTb3+の寿命の予備測定をレーザー励起及び高速捕捉システムを利用し実施した。リガンド励起下（λex=352nm、λan=545nm）に固有寿命値2.56を得た。この結果は、Tb3+カチオンがH22IAMにより水配位から良好に保護され、非放射性の不活性化を防止していることを示している。
【０３８４】
8.4 水中安定性
［Tb（H22IAM）］+錯体の安定性は、希釈実験を実施することで推定できる。分子のルミネッセンスはその多くを量子収量及び励起係数に依存している。ランタニドカチオンが極端に低い励起係数を持つ場合には、ランタニドに配位するリガンドは“アンテナ”として機能できなければならない。“アンテナ”は大量のUV光を吸収でき、生じたエネルギーをランタニドカチオンに転移できる。このことは、錯体が溶液中でまだ形成される時のみランタニドカチオンのルミネッセンスを観察することができること、そして発光ランタニド錯体の安定性を予測することができることを意味している。［Tb（H22IAM）］+のリン酸緩衝保存液を連続して希釈し、発光スペクトルを記録した。結果を図16に示すが、表には各種濃度、λex=347nmに於ける、0.01Mのリン酸緩衝液中の錯体［Tb（H22IAM）］+の発光スペクトルが含まれている。
【０３８５】
これら結果は、錯体のルミネッセンスが10-15M溶液で検出できることを示しており、この錯体が極めて高い熱力学的安定性を持つことを表している。錯体が水中で合成されていることから、この振る舞いは運動の不活性の結果ではない。
【０３８６】
実施例９
実施例９は、リガンドH22IAMとバイキャップドH221AMのDMSO中での光物理特性及び安定特性に関する研究を記載する。
【０３８７】
9.1 量子収量
エネルギー転移及びクエンチング溶媒の定量値を得るために、［Tb（H22IAM）］+及び［Tb（バイキャップドH22IAM）］+の相対量子収量を［Tb（バイキャップドTRENSAM）2］+を参照体として用い、DMSO中にて決定した。結果を表３に示すが、表は1.071／10-4Mの［Tb（バイキャップドTRENSAM）2］+溶を参照体として利用しDMSO中に決定された9.98・10-5Mの［Tb（H22IAM）］+及び9.19・10-5Mの［Tb（バイキャップドH22IAM）］+溶の相対量子収量を示している。サンプル及び参照体は、サンプルが378nmで励起され、参照体が372nmで励起されたことを除き、同一吸収及び同一λexで測定された。
【０３８８】
表３
Figure 0004819223
［Tb（H22IAM）］+溶液中の比較は、［Ln（H22IAM）］+と形成されたより安定な錯体がより良好なルミネッセンス特性をもつことを示した。その他興味深い１結果が［Tb（バイキャップドH22IAM）］+錯体の発光スペクトルより得られた。Tb3+の5D4レベルから生ずる通常の転移に加え、リガンドの電子レベルから生じた広域帯がより高いエネルギーで観察できる。この観察は、リガンドからの発光が見られない水とは異なりDMSO中ではリガンド→Lnのエネルギー転移が、全体として効率的でないことを示している。
【０３８９】
9.2 DMSO 中での安定性
DMSO中での［Tb（H22IAM）］+及び［Tb（バイキャップドH22IAM）］+の安定性を算出するために、これら化合物の発光スペクトルを各種濃度について測定した。
【０３９０】
これら研究の結果を図17にしめすが、図は各種濃度のλex=335nm（9.98、10-5M）に於ける、及びその他全ての濃度についてλex=347nmでの［Tb（H22IAM）］+の標準化発光スペクトルを示している。Tb3+から生じたシグナルは時間分解測定により識別され、増幅することができ、そして図18は各種濃度に於けるλex=365nm（9.19・10-5M）及びその他全ての濃度に於けるλex=351nmでの［Tb（バイキャップドH22IAM）］+の標準化発光スペクトルを示している。Tb3+より生じたシグナルは時間分解測定法により識別され、増幅できた。
【０３９１】
実施例10
実施例10はリガンドH22IAM-モノ-(N-5-アミノペンチルコハク酸）18の合成を例示する。このリガンドは、発光ランタニド錯体を抗体の様な免疫活性種に結合させるためのものである。４つある2-ヒドロキシイソフタルアミド基の内の１つは、カルボン酸基で終止するリンカーで置換される。合成略図を図９に示す。
【０３９２】
10.1 10- アミノ -4- オキソ -5- アザ - デカン酸、 16 の合成
1,5-ペンタンジアミン（2.5g、24mmol)の乾燥メタノール（20mL）溶液に無水コハク酸（2g、20mmol）の乾燥塩化メチル溶液（20mL）を２時間かけ滴下し加え、産物を白色の固体として沈殿させ、濾過して集めた。収率；80%。1H NMR(500MHz, D2O, 25℃）；δ1.280（５重項,Ｊ＝7.5，2H CH2), 1.449(５重項, J=7.5、2H, CH2), 1.577(５重項、J=7.5、2H, CH2), 2.337（s, 4H, CH2), 2.886(t, J=7.5Hz, 2H, CH2), 3.072(t、J=7.5、2H, CH2）。13C NMR(500MHz, D2O、25℃):δ22.73、26.22、27.66、32.34、33.13、38.76、39.37、175.72、180。
【０３９３】
10.2 Me 4 （ H22IAM- モノ -(N-5- アミノペンチル）コハク酸誘導体
Me4H22IAMテトラキス（チアゾリド）（７，図８）（5.4g、4mmol)のCH2Cl2溶液に、16（0.2g、1mmol)のCH2Cl2溶液（200mL)を24時間かけ滴下し加え、混合液を更に24時間攪拌した後、メチルアミン（0.1mL、40%水溶液）を加えた。チアゾリドに特徴的な黄色の色が消えた：溶液を蒸発、乾燥させ、適当な分画を吸引し勾配フラッシュシリカクロマトグラフィーカラム（CH2Cl2溶液中の5-10% CH3OH勾配）にかけ、白色の泡体として純粋産物0.59g（51%）を得た。(+)-FABMS:m/s:1154.7[MH+]。1H NMR(500MHz, CDCl3, 25℃）；δ1.246(br s, 2H, CH2), 1.371(br s, 2H, CH2), 1.469(br s, 2H, CH2), 2.263(br s, 2H, CH2),2.355(br, s,2H, CH2), 2.737(br s, 12H, NCH2), 2.858(s, 4H, CH2), 3.015(br s,2H, CH2), 3.275(br s, 2H, CH2), 3.479(s, 8H, NCH2), 3.694(s, 12H, OCH3), 6.930(s,1H, NH), 7.020(t,J=7.5, 4H, ArH), 7.5-7.6(m, 8H,4NH+4ArH), 7.722(d,4H,J=7.0, ArH), 7.94-8.0(m, 4H, NH)。13C NMR(500MHz, CDCl3, 25℃): δ=21.50, 23.8, 26.57. 28.63, 30.66, 31.24, 37.19, 38.90, 39.43, 44.91, 50.88, 52.95, 62.99, 63.03, 124.31, 127.34, 127.40, 128.41, 128.45,128.66, 132.91, 133.39,155.46, 155.52, 165.62, 166.12, 173.02, 175.10, 176。
【０３９４】
10.3 H22IAM- モノ -(N-5- アミノペンチル - コハク酸）誘導体
18(0.58g、0.5mmol)を乾燥し、脱気されたCH2Cl2に(20mL）溶解した。養鶏を氷槽にて冷却し、BBr3（1mL、11.4mmol)を窒素下、注射器を用い加えられた。得られた淡黄色のスラリーを48時間攪拌し、その後揮発性産物を真空下に除き、残査をメタノール（30mL）でクエンチングした。メタノール液を水(40mL)で希釈し、無色透明の液体が得られるまで煮沸した；その容積は10mLまで減量された。溶液を冷却すると、白色の固体が沈殿し始め、濾過して46mgの産物を集め、真空下に乾燥した。この溶液の濾液を遠心分離で集め、乾燥させ更に213mgの固体を得た。収率；40%。(+)-FABMS:m/Z:1097.7。1H NMR(500MHz, DMSO-d6, 25℃）；δ1.24-1.60（m, 6H, CH2), 2.812(m, 4H, CH2), 3.476(br s, 12H, NCH2), 3.702(br s, 8H, NCH2), 6.923(t, J=7.7, 4H, ArH) 7.684(br s, 1H, NH), 7.95-8.04(m, 8H, ArH), 8.818(br s,4H, NH), 8.943(br s, 4H, NH)。1H NMR(500MHz, D2O, 25℃）；δ1.297（５重項、J=7.2, CH2), 1.444(５重項、J=7.2, 2H, CH2), 1.579（５重項、J=7.2、2H、CH2), 2.664(s, 4H, CH2), 2.889（t, J=7.2、2H、CH2), 3.099(t,、J=7.2, 2H, CH2), 3.437（br s, 8H, NCH2), 3.653(br s, 12H, NCH2), 6.5-6.7(m,4H、ArH), 7.3-7.5(m, 8H, ArH)。C54H69N11O15・（HBr)2・9H2Oに関する分析理論値（実測値）：C, 45.16(45.14); H, 5.49(6.25); N, 10.46(10.73)。
【０３９５】
10.4 Tb ［ H22IAM- モノ -(N-5- アミノペンチル - コハク酸）誘導体、 19
18（0.042mmol)及びTb(NO3)3・6H2O（0.042mmol、99.999%）を30mLのMeOHに懸濁した。懸濁液を環流し、透明になるまで加熱した。溶媒は7mLまで減らされ、過剰量のピリジンが加えられた。UV照射（354nm)により緑色を強く発光する白色の固体が直ぐに沈殿した。懸濁液を15時間還流し続けた。溶液を４℃に冷却した後、産物を濾過し、真空オーブンで乾燥させ46mgの固体を得た。収率63%。TBC54H68N11O15Br(NO3)・7H2Oに関する分析理論値（実測値）：C, 40.09(39.95); H, 5.11(4.76）; N, 10.39(10.42)。
【０３９６】
10.5 Eu ［ H22IAM- モノ -(N-5- アミノフェニル - コハク酸）誘導体］、 20
18（0.014mmol)をEuCl3・7H2O（0.014mmol、99.999%）を含む12mLのH2Oに懸濁させた。懸濁液を環流するまで加熱した。溶液が透明になったら、過剰のピリジンを加えた（30滴）。白色の沈殿が直ぐに現れ、ピリジンを更に加えこれを溶解した。15時間還流した後、溶媒を除き、白色の固体をMeOHに再溶解した。ポリ人を加え固体を得ると、UV照射（354nm)により強い赤い発光が観察された。11.4mgの化合物を濾過して集め、乾燥させた。収率：53%。EuC54H68N11O15Br2Cl・5H2Oに関する分析理論値（実測値）：C, 41.89(41.55）; H, 5.08(5.07）; N, 9.95(10.24)。
【０３９７】
実施例11
実施例11はリガンドH22テトラ(6-アミノ-1-ヘキサンアミド）IAM,23の合成を例示する。このリガンドは発光ランタニド錯体を抗体の様な免疫反応種に結合させることを目的としている。４つある2-ヒドロキシイソフタルアミド基の内の１つは、第１アミンで終止するリンカーで置換される。合成略図を図10に示す。
【０３９８】
11.1 6-(Z- アミノ） -1- ヘキシルアミン、 21 の合成
1,6-ヘキサンジアミン（0.050mmol)のCH2Cl2（50mL）溶液を1.0当量の塩化水素酸で中和した。この中和アミン液の半量に、Z-チアゾリドのCH2Cl2(50mL)液を８時間かけ、攪拌しながらゆっくり加えた。得られた液体を2MのKOH液（100mL)で洗浄し、これを蒸発させ乾燥した。次に残査をクロマトグラフィーにかけ（3-15%CH3OHのCH2Cl2勾配溶液）、6-（Z-アミノ）-1-ヘキサンアミンを白色の半固体として得た。1H NMR(500MHz, CDCl3 , 25℃）；δ1.3193（br s, 4H CH2), 1.4255(br d,2H, CH2), 1.4875(br d,), 2.6671（t, 2H, J=7.0, 2H, CH2), 3.1765(q, 2H, J=6.5, 2H, CH2), 4.8532(br s, 1H, NH）, 5.0827(s, 2H, OCH2), 7.28-7.38(m, 5H, ArH)。
【０３９９】
11.2 Me 4 H22 テトラ (6-Z- アミノ） -1- ヘキサンアミド） IAM 、 22
Me4H22テトラキス（チアゾリド）IAM（７，図８）（0.8mmol)のCH2Cl2(50mL)溶液に、21（4mmol)を加え、混合液をテトラチアゾライドに特徴的な黄色が消えるまで攪拌した。反応混合液を蒸発させ、乾燥し、適当な分画を勾配フラッシュシリカゲルカラム（2-7％CH3OHのCH2Cl2液）より集め、蒸発させて乾燥し、白色の泡体として0.89g(59%)の純産物を得た。(+)-FABMS:m/Z:1874.9[MH+]。1H NMR(500MHz, CDCl3, 25℃）；δ1.333(br s, 16H, CH2), 1.465(br t, 8H, J=6.5, CH2), 1.556(br t, 8H, J=6.5, CH2), 2.688(s, 4H, CH2),2.720(t, 8H, J=6.0, CH2), 3.132(q, 8H, J=6.5, CH2), 3.366(q, 8H, J=6.5, CH2), 3.460(q, 8H, J=6.0, CH2)3.765(s, 12H, NH), 5.041(s, 8H, OCH2), 5.096(s, 8H, NH), 7.073(t, 4H, J=7.5, ArH), 7.26-7.38(m, 20H, ArH), 7.517(t, 4H, J=5.7, HN), 7.675(d, 4H, J=7.5, ArH), 7.812(d, 4H, J=7.5, ArH), 7.857(t, 4H, J=5.5, NH)。13C NMR(500MHz, CDCl3 , 25℃）；δ26.22, 26.51, 29.31, 29.78, 37.72, 39.70, 40.78, 51.88, 53.40, 63.17, 66.40, 124.61, 127.34, 127.92, 127.96, 129.03, 133.69, 136.59, 155.53, 156.43, 165.44。
【０４００】
11.3 H22 テトラ (6- アミノ -1- ヘキサンアミド） IAM.23
22（0.25g、0.13mmol)を乾燥、脱気したCH2Cl2(20mL)に溶解した。溶液を氷槽中にて冷却し、BBr3（0.5mL、5.7mmol)を窒素下、注射器を使い加えた。得られた淡黄色のスラリーを48時間攪拌、その後揮発成分を真空下に除き、残査をメタノール(20mL)で急冷した。メタノール液を水40mLで希釈し、無色透明の液体が得られるまで煮沸し、容積を10mLまで減らした。溶液を冷却し、ゲルとして現れた化合物を遠心分離し、水と分離した。乾燥後、白色固体234mgを集めた。(+)-FABMS:m/Z:1281.7[MH+]。1H NMR(500MHz, DMSO-d6）25℃）；δ1.310(br s, 16H, CH2), 1.541(br s, 16H, CH2), 2.731（ｑ、8H,J=6.0, CH2), 3.277(q, 8H, J=6.0、CH2), 3.468(br s, 12H, CH2), 3.764(br s, 8H, CH2), 6.922（t、4H, J=7.8, ArH), 8.968(s, 4H, NH), 8.019(d, J=7.8, 4H, ArH), 8.084(d, J=7.8, 4H, ArH), 8.992(br, s, 4H, NH)。
【０４０１】
11.4 Tb[H82.2) テトラ (6- アミノ -1- ヘキサンアミド） IAM].24
23（0.042mmol)を12mLのTb(NO3)3・6H2O（0.042mmol、99.999%）を含むMeOH溶液に懸濁した。懸濁液を環流するまで加熱し、固体を溶解した。得られた溶液にコロイジを45滴加えた。UV照射により強い緑の発光が観察された。13時間還流した後、白色固体が沈殿するまで溶媒を蒸発させた。産物を濾過し、Et2Oで洗浄した。産物を乾燥させた後（真空オーブン）、67mgの産物を集めた。
TbC66H96N14O12B(NO3)(HBr）7・9H2Oに関する分析理論値（実測値）：C, 35.65(35.60）; H, 5.44(5.48）; N, 9.45(9.43)。
【０４０２】
実施例12
実施例12は各種長さの主鎖を持つ発明の化合物の合成を例示する。合成略図を図12に示す。
【０４０３】
12.1 2- メトキシ -1-(2- メルカプトチアゾライド）イソフタルアミドメチルアミド、 44 の合成
１（20g、0.050mol)の塩化メチル（200mL)溶液に、2mLのメチルアミン溶液（40重量%水溶液、d=0.902）及び50mLのイソプロパノールを８時間かけ、滴下し加えた。反応混合液を蒸発、乾燥させ、残査を勾配フラッシュシリカカラム（1-5%メタノールの塩化メタノール液）で精製した。所望産物5.8gを黄色の結晶固体として得た。メチルアミンを基本とした収率：81%。未反応のジチアゾリド7.8gも同時に分離し、回収した。
【０４０４】
1H NMR(500MHz, CDCl3, 25℃）（図14）δ3.012(d, J=5.0, 3H, NHCH3), 3.449(t, J=6.5, 2H, CH2), 3.866(s, 3H, OCH3), 4.660(t, J=7.5, 2H, CH2),7.227(d, J=7.5, 1H, ArH), 7.416(d, J=7.5, 1H, ArH), 7.425(s, br, 1H, アミドH）、8.124(d, J=7.5, 1H, ArH)。13C NMR(500MHz, CDCl3 , 25℃）（図15）δ26.30, 28.73, 55.32, 62.62, 123.81, 126.78, 128.70, 131.49, 155.06, 164.98, 201.15。
【０４０５】
12.2 Me 4 H(3,2)IAM 、 45 の合成
H(3,2)-アミン（1mmol）のCH2Cl2(50mL)溶液に、化合物44（4.8mmol)を加えた。TLCが反応の収量を示すまで混合液を攪拌した。反応混合液を勾配フラッシュシリカゲルカラム（2-7％CH3OHのCH2Cl2液）にかけ精製した。純産物を白色の泡体として得た。収率81%。
(+)-FABMS:m/Z:1011.8[MH+]。1H NMR(500MHz, CDCl3, 25℃）；δ1.624(５重項, N=6.5, 2H, CH2), 2.524(t, J=6.5, 4H, CH2), 2.649(t, 8H, J=6.5, CH2), 2.935(d, 12H, J=5.0, CH2),3.448(q, 8H, J=6.5, CH2), 3.777(s, 12H, CH3), 7.097(t, 4H, J=7.5, CH2), 7.451(t, 4H, J=5.5, アミド), 7.714(d, 4H, J=7.5、ArH), 7.813(t, 4H, J=5.5, アミドH), 7.856(d, J=7.5, 4H、ArH。13C NMR(500MHz, CDCl3 , 25℃）；δ24.15, 26.67, 37.83, 52.06, 53.21, 63.09, 124.54. 127.53, 128.41, 133.23, 133.63, 155.60, 165.46, 165。
【０４０６】
12.3 H 4 H(3.2)IAM,47 の合成
45（0.5mmol)を乾燥、脱気したCH2Cl2(20mL)に溶解し、得られた溶液を氷槽中にて冷却した。BBr3（11.4mmol)を窒素下、注射器を使い加えた。得られた淡黄色のスラリーを48時間攪拌した。揮発成分を真空下に除き、残査をメタノール(30mL)で急冷した。メタノール液を水(40mL)で希釈し、無色透明の液体が得られるまで煮沸し、容積を10mLまで減らした。溶液を冷却すると白色の沈殿が現れ、これを濾過して集め、真空下に乾燥させた。収率62%。
(+)-FABMS:m/Z:1874.9[MH+]。1H NMR(500MHz, CD3OD, 25℃）；δ2.467(５重項、J=6.0, 2H, CH2), 2.871( s, 12H, CH2), 3.625（t、8H,J=6.0, CH2), 3.65-3.75(m, 8H, CH2), 3.85-3.95(m, 4H, CH2), 6.734(t, 4H, J=7.5, ArH), 7.678（d、4H, J=7.5, ArH), 7.772(t, 4H, J=7.5, ArH)。
【０４０７】
12.4 Me4H(4.2)IAM, 46 の合成
本化合物は、H(3,2)-アミンの代わりにH(4,2)-アミンを使うこと以外は、化合物45に関する記述と同一手順を用い調製された。収率84%。
【０４０８】
(+)-FABMS:m/Z:1025.9[MH+]。1H NMR(500MHz, CDCl3, 25℃）；δ1.412(s,br,4H, CH2), 2.490(s, br, 4H, CH2), 2.643(t, 8H, J=6.0, CH2), 2.945(d, 12H, J=5.0, CH2),3.464(q, J=6.5, 8H, CH2), 3.767(s, 12H, CH3), 7.111(t, 4H, J=7.5, ArH), 7.396(q, 4H, J=5.0, アミドH), 7.752(d, 4H, J=7.5、ArH), 7.795(t, 4H, J=5.0, アミドH), 7.839(d, J=7.5, 4H、ArH)。13C NMR(500MHz, CDCl3 , 25℃）；δ24.15, 24.01, 26.23, 37.64, 49.72, 52.58, 52.41, 53.64, 62.65, 124/03, 127.29, 128.00, 132.79, 133.00, 155/29, 165.20, 165.。
【０４０９】
12.5 H4H（４．２）IAM，48の合成
本化合物は化合物47に関し記載された典型的BBr3脱保護法により脱保護された。
【０４１０】
(+)-FABMS:m/Z:969.7[MH+]。1H NMR(500MHz, DMSO-d6, 25℃）；δ1.766(s, br, 4H, CH2), 2.812(d, J=5.0, 12H, CH3), 3.31(s, br, 4H, CH2), 3.386(s, br, 8H, CH2),3.714(d, br, J=5.5, 8H, CH2), 6.948(t, 4H, J=7.5, ArH), 7.984(d, 8H, J=7.5, ArH), 8.844(t, J=5.5, 4H, アミドH), 8.984(d, br, J=5.5, 4H、アミドH), 9.549(s, br, 2H, フェノールH）。13C NMR(500MHz, D2O-NaOD , 25℃）、δ1.313(s, br, 4H, CH2), 2.388(s, br, 4H, CH2), 2.593(t, J=6.0, (H, CH2), 2.755(s, br, 12H, CH3), 3.343(t, J=6.0, 8H, CH2), 6.477(t, 4H, J=7.5, ArH), 7.816(d, 8H, J=7.5, ArH)。
【０４１１】
上記記述は例示を目的とするものであり、制限を目的とするものではないと理解される。上記記述を読むことで多くの実施態様が当業者に明らかになるだろう。従って、発明の範囲は上記記述の参照により決定されるものでなく、添付のクレームの範囲を参照し、これらクレームが題されたものと等価である完全な範囲にそって決定されなければならない。出願中特許及び公開特許を含めた全ての刊行物及び参照物の開示が参照され、ここに取り込まれている。
【図面の簡単な説明】
【図１】 リガンドH3（二面冠TRENSAM）・2HBrの合成経路図の一例である。
【図２】 （A）〜（B）は、緩衝水溶液中で二面冠TRENSAMをEuCl3で滴定することにより得られるスペクトルの実験結果（A）と計算値（B）である。図2Aのスペクトル1〜18は、順番にランタニド・イオンの濃度の増加に対応している。図2Bでは、実線は二面冠TRENSAMであり、点線はEu［二面冠TRENSAM］2であり、破線は、Eu［二面冠TRENSAM］である。
【図３】 Eu［二面冠TRENSAM］について実験により得られた電子スペクトル（実線）と計算により得られた電子スペクトル（点線）を重ねたグラフである。
【図４】 （A）〜（B）は、［Eu（二面冠TRENSAM）2］+について、確率20％の楕円体でのORTEP（A）と空間充填（B）で示した構造図である。図を見やすくするため、水素、溶媒、反対イオンは省略してある。
【図５】 （A）〜（B）は、［Eu（二面冠TRENSAM）2］+の金属中心の構造図（ORTEP）である。金属中心の配位多面体は、わずかに歪んだ正方逆プリズム（A）であり、その逆プリズムのそれぞれの面は、二面冠TRENSAMリガンド（B）の1つによって形成されている。確率50％の楕円体が示してある。
【図６】 自由な二面冠TRENSAM（実線、（ミリポアで精製した）水の中に4.24×10-4M）、［Tb（二面冠TRENSAM）2］+（破線、（ミリポアで精製した）水の中に1.3×10-5M）、［Eu（二面冠TRENSAM）2］+（点線、（ミリポアで精製した）水の中に1.08×10-4M）の発光スペクトルを重ねて示したグラフである。0.1MのKCl、KOHでpHを5.78に調整した0.05MES緩衝液を使用した。
【図７】 （A）〜（B）は、本発明で使用する代表的なデンドリマーの構造図である。
【図８】 本発明の4本脚リガンドを合成するための代表的な経路を示す図である。
【図９】 本発明の化合物を、この化合物をリガンドを別の化学種に結合させるための座を提供するリンカー・アームを用いて誘導体化するための代表的経路を示す図である。
【図１０】 アルキル・アミン基を用いて誘導体化した本発明の化合物を合成するための代表的経路を示す図である。
【図１１】 さまざまな長さの骨格を有する本発明の化合物を合成するための代表的経路を示す図である。
【図１２】 本発明の化合物を別の分子に結合させるための座を提供するリンカーを骨格に有する本発明の化合物を合成するための代表的経路を示す図である。
【図１３】 ミリポア精製水に約10-6MのリガンドH22IAMを溶かしたときの励起スペクトル（点線、λan=417nm）と発光スペクトル（実線、λex=350nm）を規格化して示したグラフである。
【図１４】 ミリポア精製水に8.2×10-7Mの［Tb（H22IAM）2］+を溶かしたときのUV/Visスペクトルである。
【図１５】 ミリポア精製水に［Tb（H22IAM）］+と［Eu（H22IAM）］+を溶かしたときの規格化した発光スペクトルである。［Tb（H22IAM）］+は、8.2×10-7M、λex=354nm；［Eu（H22IAM）］+は、約10-6M、λex=350nmである。
【図１６】 0.01Mリン酸緩衝液に［Tb（H22IAM）］+錯体を溶かしてさまざまな濃度にした場合の発光スペクトルを重ねて示したグラフである。λex=347nm。
【図１７】 さまざまな濃度の［Tb（H22IAM）］+について規格化した発光スペクトルを重ねて示したグラフである。λex=335nm（9.98×10-5M）、他のすべての濃度では、λex=347nmである。
【図１８】 さまざまな濃度の［Tb（二面冠H22IAM）］+について規格化した発光スペクトルを重ねて示したグラフである。λex=365nm（9.19×10-5M）、他のすべての濃度では、λex=351nmである。
【図１９】 本発明の化合物の具体例を示す表である。
【図２０】 本発明の多重アッセイの一例を示した概略図である。
【図２１】 さまざまな長さの骨格を有する本発明の化合物の合成経路を示す図である。

Claims (103)

  1. 式（I）：
    Figure 0004819223
    （式中、
    R2、R4、R5及びR7は水素、アルキル及び置換型アルキル基を含む群より独立に選択されるメンバーであり、
    あるいは、R2、R4、R5及びR7の２以上が、C 6 -C 30 アルキレン及びC 6 -C 30 置換型アルキレンから成る群より選択されるリンカー成分により接続されて、少なくとも１個の環を形成し；
    R3、R8及びR9はアルキレン及び置換型アルキレン基から成る群より独立に選択されるメンバーであり；
    R1、R6、R10、R11、R12、R13、R20、R21、R22及びR23はHであり；
    Q1は-OR18であり；
    Q2は-OR19であり、
    ここで、前記R18及びR19はHであり；
    ａは０又は１であるが、ただしａが０の時N2’はカルボニル基2’に直接共有結合しなければならず、
    ｚは０または１であるが、ｚが０の時にはN1’はカルボニル基1’に直接共有結合しなければならない；
    前記置換型アルキルは、1〜6個の炭素原子を有する低級アルキル、アリール、アシル、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、チオアミド、アシルオキシ、アリールオキシ、アリールオキシアルキル、メルカプト、チア、アザ、オキソ、飽和又は不飽和環式炭化水素、及び複素環から選択される１以上の置換基を含むアルキルである。）
    の構造を持つ化合物。
  2. ｚが０である、請求項１記載の化合物。
  3. R3が直鎖型C1-C6アルキレンである、請求項１に記載の化合物。
  4. 前記R8が(CH2)pであり；
    Ｒ4が式II：
    Figure 0004819223
    （式中、
    R29は水素、アルキル及び置換型アルキル基を含む群より独立に選択され、
    あるいは、R2、R7及びR29の２以上が、C 6 -C 30 アルキレン及びC 6 -C 30 置換型アルキレンから成る群より選択されるリンカー成分により接続されて、少なくとも１個の環を形成し；
    R46、R47、R31、R32及びR33はHである）
    R3は(CH2)xであり；
    Q3は-OR28であり、ここで前記R28はHであり；
    p及びxは１〜５の整数から成る群より独立に選択されるメンバーであり；そして
    ｚは０である。）
    の構造を持つ基で置換されたアルキル基である、請求項２に記載の化合物。
  5. 式（I）：
    Figure 0004819223
    （式中、
    R2 、R 5 及びR7は水素、アルキル及び置換型アルキル基をからなる群より独立に選択されるメンバーであり、
    R9はアルキレン及び置換型アルキレン基から成る群より独立に選択されるメンバーであり；
    R1、R6、R10、R11、R12、R13、R20、R21、R22及びR23は、Hであり;
    Q1は-OR18であり；
    Q2は-OR19であり、
    ここで、前記R18及びR19はHであり；
    ａは０又は１であるが、ただしａが０の時、N2’はカルボニル基2’に直接共有結合し、
    前記置換型アルキルは、1〜6個の炭素原子を有する低級アルキル、アリール、アシル、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、チオアミド、アシルオキシ、アリールオキシ、アリールオキシアルキル、メルカプト、チア、アザ、オキソ、飽和又は不飽和環式炭化水素、及び複素環から選択される１以上の置換基を含むアルキルであり；
    R 8 は(CH 2 )pであり；
    R 4 は、式II：
    Figure 0004819223
     （R 29 は、H、アルキル及び置換型アルキル基を含む群より独立に選択されるメンバーであり；R 2 、R 7 及びR 29 の２以上が、C 6 -C 30 アルキレン及びC 6 -C 30 置換型アルキレンから成る群より選択されるリンカー成分により接続されて、少なくとも１個の環を形成し；R 46 、R 47 、R 31 、R 32 及びR 33 は、Hである。）
    の構造を有する基で置換されたアルキル基であり；
    R 3 は(CH 2 )xであり；
    Q 3 は-OR 28 であり、ここで、R 28 はHであり；
    p及びxは１〜５の整数から成る群より独立に選択されるメンバーであり；
    ｚは０であり；そして
    N 1' は、カルボニル基1’に直接共有結合する。）
    の構造を持つ化合物。
  6. 前記リンカー成分が式III：
    Figure 0004819223
    （式中、
    ｂ，ｅ，ｆは１から５までの整数より成る群から独立に選択されるメンバーである）
    の構造を持つ、請求項５に記載の化合物。
  7. 式IV：
    Figure 0004819223
    （式中、ｂ、ｂ’、ｅ、ｅ’、ｆ及びｆ’は１から５までの整数から成る群より独立に選択されるメンバーであり、R 11 、R 12 、R 13 、R 18 、R 19 、R 21 、R 22 、R 23 、R 28 、R 31 、R 32 及びR 33 は請求項５で定義したとおりである。）
    の構造を有する、請求項６に記載の化合物。
  8. 式Ｖ：
    Figure 0004819223
     （式中、R 1 、R 2 、R 10 及びQ 1 は請求項１で定義したとおりである。）
    の構造を有する、請求項４に記載の化合物。
  9. 式VI：
    Figure 0004819223
     （式中、R 1 、R 2 、R 10 及びQ 1 は請求項１で定義したとおりである。）
    の構造を有する、請求項８に記載の化合物。
  10. 前記R2、R3、R5、R 7 及びR29が、H、C1〜C10アルキル及びC1〜C10置換型アルキルから独立に選択されたメンバーであり；R 8 及びR 9 がC 1 〜C 10 アルキル及びC 1 〜C 10 置換型アルキルから独立に選択されたメンバーである、請求項４に記載の化合物。
  11. 前記R2、R3、R5、R 7 及びR29が、H、C2〜C6アルキル及びC2〜C6置換型アルキルから独立に選択されたメンバーであり；R 8 及びR 9 がC 2 〜C 6 アルキル及びC 2 〜C 6 置換型アルキルから独立に選択されたメンバーである、請求項１０に記載の化合物。
  12. 前記R2、R3、R5、R 7 及びR29が、H、及び多環式アリール基により置換されたアルキルより成る群から独立に選択されたメンバーであり；R 8 及びR 9 が多環式アリール基により置換されたアルキルである、請求項４に記載の化合物。
  13. 前記R2、R5、R 7 及びR29から成る群より選択されたメンバー及びその組合せが第１アルキルアミンである、請求項４に記載の化合物。
  14. 前記第１アルキルアミンが、ω位置にアミン成分を持つC1〜C10アルキル鎖である、請求項１３に記載の化合物。
  15. 前記第１アルキルアミンが、ω位置にアミン成分を持つC2〜C6アルキル鎖である、請求項１４に記載の化合物。
  16. 前記R2、R5、R 7 及びR29から成る群より選択されたメンバー及びその組合せが、ω-カルボキシルアルキル基、ω-カルボキシル置換型アルキル基及びその組合せから選択されるメンバーである、請求項４に記載の化合物。
  17. 前記ω-カルボキシル置換型アルキル基が式VII：
    Figure 0004819223
    （式中、
    XはＯ、Ｓ及びNR50より選択されるメンバーであり、前記NR50はH、アルキル及び置換型アルキルから選択されるメンバーであり；
    YはHであり；そして
    ｊ及びｋは１〜18の整数より成る群から独立に選択されるメンバーである。）
    の構造を有する、請求項１６に記載の化合物。
  18. 前記ω-カルボキシル置換型アルキル基が式VIII：
    Figure 0004819223
     （式中、YはHである。）
    の構造を有する、請求項１７に記載の化合物。
  19. 前記R1、R2、R5、R6、R7、R10、R29、R46及びR47がHである、請求項４に記載の化合物。
  20. 式（I）：
    Figure 0004819223
     （式中、
    R 2 及びR 7 は水素、アルキル及び置換型アルキル基を含む群より独立に選択されるメンバーであり；
    R 3 、R 8 及びR 9 はアルキレン及び置換型アルキレン基から成る群より独立に選択されるメンバーであり；
    R 1 、R 6 、R 10 、R 11 、R 12 、R 13 、R 20 、R 21 、R 22 及びR 23 はHであり；
    Q 1 は-OR 18 であり；
    Q 2 は-OR 19 であり、
    ここで、前記R 18 及びR 19 はHであり；
    ａは０又は１であるが、ただしａが０の時N 2 ’ はカルボニル基2’に直接共有結合しなければならず、
    ｚは０または１であるが、ｚが０の時にはN 1 ’ はカルボニル基1’に直接共有結合しなければならない；
    前記置換型アルキルは、1〜6個の炭素原子を有する低級アルキル、アリール、アシル、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、チオアミド、アシルオキシ、アリールオキシ、アリールオキシアルキル、メルカプト、チア、アザ、オキソ、飽和又は不飽和環式炭化水素、及び複素環から選択される１以上の置換基を含むアルキルであり；
    R 4 は、請求項８で定義された式Iの構造を有する基で置換されたアルキル基であり；
    R 5 は、式IX：
    Figure 0004819223
     （式中、R 39 はアルキレン及び置換型アルキレン基から成る群より独立に選択され、R 40 、R 41 、R 42 、R 43 及びR 45 はHである。）
    の構造を持つ化合物。
  21. 式X：
    Figure 0004819223
    （式中、
    M、N、P及びZは１から５までの整数から成る群より独立に選択されるメンバーであり；R 1 、R 2 、R 3 、R 6 、R 7 、R 10 、R 11 、R 12 、R 13 、R 20 、R 21 、R 22 、R 23 、R 29 、R 31 、R 32 、R 33 、R 39 、R 40 、R 41 、R 42 、R 43 、R 45 、R 46 、R 47 、Q 1 、Q 2 、Q 3 、及びQ ４
    は請求項２０で定義したとおりである。）
    の構造を有する、請求項２０に記載の化合物。
  22. 前記R 2 、R7 、R 29 及びR39、及びその組合せが、ω-カルボキシルアルキル基、ω-カルボキシル置換型アルキル基、及びその組合せより選択されたメンバーである、請求項２１に記載の化合物。
  23. 前記ω-カルボキシル置換型アルキル基が式VII：
    Figure 0004819223
    （式中、
    XはO、S及びNR50より選択されるメンバーであり、前記NR50はH、アルキル及び置換型アルキルから選択されるメンバーであり；
    YはHであり；そして
    ｊ及びｋは１ないし18の整数より成る群から独立に選択されるメンバーである。）
    の構造を有する、請求項２２に記載の化合物。
  24. 前記ω-カルボキシル置換型アルキル基が式VIII：
    Figure 0004819223
     （式中、Yは請求項２３で定義したとおりである。）
    の構造を有する、請求項２３に記載の化合物。
  25. 前記R1、R2、R6、R7、R10、R20、R29、R39、R40、R45、R46及びR47がHである、請求項２１に記載の化合物。
  26. 式XI：
    Figure 0004819223
     （式中、R 1 、R 2 及びR 10 は請求項２１で定義したとおりである。）
    の構造を有する、請求項２１に記載の化合物。
  27. 前記R 2 、R 7 、R29及びR39が共にC 6 -C 30 アルキレン及びC 6 -C 30 置換型アルキレンから成る群より選択される単一リンカー成分を含む、請求項２０に記載の化合物。
  28. 前記リンカー成分が式XII：
    Figure 0004819223
    （式中、
    ｂ，ｅ，ｆ、ｇ及びｈは１から５までの数より独立に選択されるメンバーである。）
    の構造を持つ、請求項２７に記載の化合物。
  29. 式XIII：
    Figure 0004819223
    （式中、
    R2、R7、R10、R20、R40、R45、R46及びR47は水素、アルキル及び置換型アルキル基を含む群より独立に選択されるメンバーであり；
    R11、R12、R13、R21、R22,R23、R31、R32、R33、R41，R42及びR43はHであり；
    Q1、Q2、Q3及びQ4はそれぞれOR18、OR19、OR28、OR38であり、前記R18、R19、R28及びR38はH及び単一陰荷電より独立に選択されるメンバーであり；
    ｂ及びb’は１から５までの整数よりなる群から独立に選択されるメンバーであり；そして
    ｅ、ｅ’、ｆ、ｆ’、ｇ、ｇ’、ｈ及びｈ’は０から３までの数から成る群より独立に選択されるメンバーである。）
    の構造を有する、請求項２８に記載の化合物。
  30. 式XIV：
    Figure 0004819223
    の構造を有する、請求項２９に記載の化合物。
  31. 前記化合物がキャリアー分子に共有結合している、請求項１に記載の化合物。
  32. 金属イオンと請求項１、５又は２０に記載の化合物との間に形成された錯体。
  33. 前記錯体がルミネッセンスを放射する、請求項３２に記載の錯体。
  34. 前記ルミネッセンスが円偏光ルミネッセンスである、請求項３３に記載の錯体。
  35. 前記ルミネッセンスが当該錯体の電気化学的励起により生ずる、請求項３２に記載の錯体。
  36. 前記金属イオンがランタニド系のイオンである、請求項３２に記載の錯体。
  37. 前記ランタニドイオンが、テルビウム、ユーロピウム、ジスポロシウム及びネオジウムより成る群から選択されるメンバーである、請求項３６に記載の錯体。
  38. 式XV：
    Figure 0004819223
    （式中、
    Dはデンドリマーであり、
    ｗは４から１００までの整数より成る群から選択されるメンバーであり、
    R 1 、R 2 、R 10 、R 11 、R 12 、R 13 及びQ 1 は請求項１で定義したとおりである。）
    の構造を有する、請求項１に記載の化合物。
  39. 前記化合物が式XVI：
    Figure 0004819223
     （式中、R 2 、R 10 、R 11 、R 12 、R 13 、Q 1 、D及びwは請求項１及び３８で定義したとおりである。）
    の構造を有する、請求項３８に記載の化合物。
  40. 前記デンドリマーがポリ（プロピレンイミン）デンドリマーである、請求項３８に記載の化合物。
  41. 前記デンドリマーが２世代から１０世代から成る群より選択される世代である、請求項３８に記載の化合物。
  42. ｗが８から５０までの整数から成る群より選択されるメンバーである、請求項３８に記載の化合物。
  43. 前記化合物がキャリアー分子と共有結合している、請求項１に記載の化合物。
  44. 前記キャリアー分子が、合成ポリマー及び生物分子から成る群より選択されたメンバーである、請求項４３に記載の化合物。
  45. 少なくとも0.1の量子収量を持つ、請求項３６に記載の錯体。
  46. 前記ランタニドイオンが、テルビウム、ユーロピウム及びその組合せから選択されるメンバーのイオンである、請求項４５に記載の錯体。
  47. 更に少なくとも１のサリチルアミジル成分を含む、請求項４４に記載の化合物。
  48. 前記生物分子が、抗体、抗原、ペプチド、核酸、酵素、ハプテン、炭水化物、及び医薬活性作用物質から成る群より選択されたメンバーである、請求項４４に記載の化合物。
  49. サンプルが酵素を含むか否かを決定する方法であって、
    （ａ）該サンプルを、以下を含むペプチド構築体と接触せしめること、
    i)請求項３２に記載の錯体；
    ii)該錯体の発光帯に重複する吸収帯を持つ光ネルギークエンチャー：及び
    iii)該酵素に関する切断認識部位、
    前記ペプチドは、該錯体が励起された時該錯体と該クエンチャー間で蛍光エネルギー転移が可能な立体構造にある；
    （ｂ）該錯体を励起すること；そして
    （ｃ）該サンプル中の該酵素の存在は該蛍光特性に変化をもたらす、該サンプルの蛍光特性を決定すること、
    を含む、方法。
  50. 化合物が酵素活性を変化させるか否かを決定する方法であって、
    （ａ）該酵素を含む該サンプルを、以下を含むペプチド構築体と接触せしめること、
    i)請求項３２に記載の錯体；
    ii)該錯体の発光帯に重複する吸収帯を持つ光ネルギークエンチャー：及び
    iii)該酵素に関する切断認識部位、
    前記ペプチドは、該錯体が励起された時該錯体と該クエンチャー間で蛍光エネルギー転移が可能な立体構造にある；
    （ｂ）該錯体を励起すること；そして
    （ｃ）該サンプル中の該酵素の該活性が該蛍光特性に変化をもたらす、該サンプルの蛍光特性を決定すること、
    を含む、方法。
  51. 核酸標的配列を検出する方法であって、
    （ａ）該標的配列を、以下を具備する単鎖型標的結合配列を含む検出体オリゴヌクレオチドに触せしめること、
    i)請求項３２に記載の錯体；
    ii)該錯体の発光帯に重複する吸収帯を持つ光ネルギークエンチャー：及び
    iii)該酵素に関する切断認識部位、
    前記検出体は、該錯体が励起された時に該錯体と該クエンチャーとの間で蛍光エネルギーが転移可能な立体構造にある；
    （ｂ）該標的結合配列を該標的配列とハイブリダイゼーションし、それにより該検出体オリゴヌクレオチドの該立体構造を変化させ、蛍光パラメータに変化を生じせしめること；及び
    （ｃ）該蛍光パラメータの該変化を検出し、それにより該核酸標的配列を検出すること、を含む、方法。
  52. 該検出体オリゴヌクレオチドが、分子ビーコン、スコルピオンプローブ、サンライズプローブ、ライトアッププローブ及びTaqMan（登録商標）プローブより選択される様式を持つ、請求項５１に記載の方法。
  53. 核酸標的配列の存在を検出する方法であって、
    （ａ）標的配列の少なくとも一部が該標的配列とのハイブリダイゼーションに利用可能な単鎖型のテールを形成する状態で、該標的配列に、単鎖型標的結合配列及び該標的結合配列の5’側に位置する分子内結合二次構造を含む検出体オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせること、
    前記検出体オリゴヌクレオチドには以下が連結されている、
    i)請求項３２に記載の錯体；
    ii)該錯体の発光帯に重複する吸収帯を持つ光ネルギークエンチャー：及び
    iii)該酵素に関する切断認識部位、
    前記検出体核酸は該錯体が励起された時に、該錯体と該クエンチャーの間で蛍光エネルギーの転移が可能な立体構造にある；
    （ｂ）プライマー延長反応に於いて、該分子内結合二次構造を鋳型として利用して相補鎖を合成し、それにより該分子内結合二次構造を乖離せしめ、蛍光パラメータに変化を生じせしめること；
    （ｃ）該蛍光パラメータの該変化を検出し、それにより該核酸標的配列を検出すること、を含む、方法。
  54. 該分子内結合二次構造がヘアピン、ステム−ループ構造、シュードノット、３重螺旋、及び立体構造支援構造より選択されたメンバーである、請求項５３に記載の方法。
  55. 該相補鎖が標的増幅反応にて合成される、請求項５３に記載の方法。
  56. 該相補鎖が検出体オリゴヌクレオチドを鋳型に利用する標的配列の延長により合成される、請求項５３に記載の方法。
  57. 分子間結合二次構造が完全な又は部分的な単鎖型エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでいる、請求項５３に記載の方法。
  58. 蛍光の該変化が該標的配列の存在の指標として検出される、請求項５３に記載の方法。
  59. 該蛍光パラメータが即時的に検出される、請求項５３に記載の方法。
  60. 該分子間塩基対合二次構造が、該標的結合配列の一部を含んでいる、請求項５３に記載の方法。
  61. 増幅反応中に標的配列の増幅を検出する方法：
    （ａ）標的配列の少なくとも一部が該標的配列とのハイブリダイゼーションに利用可能な単鎖型のテールを形成する状態で、該標的配列に、単鎖型標的結合配列及び該標的結合配列の5’側に位置する分子内結合二次構造を含む検出体オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせること、
    前記検出体オリゴヌクレオチドには以下が連結されている、
    i)請求項３２に記載の錯体；
    ii)該錯体の発光帯に重複する吸収帯を持つ光ネルギークエンチャー：及び
    iii)該酵素に関する切断認識部位、
    前記検出体核酸は該錯体が励起された時に、該錯体と該クエンチャーの間で蛍光エネルギーの転移が可能な立体構造にある；
    （ｂ）該標的配列上にハイブリダズした検出体オリゴヌクレオチドを、ポリメラーゼを使い延長し検出体オリゴヌクレオチド延長産物を生成し、そして該標的配列から該検出オリゴヌクレオチド延長産物を分離すること
    （ｃ）該検出体オリゴヌクレオチド延長産物にプライマーをハイブリダイゼーションし、そしてプライマーを該ポリメラーゼを使い延長し、それにより該分子内結合二次構造を直鎖化して蛍光パラメータに変化を生じせしめること；及び
    （ｄ）該蛍光パラメータの該変化を検出し、それにより該核酸標的配列を検出すること、を含む、方法。
  62. 該標的配列が鎖置換型増幅、ポリメラーゼチェーンリアクション、3SR、TMA及びNASBAより選択される方法にて増幅される、請求項６１に記載の方法。
  63. 該二次構造が更に部分的又は完全な単鎖型制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む、請求項６１に記載の方法。
  64. 蛍光強度の変化が検出される、請求項６１に記載の方法。
  65. 該蛍光強度の変化が即時的に検出される、請求項６４に記載の方法。
  66. 該分子間塩基対合二次構造が該標的結合配列の一部を含んでいる、請求項６１に記載の方法。
  67. 請求項３２に記載の錯体を含む第１核酸と第２核酸とのハイブリダイゼーションを確認する方法であって、
    （ａ）該第１核酸を該第２核酸と接触せしめること；
    （ｂ）該第１核酸、該第２核酸及びその組合せから選択されたメンバーの蛍光特性の変化を検出し、それにより該ハイブリダイゼーションの生起を確認すること、
    を含む、方法。
  68. 該第２核酸が、それに結合した光エネルギークエンチャーを含んでいる、請求項６７に記載の方法。
  69. 請求項３２に記載の錯体を含むマイクロアレイであって、クエンチャーが固相支持体に直接、又は固相支持体に結合したキャリアー分子に結合される、マイクロアレイ。
  70. 該キャリアー分子が、核酸、ペプチド、ペプチド核酸及びその組合せより選択されるメンバーである、請求項６９に記載のマイクロアレイ。
  71. 該固相が第１領域と第２領域に分けられ、且つ該第１領域は第１キャリアー分子に結合され、そして第１領域に結合している第１該錯体を含み、第２領域は第２キャリアー分子に結合し、第２領域に結合している第２該錯体を含んでいる、請求項６９に記載のマイクロアレイ。
  72. 該第１及び第２キャリー分子が、核酸、ペプチド及びペプチド核酸から独立に選択されたメンバーである、請求項７１に記載のマイクロアレイ。
  73. 該第１光エネルギークエンチャー及び第２錯体が異なる構造を有する、請求項７１に記載のマイクロアレイ。
  74. 化合物の存在に関しマイクロアレイを探索する方法であって、
    （ａ）該化合物に、請求項３２に記載の錯体を含むプローブの付いたマイクロアレイを接触せしめること；
    （ｂ）該プローブ、該化合物、及びその組合せより選択されたメンバーの蛍光特性の差を検出し、それより該化合物の存在を確認すること、
    を含む、方法。
  75. 該化合物が核酸、ペプチド及びペプチド核酸から独立に選択されたメンバーである、請求項７４に記載の方法。
  76. 放射線感受特性を有する請求項３２に記載の錯体を含む、放射線治療を必要とする増殖体を持つ被験者に放射線治療を提供するための医薬組成物であって、
    該組成物は該被験者に投与され、そして該増殖体に近接してイオン化放射線が照射される、医薬組成物。
  77. 請求項３２に記載の錯体を含む、傷害又は被験者のメラニン沈着組織に覆われた傷害の光力学的治療のための医薬組成物であって、
    該組成物は該被験者に投与され、そして該傷害部は光照射される、医薬組成物。
  78. 該光照射線が７００〜９００ナノメーターの波長域を有する光である、請求項７７に記載の医薬組成物。
  79. 該光照射線が７３０〜７７０ナノメーターの波長域を有する光である、請求項７８に記載の医薬組成物。
  80. 該化合物がインク又は色素の成分を含む、請求項３２に記載の錯体。
  81. 該錯体が光の伝達及び増幅に適した基質の成分を含んでいる、請求項３２に記載の錯体。
  82. 該基質が、ガラス、有機ポリマー、無機ポリマー及びその組合せから選択されたメンバーを含んでいる、請求項８１に記載の錯体。
  83. 光の伝達及び増幅に適した請求項８１に記載の錯体を含む基質に光を通過させ、それにより該光を増幅させることを含む、基質による伝達光を増幅する方法。
  84. 分析体の蛍光アッセイを実施する方法であって、
    （ａ）結合相手認識成分にある結合相手を該分析体に置き換え、それにより分析体−認識成分複合体及び遊離型結合相手を形成せしめること、該結合相手及び該遊離型結合相手は請求項１に記載の化合物を含んでいる；
    （ｂ）ランタニドイオン及び該結合相手、該遊離型結合相手、及びその組合せから選択されたメンバーの間に蛍光錯体を形成せしめること；
    （ｃ）蛍光錯体を検出すること、
    を含む、方法。
  85. 該認識成分、該結合相手及び該分析体が、生体活性物質、生物分子及びその組合せから成る群より独立に選択される、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記生物分子が、ハプテン、抗体、抗原、炭水化物、核酸、ペプチド、酵素及び受容体から成る群より選択されたメンバーである、請求項８５に記載の材料。
  87. 該認識成分、該結合相手及び該分析体から成る群より選択された１またはそれ以上のメンバーが表面に結合されている、請求項８４に記載の方法。
  88. 該結合相手−認識成分複合体より該結合相手を置換する前に該蛍光錯体が形成される、請求項８４に記載の方法。
  89. 該結合相手−認識成分複合体より該結合相手が置換された後に該蛍光錯体が形成される、請求項８４に記載の方法。
  90. 該認識−結合相手のペア、該分析体-認識成分のペア及びその組合せから成る群のメンバーより、該遊離型結合相手を分離することを更に含む、請求項８４に記載の方法。
  91. 該蛍光錯体が該分離の後形成される、請求項９０に記載の方法。
  92. 該化合物がバイキャプドTRENSAM（トリス[（２−ヒドロキシベンゾイル）−２−アミノエチル]アミン）である、請求項３６に記載の錯体。
  93. 該金属イオンがテルビウムイオンである、請求項９２に記載の錯体。
  94. 該金属イオンがユーロピウムイオンである、請求項９２に記載の錯体。
  95. 該錯体が、[バイキャプドTRENSAM]2を含む、請求項３６に記載の錯体。
  96. 該金属イオンがテルビウムイオンである、請求項９５に記載の錯体。
  97. 該金属イオンがユーロピウムイオンである、請求項９５に記載の錯体。
  98. 該化合物がH22IAMである、請求項３６に記載の錯体。
  99. 該金属イオンがテルビウムイオンである、請求項９８に記載の錯体。
  100. 該金属イオンがユーロピウムイオンである、請求項９８に記載の方法。
  101. 該錯体が、バイキャプドH22IAMを含む、請求項３６に記載の錯体。
  102. 該金属イオンがテルビウムイオンである、請求項１０１に記載の錯体。
  103. 該金属イオンがユーロピウムイオンである、請求項１０１に記載の錯体。
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