JPH0694720A - ユーロピウムキレート試薬を用いた核酸の光化学的標識及び遺伝子プローブ試験系におけるその使用 - Google Patents
ユーロピウムキレート試薬を用いた核酸の光化学的標識及び遺伝子プローブ試験系におけるその使用Info
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 式
【化１】Ｌｎ−Ｓ−Ｆｕ
式中、Ｌｎはランタニドイオン−キレート構造であり、
Ｓはスペーサー分子であり、Ｆｕはフロクマリン誘導体
であるの光化学的標識用試薬。 【効果】 遺伝子診断法において有用である。
Ｓはスペーサー分子であり、Ｆｕはフロクマリン誘導体
であるの光化学的標識用試薬。 【効果】 遺伝子診断法において有用である。
Description
【０００１】遺伝子プローブ診断法は、ＤＮＡ／ＲＮＡ
配列の配列特異的検出の方法である。これは、検出する
べきＤＮＡ／ＲＮＡの相補的配列領域を有する遺伝子プ
ローブ配列のハイブリッド形成に基づいている［Ｊ．
Ａ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ，Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６９，
１−２５(１９８８)；Ｕ．Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｒ．Ｋ
ａｉｓｅｒ，Ｃ．Ｔ．Ｃａｓｋｅｙ，Ｌ．Ｈｏｏｄ，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４２，２２９(１９８８)］。
配列の配列特異的検出の方法である。これは、検出する
べきＤＮＡ／ＲＮＡの相補的配列領域を有する遺伝子プ
ローブ配列のハイブリッド形成に基づいている［Ｊ．
Ａ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ，Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６９，
１−２５(１９８８)；Ｕ．Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｒ．Ｋ
ａｉｓｅｒ，Ｃ．Ｔ．Ｃａｓｋｅｙ，Ｌ．Ｈｏｏｄ，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４２，２２９(１９８８)］。
【０００２】遺伝子プローブ診断学により、感染症及び
遺伝的欠陥の検出が可能になる。遺伝子プローブ診断学
を広く適用するための前提条件は、検出の適した感度、
実行の単純さ及び放射性の回避である。
遺伝的欠陥の検出が可能になる。遺伝子プローブ診断学
を広く適用するための前提条件は、検出の適した感度、
実行の単純さ及び放射性の回避である。
【０００３】遺伝子プローブ診断学の１つの変法は、検
出するべきＤＮＡ／ＲＮＡの直接光化学的標識を用いて
行われ、その後相補的核酸配列を有する遺伝子プローブ
へのハイブリッド形成を行う［Ｎ．Ｄａｔｔａｇｕｐｔ
ａ，Ｐ．Ｍ．Ｍ．Ｒａｅ，Ｅ．Ｄ．Ｈｕｇｕｅｎｅｌ，
Ｅ．Ｃａｒｌｓｏｎ，Ａ．Ｌｙｇａ，Ｊ．Ｓ．Ｓｈａｐ
ｉｒｏ，Ｊ．Ｐ．Ａｌｂａｒｅｌｌａ，Ａｎａｌｙｔｉ
ｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７７，８５（１
９８９）；Ｊ．Ｐ．Ａｌｂａｒｅｌｌａ，Ｒ．Ｌ．Ｍｉ
ｎｅｇａｒ，Ｗ．Ｌ．Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｄａｔ
ｔａｇｐｔａ，Ｅ．Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７，４２９３（１９
８９）］。
出するべきＤＮＡ／ＲＮＡの直接光化学的標識を用いて
行われ、その後相補的核酸配列を有する遺伝子プローブ
へのハイブリッド形成を行う［Ｎ．Ｄａｔｔａｇｕｐｔ
ａ，Ｐ．Ｍ．Ｍ．Ｒａｅ，Ｅ．Ｄ．Ｈｕｇｕｅｎｅｌ，
Ｅ．Ｃａｒｌｓｏｎ，Ａ．Ｌｙｇａ，Ｊ．Ｓ．Ｓｈａｐ
ｉｒｏ，Ｊ．Ｐ．Ａｌｂａｒｅｌｌａ，Ａｎａｌｙｔｉ
ｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７７，８５（１
９８９）；Ｊ．Ｐ．Ａｌｂａｒｅｌｌａ，Ｒ．Ｌ．Ｍｉ
ｎｅｇａｒ，Ｗ．Ｌ．Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｄａｔ
ｔａｇｐｔａ，Ｅ．Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７，４２９３（１９
８９）］。
【０００４】適したスペーサー分子を用いてビオチンに
結合するフロクマリンは、核酸の光化学的ビオチニル化
に非常に適していることが示された。相補的核酸配列を
有する遺伝子プローブへのハイブリッド形成及び分離段
階の後、例えば抗ビオチン−抗体又はアビジンあるいは
ストレプタビジンとアルカリホスファターゼの複合体の
添加により検出を行う。検出のために、追加の段階でア
ルカリホスファターゼにより誘導される発色反応を行う
［Ｊ．Ｊ．Ｌｅａｒｙ，Ｄ．Ｊ．Ｂｒｉｇａｔｉ，Ｄ．
Ｃ．Ｗａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８０，４０４５−４０４９（１９８
３）］。
結合するフロクマリンは、核酸の光化学的ビオチニル化
に非常に適していることが示された。相補的核酸配列を
有する遺伝子プローブへのハイブリッド形成及び分離段
階の後、例えば抗ビオチン−抗体又はアビジンあるいは
ストレプタビジンとアルカリホスファターゼの複合体の
添加により検出を行う。検出のために、追加の段階でア
ルカリホスファターゼにより誘導される発色反応を行う
［Ｊ．Ｊ．Ｌｅａｒｙ，Ｄ．Ｊ．Ｂｒｉｇａｔｉ，Ｄ．
Ｃ．Ｗａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８０，４０４５−４０４９（１９８
３）］。
【０００５】ビオチンを用いた検出系の１つの欠点は、
生物系にビオチンが広く分布していることである。
生物系にビオチンが広く分布していることである。
【０００６】可能な変法は、例えば検出するべきＤＮＡ
／ＲＮＡの蛍光染料を用いた直接光化学的標識である。
しかしこれはエネルギーの浪費の傾向があるので光反応
条件下では実際的でないことが見いだされた。さらに適
した標識は光化学的に不活性でなければならない。
／ＲＮＡの蛍光染料を用いた直接光化学的標識である。
しかしこれはエネルギーの浪費の傾向があるので光反応
条件下では実際的でないことが見いだされた。さらに適
した標識は光化学的に不活性でなければならない。
【０００７】驚くべきことに、スペーサーを用いて適し
たフロクマリンに結合したランタニドキレートが適して
いることが見いだされた。
たフロクマリンに結合したランタニドキレートが適して
いることが見いだされた。
【０００８】ランタニドキレート、特にユーロピウムキ
レートは、すでに免疫診断学において日常的に用いられ
ている［Ｐ．Ｄｅｇａｎ，Ａ．Ａｂｂｏｎｄａｎｄｏｌ
ｏ，Ｇ．Ｍｏｎｔａｎｇｎｏｌｉ，Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ
ｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉ
ｎｅｓｃｅｎｃｅ ５，２０７（１９９０）］。これら
を用いる場合の特別の利点は、蛍光の時間分解測定が可
能なことである。遺伝子プローブ診断学へのその適用も
ここに初めて記載された［Ａ．Ｏｓｅｒ，Ｗ．Ｋ．Ｒｏ
ｔｈ，Ｇ．Ｖａｌｅｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，３，１１８１（１９８８）］が、この研究の
場合ユーロピウムキレート試薬を用いた標識は高価な方
法を用いて行われている。さらにＰＣＲ反応へのユーロ
ピウムキレートプライマーの利用が記載された［Ｐ．Ｄ
ａｈｌｅｎ，Ａ．Ｉｉｔｉａｅ，Ｖ．−Ｍ．Ｍｕｋｋａ
ｌａ，Ｐ．Ｈｕｒｓ−Ｋａｉｎｅｎ，Ｍ．Ｋｗｉａｔｋ
ｏｗｓｋｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕ
ｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ５，１４３−１４９（１９９
１）］。
レートは、すでに免疫診断学において日常的に用いられ
ている［Ｐ．Ｄｅｇａｎ，Ａ．Ａｂｂｏｎｄａｎｄｏｌ
ｏ，Ｇ．Ｍｏｎｔａｎｇｎｏｌｉ，Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ
ｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉ
ｎｅｓｃｅｎｃｅ ５，２０７（１９９０）］。これら
を用いる場合の特別の利点は、蛍光の時間分解測定が可
能なことである。遺伝子プローブ診断学へのその適用も
ここに初めて記載された［Ａ．Ｏｓｅｒ，Ｗ．Ｋ．Ｒｏ
ｔｈ，Ｇ．Ｖａｌｅｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，３，１１８１（１９８８）］が、この研究の
場合ユーロピウムキレート試薬を用いた標識は高価な方
法を用いて行われている。さらにＰＣＲ反応へのユーロ
ピウムキレートプライマーの利用が記載された［Ｐ．Ｄ
ａｈｌｅｎ，Ａ．Ｉｉｔｉａｅ，Ｖ．−Ｍ．Ｍｕｋｋａ
ｌａ，Ｐ．Ｈｕｒｓ−Ｋａｉｎｅｎ，Ｍ．Ｋｗｉａｔｋ
ｏｗｓｋｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕ
ｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ５，１４３−１４９（１９９
１）］。
【０００９】本発明に従えば、一般式
【００１０】
【化２】Ｌｎ−Ｓ−Ｆｕ ［式中、Ｌｎはランタニドイオン−キレート構造であ
り、Ｓはスペーサー分子であり、Ｆｕは光化学的結合可
能構造としてのフロクマリン（ｆｕｒｏｃｏｕｍａｒｉ
ｎ）誘導体である］の標識用試薬が合成される。
り、Ｓはスペーサー分子であり、Ｆｕは光化学的結合可
能構造としてのフロクマリン（ｆｕｒｏｃｏｕｍａｒｉ
ｎ）誘導体である］の標識用試薬が合成される。
【００１１】ランタニドイオン−キレート構造（Ｌｎ）
は、式
は、式
【００１２】
【化３】
【００１３】［式中、Ｘは場合により複素原子基（ｈｅ
ｔｅｒｏ ａｔｏｍ ｇｒｏｕｐｉｎｇ）を含むＣ5−
Ｃ14−アリーレン、又は複素原子基［Ｎ、Ｏ、Ｓ（１
ｘ、１個以上）を含むＣ1−Ｃ24−アルキレンであり、
Ｙ及び場合によりＸ＋ＹはＮ−オキシスクシンイミド、
Ｎ−マレイミド、ＮＨ2、ＯＨ、ＣＯＣＨ2−ハロゲン、
ハロゲン、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、ＳＨ、
ＣＯ−ハロゲン、ＣＯＯＣＯＲ1、ＣＨ＝ＣＨＣＯ
2Ｒ1、
ｔｅｒｏ ａｔｏｍ ｇｒｏｕｐｉｎｇ）を含むＣ5−
Ｃ14−アリーレン、又は複素原子基［Ｎ、Ｏ、Ｓ（１
ｘ、１個以上）を含むＣ1−Ｃ24−アルキレンであり、
Ｙ及び場合によりＸ＋ＹはＮ−オキシスクシンイミド、
Ｎ−マレイミド、ＮＨ2、ＯＨ、ＣＯＣＨ2−ハロゲン、
ハロゲン、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、ＳＨ、
ＣＯ−ハロゲン、ＣＯＯＣＯＲ1、ＣＨ＝ＣＨＣＯ
2Ｒ1、
【００１４】
【化４】
【００１５】であり、ここでＲ1は水素、場合によりフ
ェニル基により置換されていてもよい飽和又は不飽和Ｃ
1−Ｃ20−アルキル基、又はフェニル基であり、Ｒは他
から独立して各場合に水素、アンモニウム又は当量のア
ルカリ金属あるいは１／２当量のアルカリ土類金属であ
る］のピリジン誘導体である。
ェニル基により置換されていてもよい飽和又は不飽和Ｃ
1−Ｃ20−アルキル基、又はフェニル基であり、Ｒは他
から独立して各場合に水素、アンモニウム又は当量のア
ルカリ金属あるいは１／２当量のアルカリ土類金属であ
る］のピリジン誘導体である。
【００１６】ピリジン誘導体Ｌｎの合成は、それ自体既
知の方法に従って行うことができる［例えばＦ．Ｖｏｅ
ｇｔｌｅ ａｎｄ Ｃ．Ｏｈｍ，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１
１７，８４９−８５４（１９８４）；Ｒ．Ｓｉｎｇｈ
ａｎｄ Ｇ．Ｊｕｓｔ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，
４４５３（１９８９）を参照］。
知の方法に従って行うことができる［例えばＦ．Ｖｏｅ
ｇｔｌｅ ａｎｄ Ｃ．Ｏｈｍ，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１
１７，８４９−８５４（１９８４）；Ｒ．Ｓｉｎｇｈ
ａｎｄ Ｇ．Ｊｕｓｔ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，
４４５３（１９８９）を参照］。
【００１７】スペーサーはポリアルキルアミン、ポリエ
チレングリコール又はそれらの組み合わせである。
チレングリコール又はそれらの組み合わせである。
【００１８】ポリアルキルアミンは次の一般式：
【００１９】
【化５】 ［式中、ＲはＨ、Ｃ1−Ｃ7−アルキル、アリール（例え
ばフェニル、ナフチル又はアントラニル）、ヒドロキシ
ル又はＣ1−Ｃ7−アルコキシであり、ｘは２−７の数で
あり、ｙは３−１０の数であり、Ｒは上記で可能な変数
において異なっていることができ、すなわちＲはスペー
サ ｘの場合も同様であり、すなわちｘはスペーサー中の−
(ＣＨ2)x−単位の各繰り返しに関して同一である必要は
ない］を有する。
ばフェニル、ナフチル又はアントラニル）、ヒドロキシ
ル又はＣ1−Ｃ7−アルコキシであり、ｘは２−７の数で
あり、ｙは３−１０の数であり、Ｒは上記で可能な変数
において異なっていることができ、すなわちＲはスペー
サ ｘの場合も同様であり、すなわちｘはスペーサー中の−
(ＣＨ2)x−単位の各繰り返しに関して同一である必要は
ない］を有する。
【００２０】Ｒは互いに独立してＨ、Ｃ1−Ｃ4−アルキ
ル（例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピ
ル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）であ
り、ｘは２、３、４又は５であり、ｙは３、４、５又は
６であることが好ましい。
ル（例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピ
ル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）であ
り、ｘは２、３、４又は５であり、ｙは３、４、５又は
６であることが好ましい。
【００２１】特に好ましいのは、式
【００２２】
【化６】 のＮ−４，Ｎ−９−ジメチルスペルミン誘導体である。
【００２３】ポリエチレングリコールは次の一般式、
【００２４】
【化７】−Ｏ−[−(ＣＨ2)x−Ｏ−]y− ［式中ｘは２、３、４又は５であり、ｙは３、４、５又
は６である］を有する。
は６である］を有する。
【００２５】好ましいのはｘが２、３、４又は５であ
り、ｙが３、４、５又は６のポリエチレングリコールで
ある。特に好ましいのはｘが２であり、ｙが４、５又は
６のポリエチレングリコールである。
り、ｙが３、４、５又は６のポリエチレングリコールで
ある。特に好ましいのはｘが２であり、ｙが４、５又は
６のポリエチレングリコールである。
【００２６】アミン／グリコール構造が組み合わされた
スペーサー分子は次の一般式
スペーサー分子は次の一般式
【００２７】
【化８】
【００２８】［式中Ｚ1、Ｚ2及びＺ3は互いに独立して
Ｏ又はＮＲであり、ＲはＨ、Ｃ1−Ｃ7−アルキル、アリ
ール（例えばフェニル、ナフチル又はアントラニル）、
ヒドロキシル又はＣ1−Ｃ7−アルコキシであり、ｘは２
−７の数であり、ｙは３−１０の数である］を有する。
Ｏ又はＮＲであり、ＲはＨ、Ｃ1−Ｃ7−アルキル、アリ
ール（例えばフェニル、ナフチル又はアントラニル）、
ヒドロキシル又はＣ1−Ｃ7−アルコキシであり、ｘは２
−７の数であり、ｙは３−１０の数である］を有する。
【００２９】好ましいのはＺ2がＯであり、Ｚ1及びＺ3
がＮＲであり、ＲがＨ、Ｃ1−Ｃ4−アルキル（例えばメ
チル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチ
ル、ｉ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）であり、ｘが２、
３、４又は５であり、ｙが３、４、５又は６であるスペ
ーサー構造である。
がＮＲであり、ＲがＨ、Ｃ1−Ｃ4−アルキル（例えばメ
チル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチ
ル、ｉ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）であり、ｘが２、
３、４又は５であり、ｙが３、４、５又は６であるスペ
ーサー構造である。
【００３０】特に好ましいのは、Ｚ2がＯであり、Ｚ1及
びＺ3がＮＲであり、ＲがＨ、メチル、エチルであり、
ｘが２であり、ｙが６である、構造である。
びＺ3がＮＲであり、ＲがＨ、メチル、エチルであり、
ｘが２であり、ｙが６である、構造である。
【００３１】光化学的結合可能な適した構造は特にフロ
クマリン、例えばアンゲリシン（イソプソラレン）又は
プソラレン及びそれらの誘導体であり、これらは核酸と
光化学的に反応する。
クマリン、例えばアンゲリシン（イソプソラレン）又は
プソラレン及びそれらの誘導体であり、これらは核酸と
光化学的に反応する。
【００３２】アンゲリシン誘導体は次の一般式
【００３３】
【化９】
【００３４】［式中Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は互いに独立して
Ｈ又はＣ1−Ｃ7−アルキルであり、Ｒ4はＨ、Ｃ1−Ｃ7
−アルキル又はヒドロキシルを有する低級アルキル、Ｃ
1−Ｃ7−アルコキシ、アミノ、ハロあるいはＮ−フタル
イミド置換基である］を有する。
Ｈ又はＣ1−Ｃ7−アルキルであり、Ｒ4はＨ、Ｃ1−Ｃ7
−アルキル又はヒドロキシルを有する低級アルキル、Ｃ
1−Ｃ7−アルコキシ、アミノ、ハロあるいはＮ−フタル
イミド置換基である］を有する。
【００３５】特に好ましいのは以下のＲ1−Ｒ4の基を含
むアンゲリシン誘導体である。
むアンゲリシン誘導体である。
【００３６】
【表１】
【００３７】異なるＲを有する他の化合物も文献から既
知の方法により合成することができる。
知の方法により合成することができる。
【００３８】適したプソラレンは以下の一般式：
【００３９】
【化１０】
【００４０】［式中Ｒ1、Ｒ3及びＲ6は互いに独立して
Ｈ又はＣ1−Ｃ7−アルキルであり、Ｒ4はＨ、Ｃ1−Ｃ7
−アルキル又はヒドロキシルを有するＣ1−Ｃ7−アルキ
ル、Ｃ1−Ｃ7−アルコキシ、アミノ、ハロあるいはＮ−
フタルイミド置換基であり、Ｒ2及びＲ5は互いに独立し
てＨ、ヒドロキシル、カルボキシル、カーボ−Ｃ1−Ｃ7
−アルコキシ又はＣ1−Ｃ7−アルコキシである］を有す
る。
Ｈ又はＣ1−Ｃ7−アルキルであり、Ｒ4はＨ、Ｃ1−Ｃ7
−アルキル又はヒドロキシルを有するＣ1−Ｃ7−アルキ
ル、Ｃ1−Ｃ7−アルコキシ、アミノ、ハロあるいはＮ−
フタルイミド置換基であり、Ｒ2及びＲ5は互いに独立し
てＨ、ヒドロキシル、カルボキシル、カーボ−Ｃ1−Ｃ7
−アルコキシ又はＣ1−Ｃ7−アルコキシである］を有す
る。
【００４１】アンゲリシン誘導体の方がプソラレンと比
較して一付加生成の故に有利である。
較して一付加生成の故に有利である。
【００４２】ランタニドイオンキレート試薬、スペーサ
ー及びフロクマリンの結合の順序は任意である。従って
中でも最初にキレート試薬ＬｎをスペーサーＳと結合
し、続いて生成物をフロクマリンＦｕと反応させること
ができる。逆にＦｕ−Ｓを最初に構築し、その後Ｌｎと
反応させることができる。
ー及びフロクマリンの結合の順序は任意である。従って
中でも最初にキレート試薬ＬｎをスペーサーＳと結合
し、続いて生成物をフロクマリンＦｕと反応させること
ができる。逆にＦｕ−Ｓを最初に構築し、その後Ｌｎと
反応させることができる。
【００４３】部分の結合はそれ自体既知の方法で行う。
【００４４】
【実施例】実施例１ａ） ２，６−ビス［Ｎ，Ｎ−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル
メチル）−アミノ−メチル］−４−（５−ヒドロキシ−
１−ペンチニル）ピリジン（１）の製造：
メチル）−アミノ−メチル］−４−（５−ヒドロキシ−
１−ペンチニル）ピリジン（１）の製造：
【００４５】
【化１１】
【００４６】６ｇ（１０ミリモル）の２，６−ビス
［Ｎ，Ｎ−ビス（ｔ−ブトキシカルボニルメチル）−ア
ミノ−メチル］−４−ブロモピリジン（Ａｃｔａ Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｅｒ．Ｂ ４２，（１９８８）３
７３にてＨ．Ｔａｋａｌｏ，Ｐ．Ｐａｓａｎｅｎ ａｎ
ｄ Ｊ．Ｋａｕｋａｒｅにより記載の通りに製造）を蒸
留したばかりの１５ｍｌのテトラヒドロフラン及び１５
ｍｌのトリエチルアミンの混合物に溶解する。溶液を脱
ガスし、１ｇ（１２ミリモル）の５−ヒドロキシ−１−
ペンチンを導入する。２８０ｍｇ（０．４ミリモル）の
ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ク
ロリド、８４０ｍｇ（３．２ミリモル）のトリフェニル
ホスフィン及び１１７ｍｇ（０．６１ミリモル）のＣｕ
（Ｉ）ヨーダイドの混合物を含む触媒を室温で撹拌しな
がら加える。７時間還流した後に、ＴＬＣにより反応が
完了する。室温に冷却し、続いて濾過した後、溶液を真
空中で濃縮し、シリカゲル上でクロマトグラフィー（溶
離剤：酢酸エチル、Ｒf＝０．６１）にかける。
［Ｎ，Ｎ−ビス（ｔ−ブトキシカルボニルメチル）−ア
ミノ−メチル］−４−ブロモピリジン（Ａｃｔａ Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｅｒ．Ｂ ４２，（１９８８）３
７３にてＨ．Ｔａｋａｌｏ，Ｐ．Ｐａｓａｎｅｎ ａｎ
ｄ Ｊ．Ｋａｕｋａｒｅにより記載の通りに製造）を蒸
留したばかりの１５ｍｌのテトラヒドロフラン及び１５
ｍｌのトリエチルアミンの混合物に溶解する。溶液を脱
ガスし、１ｇ（１２ミリモル）の５−ヒドロキシ−１−
ペンチンを導入する。２８０ｍｇ（０．４ミリモル）の
ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ク
ロリド、８４０ｍｇ（３．２ミリモル）のトリフェニル
ホスフィン及び１１７ｍｇ（０．６１ミリモル）のＣｕ
（Ｉ）ヨーダイドの混合物を含む触媒を室温で撹拌しな
がら加える。７時間還流した後に、ＴＬＣにより反応が
完了する。室温に冷却し、続いて濾過した後、溶液を真
空中で濃縮し、シリカゲル上でクロマトグラフィー（溶
離剤：酢酸エチル、Ｒf＝０．６１）にかける。
【００４７】４．６ｇ（理論値の６８％）の微黄色固
体、融点９０℃が得られる。
体、融点９０℃が得られる。
【００４８】実施例１ｂ） ２，６−ビス［Ｎ，Ｎ−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル
メチル）−アミノ−メチル］−４−（１１−ヒドロキシ
−１−ウンデシニル）ピリジン（２）の製造：６ｇ（１
０ミリモル）の２，６−ビス［Ｎ，Ｎ−ビス（ｔ−ブト
キシカルボニルメチル）−アミノ−メチル］−４−ブロ
モピリジンを、実施例１ａ）と同様にＰｄ触媒の作用下
で１．９３ｇ（１２ミリモル）の１−ウンデシン−１０
−オールと反応させる。シリカゲル上のクロマトグラフ
ィー（溶離剤：酢酸エチル、Ｒf＝０．５２）にかけた
後、７ｇ（理論値の７７％）の黄色固体、融点５７−５
９℃が得られる。
メチル）−アミノ−メチル］−４−（１１−ヒドロキシ
−１−ウンデシニル）ピリジン（２）の製造：６ｇ（１
０ミリモル）の２，６−ビス［Ｎ，Ｎ−ビス（ｔ−ブト
キシカルボニルメチル）−アミノ−メチル］−４−ブロ
モピリジンを、実施例１ａ）と同様にＰｄ触媒の作用下
で１．９３ｇ（１２ミリモル）の１−ウンデシン−１０
−オールと反応させる。シリカゲル上のクロマトグラフ
ィー（溶離剤：酢酸エチル、Ｒf＝０．５２）にかけた
後、７ｇ（理論値の７７％）の黄色固体、融点５７−５
９℃が得られる。
【００４９】実施例２ａ） ２，６−ビス［Ｎ，Ｎ−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル
メチル）−アミノ−メチル］−４−（５−ヒドロキシペ
ンチル）ピリジン（３）の製造：
メチル）−アミノ−メチル］−４−（５−ヒドロキシペ
ンチル）ピリジン（３）の製造：
【００５０】
【化１２】
【００５１】４７２ｍｇ（０．７ミリモル）の実施例１
に記載の化合物１を、２０ｍｌの無水エタノールに溶解
し、２４ｍｇの１０％Ｐｄ／Ｃを加える。溶液を水素正
圧下の４５−５０℃にて激しく撹拌する。１時間以内に
反応が完了する（ＴＬＣにより）。冷却及び触媒の除去
後、溶液を真空中で濃縮し、残留物をシリカゲルのクロ
マトグラフィー（溶離剤：酢酸エチル、Ｒf＝０．５
２）にかける。２４２ｍｇ（理論値の５１％）の微黄色
油が得られる。
に記載の化合物１を、２０ｍｌの無水エタノールに溶解
し、２４ｍｇの１０％Ｐｄ／Ｃを加える。溶液を水素正
圧下の４５−５０℃にて激しく撹拌する。１時間以内に
反応が完了する（ＴＬＣにより）。冷却及び触媒の除去
後、溶液を真空中で濃縮し、残留物をシリカゲルのクロ
マトグラフィー（溶離剤：酢酸エチル、Ｒf＝０．５
２）にかける。２４２ｍｇ（理論値の５１％）の微黄色
油が得られる。
【００５２】同一の反応条件下で触媒としてＰｔＯ2を
用いると収率が向上する（理論値の５６％）。
用いると収率が向上する（理論値の５６％）。
【００５３】実施例２ｂ） ２，６−ビス［Ｎ，Ｎ−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル
メチル）−アミノ−メチル］−４−（１１−ヒドロキシ
ウンデシル）ピリジン（４）の製造：１．０ｇ（１．３
２ミリモル）の実施例１ｂ）に記載の化合物２を実施例
２ａ）と同様にＰｔＯ2触媒（１００ｍｇ）を用いて水
添する。シリカゲル上のクロマトグラフィー（溶離剤：
クロロホルム／エタノール１５：１、Ｒf＝０．４）に
かけた後、７２５ｍｇ（理論値の７２％）の微黄色油が
得られる。
メチル）−アミノ−メチル］−４−（１１−ヒドロキシ
ウンデシル）ピリジン（４）の製造：１．０ｇ（１．３
２ミリモル）の実施例１ｂ）に記載の化合物２を実施例
２ａ）と同様にＰｔＯ2触媒（１００ｍｇ）を用いて水
添する。シリカゲル上のクロマトグラフィー（溶離剤：
クロロホルム／エタノール１５：１、Ｒf＝０．４）に
かけた後、７２５ｍｇ（理論値の７２％）の微黄色油が
得られる。
【００５４】実施例３ アミノ−ＰＥＧ−アンゲリシン（５）の製造：
【００５５】
【化１３】
【００５６】４．８７ｇ（２０ミリモル）の４’−アミ
ノメチル−４，５’−ジメチルアンゲリシンを２５ｍＬ
のＤＭＦに溶解し、３．２４ｇ（２０ｍｌ）のカルボニ
ルジイミダゾールと室温で反応させる。窒素下で６時間
撹拌した後、完全な反応（ＴＬＣにより）が観察され
た。溶液を４０ｍｌのＤＭＦ中の１６．８５ｇ（６０ミ
リモル）の１，１７−ジアミノ−３，６，９，１２，１
５−ペンタオキサヘプタデカンの溶液に８０℃にてゆっ
くり滴下し、混合物を７０℃でさらに１２時間撹拌す
る。冷却後、溶液を真空中で濃縮し、シリカゲル上のク
ロマトグラフィー（溶離剤：クロロホルム／メタノール
／アンモニア９０：１０：１、Ｒf＝０．２８）にかけ
る。７．１ｇ（理論値の６５％）の微黄色油が得られ
る。
ノメチル−４，５’−ジメチルアンゲリシンを２５ｍＬ
のＤＭＦに溶解し、３．２４ｇ（２０ｍｌ）のカルボニ
ルジイミダゾールと室温で反応させる。窒素下で６時間
撹拌した後、完全な反応（ＴＬＣにより）が観察され
た。溶液を４０ｍｌのＤＭＦ中の１６．８５ｇ（６０ミ
リモル）の１，１７−ジアミノ−３，６，９，１２，１
５−ペンタオキサヘプタデカンの溶液に８０℃にてゆっ
くり滴下し、混合物を７０℃でさらに１２時間撹拌す
る。冷却後、溶液を真空中で濃縮し、シリカゲル上のク
ロマトグラフィー（溶離剤：クロロホルム／メタノール
／アンモニア９０：１０：１、Ｒf＝０．２８）にかけ
る。７．１ｇ（理論値の６５％）の微黄色油が得られ
る。
【００５７】実施例４ａ） Ｌｎ−Ｓ−Ｆｎエステル（６）の製造：
【００５８】
【化１４】
【００５９】２５０ｍｇ（０．３７ミリモル）の実施例
２ａ）に記載の化合物３を３ｍｌの乾燥トルエンに溶解
する。６５ｍｇ（０．４ミリモル）のカルボニルジイミ
ダゾールを加える。Ｎ2下の６０℃にて１７時間撹拌し
た後、３が完全に反応し（ＴＬＣにより、溶離剤：クロ
ロホルム／エタノール１５：１、Ｒf＝０．４５）、新
しい生成物が形成される（溶離剤：上記参照、Ｒf＝
０．６３）。２２０ｍｇ（０．４ミリモル）の実施例３
に記載の化合物５を加え、反応混合物を９０℃にてさら
に２４時間撹拌する。冷却後、溶液を真空中で濃縮し、
残留物をシリカゲル上のクロマトグラフィー（溶離剤：
トルエン／エタノール５：１、Ｒf＝０．３６）にかけ
る。１３８ｍｇ（理論値の３０％）の微黄色油を得る。
２ａ）に記載の化合物３を３ｍｌの乾燥トルエンに溶解
する。６５ｍｇ（０．４ミリモル）のカルボニルジイミ
ダゾールを加える。Ｎ2下の６０℃にて１７時間撹拌し
た後、３が完全に反応し（ＴＬＣにより、溶離剤：クロ
ロホルム／エタノール１５：１、Ｒf＝０．４５）、新
しい生成物が形成される（溶離剤：上記参照、Ｒf＝
０．６３）。２２０ｍｇ（０．４ミリモル）の実施例３
に記載の化合物５を加え、反応混合物を９０℃にてさら
に２４時間撹拌する。冷却後、溶液を真空中で濃縮し、
残留物をシリカゲル上のクロマトグラフィー（溶離剤：
トルエン／エタノール５：１、Ｒf＝０．３６）にかけ
る。１３８ｍｇ（理論値の３０％）の微黄色油を得る。
【００６０】実施例４ｂ） Ｌｎ−Ｓ−Ｆｎエステル（７）の製造 ４１０ｍｇ（０．５４ミリモル）の実施例２ｂ）に記載
の化合物４をカルボニルジイミダゾールで活性化し、続
いて実施例４ａ）に記載のように実施例３）に記載のア
ミノ−ＰＥＧ−アンゲリシン５と反応させる。シリカゲ
ル上のクロマトグラフィー（溶離剤：トルエン／エタノ
ール５：１、Ｒf＝０．３１）の後、１８８ｍｇ（理論
値の２６％）の黄色油を得る。
の化合物４をカルボニルジイミダゾールで活性化し、続
いて実施例４ａ）に記載のように実施例３）に記載のア
ミノ−ＰＥＧ−アンゲリシン５と反応させる。シリカゲ
ル上のクロマトグラフィー（溶離剤：トルエン／エタノ
ール５：１、Ｒf＝０．３１）の後、１８８ｍｇ（理論
値の２６％）の黄色油を得る。
【００６１】実施例５ａ） Ｌｎ−Ｓ−Ｆｎ−テトラカルボン酸（８）の製造：
【００６２】
【化１５】
【００６３】１３８ｍｇ（０．１１ミリモル）の実施例
４ａ）に記載のテトラエステル６を４ｍｌの乾燥ベンゼ
ンに溶解し、５６９ｍｇ（５ミリモル）の三フッ化酢酸
をＮ2下で加える。６０℃で２時間撹拌した後、生成物
がベンゼンから油として分離する。ＴＬＣにより反応は
完了する。冷却後、溶液を真空中で濃縮する。残留物を
５ｍｌの蒸留水に溶解し、３ｍｌのジエチルエーテルと
共に２回振ることにより抽出する。水相を濃縮し、ＲＰ
１８上のクロマトグラフィー（溶離剤：メタノール、Ｒ
f＝０．１３）にかける。７０ｍｇ（理論値の６２％）
の乳白色の粘性油が得られる。
４ａ）に記載のテトラエステル６を４ｍｌの乾燥ベンゼ
ンに溶解し、５６９ｍｇ（５ミリモル）の三フッ化酢酸
をＮ2下で加える。６０℃で２時間撹拌した後、生成物
がベンゼンから油として分離する。ＴＬＣにより反応は
完了する。冷却後、溶液を真空中で濃縮する。残留物を
５ｍｌの蒸留水に溶解し、３ｍｌのジエチルエーテルと
共に２回振ることにより抽出する。水相を濃縮し、ＲＰ
１８上のクロマトグラフィー（溶離剤：メタノール、Ｒ
f＝０．１３）にかける。７０ｍｇ（理論値の６２％）
の乳白色の粘性油が得られる。
【００６４】実施例５ｂ） Ｌｎ−Ｓ−Ｆｎ四酸（９）の製造：４５ｍｇ（０．０３
４ミリモル）の実施例４ｂ）に記載のテトラエステル９
を実施例５ａ）と同様にして三フッ化酢酸と反応させ
る。３０ｍｇ（理論値の８１％）の粘性油が得られる。
４ミリモル）の実施例４ｂ）に記載のテトラエステル９
を実施例５ａ）と同様にして三フッ化酢酸と反応させ
る。３０ｍｇ（理論値の８１％）の粘性油が得られる。
【００６５】実施例６ Ｎ1−(アンゲリシンアミノ)−Ｎ4，Ｎ9−ジメチルスペ
ルミン（１０）の製造：
ルミン（１０）の製造：
【００６６】
【化１６】
【００６７】４．８７ｇ（２０ミリモル）の４’−アミ
ノメチル−４，５’−ジメチルアンゲリシンを実施例１
と同様にカルボニルジイミダゾールで活性化する。得ら
れた溶液を、実施例１と同様にして４０ｍｌのＤＭＦ中
の１３．８ｇ（６０ミリモル）のＮ4，Ｎ9−ジメチルス
ペルミンの溶液に滴下する。冷却後、溶液を真空中で濃
縮し、残留物をシリカゲル上のクロマトグラフィー（溶
離剤：クロロホルム／メタノール／アンモニア３０：
５：１、Ｒf＝０．１１）にかける。７．１ｇ（理論値
の７１％）の黄色油が得られる。
ノメチル−４，５’−ジメチルアンゲリシンを実施例１
と同様にカルボニルジイミダゾールで活性化する。得ら
れた溶液を、実施例１と同様にして４０ｍｌのＤＭＦ中
の１３．８ｇ（６０ミリモル）のＮ4，Ｎ9−ジメチルス
ペルミンの溶液に滴下する。冷却後、溶液を真空中で濃
縮し、残留物をシリカゲル上のクロマトグラフィー（溶
離剤：クロロホルム／メタノール／アンモニア３０：
５：１、Ｒf＝０．１１）にかける。７．１ｇ（理論値
の７１％）の黄色油が得られる。
【００６８】実施例７ Ｌｎ−Ｓ−Ｆｎ−エステル（１１）の製造：
【００６９】
【化１７】
【００７０】３１８ｍｇ（０．５ミリモル）の実施例２
ｂ）に記載の化合物４をカルボニルジイミダゾールで活
性化し、続いて実施例４と同様にして実施例６に記載の
アミノ化合物１０と反応させる。シリカゲル上のクロマ
トグラフィー（溶離剤：クロロホルム／メタノールメア
ンモニア７０：４５：１、Ｒf＝０．４２）の後、１３
２ｍｇ（理論値の２１％）の黄色油が得られる。
ｂ）に記載の化合物４をカルボニルジイミダゾールで活
性化し、続いて実施例４と同様にして実施例６に記載の
アミノ化合物１０と反応させる。シリカゲル上のクロマ
トグラフィー（溶離剤：クロロホルム／メタノールメア
ンモニア７０：４５：１、Ｒf＝０．４２）の後、１３
２ｍｇ（理論値の２１％）の黄色油が得られる。
【００７１】実施例８ Ｌｎ−Ｓ−Ｆｎ四酸（１２）の製造：（ＥｕＰＡ） ３０ｍｇ（０．０２３ミリモル）の実施例７に記載のテ
トラエステル１１を実施例５と同様にして三フッ化酢酸
と反応させる。２２ｍｇ（理論値の９２％）の黄色油が
得られる。
トラエステル１１を実施例５と同様にして三フッ化酢酸
と反応させる。２２ｍｇ（理論値の９２％）の黄色油が
得られる。
【００７２】実施例９ ヘアピンオリゴヌクレオチドとＥｕＰＡ（１２）の光化
学的反応 ５０μｇのヘアピンオリゴヌクレオチドを１００μｌの
トリス−ＨＣｌ緩衝液に取り上げる。溶液を５０℃の水
浴中に１５分間放置する。ゆっくり室温に冷却するため
に試料を水浴から取り出す。続いてさらに４００μｌの
水を加える。
学的反応 ５０μｇのヘアピンオリゴヌクレオチドを１００μｌの
トリス−ＨＣｌ緩衝液に取り上げる。溶液を５０℃の水
浴中に１５分間放置する。ゆっくり室温に冷却するため
に試料を水浴から取り出す。続いてさらに４００μｌの
水を加える。
【００７３】光反応のために、１５μｇのハイブリッド
形成したヘアピンオリゴヌクレオチドに２０倍モル過剰
のＥｕＰＡを加える。続いて氷浴中のＥｐｐｅｎｄｏｒ
ｆ管にて３１２ｎｍ又は３６６ｎｍのＵＶランプ下で溶
液を照明する。光反応の後にＨＰＬＣを行う。１５分以
内に反応が完了した。
形成したヘアピンオリゴヌクレオチドに２０倍モル過剰
のＥｕＰＡを加える。続いて氷浴中のＥｐｐｅｎｄｏｒ
ｆ管にて３１２ｎｍ又は３６６ｎｍのＵＶランプ下で溶
液を照明する。光反応の後にＨＰＬＣを行う。１５分以
内に反応が完了した。
【００７４】実施例１０ ＥｕＰＡ（１２）を用いた光化学的標識 光化学的標識のために、５０μｌの１Ｍナトリウムテト
ラボレート緩衝液ｐＨ８．３及び５０μｌのＥｕＰＡ
（２μｇ／μｌ）を、２０μｌのＴＥ緩衝液中の２−５
μｇのＤＮＡに加え、２回蒸留Ｈ2Ｏで５００μｌとし
た。その後混合物を３１２ｎｍにてＵＶトランスイルミ
ネーター（ｔｒａｎｓ−ｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ）で１
０分間照射し、この過程の間試料を氷上に保った。
ラボレート緩衝液ｐＨ８．３及び５０μｌのＥｕＰＡ
（２μｇ／μｌ）を、２０μｌのＴＥ緩衝液中の２−５
μｇのＤＮＡに加え、２回蒸留Ｈ2Ｏで５００μｌとし
た。その後混合物を３１２ｎｍにてＵＶトランスイルミ
ネーター（ｔｒａｎｓ−ｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ）で１
０分間照射し、この過程の間試料を氷上に保った。
【００７５】続いて光化学的標識ＤＮＡを、１／１０体
積の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．８及び１体積のイソプ
ロパノールを用いて室温にて沈澱させ、５分間放置し
た。その後ＤＮＡをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機中で１
０，０００ｒｐｍにて遠心し、上澄み液をデカンテーシ
ョンし、ＤＮＡ沈澱を７０％のエタノールで洗浄した。
試料が乾燥した後、光化学的標識ＤＮＡをＴＥ中に取り
上げた。その後ＥｕＰＡを用いたＤＮＡの光化学的標識
を、アガロースゲル電気泳動及びミクロタイター（ｍｉ
ｃｒｏｔｉｔｒｅ）試験により調べた。
積の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．８及び１体積のイソプ
ロパノールを用いて室温にて沈澱させ、５分間放置し
た。その後ＤＮＡをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機中で１
０，０００ｒｐｍにて遠心し、上澄み液をデカンテーシ
ョンし、ＤＮＡ沈澱を７０％のエタノールで洗浄した。
試料が乾燥した後、光化学的標識ＤＮＡをＴＥ中に取り
上げた。その後ＥｕＰＡを用いたＤＮＡの光化学的標識
を、アガロースゲル電気泳動及びミクロタイター（ｍｉ
ｃｒｏｔｉｔｒｅ）試験により調べた。
【００７６】実施例１１ ミクロタイター試験におけるＥｕＰＡ標識の検出 ２本鎖ＤＮＡのＥｕＰＡ標識を検出するために、標識後
のＤＮＡを１：２の希釈段階の２５０ｎｇから１２５ｐ
ｇの濃度でミクロタイター試験プレートにピペットで入
れた。ミクロタイターウェル中のポリスチレン基に結合
させるために、ＤＮＡを最初にウェル中でＰＢＳＭ緩衝
液（０．１ＭのＭｇＣｌ2、０．１５ＭのＮａＣｌ、３
ＭのＫＣｌを含む１０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．
２）により希釈し、室温で終夜培養した。その後２００
μｌのＰＢＳＭ緩衝液で２回洗浄し、ＵＶトランスイル
ミネーターを用いて３１２ｎｍにて１０分間照射するこ
とによりＤＮＡをウェルに固定した。このようにして固
定したＤＮＡをその後Ｄｅｌｆｉａ／Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａからの洗浄用濃度の緩衝液で４回洗浄し、ユーロピウ
ムを負荷された過剰のＥｕＰＡを除去した。負の標準と
して非標識２本鎖ＤＮＡを同様の方法で処理した。
のＤＮＡを１：２の希釈段階の２５０ｎｇから１２５ｐ
ｇの濃度でミクロタイター試験プレートにピペットで入
れた。ミクロタイターウェル中のポリスチレン基に結合
させるために、ＤＮＡを最初にウェル中でＰＢＳＭ緩衝
液（０．１ＭのＭｇＣｌ2、０．１５ＭのＮａＣｌ、３
ＭのＫＣｌを含む１０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．
２）により希釈し、室温で終夜培養した。その後２００
μｌのＰＢＳＭ緩衝液で２回洗浄し、ＵＶトランスイル
ミネーターを用いて３１２ｎｍにて１０分間照射するこ
とによりＤＮＡをウェルに固定した。このようにして固
定したＤＮＡをその後Ｄｅｌｆｉａ／Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａからの洗浄用濃度の緩衝液で４回洗浄し、ユーロピウ
ムを負荷された過剰のＥｕＰＡを除去した。負の標準と
して非標識２本鎖ＤＮＡを同様の方法で処理した。
【００７７】１００μｌのＷａｌｌａｃ／Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａからの強調溶液（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｓｏ
ｌｕｔｉｏｎ）を加えた後、室温にて３０分後、Ｗａｌ
ｌａｃ／ＰｈａｒｍａｃｉａからのＤＥＬＦＩＡ １２
３２蛍光光度計で２９０−３６０ｎｍ励起／６１５ｎｍ
発光にてユーロピウムの時間分解蛍光を測定した。ＤＮ
Ａの希釈に依存して２１２，０００−１，７００の蛍光
シグナルが標識ＤＮＡにおいて測定された。非標識ＤＮ
Ａは低いバックグラウンドシグナルのみを与えた。
ｃｉａからの強調溶液（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｓｏ
ｌｕｔｉｏｎ）を加えた後、室温にて３０分後、Ｗａｌ
ｌａｃ／ＰｈａｒｍａｃｉａからのＤＥＬＦＩＡ １２
３２蛍光光度計で２９０−３６０ｎｍ励起／６１５ｎｍ
発光にてユーロピウムの時間分解蛍光を測定した。ＤＮ
Ａの希釈に依存して２１２，０００−１，７００の蛍光
シグナルが標識ＤＮＡにおいて測定された。非標識ＤＮ
Ａは低いバックグラウンドシグナルのみを与えた。
【００７８】実施例１２ 逆相試験におけるＥｕＰＡ−標識ゲノムＤＮＡのハイブ
リッド形成 ＥｕＰＡ−標識ＤＮＡの製造を実施例１０に記載の方法
に従って行った。
リッド形成 ＥｕＰＡ−標識ＤＮＡの製造を実施例１０に記載の方法
に従って行った。
【００７９】４０−６８℃の培養温度で従来の方法によ
りハイブリッド形成を行った。ハイブリッド形成温度に
依存して異なる物質を加えた。長い遺伝子プローブの場
合、ハイブリッド形成の速度と量を増すためにデキスト
ランサルフェート又は他のポリマーを用いた。乾燥乳
（ｄｒｉｅｄ ｍｉｌｋ）、デンハート溶液、ヘパリン
又はＳＤＳなどの界面活性剤及び阻害剤を用いて膜への
ＤＮＡの非特異的結合を抑制した。ウレア又はホルムア
ルデヒドなどの変性剤を用いてハイブリッドの融解温度
を下げ、低いハイブリッド形成温度を用いることができ
る。さらに点染上における非−相同ＤＮＡへのプローブ
の非特異的結合を、異種ＤＮＡを加えることにより減少
させることができる。
りハイブリッド形成を行った。ハイブリッド形成温度に
依存して異なる物質を加えた。長い遺伝子プローブの場
合、ハイブリッド形成の速度と量を増すためにデキスト
ランサルフェート又は他のポリマーを用いた。乾燥乳
（ｄｒｉｅｄ ｍｉｌｋ）、デンハート溶液、ヘパリン
又はＳＤＳなどの界面活性剤及び阻害剤を用いて膜への
ＤＮＡの非特異的結合を抑制した。ウレア又はホルムア
ルデヒドなどの変性剤を用いてハイブリッドの融解温度
を下げ、低いハイブリッド形成温度を用いることができ
る。さらに点染上における非−相同ＤＮＡへのプローブ
の非特異的結合を、異種ＤＮＡを加えることにより減少
させることができる。
【００８０】ハイブリッド形成の準備のために、１００
ｎｇの非標識大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−特異的遺伝子プ
ローブ（１．７ｋｂ−６ｋｂ）を最初に１００℃にて５
分間変性し、０℃に冷却し、その後Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅ
ｒ ａｎｄ ＳｃｈｕｅｌｌからのＭｉｎｉｆｏｌｄ−
ＩＩ濾過装置を用いて前処理ニトロセルロース又はナイ
ロン膜に移し、８０℃で２時間固定した。
ｎｇの非標識大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−特異的遺伝子プ
ローブ（１．７ｋｂ−６ｋｂ）を最初に１００℃にて５
分間変性し、０℃に冷却し、その後Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅ
ｒ ａｎｄ ＳｃｈｕｅｌｌからのＭｉｎｉｆｏｌｄ−
ＩＩ濾過装置を用いて前処理ニトロセルロース又はナイ
ロン膜に移し、８０℃で２時間固定した。
【００８１】フィルターを、密封プラスチックフィルム
の袋又はプラスチックの箱の中で、フィルター１００ｃ
ｍ2当たり少なくとも２０ｍｌのハイブリッド形成溶液
を用い、６８℃にて少なくとも１時間ハイブリッド形成
した。
の袋又はプラスチックの箱の中で、フィルター１００ｃ
ｍ2当たり少なくとも２０ｍｌのハイブリッド形成溶液
を用い、６８℃にて少なくとも１時間ハイブリッド形成
した。
【００８２】溶液を、大腸菌（１μｌ）からの変性した
ばかりの（１００℃、５分間）ＥｕＰＡ−標識ゲノムＤ
ＮＡを加えた、１００ｃｍ2のフィルターの２．５ｍｌ
のハイブリッド形成溶液で置換した。フィルターをゆっ
くり振りながら６８℃で少なくとも６時間培養した。
ばかりの（１００℃、５分間）ＥｕＰＡ−標識ゲノムＤ
ＮＡを加えた、１００ｃｍ2のフィルターの２．５ｍｌ
のハイブリッド形成溶液で置換した。フィルターをゆっ
くり振りながら６８℃で少なくとも６時間培養した。
【００８３】その後フィルターをフィルター１００ｃｍ
2当たり少なくとも５０ｍｌの２ｘＳＳＣ、０．１％の
ＳＤＳを用いて室温で２ｘ５分間、及び０．１ｘＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳを用いて６８℃で２ｘ１５分間洗浄
した。
2当たり少なくとも５０ｍｌの２ｘＳＳＣ、０．１％の
ＳＤＳを用いて室温で２ｘ５分間、及び０．１ｘＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳを用いて６８℃で２ｘ１５分間洗浄
した。
【００８４】その後ハイブリッド形成ＤＮＡの検出にフ
ィルターを直接用いた。すでにユーロピウムを負荷した
ＥｕＰＡ−ＤＮＡを用いたか、又は後にユーロピウムを
負荷したＥｕＰＡ−ＤＮＡを用いたかにより、蛍光の読
み取りのためのフィルターの仕上げにおいてさらに以下
の段階を行った。ユーロピウムを負荷していないＥｕＰ
Ａ−標識ゲノムＤＮＡの場合、フィルターを、合計体積
２ｍｌ中の１００μＭのＥｕＣｌ、１００μＭのＥＤＴ
Ａ及び１ｘＳＳＣ ｐＨ７．０で室温にて２時間処理し
た。その後フィルターを２ｘＳＳＣで６回洗浄した。続
いてハイブリッド形成点染の各溝（ｓｌｏｔ）を切断
し、１．５ｍｌの反応管中で１ｍｌの強調溶液で処理し
た。室温で３０分間培養した後、各溝からの２００μｌ
の試料をミクロタイタープレート中にピペットで入れ、
Ｗａｌｌａｃ／ＰｈａｒｍａｃｉａからのＤＥＬＦＩＡ
１２３２蛍光光度計で２９０−３６０ｎｍ励起及び６
１５発光にて試料を測定した。
ィルターを直接用いた。すでにユーロピウムを負荷した
ＥｕＰＡ−ＤＮＡを用いたか、又は後にユーロピウムを
負荷したＥｕＰＡ−ＤＮＡを用いたかにより、蛍光の読
み取りのためのフィルターの仕上げにおいてさらに以下
の段階を行った。ユーロピウムを負荷していないＥｕＰ
Ａ−標識ゲノムＤＮＡの場合、フィルターを、合計体積
２ｍｌ中の１００μＭのＥｕＣｌ、１００μＭのＥＤＴ
Ａ及び１ｘＳＳＣ ｐＨ７．０で室温にて２時間処理し
た。その後フィルターを２ｘＳＳＣで６回洗浄した。続
いてハイブリッド形成点染の各溝（ｓｌｏｔ）を切断
し、１．５ｍｌの反応管中で１ｍｌの強調溶液で処理し
た。室温で３０分間培養した後、各溝からの２００μｌ
の試料をミクロタイタープレート中にピペットで入れ、
Ｗａｌｌａｃ／ＰｈａｒｍａｃｉａからのＤＥＬＦＩＡ
１２３２蛍光光度計で２９０−３６０ｎｍ励起及び６
１５発光にて試料を測定した。
【００８５】標識の前にユーロピウムを負荷したＥｕＰ
Ａ−標識を用いた溝点染の場合、各溝をハイブリッド形
成の直後に切断し、それに１．５ｍｌの反応管中で１ｍ
ｌの強調溶液を加え、その後上記の通りに強調溶液を加
え、蛍光光度計で測定を行った。
Ａ−標識を用いた溝点染の場合、各溝をハイブリッド形
成の直後に切断し、それに１．５ｍｌの反応管中で１ｍ
ｌの強調溶液を加え、その後上記の通りに強調溶液を加
え、蛍光光度計で測定を行った。
【００８６】溶液： ２０ｘＳＳＣ： ３ＭのＮａＣｌ、０.３Ｍのク
エン酸Ｎａ、ｐＨ７.０ ハイブリッド形成溶液：５ｘＳＳＣ；０．１％のＮ−ラ
ウロイルサルコシン、Ｎａ塩、０．０２％のＳＤＳ；
０．５％の阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、５０−７
０℃で溶液を溶解実施例１３ ＥｕＰＡ−標識遺伝子プローブを用いたハイブリッド形
成 実施例１０に記載の方法に従い、ＥｕＰＡ−標識遺伝子
プローブ（１．７−６ｋｂ）の製造を行った。
エン酸Ｎａ、ｐＨ７.０ ハイブリッド形成溶液：５ｘＳＳＣ；０．１％のＮ−ラ
ウロイルサルコシン、Ｎａ塩、０．０２％のＳＤＳ；
０．５％の阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、５０−７
０℃で溶液を溶解実施例１３ ＥｕＰＡ−標識遺伝子プローブを用いたハイブリッド形
成 実施例１０に記載の方法に従い、ＥｕＰＡ−標識遺伝子
プローブ（１．７−６ｋｂ）の製造を行った。
【００８７】ＥｕＰＡ−標識遺伝子プローブは、固−相
又は液体ハイブリッド形成において用いることができ
る。適した固相は、例えばニトロセルロース膜、ナイロ
ン膜、ミクロタイタープレートのポリスチレン基、ある
いは磁気粒子である。遺伝子プローブの、相補的ゲノム
ＤＮＡとの蛍光ハイブリッド形成複合体は、ヒドロキシ
アパタイトを用いて遊離の蛍光遺伝子プローブから分離
することができる。
又は液体ハイブリッド形成において用いることができ
る。適した固相は、例えばニトロセルロース膜、ナイロ
ン膜、ミクロタイタープレートのポリスチレン基、ある
いは磁気粒子である。遺伝子プローブの、相補的ゲノム
ＤＮＡとの蛍光ハイブリッド形成複合体は、ヒドロキシ
アパタイトを用いて遊離の蛍光遺伝子プローブから分離
することができる。
【００８８】例えば溝−点染ハイブリッド形成を、Ｅｕ
ＰＡ−標識大腸菌−特異的遺伝子プローブ（１．７ｋｂ
−０．６ｋｂ）及び大腸菌からのゲノムＤＮＡを用いて
行った。
ＰＡ−標識大腸菌−特異的遺伝子プローブ（１．７ｋｂ
−０．６ｋｂ）及び大腸菌からのゲノムＤＮＡを用いて
行った。
【００８９】この目的のために、ゲノム大腸菌ＤＮＡを
１００℃で５分間変性し、その後０℃に冷却し、Ｓｃｈ
ｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ ＳｃｈｕｅｌｌからのＭｉｎ
ｉｆｏｌｄ−ＩＩ濾過装置を用い、１：２の希釈段階に
おける５００ｎｇから１２５ｐｇの濃度でニトロセルロ
ース又はナイロン膜に移した。予備ハイブリッド形成及
びハイブリッド形成を実施例１２に記載の通りに行っ
た。１００ｎｇのＥｕＰＡ−標識大腸菌遺伝子プローブ
を用いた。
１００℃で５分間変性し、その後０℃に冷却し、Ｓｃｈ
ｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ ＳｃｈｕｅｌｌからのＭｉｎ
ｉｆｏｌｄ−ＩＩ濾過装置を用い、１：２の希釈段階に
おける５００ｎｇから１２５ｐｇの濃度でニトロセルロ
ース又はナイロン膜に移した。予備ハイブリッド形成及
びハイブリッド形成を実施例１２に記載の通りに行っ
た。１００ｎｇのＥｕＰＡ−標識大腸菌遺伝子プローブ
を用いた。
【００９０】強調溶液で処理した後、切り出したフィル
ター溝をＷａｌｌａｃ／ＰｈａｒｍａｃｉａからのＤＥ
ＬＦＩＡ １２３２蛍光光度計にてそれぞれ測定するこ
とにより、読み取りを行った。
ター溝をＷａｌｌａｃ／ＰｈａｒｍａｃｉａからのＤＥ
ＬＦＩＡ １２３２蛍光光度計にてそれぞれ測定するこ
とにより、読み取りを行った。
【００９１】遺伝子プローブを用い、大腸菌からの１２
５ｎｇのゲノムＤＮＡでも検出可能であった。これは、
純粋なｐＢＲ３２２プラスミドプローブのｐＢＲ３２２
ＤＮＡへのハイブリッド形成において測定される０．１
ｐｇのＤＮＡの試験感度に相当する。
５ｎｇのゲノムＤＮＡでも検出可能であった。これは、
純粋なｐＢＲ３２２プラスミドプローブのｐＢＲ３２２
ＤＮＡへのハイブリッド形成において測定される０．１
ｐｇのＤＮＡの試験感度に相当する。
【００９２】別法として、ミクロタイターハイブリッド
形成試験を行った。この目的の場合、ゲノム大腸菌ＤＮ
Ａを上記のように変性し、その後１０ｎｇから４５ｐｇ
の希釈試料をミクロタイターウェルにピペットで入れ、
室温にて終夜放置した。その後２００μｌのＰＢＳＭ緩
衝液を用いて２回洗浄し、ＤＮＡをＵＶトランスイルミ
ネーターを用いて３１２ｎｍにて１０分間固定した。１
０ｎｇのＥｕＰＡ−標識遺伝子プローブを含む２００μ
ｌのハイブリッド形成溶液（実施例１２）を加え、ハイ
ブリッド形成混合物を６８℃で少なくとも６時間培養し
た。続いてミクロタイターウェルを２ｘ２００μｌの２
ｘＳＳＣ、０．１ＳＤＳを用いて室温で２ｘ５分間、２
ｘ２００μｌの０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用い
て５０℃で２ｘ１５分間洗浄した。
形成試験を行った。この目的の場合、ゲノム大腸菌ＤＮ
Ａを上記のように変性し、その後１０ｎｇから４５ｐｇ
の希釈試料をミクロタイターウェルにピペットで入れ、
室温にて終夜放置した。その後２００μｌのＰＢＳＭ緩
衝液を用いて２回洗浄し、ＤＮＡをＵＶトランスイルミ
ネーターを用いて３１２ｎｍにて１０分間固定した。１
０ｎｇのＥｕＰＡ−標識遺伝子プローブを含む２００μ
ｌのハイブリッド形成溶液（実施例１２）を加え、ハイ
ブリッド形成混合物を６８℃で少なくとも６時間培養し
た。続いてミクロタイターウェルを２ｘ２００μｌの２
ｘＳＳＣ、０．１ＳＤＳを用いて室温で２ｘ５分間、２
ｘ２００μｌの０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用い
て５０℃で２ｘ１５分間洗浄した。
【００９３】ウェルを１００μｌの強調溶液で処理した
後Ｗａｌｌａｃ／ＰｈａｒｍａｃｉａからのＤＥＬＦＩ
Ａ １２３２蛍光光度計で、実施例１２と同様に読み取
りを行った。
後Ｗａｌｌａｃ／ＰｈａｒｍａｃｉａからのＤＥＬＦＩ
Ａ １２３２蛍光光度計で、実施例１２と同様に読み取
りを行った。
【００９４】本発明の主たる特徴及び態様は以下の通り
である。
である。
【００９５】１．一般式
【００９６】
【化１８】Ｌｎ−Ｓ−Ｆｕ ［式中、Ｌｎはランタニドイオン−キレート構造であ
り、Ｓはスペーサー分子であり、Ｆｕはフロクマリン誘
導体である］の標識用試薬。
り、Ｓはスペーサー分子であり、Ｆｕはフロクマリン誘
導体である］の標識用試薬。
【００９７】２．ランタニドイオン−キレート構造（Ｌ
ｎ）が式
ｎ）が式
【００９８】
【化１９】
【００９９】［式中、Ｘは場合により複素原子基を含む
Ｃ5−Ｃ14−アリーレン、又は複素原子基［Ｎ、Ｏ、Ｓ
（１ｘ、１個以上）を含むＣ1−Ｃ24−アルキレンであ
り、Ｙ及び場合によりＸ＋ＹはＮ−オキシスクシンイミ
ド、Ｎ−マレイミド、ＮＨ2、ＯＨ、ＣＯＣＨ2−ハロゲ
ン、ハロゲン、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、Ｓ
Ｈ、ＣＯ−ハロゲン、ＣＯＯＣＯＲ1、ＣＨ＝ＣＨＣＯ2
Ｒ1、
Ｃ5−Ｃ14−アリーレン、又は複素原子基［Ｎ、Ｏ、Ｓ
（１ｘ、１個以上）を含むＣ1−Ｃ24−アルキレンであ
り、Ｙ及び場合によりＸ＋ＹはＮ−オキシスクシンイミ
ド、Ｎ−マレイミド、ＮＨ2、ＯＨ、ＣＯＣＨ2−ハロゲ
ン、ハロゲン、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、Ｓ
Ｈ、ＣＯ−ハロゲン、ＣＯＯＣＯＲ1、ＣＨ＝ＣＨＣＯ2
Ｒ1、
【０１００】
【化２０】
【０１０１】であり、ここでＲ1は水素、場合によりフ
ェニル基により置換されていてもよい飽和又は不飽和Ｃ
1−Ｃ20−アルキル基、又はフェニル基であり、Ｒは他
から独立して各場合に水素、アンモニウム又は当量のア
ルカリ金属あるいは１／２当量のアルカリ土類金属であ
る］のピリジン誘導体である上記１項記載の標識用試
薬。
ェニル基により置換されていてもよい飽和又は不飽和Ｃ
1−Ｃ20−アルキル基、又はフェニル基であり、Ｒは他
から独立して各場合に水素、アンモニウム又は当量のア
ルカリ金属あるいは１／２当量のアルカリ土類金属であ
る］のピリジン誘導体である上記１項記載の標識用試
薬。
【０１０２】３．スペーサーがポリアルキルアミン、ポ
リエチレングリコール又はこれらの組み合わせである上
記１項記載の標識用試薬。
リエチレングリコール又はこれらの組み合わせである上
記１項記載の標識用試薬。
【０１０３】４．Ｆｕが次の一般式：
【０１０４】
【化２１】
【０１０５】［式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は互いに独立し
てＨ又はＣ1−Ｃ7−アルキルであり、Ｒ4はＨ、Ｃ1−Ｃ
7−アルキル又はヒドロキシルを有する低級アルキル、
Ｃ1−Ｃ7−アルコキシ、アミノ、ハロ又はＮ−フタルイ
ミド置換基である］のアンゲリシン誘導体である上記１
項記載の標識用試薬。
てＨ又はＣ1−Ｃ7−アルキルであり、Ｒ4はＨ、Ｃ1−Ｃ
7−アルキル又はヒドロキシルを有する低級アルキル、
Ｃ1−Ｃ7−アルコキシ、アミノ、ハロ又はＮ−フタルイ
ミド置換基である］のアンゲリシン誘導体である上記１
項記載の標識用試薬。
【０１０６】５．Ｆｕが次の一般式：
【０１０７】
【化２２】
【０１０８】［式中、Ｒ1、Ｒ3及びＲ6は互いに独立し
てＨ又はＣ1−Ｃ7−アルキルであり、Ｒ4はＨ、Ｃ1−Ｃ
7−アルキル又はヒドロキシルを有するＣ1−Ｃ7−アル
キル、Ｃ1−Ｃ7−アルコキシ、アミノ、ハロ又はＮ−フ
タルイミド置換基であり、Ｒ2及びＲ5は互いに独立して
Ｈ、ヒドロキシル、カルボキシル、カーボ−Ｃ1−Ｃ7−
アルコキシ又はＣ1−Ｃ7−アルコキシである］のプロソ
ラレンである上記１項記載の標識用試薬。
てＨ又はＣ1−Ｃ7−アルキルであり、Ｒ4はＨ、Ｃ1−Ｃ
7−アルキル又はヒドロキシルを有するＣ1−Ｃ7−アル
キル、Ｃ1−Ｃ7−アルコキシ、アミノ、ハロ又はＮ−フ
タルイミド置換基であり、Ｒ2及びＲ5は互いに独立して
Ｈ、ヒドロキシル、カルボキシル、カーボ−Ｃ1−Ｃ7−
アルコキシ又はＣ1−Ｃ7−アルコキシである］のプロソ
ラレンである上記１項記載の標識用試薬。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ボルフガング・シユプリンガー ドイツ連邦共和国デー5600ブツペルタール １・カテルンベルガーシユルベーク31 (72)発明者 ヘルベルト・フクル ドイツ連邦共和国デー5060ベルギッシユグ ラートバツハ２・ゲマルケンベーク９ (72)発明者 ユルゲン・ケヒヤー ドイツ連邦共和国デー4018ランゲンフエル ト・ザイデンベバーシユトラーセ５
Claims (1)
- 【請求項１】 一般式 【化１】Ｌｎ−Ｓ−Ｆｕ ［式中、Ｌｎはランタニドイオン−キレート構造であ
り、Ｓはスペーサー分子であり、Ｆｕはフロクマリン誘
導体である］の標識用試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4222255.9 | 1992-07-07 | ||
| DE19924222255 DE4222255A1 (de) | 1992-07-07 | 1992-07-07 | Fotochemische Markierung von Nukleinsäuren mit Europiumchelat-Reagenzien und ihre Verwendung in Gensondentestsystemen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0694720A true JPH0694720A (ja) | 1994-04-08 |
Family
ID=6462656
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17848693A Pending JPH0694720A (ja) | 1992-07-07 | 1993-06-28 | ユーロピウムキレート試薬を用いた核酸の光化学的標識及び遺伝子プローブ試験系におけるその使用 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0578067A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0694720A (ja) |
| CA (1) | CA2099542A1 (ja) |
| DE (1) | DE4222255A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09268751A (ja) * | 1996-03-29 | 1997-10-14 | Daiken:Kk | 天井点検口用蓋体の取付構造 |
| JP2003523312A (ja) * | 1999-02-18 | 2003-08-05 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 発光マーカーとして使用するためのフタルアミド−ランタニド錯体 |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7745142B2 (en) | 1997-09-15 | 2010-06-29 | Molecular Devices Corporation | Molecular modification assays |
| US6297018B1 (en) | 1998-04-17 | 2001-10-02 | Ljl Biosystems, Inc. | Methods and apparatus for detecting nucleic acid polymorphisms |
| WO2000048991A1 (en) * | 1999-02-18 | 2000-08-24 | The Regents Of The University Of California | Salicylamide-lanthanide complexes for use as luminescent markers |
| DE60141871D1 (de) * | 2000-05-05 | 2010-06-02 | Wallac Oy | Oligonukleotidmarkierungsstoffe und ihre Verwendung |
| DE602004016390D1 (en) | 2003-12-30 | 2008-10-16 | Univ California Office Of The | Aromatische triamid-lanthanid-komplexe |
| AU2007272604B2 (en) | 2006-07-10 | 2013-08-01 | The Regents Of The University Of California | Luminescent 1-hydroxy-2-pyridinone chelates of lanthanides |
| ES2655082T3 (es) | 2006-08-15 | 2018-02-16 | The Regents Of The University Of California | Complejos luminiscentes de lantánidos macrocíclicos |
| WO2008092120A1 (en) | 2007-01-25 | 2008-07-31 | Lumiphore, Inc. | Multi-color time resolved fluorophores based on macrocyclic lanthanide complexes |
| US9273059B2 (en) | 2009-08-24 | 2016-03-01 | Lumiphore, Inc. | Macrocyclic HOPO chelators |
| DE102011001368B4 (de) | 2011-03-17 | 2013-01-31 | Bundesanstalt für Materialforschung und -Prüfung (BAM) | Lanthanoid-Chelate enthaltende Partikel, deren Herstellung sowie deren Verwendung in der Bioanalytik |
| US11453652B2 (en) | 2013-03-15 | 2022-09-27 | Lumiphore, Inc. | Di-macrocycles |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0187332B1 (en) * | 1985-01-10 | 1989-02-01 | Molecular Diagnostics, Inc. | Photochemical method of labelling nucleic acids for detection in hybridization assays |
| SE8502573D0 (sv) * | 1985-05-23 | 1985-05-23 | Jouko Kanakre | Fluorescent lanthanide chelates useful as labels of physiologically active materials |
-
1992
- 1992-07-07 DE DE19924222255 patent/DE4222255A1/de not_active Withdrawn
-
1993
- 1993-06-24 EP EP93110109A patent/EP0578067A1/de not_active Withdrawn
- 1993-06-28 JP JP17848693A patent/JPH0694720A/ja active Pending
- 1993-07-02 CA CA 2099542 patent/CA2099542A1/en not_active Abandoned
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09268751A (ja) * | 1996-03-29 | 1997-10-14 | Daiken:Kk | 天井点検口用蓋体の取付構造 |
| JP2003523312A (ja) * | 1999-02-18 | 2003-08-05 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 発光マーカーとして使用するためのフタルアミド−ランタニド錯体 |
| JP4819223B2 (ja) * | 1999-02-18 | 2011-11-24 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 発光マーカーとして使用するためのフタルアミド−ランタニド錯体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0578067A1 (de) | 1994-01-12 |
| CA2099542A1 (en) | 1994-01-08 |
| DE4222255A1 (de) | 1994-01-13 |
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