JPH0694720A - ユーロピウムキレート試薬を用いた核酸の光化学的標識及び遺伝子プローブ試験系におけるその使用 - Google Patents
ユーロピウムキレート試薬を用いた核酸の光化学的標識及び遺伝子プローブ試験系におけるその使用Info
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- JPH0694720A JPH0694720A JP17848693A JP17848693A JPH0694720A JP H0694720 A JPH0694720 A JP H0694720A JP 17848693 A JP17848693 A JP 17848693A JP 17848693 A JP17848693 A JP 17848693A JP H0694720 A JPH0694720 A JP H0694720A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 式
【化1】Ln−S−Fu
式中、Lnはランタニドイオン−キレート構造であり、
Sはスペーサー分子であり、Fuはフロクマリン誘導体
であるの光化学的標識用試薬。 【効果】 遺伝子診断法において有用である。
Sはスペーサー分子であり、Fuはフロクマリン誘導体
であるの光化学的標識用試薬。 【効果】 遺伝子診断法において有用である。
Description
【0001】遺伝子プローブ診断法は、DNA/RNA
配列の配列特異的検出の方法である。これは、検出する
べきDNA/RNAの相補的配列領域を有する遺伝子プ
ローブ配列のハイブリッド形成に基づいている[J.
A.Matthews,L.J.Kricka,Ana
lytical Biochemistry 169,
1−25(1988);U.Landegren,R.K
aiser,C.T.Caskey,L.Hood,S
cience 242,229(1988)]。
配列の配列特異的検出の方法である。これは、検出する
べきDNA/RNAの相補的配列領域を有する遺伝子プ
ローブ配列のハイブリッド形成に基づいている[J.
A.Matthews,L.J.Kricka,Ana
lytical Biochemistry 169,
1−25(1988);U.Landegren,R.K
aiser,C.T.Caskey,L.Hood,S
cience 242,229(1988)]。
【0002】遺伝子プローブ診断学により、感染症及び
遺伝的欠陥の検出が可能になる。遺伝子プローブ診断学
を広く適用するための前提条件は、検出の適した感度、
実行の単純さ及び放射性の回避である。
遺伝的欠陥の検出が可能になる。遺伝子プローブ診断学
を広く適用するための前提条件は、検出の適した感度、
実行の単純さ及び放射性の回避である。
【0003】遺伝子プローブ診断学の1つの変法は、検
出するべきDNA/RNAの直接光化学的標識を用いて
行われ、その後相補的核酸配列を有する遺伝子プローブ
へのハイブリッド形成を行う[N.Dattagupt
a,P.M.M.Rae,E.D.Huguenel,
E.Carlson,A.Lyga,J.S.Shap
iro,J.P.Albarella,Analyti
cal Biochemistry 177,85(1
989);J.P.Albarella,R.L.Mi
negar,W.L.Patterson,M.Dat
tagpta,E.Carlson,Nucleic
Acids Research 17,4293(19
89)]。
出するべきDNA/RNAの直接光化学的標識を用いて
行われ、その後相補的核酸配列を有する遺伝子プローブ
へのハイブリッド形成を行う[N.Dattagupt
a,P.M.M.Rae,E.D.Huguenel,
E.Carlson,A.Lyga,J.S.Shap
iro,J.P.Albarella,Analyti
cal Biochemistry 177,85(1
989);J.P.Albarella,R.L.Mi
negar,W.L.Patterson,M.Dat
tagpta,E.Carlson,Nucleic
Acids Research 17,4293(19
89)]。
【0004】適したスペーサー分子を用いてビオチンに
結合するフロクマリンは、核酸の光化学的ビオチニル化
に非常に適していることが示された。相補的核酸配列を
有する遺伝子プローブへのハイブリッド形成及び分離段
階の後、例えば抗ビオチン−抗体又はアビジンあるいは
ストレプタビジンとアルカリホスファターゼの複合体の
添加により検出を行う。検出のために、追加の段階でア
ルカリホスファターゼにより誘導される発色反応を行う
[J.J.Leary,D.J.Brigati,D.
C.Ward,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 80,4045−4049(198
3)]。
結合するフロクマリンは、核酸の光化学的ビオチニル化
に非常に適していることが示された。相補的核酸配列を
有する遺伝子プローブへのハイブリッド形成及び分離段
階の後、例えば抗ビオチン−抗体又はアビジンあるいは
ストレプタビジンとアルカリホスファターゼの複合体の
添加により検出を行う。検出のために、追加の段階でア
ルカリホスファターゼにより誘導される発色反応を行う
[J.J.Leary,D.J.Brigati,D.
C.Ward,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 80,4045−4049(198
3)]。
【0005】ビオチンを用いた検出系の1つの欠点は、
生物系にビオチンが広く分布していることである。
生物系にビオチンが広く分布していることである。
【0006】可能な変法は、例えば検出するべきDNA
/RNAの蛍光染料を用いた直接光化学的標識である。
しかしこれはエネルギーの浪費の傾向があるので光反応
条件下では実際的でないことが見いだされた。さらに適
した標識は光化学的に不活性でなければならない。
/RNAの蛍光染料を用いた直接光化学的標識である。
しかしこれはエネルギーの浪費の傾向があるので光反応
条件下では実際的でないことが見いだされた。さらに適
した標識は光化学的に不活性でなければならない。
【0007】驚くべきことに、スペーサーを用いて適し
たフロクマリンに結合したランタニドキレートが適して
いることが見いだされた。
たフロクマリンに結合したランタニドキレートが適して
いることが見いだされた。
【0008】ランタニドキレート、特にユーロピウムキ
レートは、すでに免疫診断学において日常的に用いられ
ている[P.Degan,A.Abbondandol
o,G.Montangnoli,J.of Biol
uminescence and Chemilumi
nescence 5,207(1990)]。これら
を用いる場合の特別の利点は、蛍光の時間分解測定が可
能なことである。遺伝子プローブ診断学へのその適用も
ここに初めて記載された[A.Oser,W.K.Ro
th,G.Valet,Nucleic Acids
Res.,3,1181(1988)]が、この研究の
場合ユーロピウムキレート試薬を用いた標識は高価な方
法を用いて行われている。さらにPCR反応へのユーロ
ピウムキレートプライマーの利用が記載された[P.D
ahlen,A.Iitiae,V.−M.Mukka
la,P.Hurs−Kainen,M.Kwiatk
owski,Molecular and Cellu
lar Probes 5,143−149(199
1)]。
レートは、すでに免疫診断学において日常的に用いられ
ている[P.Degan,A.Abbondandol
o,G.Montangnoli,J.of Biol
uminescence and Chemilumi
nescence 5,207(1990)]。これら
を用いる場合の特別の利点は、蛍光の時間分解測定が可
能なことである。遺伝子プローブ診断学へのその適用も
ここに初めて記載された[A.Oser,W.K.Ro
th,G.Valet,Nucleic Acids
Res.,3,1181(1988)]が、この研究の
場合ユーロピウムキレート試薬を用いた標識は高価な方
法を用いて行われている。さらにPCR反応へのユーロ
ピウムキレートプライマーの利用が記載された[P.D
ahlen,A.Iitiae,V.−M.Mukka
la,P.Hurs−Kainen,M.Kwiatk
owski,Molecular and Cellu
lar Probes 5,143−149(199
1)]。
【0009】本発明に従えば、一般式
【0010】
【化2】Ln−S−Fu [式中、Lnはランタニドイオン−キレート構造であ
り、Sはスペーサー分子であり、Fuは光化学的結合可
能構造としてのフロクマリン(furocoumari
n)誘導体である]の標識用試薬が合成される。
り、Sはスペーサー分子であり、Fuは光化学的結合可
能構造としてのフロクマリン(furocoumari
n)誘導体である]の標識用試薬が合成される。
【0011】ランタニドイオン−キレート構造(Ln)
は、式
は、式
【0012】
【化3】
【0013】[式中、Xは場合により複素原子基(he
tero atom grouping)を含むC5−
C14−アリーレン、又は複素原子基[N、O、S(1
x、1個以上)を含むC1−C24−アルキレンであり、
Y及び場合によりX+YはN−オキシスクシンイミド、
N−マレイミド、NH2、OH、COCH2−ハロゲン、
ハロゲン、NCO、NCS、CHO、COOH、SH、
CO−ハロゲン、COOCOR1、CH=CHCO
2R1、
tero atom grouping)を含むC5−
C14−アリーレン、又は複素原子基[N、O、S(1
x、1個以上)を含むC1−C24−アルキレンであり、
Y及び場合によりX+YはN−オキシスクシンイミド、
N−マレイミド、NH2、OH、COCH2−ハロゲン、
ハロゲン、NCO、NCS、CHO、COOH、SH、
CO−ハロゲン、COOCOR1、CH=CHCO
2R1、
【0014】
【化4】
【0015】であり、ここでR1は水素、場合によりフ
ェニル基により置換されていてもよい飽和又は不飽和C
1−C20−アルキル基、又はフェニル基であり、Rは他
から独立して各場合に水素、アンモニウム又は当量のア
ルカリ金属あるいは1/2当量のアルカリ土類金属であ
る]のピリジン誘導体である。
ェニル基により置換されていてもよい飽和又は不飽和C
1−C20−アルキル基、又はフェニル基であり、Rは他
から独立して各場合に水素、アンモニウム又は当量のア
ルカリ金属あるいは1/2当量のアルカリ土類金属であ
る]のピリジン誘導体である。
【0016】ピリジン誘導体Lnの合成は、それ自体既
知の方法に従って行うことができる[例えばF.Voe
gtle and C.Ohm,Chem.Ber.1
17,849−854(1984);R.Singh
and G.Just,J.Org.Chem.54,
4453(1989)を参照]。
知の方法に従って行うことができる[例えばF.Voe
gtle and C.Ohm,Chem.Ber.1
17,849−854(1984);R.Singh
and G.Just,J.Org.Chem.54,
4453(1989)を参照]。
【0017】スペーサーはポリアルキルアミン、ポリエ
チレングリコール又はそれらの組み合わせである。
チレングリコール又はそれらの組み合わせである。
【0018】ポリアルキルアミンは次の一般式:
【0019】
【化5】 [式中、RはH、C1−C7−アルキル、アリール(例え
ばフェニル、ナフチル又はアントラニル)、ヒドロキシ
ル又はC1−C7−アルコキシであり、xは2−7の数で
あり、yは3−10の数であり、Rは上記で可能な変数
において異なっていることができ、すなわちRはスペー
サ xの場合も同様であり、すなわちxはスペーサー中の−
(CH2)x−単位の各繰り返しに関して同一である必要は
ない]を有する。
ばフェニル、ナフチル又はアントラニル)、ヒドロキシ
ル又はC1−C7−アルコキシであり、xは2−7の数で
あり、yは3−10の数であり、Rは上記で可能な変数
において異なっていることができ、すなわちRはスペー
サ xの場合も同様であり、すなわちxはスペーサー中の−
(CH2)x−単位の各繰り返しに関して同一である必要は
ない]を有する。
【0020】Rは互いに独立してH、C1−C4−アルキ
ル(例えばメチル、エチル、n−プロピル、i−プロピ
ル、n−ブチル、i−ブチル、tert−ブチル)であ
り、xは2、3、4又は5であり、yは3、4、5又は
6であることが好ましい。
ル(例えばメチル、エチル、n−プロピル、i−プロピ
ル、n−ブチル、i−ブチル、tert−ブチル)であ
り、xは2、3、4又は5であり、yは3、4、5又は
6であることが好ましい。
【0021】特に好ましいのは、式
【0022】
【化6】 のN−4,N−9−ジメチルスペルミン誘導体である。
【0023】ポリエチレングリコールは次の一般式、
【0024】
【化7】−O−[−(CH2)x−O−]y− [式中xは2、3、4又は5であり、yは3、4、5又
は6である]を有する。
は6である]を有する。
【0025】好ましいのはxが2、3、4又は5であ
り、yが3、4、5又は6のポリエチレングリコールで
ある。特に好ましいのはxが2であり、yが4、5又は
6のポリエチレングリコールである。
り、yが3、4、5又は6のポリエチレングリコールで
ある。特に好ましいのはxが2であり、yが4、5又は
6のポリエチレングリコールである。
【0026】アミン/グリコール構造が組み合わされた
スペーサー分子は次の一般式
スペーサー分子は次の一般式
【0027】
【化8】
【0028】[式中Z1、Z2及びZ3は互いに独立して
O又はNRであり、RはH、C1−C7−アルキル、アリ
ール(例えばフェニル、ナフチル又はアントラニル)、
ヒドロキシル又はC1−C7−アルコキシであり、xは2
−7の数であり、yは3−10の数である]を有する。
O又はNRであり、RはH、C1−C7−アルキル、アリ
ール(例えばフェニル、ナフチル又はアントラニル)、
ヒドロキシル又はC1−C7−アルコキシであり、xは2
−7の数であり、yは3−10の数である]を有する。
【0029】好ましいのはZ2がOであり、Z1及びZ3
がNRであり、RがH、C1−C4−アルキル(例えばメ
チル、エチル、n−プロピル、i−プロピル、n−ブチ
ル、i−ブチル、tert−ブチル)であり、xが2、
3、4又は5であり、yが3、4、5又は6であるスペ
ーサー構造である。
がNRであり、RがH、C1−C4−アルキル(例えばメ
チル、エチル、n−プロピル、i−プロピル、n−ブチ
ル、i−ブチル、tert−ブチル)であり、xが2、
3、4又は5であり、yが3、4、5又は6であるスペ
ーサー構造である。
【0030】特に好ましいのは、Z2がOであり、Z1及
びZ3がNRであり、RがH、メチル、エチルであり、
xが2であり、yが6である、構造である。
びZ3がNRであり、RがH、メチル、エチルであり、
xが2であり、yが6である、構造である。
【0031】光化学的結合可能な適した構造は特にフロ
クマリン、例えばアンゲリシン(イソプソラレン)又は
プソラレン及びそれらの誘導体であり、これらは核酸と
光化学的に反応する。
クマリン、例えばアンゲリシン(イソプソラレン)又は
プソラレン及びそれらの誘導体であり、これらは核酸と
光化学的に反応する。
【0032】アンゲリシン誘導体は次の一般式
【0033】
【化9】
【0034】[式中R1、R2及びR3は互いに独立して
H又はC1−C7−アルキルであり、R4はH、C1−C7
−アルキル又はヒドロキシルを有する低級アルキル、C
1−C7−アルコキシ、アミノ、ハロあるいはN−フタル
イミド置換基である]を有する。
H又はC1−C7−アルキルであり、R4はH、C1−C7
−アルキル又はヒドロキシルを有する低級アルキル、C
1−C7−アルコキシ、アミノ、ハロあるいはN−フタル
イミド置換基である]を有する。
【0035】特に好ましいのは以下のR1−R4の基を含
むアンゲリシン誘導体である。
むアンゲリシン誘導体である。
【0036】
【表1】
【0037】異なるRを有する他の化合物も文献から既
知の方法により合成することができる。
知の方法により合成することができる。
【0038】適したプソラレンは以下の一般式:
【0039】
【化10】
【0040】[式中R1、R3及びR6は互いに独立して
H又はC1−C7−アルキルであり、R4はH、C1−C7
−アルキル又はヒドロキシルを有するC1−C7−アルキ
ル、C1−C7−アルコキシ、アミノ、ハロあるいはN−
フタルイミド置換基であり、R2及びR5は互いに独立し
てH、ヒドロキシル、カルボキシル、カーボ−C1−C7
−アルコキシ又はC1−C7−アルコキシである]を有す
る。
H又はC1−C7−アルキルであり、R4はH、C1−C7
−アルキル又はヒドロキシルを有するC1−C7−アルキ
ル、C1−C7−アルコキシ、アミノ、ハロあるいはN−
フタルイミド置換基であり、R2及びR5は互いに独立し
てH、ヒドロキシル、カルボキシル、カーボ−C1−C7
−アルコキシ又はC1−C7−アルコキシである]を有す
る。
【0041】アンゲリシン誘導体の方がプソラレンと比
較して一付加生成の故に有利である。
較して一付加生成の故に有利である。
【0042】ランタニドイオンキレート試薬、スペーサ
ー及びフロクマリンの結合の順序は任意である。従って
中でも最初にキレート試薬LnをスペーサーSと結合
し、続いて生成物をフロクマリンFuと反応させること
ができる。逆にFu−Sを最初に構築し、その後Lnと
反応させることができる。
ー及びフロクマリンの結合の順序は任意である。従って
中でも最初にキレート試薬LnをスペーサーSと結合
し、続いて生成物をフロクマリンFuと反応させること
ができる。逆にFu−Sを最初に構築し、その後Lnと
反応させることができる。
【0043】部分の結合はそれ自体既知の方法で行う。
【0044】
【実施例】実施例1a) 2,6−ビス[N,N−ビス(t−ブトキシカルボニル
メチル)−アミノ−メチル]−4−(5−ヒドロキシ−
1−ペンチニル)ピリジン(1)の製造:
メチル)−アミノ−メチル]−4−(5−ヒドロキシ−
1−ペンチニル)ピリジン(1)の製造:
【0045】
【化11】
【0046】6g(10ミリモル)の2,6−ビス
[N,N−ビス(t−ブトキシカルボニルメチル)−ア
ミノ−メチル]−4−ブロモピリジン(Acta Ch
em.Scand.Ser.B 42,(1988)3
73にてH.Takalo,P.Pasanen an
d J.Kaukareにより記載の通りに製造)を蒸
留したばかりの15mlのテトラヒドロフラン及び15
mlのトリエチルアミンの混合物に溶解する。溶液を脱
ガスし、1g(12ミリモル)の5−ヒドロキシ−1−
ペンチンを導入する。280mg(0.4ミリモル)の
ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)ク
ロリド、840mg(3.2ミリモル)のトリフェニル
ホスフィン及び117mg(0.61ミリモル)のCu
(I)ヨーダイドの混合物を含む触媒を室温で撹拌しな
がら加える。7時間還流した後に、TLCにより反応が
完了する。室温に冷却し、続いて濾過した後、溶液を真
空中で濃縮し、シリカゲル上でクロマトグラフィー(溶
離剤:酢酸エチル、Rf=0.61)にかける。
[N,N−ビス(t−ブトキシカルボニルメチル)−ア
ミノ−メチル]−4−ブロモピリジン(Acta Ch
em.Scand.Ser.B 42,(1988)3
73にてH.Takalo,P.Pasanen an
d J.Kaukareにより記載の通りに製造)を蒸
留したばかりの15mlのテトラヒドロフラン及び15
mlのトリエチルアミンの混合物に溶解する。溶液を脱
ガスし、1g(12ミリモル)の5−ヒドロキシ−1−
ペンチンを導入する。280mg(0.4ミリモル)の
ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)ク
ロリド、840mg(3.2ミリモル)のトリフェニル
ホスフィン及び117mg(0.61ミリモル)のCu
(I)ヨーダイドの混合物を含む触媒を室温で撹拌しな
がら加える。7時間還流した後に、TLCにより反応が
完了する。室温に冷却し、続いて濾過した後、溶液を真
空中で濃縮し、シリカゲル上でクロマトグラフィー(溶
離剤:酢酸エチル、Rf=0.61)にかける。
【0047】4.6g(理論値の68%)の微黄色固
体、融点90℃が得られる。
体、融点90℃が得られる。
【0048】実施例1b) 2,6−ビス[N,N−ビス(t−ブトキシカルボニル
メチル)−アミノ−メチル]−4−(11−ヒドロキシ
−1−ウンデシニル)ピリジン(2)の製造:6g(1
0ミリモル)の2,6−ビス[N,N−ビス(t−ブト
キシカルボニルメチル)−アミノ−メチル]−4−ブロ
モピリジンを、実施例1a)と同様にPd触媒の作用下
で1.93g(12ミリモル)の1−ウンデシン−10
−オールと反応させる。シリカゲル上のクロマトグラフ
ィー(溶離剤:酢酸エチル、Rf=0.52)にかけた
後、7g(理論値の77%)の黄色固体、融点57−5
9℃が得られる。
メチル)−アミノ−メチル]−4−(11−ヒドロキシ
−1−ウンデシニル)ピリジン(2)の製造:6g(1
0ミリモル)の2,6−ビス[N,N−ビス(t−ブト
キシカルボニルメチル)−アミノ−メチル]−4−ブロ
モピリジンを、実施例1a)と同様にPd触媒の作用下
で1.93g(12ミリモル)の1−ウンデシン−10
−オールと反応させる。シリカゲル上のクロマトグラフ
ィー(溶離剤:酢酸エチル、Rf=0.52)にかけた
後、7g(理論値の77%)の黄色固体、融点57−5
9℃が得られる。
【0049】実施例2a) 2,6−ビス[N,N−ビス(t−ブトキシカルボニル
メチル)−アミノ−メチル]−4−(5−ヒドロキシペ
ンチル)ピリジン(3)の製造:
メチル)−アミノ−メチル]−4−(5−ヒドロキシペ
ンチル)ピリジン(3)の製造:
【0050】
【化12】
【0051】472mg(0.7ミリモル)の実施例1
に記載の化合物1を、20mlの無水エタノールに溶解
し、24mgの10%Pd/Cを加える。溶液を水素正
圧下の45−50℃にて激しく撹拌する。1時間以内に
反応が完了する(TLCにより)。冷却及び触媒の除去
後、溶液を真空中で濃縮し、残留物をシリカゲルのクロ
マトグラフィー(溶離剤:酢酸エチル、Rf=0.5
2)にかける。242mg(理論値の51%)の微黄色
油が得られる。
に記載の化合物1を、20mlの無水エタノールに溶解
し、24mgの10%Pd/Cを加える。溶液を水素正
圧下の45−50℃にて激しく撹拌する。1時間以内に
反応が完了する(TLCにより)。冷却及び触媒の除去
後、溶液を真空中で濃縮し、残留物をシリカゲルのクロ
マトグラフィー(溶離剤:酢酸エチル、Rf=0.5
2)にかける。242mg(理論値の51%)の微黄色
油が得られる。
【0052】同一の反応条件下で触媒としてPtO2を
用いると収率が向上する(理論値の56%)。
用いると収率が向上する(理論値の56%)。
【0053】実施例2b) 2,6−ビス[N,N−ビス(t−ブトキシカルボニル
メチル)−アミノ−メチル]−4−(11−ヒドロキシ
ウンデシル)ピリジン(4)の製造:1.0g(1.3
2ミリモル)の実施例1b)に記載の化合物2を実施例
2a)と同様にPtO2触媒(100mg)を用いて水
添する。シリカゲル上のクロマトグラフィー(溶離剤:
クロロホルム/エタノール15:1、Rf=0.4)に
かけた後、725mg(理論値の72%)の微黄色油が
得られる。
メチル)−アミノ−メチル]−4−(11−ヒドロキシ
ウンデシル)ピリジン(4)の製造:1.0g(1.3
2ミリモル)の実施例1b)に記載の化合物2を実施例
2a)と同様にPtO2触媒(100mg)を用いて水
添する。シリカゲル上のクロマトグラフィー(溶離剤:
クロロホルム/エタノール15:1、Rf=0.4)に
かけた後、725mg(理論値の72%)の微黄色油が
得られる。
【0054】実施例3 アミノ−PEG−アンゲリシン(5)の製造:
【0055】
【化13】
【0056】4.87g(20ミリモル)の4’−アミ
ノメチル−4,5’−ジメチルアンゲリシンを25mL
のDMFに溶解し、3.24g(20ml)のカルボニ
ルジイミダゾールと室温で反応させる。窒素下で6時間
撹拌した後、完全な反応(TLCにより)が観察され
た。溶液を40mlのDMF中の16.85g(60ミ
リモル)の1,17−ジアミノ−3,6,9,12,1
5−ペンタオキサヘプタデカンの溶液に80℃にてゆっ
くり滴下し、混合物を70℃でさらに12時間撹拌す
る。冷却後、溶液を真空中で濃縮し、シリカゲル上のク
ロマトグラフィー(溶離剤:クロロホルム/メタノール
/アンモニア90:10:1、Rf=0.28)にかけ
る。7.1g(理論値の65%)の微黄色油が得られ
る。
ノメチル−4,5’−ジメチルアンゲリシンを25mL
のDMFに溶解し、3.24g(20ml)のカルボニ
ルジイミダゾールと室温で反応させる。窒素下で6時間
撹拌した後、完全な反応(TLCにより)が観察され
た。溶液を40mlのDMF中の16.85g(60ミ
リモル)の1,17−ジアミノ−3,6,9,12,1
5−ペンタオキサヘプタデカンの溶液に80℃にてゆっ
くり滴下し、混合物を70℃でさらに12時間撹拌す
る。冷却後、溶液を真空中で濃縮し、シリカゲル上のク
ロマトグラフィー(溶離剤:クロロホルム/メタノール
/アンモニア90:10:1、Rf=0.28)にかけ
る。7.1g(理論値の65%)の微黄色油が得られ
る。
【0057】実施例4a) Ln−S−Fnエステル(6)の製造:
【0058】
【化14】
【0059】250mg(0.37ミリモル)の実施例
2a)に記載の化合物3を3mlの乾燥トルエンに溶解
する。65mg(0.4ミリモル)のカルボニルジイミ
ダゾールを加える。N2下の60℃にて17時間撹拌し
た後、3が完全に反応し(TLCにより、溶離剤:クロ
ロホルム/エタノール15:1、Rf=0.45)、新
しい生成物が形成される(溶離剤:上記参照、Rf=
0.63)。220mg(0.4ミリモル)の実施例3
に記載の化合物5を加え、反応混合物を90℃にてさら
に24時間撹拌する。冷却後、溶液を真空中で濃縮し、
残留物をシリカゲル上のクロマトグラフィー(溶離剤:
トルエン/エタノール5:1、Rf=0.36)にかけ
る。138mg(理論値の30%)の微黄色油を得る。
2a)に記載の化合物3を3mlの乾燥トルエンに溶解
する。65mg(0.4ミリモル)のカルボニルジイミ
ダゾールを加える。N2下の60℃にて17時間撹拌し
た後、3が完全に反応し(TLCにより、溶離剤:クロ
ロホルム/エタノール15:1、Rf=0.45)、新
しい生成物が形成される(溶離剤:上記参照、Rf=
0.63)。220mg(0.4ミリモル)の実施例3
に記載の化合物5を加え、反応混合物を90℃にてさら
に24時間撹拌する。冷却後、溶液を真空中で濃縮し、
残留物をシリカゲル上のクロマトグラフィー(溶離剤:
トルエン/エタノール5:1、Rf=0.36)にかけ
る。138mg(理論値の30%)の微黄色油を得る。
【0060】実施例4b) Ln−S−Fnエステル(7)の製造 410mg(0.54ミリモル)の実施例2b)に記載
の化合物4をカルボニルジイミダゾールで活性化し、続
いて実施例4a)に記載のように実施例3)に記載のア
ミノ−PEG−アンゲリシン5と反応させる。シリカゲ
ル上のクロマトグラフィー(溶離剤:トルエン/エタノ
ール5:1、Rf=0.31)の後、188mg(理論
値の26%)の黄色油を得る。
の化合物4をカルボニルジイミダゾールで活性化し、続
いて実施例4a)に記載のように実施例3)に記載のア
ミノ−PEG−アンゲリシン5と反応させる。シリカゲ
ル上のクロマトグラフィー(溶離剤:トルエン/エタノ
ール5:1、Rf=0.31)の後、188mg(理論
値の26%)の黄色油を得る。
【0061】実施例5a) Ln−S−Fn−テトラカルボン酸(8)の製造:
【0062】
【化15】
【0063】138mg(0.11ミリモル)の実施例
4a)に記載のテトラエステル6を4mlの乾燥ベンゼ
ンに溶解し、569mg(5ミリモル)の三フッ化酢酸
をN2下で加える。60℃で2時間撹拌した後、生成物
がベンゼンから油として分離する。TLCにより反応は
完了する。冷却後、溶液を真空中で濃縮する。残留物を
5mlの蒸留水に溶解し、3mlのジエチルエーテルと
共に2回振ることにより抽出する。水相を濃縮し、RP
18上のクロマトグラフィー(溶離剤:メタノール、R
f=0.13)にかける。70mg(理論値の62%)
の乳白色の粘性油が得られる。
4a)に記載のテトラエステル6を4mlの乾燥ベンゼ
ンに溶解し、569mg(5ミリモル)の三フッ化酢酸
をN2下で加える。60℃で2時間撹拌した後、生成物
がベンゼンから油として分離する。TLCにより反応は
完了する。冷却後、溶液を真空中で濃縮する。残留物を
5mlの蒸留水に溶解し、3mlのジエチルエーテルと
共に2回振ることにより抽出する。水相を濃縮し、RP
18上のクロマトグラフィー(溶離剤:メタノール、R
f=0.13)にかける。70mg(理論値の62%)
の乳白色の粘性油が得られる。
【0064】実施例5b) Ln−S−Fn四酸(9)の製造:45mg(0.03
4ミリモル)の実施例4b)に記載のテトラエステル9
を実施例5a)と同様にして三フッ化酢酸と反応させ
る。30mg(理論値の81%)の粘性油が得られる。
4ミリモル)の実施例4b)に記載のテトラエステル9
を実施例5a)と同様にして三フッ化酢酸と反応させ
る。30mg(理論値の81%)の粘性油が得られる。
【0065】実施例6 N1−(アンゲリシンアミノ)−N4,N9−ジメチルスペ
ルミン(10)の製造:
ルミン(10)の製造:
【0066】
【化16】
【0067】4.87g(20ミリモル)の4’−アミ
ノメチル−4,5’−ジメチルアンゲリシンを実施例1
と同様にカルボニルジイミダゾールで活性化する。得ら
れた溶液を、実施例1と同様にして40mlのDMF中
の13.8g(60ミリモル)のN4,N9−ジメチルス
ペルミンの溶液に滴下する。冷却後、溶液を真空中で濃
縮し、残留物をシリカゲル上のクロマトグラフィー(溶
離剤:クロロホルム/メタノール/アンモニア30:
5:1、Rf=0.11)にかける。7.1g(理論値
の71%)の黄色油が得られる。
ノメチル−4,5’−ジメチルアンゲリシンを実施例1
と同様にカルボニルジイミダゾールで活性化する。得ら
れた溶液を、実施例1と同様にして40mlのDMF中
の13.8g(60ミリモル)のN4,N9−ジメチルス
ペルミンの溶液に滴下する。冷却後、溶液を真空中で濃
縮し、残留物をシリカゲル上のクロマトグラフィー(溶
離剤:クロロホルム/メタノール/アンモニア30:
5:1、Rf=0.11)にかける。7.1g(理論値
の71%)の黄色油が得られる。
【0068】実施例7 Ln−S−Fn−エステル(11)の製造:
【0069】
【化17】
【0070】318mg(0.5ミリモル)の実施例2
b)に記載の化合物4をカルボニルジイミダゾールで活
性化し、続いて実施例4と同様にして実施例6に記載の
アミノ化合物10と反応させる。シリカゲル上のクロマ
トグラフィー(溶離剤:クロロホルム/メタノールメア
ンモニア70:45:1、Rf=0.42)の後、13
2mg(理論値の21%)の黄色油が得られる。
b)に記載の化合物4をカルボニルジイミダゾールで活
性化し、続いて実施例4と同様にして実施例6に記載の
アミノ化合物10と反応させる。シリカゲル上のクロマ
トグラフィー(溶離剤:クロロホルム/メタノールメア
ンモニア70:45:1、Rf=0.42)の後、13
2mg(理論値の21%)の黄色油が得られる。
【0071】実施例8 Ln−S−Fn四酸(12)の製造:(EuPA) 30mg(0.023ミリモル)の実施例7に記載のテ
トラエステル11を実施例5と同様にして三フッ化酢酸
と反応させる。22mg(理論値の92%)の黄色油が
得られる。
トラエステル11を実施例5と同様にして三フッ化酢酸
と反応させる。22mg(理論値の92%)の黄色油が
得られる。
【0072】実施例9 ヘアピンオリゴヌクレオチドとEuPA(12)の光化
学的反応 50μgのヘアピンオリゴヌクレオチドを100μlの
トリス−HCl緩衝液に取り上げる。溶液を50℃の水
浴中に15分間放置する。ゆっくり室温に冷却するため
に試料を水浴から取り出す。続いてさらに400μlの
水を加える。
学的反応 50μgのヘアピンオリゴヌクレオチドを100μlの
トリス−HCl緩衝液に取り上げる。溶液を50℃の水
浴中に15分間放置する。ゆっくり室温に冷却するため
に試料を水浴から取り出す。続いてさらに400μlの
水を加える。
【0073】光反応のために、15μgのハイブリッド
形成したヘアピンオリゴヌクレオチドに20倍モル過剰
のEuPAを加える。続いて氷浴中のEppendor
f管にて312nm又は366nmのUVランプ下で溶
液を照明する。光反応の後にHPLCを行う。15分以
内に反応が完了した。
形成したヘアピンオリゴヌクレオチドに20倍モル過剰
のEuPAを加える。続いて氷浴中のEppendor
f管にて312nm又は366nmのUVランプ下で溶
液を照明する。光反応の後にHPLCを行う。15分以
内に反応が完了した。
【0074】実施例10 EuPA(12)を用いた光化学的標識 光化学的標識のために、50μlの1Mナトリウムテト
ラボレート緩衝液pH8.3及び50μlのEuPA
(2μg/μl)を、20μlのTE緩衝液中の2−5
μgのDNAに加え、2回蒸留H2Oで500μlとし
た。その後混合物を312nmにてUVトランスイルミ
ネーター(trans−illuminator)で1
0分間照射し、この過程の間試料を氷上に保った。
ラボレート緩衝液pH8.3及び50μlのEuPA
(2μg/μl)を、20μlのTE緩衝液中の2−5
μgのDNAに加え、2回蒸留H2Oで500μlとし
た。その後混合物を312nmにてUVトランスイルミ
ネーター(trans−illuminator)で1
0分間照射し、この過程の間試料を氷上に保った。
【0075】続いて光化学的標識DNAを、1/10体
積の3M酢酸ナトリウムpH5.8及び1体積のイソプ
ロパノールを用いて室温にて沈澱させ、5分間放置し
た。その後DNAをEppendorf遠心機中で1
0,000rpmにて遠心し、上澄み液をデカンテーシ
ョンし、DNA沈澱を70%のエタノールで洗浄した。
試料が乾燥した後、光化学的標識DNAをTE中に取り
上げた。その後EuPAを用いたDNAの光化学的標識
を、アガロースゲル電気泳動及びミクロタイター(mi
crotitre)試験により調べた。
積の3M酢酸ナトリウムpH5.8及び1体積のイソプ
ロパノールを用いて室温にて沈澱させ、5分間放置し
た。その後DNAをEppendorf遠心機中で1
0,000rpmにて遠心し、上澄み液をデカンテーシ
ョンし、DNA沈澱を70%のエタノールで洗浄した。
試料が乾燥した後、光化学的標識DNAをTE中に取り
上げた。その後EuPAを用いたDNAの光化学的標識
を、アガロースゲル電気泳動及びミクロタイター(mi
crotitre)試験により調べた。
【0076】実施例11 ミクロタイター試験におけるEuPA標識の検出 2本鎖DNAのEuPA標識を検出するために、標識後
のDNAを1:2の希釈段階の250ngから125p
gの濃度でミクロタイター試験プレートにピペットで入
れた。ミクロタイターウェル中のポリスチレン基に結合
させるために、DNAを最初にウェル中でPBSM緩衝
液(0.1MのMgCl2、0.15MのNaCl、3
MのKClを含む10mMのリン酸ナトリウムpH7.
2)により希釈し、室温で終夜培養した。その後200
μlのPBSM緩衝液で2回洗浄し、UVトランスイル
ミネーターを用いて312nmにて10分間照射するこ
とによりDNAをウェルに固定した。このようにして固
定したDNAをその後Delfia/Pharmaci
aからの洗浄用濃度の緩衝液で4回洗浄し、ユーロピウ
ムを負荷された過剰のEuPAを除去した。負の標準と
して非標識2本鎖DNAを同様の方法で処理した。
のDNAを1:2の希釈段階の250ngから125p
gの濃度でミクロタイター試験プレートにピペットで入
れた。ミクロタイターウェル中のポリスチレン基に結合
させるために、DNAを最初にウェル中でPBSM緩衝
液(0.1MのMgCl2、0.15MのNaCl、3
MのKClを含む10mMのリン酸ナトリウムpH7.
2)により希釈し、室温で終夜培養した。その後200
μlのPBSM緩衝液で2回洗浄し、UVトランスイル
ミネーターを用いて312nmにて10分間照射するこ
とによりDNAをウェルに固定した。このようにして固
定したDNAをその後Delfia/Pharmaci
aからの洗浄用濃度の緩衝液で4回洗浄し、ユーロピウ
ムを負荷された過剰のEuPAを除去した。負の標準と
して非標識2本鎖DNAを同様の方法で処理した。
【0077】100μlのWallac/Pharma
ciaからの強調溶液(enhancement so
lution)を加えた後、室温にて30分後、Wal
lac/PharmaciaからのDELFIA 12
32蛍光光度計で290−360nm励起/615nm
発光にてユーロピウムの時間分解蛍光を測定した。DN
Aの希釈に依存して212,000−1,700の蛍光
シグナルが標識DNAにおいて測定された。非標識DN
Aは低いバックグラウンドシグナルのみを与えた。
ciaからの強調溶液(enhancement so
lution)を加えた後、室温にて30分後、Wal
lac/PharmaciaからのDELFIA 12
32蛍光光度計で290−360nm励起/615nm
発光にてユーロピウムの時間分解蛍光を測定した。DN
Aの希釈に依存して212,000−1,700の蛍光
シグナルが標識DNAにおいて測定された。非標識DN
Aは低いバックグラウンドシグナルのみを与えた。
【0078】実施例12 逆相試験におけるEuPA−標識ゲノムDNAのハイブ
リッド形成 EuPA−標識DNAの製造を実施例10に記載の方法
に従って行った。
リッド形成 EuPA−標識DNAの製造を実施例10に記載の方法
に従って行った。
【0079】40−68℃の培養温度で従来の方法によ
りハイブリッド形成を行った。ハイブリッド形成温度に
依存して異なる物質を加えた。長い遺伝子プローブの場
合、ハイブリッド形成の速度と量を増すためにデキスト
ランサルフェート又は他のポリマーを用いた。乾燥乳
(dried milk)、デンハート溶液、ヘパリン
又はSDSなどの界面活性剤及び阻害剤を用いて膜への
DNAの非特異的結合を抑制した。ウレア又はホルムア
ルデヒドなどの変性剤を用いてハイブリッドの融解温度
を下げ、低いハイブリッド形成温度を用いることができ
る。さらに点染上における非−相同DNAへのプローブ
の非特異的結合を、異種DNAを加えることにより減少
させることができる。
りハイブリッド形成を行った。ハイブリッド形成温度に
依存して異なる物質を加えた。長い遺伝子プローブの場
合、ハイブリッド形成の速度と量を増すためにデキスト
ランサルフェート又は他のポリマーを用いた。乾燥乳
(dried milk)、デンハート溶液、ヘパリン
又はSDSなどの界面活性剤及び阻害剤を用いて膜への
DNAの非特異的結合を抑制した。ウレア又はホルムア
ルデヒドなどの変性剤を用いてハイブリッドの融解温度
を下げ、低いハイブリッド形成温度を用いることができ
る。さらに点染上における非−相同DNAへのプローブ
の非特異的結合を、異種DNAを加えることにより減少
させることができる。
【0080】ハイブリッド形成の準備のために、100
ngの非標識大腸菌(E.coli)−特異的遺伝子プ
ローブ(1.7kb−6kb)を最初に100℃にて5
分間変性し、0℃に冷却し、その後Schleiche
r and SchuellからのMinifold−
II濾過装置を用いて前処理ニトロセルロース又はナイ
ロン膜に移し、80℃で2時間固定した。
ngの非標識大腸菌(E.coli)−特異的遺伝子プ
ローブ(1.7kb−6kb)を最初に100℃にて5
分間変性し、0℃に冷却し、その後Schleiche
r and SchuellからのMinifold−
II濾過装置を用いて前処理ニトロセルロース又はナイ
ロン膜に移し、80℃で2時間固定した。
【0081】フィルターを、密封プラスチックフィルム
の袋又はプラスチックの箱の中で、フィルター100c
m2当たり少なくとも20mlのハイブリッド形成溶液
を用い、68℃にて少なくとも1時間ハイブリッド形成
した。
の袋又はプラスチックの箱の中で、フィルター100c
m2当たり少なくとも20mlのハイブリッド形成溶液
を用い、68℃にて少なくとも1時間ハイブリッド形成
した。
【0082】溶液を、大腸菌(1μl)からの変性した
ばかりの(100℃、5分間)EuPA−標識ゲノムD
NAを加えた、100cm2のフィルターの2.5ml
のハイブリッド形成溶液で置換した。フィルターをゆっ
くり振りながら68℃で少なくとも6時間培養した。
ばかりの(100℃、5分間)EuPA−標識ゲノムD
NAを加えた、100cm2のフィルターの2.5ml
のハイブリッド形成溶液で置換した。フィルターをゆっ
くり振りながら68℃で少なくとも6時間培養した。
【0083】その後フィルターをフィルター100cm
2当たり少なくとも50mlの2xSSC、0.1%の
SDSを用いて室温で2x5分間、及び0.1xSS
C、0.1%SDSを用いて68℃で2x15分間洗浄
した。
2当たり少なくとも50mlの2xSSC、0.1%の
SDSを用いて室温で2x5分間、及び0.1xSS
C、0.1%SDSを用いて68℃で2x15分間洗浄
した。
【0084】その後ハイブリッド形成DNAの検出にフ
ィルターを直接用いた。すでにユーロピウムを負荷した
EuPA−DNAを用いたか、又は後にユーロピウムを
負荷したEuPA−DNAを用いたかにより、蛍光の読
み取りのためのフィルターの仕上げにおいてさらに以下
の段階を行った。ユーロピウムを負荷していないEuP
A−標識ゲノムDNAの場合、フィルターを、合計体積
2ml中の100μMのEuCl、100μMのEDT
A及び1xSSC pH7.0で室温にて2時間処理し
た。その後フィルターを2xSSCで6回洗浄した。続
いてハイブリッド形成点染の各溝(slot)を切断
し、1.5mlの反応管中で1mlの強調溶液で処理し
た。室温で30分間培養した後、各溝からの200μl
の試料をミクロタイタープレート中にピペットで入れ、
Wallac/PharmaciaからのDELFIA
1232蛍光光度計で290−360nm励起及び6
15発光にて試料を測定した。
ィルターを直接用いた。すでにユーロピウムを負荷した
EuPA−DNAを用いたか、又は後にユーロピウムを
負荷したEuPA−DNAを用いたかにより、蛍光の読
み取りのためのフィルターの仕上げにおいてさらに以下
の段階を行った。ユーロピウムを負荷していないEuP
A−標識ゲノムDNAの場合、フィルターを、合計体積
2ml中の100μMのEuCl、100μMのEDT
A及び1xSSC pH7.0で室温にて2時間処理し
た。その後フィルターを2xSSCで6回洗浄した。続
いてハイブリッド形成点染の各溝(slot)を切断
し、1.5mlの反応管中で1mlの強調溶液で処理し
た。室温で30分間培養した後、各溝からの200μl
の試料をミクロタイタープレート中にピペットで入れ、
Wallac/PharmaciaからのDELFIA
1232蛍光光度計で290−360nm励起及び6
15発光にて試料を測定した。
【0085】標識の前にユーロピウムを負荷したEuP
A−標識を用いた溝点染の場合、各溝をハイブリッド形
成の直後に切断し、それに1.5mlの反応管中で1m
lの強調溶液を加え、その後上記の通りに強調溶液を加
え、蛍光光度計で測定を行った。
A−標識を用いた溝点染の場合、各溝をハイブリッド形
成の直後に切断し、それに1.5mlの反応管中で1m
lの強調溶液を加え、その後上記の通りに強調溶液を加
え、蛍光光度計で測定を行った。
【0086】溶液: 20xSSC: 3MのNaCl、0.3Mのク
エン酸Na、pH7.0 ハイブリッド形成溶液:5xSSC;0.1%のN−ラ
ウロイルサルコシン、Na塩、0.02%のSDS;
0.5%の阻害剤(Boehringer)、50−7
0℃で溶液を溶解実施例13 EuPA−標識遺伝子プローブを用いたハイブリッド形
成 実施例10に記載の方法に従い、EuPA−標識遺伝子
プローブ(1.7−6kb)の製造を行った。
エン酸Na、pH7.0 ハイブリッド形成溶液:5xSSC;0.1%のN−ラ
ウロイルサルコシン、Na塩、0.02%のSDS;
0.5%の阻害剤(Boehringer)、50−7
0℃で溶液を溶解実施例13 EuPA−標識遺伝子プローブを用いたハイブリッド形
成 実施例10に記載の方法に従い、EuPA−標識遺伝子
プローブ(1.7−6kb)の製造を行った。
【0087】EuPA−標識遺伝子プローブは、固−相
又は液体ハイブリッド形成において用いることができ
る。適した固相は、例えばニトロセルロース膜、ナイロ
ン膜、ミクロタイタープレートのポリスチレン基、ある
いは磁気粒子である。遺伝子プローブの、相補的ゲノム
DNAとの蛍光ハイブリッド形成複合体は、ヒドロキシ
アパタイトを用いて遊離の蛍光遺伝子プローブから分離
することができる。
又は液体ハイブリッド形成において用いることができ
る。適した固相は、例えばニトロセルロース膜、ナイロ
ン膜、ミクロタイタープレートのポリスチレン基、ある
いは磁気粒子である。遺伝子プローブの、相補的ゲノム
DNAとの蛍光ハイブリッド形成複合体は、ヒドロキシ
アパタイトを用いて遊離の蛍光遺伝子プローブから分離
することができる。
【0088】例えば溝−点染ハイブリッド形成を、Eu
PA−標識大腸菌−特異的遺伝子プローブ(1.7kb
−0.6kb)及び大腸菌からのゲノムDNAを用いて
行った。
PA−標識大腸菌−特異的遺伝子プローブ(1.7kb
−0.6kb)及び大腸菌からのゲノムDNAを用いて
行った。
【0089】この目的のために、ゲノム大腸菌DNAを
100℃で5分間変性し、その後0℃に冷却し、Sch
leicher and SchuellからのMin
ifold−II濾過装置を用い、1:2の希釈段階に
おける500ngから125pgの濃度でニトロセルロ
ース又はナイロン膜に移した。予備ハイブリッド形成及
びハイブリッド形成を実施例12に記載の通りに行っ
た。100ngのEuPA−標識大腸菌遺伝子プローブ
を用いた。
100℃で5分間変性し、その後0℃に冷却し、Sch
leicher and SchuellからのMin
ifold−II濾過装置を用い、1:2の希釈段階に
おける500ngから125pgの濃度でニトロセルロ
ース又はナイロン膜に移した。予備ハイブリッド形成及
びハイブリッド形成を実施例12に記載の通りに行っ
た。100ngのEuPA−標識大腸菌遺伝子プローブ
を用いた。
【0090】強調溶液で処理した後、切り出したフィル
ター溝をWallac/PharmaciaからのDE
LFIA 1232蛍光光度計にてそれぞれ測定するこ
とにより、読み取りを行った。
ター溝をWallac/PharmaciaからのDE
LFIA 1232蛍光光度計にてそれぞれ測定するこ
とにより、読み取りを行った。
【0091】遺伝子プローブを用い、大腸菌からの12
5ngのゲノムDNAでも検出可能であった。これは、
純粋なpBR322プラスミドプローブのpBR322
DNAへのハイブリッド形成において測定される0.1
pgのDNAの試験感度に相当する。
5ngのゲノムDNAでも検出可能であった。これは、
純粋なpBR322プラスミドプローブのpBR322
DNAへのハイブリッド形成において測定される0.1
pgのDNAの試験感度に相当する。
【0092】別法として、ミクロタイターハイブリッド
形成試験を行った。この目的の場合、ゲノム大腸菌DN
Aを上記のように変性し、その後10ngから45pg
の希釈試料をミクロタイターウェルにピペットで入れ、
室温にて終夜放置した。その後200μlのPBSM緩
衝液を用いて2回洗浄し、DNAをUVトランスイルミ
ネーターを用いて312nmにて10分間固定した。1
0ngのEuPA−標識遺伝子プローブを含む200μ
lのハイブリッド形成溶液(実施例12)を加え、ハイ
ブリッド形成混合物を68℃で少なくとも6時間培養し
た。続いてミクロタイターウェルを2x200μlの2
xSSC、0.1SDSを用いて室温で2x5分間、2
x200μlの0.1xSSC、0.1%SDSを用い
て50℃で2x15分間洗浄した。
形成試験を行った。この目的の場合、ゲノム大腸菌DN
Aを上記のように変性し、その後10ngから45pg
の希釈試料をミクロタイターウェルにピペットで入れ、
室温にて終夜放置した。その後200μlのPBSM緩
衝液を用いて2回洗浄し、DNAをUVトランスイルミ
ネーターを用いて312nmにて10分間固定した。1
0ngのEuPA−標識遺伝子プローブを含む200μ
lのハイブリッド形成溶液(実施例12)を加え、ハイ
ブリッド形成混合物を68℃で少なくとも6時間培養し
た。続いてミクロタイターウェルを2x200μlの2
xSSC、0.1SDSを用いて室温で2x5分間、2
x200μlの0.1xSSC、0.1%SDSを用い
て50℃で2x15分間洗浄した。
【0093】ウェルを100μlの強調溶液で処理した
後Wallac/PharmaciaからのDELFI
A 1232蛍光光度計で、実施例12と同様に読み取
りを行った。
後Wallac/PharmaciaからのDELFI
A 1232蛍光光度計で、実施例12と同様に読み取
りを行った。
【0094】本発明の主たる特徴及び態様は以下の通り
である。
である。
【0095】1.一般式
【0096】
【化18】Ln−S−Fu [式中、Lnはランタニドイオン−キレート構造であ
り、Sはスペーサー分子であり、Fuはフロクマリン誘
導体である]の標識用試薬。
り、Sはスペーサー分子であり、Fuはフロクマリン誘
導体である]の標識用試薬。
【0097】2.ランタニドイオン−キレート構造(L
n)が式
n)が式
【0098】
【化19】
【0099】[式中、Xは場合により複素原子基を含む
C5−C14−アリーレン、又は複素原子基[N、O、S
(1x、1個以上)を含むC1−C24−アルキレンであ
り、Y及び場合によりX+YはN−オキシスクシンイミ
ド、N−マレイミド、NH2、OH、COCH2−ハロゲ
ン、ハロゲン、NCO、NCS、CHO、COOH、S
H、CO−ハロゲン、COOCOR1、CH=CHCO2
R1、
C5−C14−アリーレン、又は複素原子基[N、O、S
(1x、1個以上)を含むC1−C24−アルキレンであ
り、Y及び場合によりX+YはN−オキシスクシンイミ
ド、N−マレイミド、NH2、OH、COCH2−ハロゲ
ン、ハロゲン、NCO、NCS、CHO、COOH、S
H、CO−ハロゲン、COOCOR1、CH=CHCO2
R1、
【0100】
【化20】
【0101】であり、ここでR1は水素、場合によりフ
ェニル基により置換されていてもよい飽和又は不飽和C
1−C20−アルキル基、又はフェニル基であり、Rは他
から独立して各場合に水素、アンモニウム又は当量のア
ルカリ金属あるいは1/2当量のアルカリ土類金属であ
る]のピリジン誘導体である上記1項記載の標識用試
薬。
ェニル基により置換されていてもよい飽和又は不飽和C
1−C20−アルキル基、又はフェニル基であり、Rは他
から独立して各場合に水素、アンモニウム又は当量のア
ルカリ金属あるいは1/2当量のアルカリ土類金属であ
る]のピリジン誘導体である上記1項記載の標識用試
薬。
【0102】3.スペーサーがポリアルキルアミン、ポ
リエチレングリコール又はこれらの組み合わせである上
記1項記載の標識用試薬。
リエチレングリコール又はこれらの組み合わせである上
記1項記載の標識用試薬。
【0103】4.Fuが次の一般式:
【0104】
【化21】
【0105】[式中、R1、R2及びR3は互いに独立し
てH又はC1−C7−アルキルであり、R4はH、C1−C
7−アルキル又はヒドロキシルを有する低級アルキル、
C1−C7−アルコキシ、アミノ、ハロ又はN−フタルイ
ミド置換基である]のアンゲリシン誘導体である上記1
項記載の標識用試薬。
てH又はC1−C7−アルキルであり、R4はH、C1−C
7−アルキル又はヒドロキシルを有する低級アルキル、
C1−C7−アルコキシ、アミノ、ハロ又はN−フタルイ
ミド置換基である]のアンゲリシン誘導体である上記1
項記載の標識用試薬。
【0106】5.Fuが次の一般式:
【0107】
【化22】
【0108】[式中、R1、R3及びR6は互いに独立し
てH又はC1−C7−アルキルであり、R4はH、C1−C
7−アルキル又はヒドロキシルを有するC1−C7−アル
キル、C1−C7−アルコキシ、アミノ、ハロ又はN−フ
タルイミド置換基であり、R2及びR5は互いに独立して
H、ヒドロキシル、カルボキシル、カーボ−C1−C7−
アルコキシ又はC1−C7−アルコキシである]のプロソ
ラレンである上記1項記載の標識用試薬。
てH又はC1−C7−アルキルであり、R4はH、C1−C
7−アルキル又はヒドロキシルを有するC1−C7−アル
キル、C1−C7−アルコキシ、アミノ、ハロ又はN−フ
タルイミド置換基であり、R2及びR5は互いに独立して
H、ヒドロキシル、カルボキシル、カーボ−C1−C7−
アルコキシ又はC1−C7−アルコキシである]のプロソ
ラレンである上記1項記載の標識用試薬。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ボルフガング・シユプリンガー ドイツ連邦共和国デー5600ブツペルタール 1・カテルンベルガーシユルベーク31 (72)発明者 ヘルベルト・フクル ドイツ連邦共和国デー5060ベルギッシユグ ラートバツハ2・ゲマルケンベーク9 (72)発明者 ユルゲン・ケヒヤー ドイツ連邦共和国デー4018ランゲンフエル ト・ザイデンベバーシユトラーセ5
Claims (1)
- 【請求項1】 一般式 【化1】Ln−S−Fu [式中、Lnはランタニドイオン−キレート構造であ
り、Sはスペーサー分子であり、Fuはフロクマリン誘
導体である]の標識用試薬。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4222255.9 | 1992-07-07 | ||
DE19924222255 DE4222255A1 (de) | 1992-07-07 | 1992-07-07 | Fotochemische Markierung von Nukleinsäuren mit Europiumchelat-Reagenzien und ihre Verwendung in Gensondentestsystemen |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0694720A true JPH0694720A (ja) | 1994-04-08 |
Family
ID=6462656
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP17848693A Pending JPH0694720A (ja) | 1992-07-07 | 1993-06-28 | ユーロピウムキレート試薬を用いた核酸の光化学的標識及び遺伝子プローブ試験系におけるその使用 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0578067A1 (ja) |
JP (1) | JPH0694720A (ja) |
CA (1) | CA2099542A1 (ja) |
DE (1) | DE4222255A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09268751A (ja) * | 1996-03-29 | 1997-10-14 | Daiken:Kk | 天井点検口用蓋体の取付構造 |
JP2003523312A (ja) * | 1999-02-18 | 2003-08-05 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 発光マーカーとして使用するためのフタルアミド−ランタニド錯体 |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7745142B2 (en) | 1997-09-15 | 2010-06-29 | Molecular Devices Corporation | Molecular modification assays |
US6297018B1 (en) | 1998-04-17 | 2001-10-02 | Ljl Biosystems, Inc. | Methods and apparatus for detecting nucleic acid polymorphisms |
ATE272049T1 (de) | 1999-02-18 | 2004-08-15 | Univ California | Salicylamid-lanthanid komplexe zur verwendung als lumineszenzmarker |
DE60141871D1 (de) | 2000-05-05 | 2010-06-02 | Wallac Oy | Oligonukleotidmarkierungsstoffe und ihre Verwendung |
DE602004016390D1 (en) | 2003-12-30 | 2008-10-16 | Univ California Office Of The | Aromatische triamid-lanthanid-komplexe |
CA2659251C (en) | 2006-07-10 | 2016-06-14 | The Regents Of The University Of California | Luminescent 1-hydroxy-2-pyridinone chelates of lanthanides |
AU2007321881B2 (en) | 2006-08-15 | 2012-11-01 | The Regents Of The University Of California | Luminescent macrocyclic lanthanide complexes |
US8507199B2 (en) | 2007-01-25 | 2013-08-13 | Lumiphore, Inc. | Multi-color time resolved fluorophores based on macrocyclic lanthanide complexes |
EP2470513B1 (en) | 2009-08-24 | 2014-10-08 | Lumiphore, Inc. | Macrocyclic hopo chelators |
DE102011001368B4 (de) | 2011-03-17 | 2013-01-31 | Bundesanstalt für Materialforschung und -Prüfung (BAM) | Lanthanoid-Chelate enthaltende Partikel, deren Herstellung sowie deren Verwendung in der Bioanalytik |
US11453652B2 (en) | 2013-03-15 | 2022-09-27 | Lumiphore, Inc. | Di-macrocycles |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0187332B1 (en) * | 1985-01-10 | 1989-02-01 | Molecular Diagnostics, Inc. | Photochemical method of labelling nucleic acids for detection in hybridization assays |
SE8502573D0 (sv) * | 1985-05-23 | 1985-05-23 | Jouko Kanakre | Fluorescent lanthanide chelates useful as labels of physiologically active materials |
-
1992
- 1992-07-07 DE DE19924222255 patent/DE4222255A1/de not_active Withdrawn
-
1993
- 1993-06-24 EP EP93110109A patent/EP0578067A1/de not_active Withdrawn
- 1993-06-28 JP JP17848693A patent/JPH0694720A/ja active Pending
- 1993-07-02 CA CA 2099542 patent/CA2099542A1/en not_active Abandoned
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09268751A (ja) * | 1996-03-29 | 1997-10-14 | Daiken:Kk | 天井点検口用蓋体の取付構造 |
JP2003523312A (ja) * | 1999-02-18 | 2003-08-05 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 発光マーカーとして使用するためのフタルアミド−ランタニド錯体 |
JP4819223B2 (ja) * | 1999-02-18 | 2011-11-24 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 発光マーカーとして使用するためのフタルアミド−ランタニド錯体 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE4222255A1 (de) | 1994-01-13 |
CA2099542A1 (en) | 1994-01-08 |
EP0578067A1 (de) | 1994-01-12 |
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