JP3253181B2 - ジゴキシゲニン試薬を用いた核酸の光化学的標識 - Google Patents
ジゴキシゲニン試薬を用いた核酸の光化学的標識Info
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Description
【０００１】遺伝子プローブ診断法は、ＤＮＡ／ＲＮＡ
配列の配列特異的検出方法である。これは、検出するべ
きＤＮＡ／ＲＮＡの相補的配列領域を有する遺伝子プロ
ーブ配列のハイブリッド形成に基づいている（Ｊ．Ａ．
Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ，Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６９，１−
２５(１９８８)；Ｕ．Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｒ．Ｋａｉ
ｓｅｒ，Ｃ．Ｔ．Ｃａｓｋｅｙ，Ｌ．Ｈｏｏｄ，Ｓｃｉ
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配列の配列特異的検出方法である。これは、検出するべ
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２５(１９８８)；Ｕ．Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｒ．Ｋａｉ
ｓｅｒ，Ｃ．Ｔ．Ｃａｓｋｅｙ，Ｌ．Ｈｏｏｄ，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２４２，２２９(１９８８)）。
【０００２】遺伝子プローブ診断学により、感染症及び
遺伝的欠陥の検出が可能になる。遺伝子プローブ診断学
を広く適用するための前提条件は、検出の適した感度、
実行の単純さ及び放射性の回避である。
遺伝的欠陥の検出が可能になる。遺伝子プローブ診断学
を広く適用するための前提条件は、検出の適した感度、
実行の単純さ及び放射性の回避である。
【０００３】遺伝子プローブ診断法の１つの変法は、検
出するべきＤＮＡ／ＲＮＡの直接光化学的標識を用いて
行われ、その後相補的核酸配列を有する遺伝子プローブ
へのハイブリッド形成が起こる（Ｎ．Ｄａｔｔａｇｕｐ
ｔａ，Ｐ．Ｍ．Ｍ．Ｒａｅ，Ｅ．Ｄ．Ｈｕｇｕｅｎｅ
ｌ，Ｅ．Ｃａｒｌｓｏｎ，Ａ．Ｌｙｇａ，Ｊ．Ｓ．Ｓｈ
ａｐｉｒｏ，Ｊ．Ｐ．Ａｌｂａｒｅｌｌａ，Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７７，８５
（１９８９）；Ｊ．Ｐ．Ａｌｂａｒｅｌｌａ，Ｒ．Ｌ．
Ｍｉｎｅｇａｒ，Ｗ．Ｌ．Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｄ
ａｔｔａｇｐｔａ，Ｅ．Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７，４２９３
（１９８９））。
出するべきＤＮＡ／ＲＮＡの直接光化学的標識を用いて
行われ、その後相補的核酸配列を有する遺伝子プローブ
へのハイブリッド形成が起こる（Ｎ．Ｄａｔｔａｇｕｐ
ｔａ，Ｐ．Ｍ．Ｍ．Ｒａｅ，Ｅ．Ｄ．Ｈｕｇｕｅｎｅ
ｌ，Ｅ．Ｃａｒｌｓｏｎ，Ａ．Ｌｙｇａ，Ｊ．Ｓ．Ｓｈ
ａｐｉｒｏ，Ｊ．Ｐ．Ａｌｂａｒｅｌｌａ，Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７７，８５
（１９８９）；Ｊ．Ｐ．Ａｌｂａｒｅｌｌａ，Ｒ．Ｌ．
Ｍｉｎｅｇａｒ，Ｗ．Ｌ．Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｄ
ａｔｔａｇｐｔａ，Ｅ．Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７，４２９３
（１９８９））。
【０００４】適したスペーサー分子を用いてビオチンに
結合するフロクマリンは、核酸の光化学的ビオチニル化
に非常に適していることが示された。相補的核酸配列を
有する遺伝子プローブへのハイブリッド形成及び分離段
階の後、例えば抗ビオチン抗体又はアビジンあるいはス
トレプタビジンとアルカリホスファターゼの複合体の添
加により検出を行う。検出のために、追加の段階でアル
カリホスファターゼにより誘導される発色反応を行う
（Ｊ．Ｊ．Ｌｅａｒｙ，Ｄ．Ｊ．Ｂｒｉｇａｔｉ，Ｄ．
Ｃ．Ｗａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８０，４０４５−４０４９（１９８
３））。
結合するフロクマリンは、核酸の光化学的ビオチニル化
に非常に適していることが示された。相補的核酸配列を
有する遺伝子プローブへのハイブリッド形成及び分離段
階の後、例えば抗ビオチン抗体又はアビジンあるいはス
トレプタビジンとアルカリホスファターゼの複合体の添
加により検出を行う。検出のために、追加の段階でアル
カリホスファターゼにより誘導される発色反応を行う
（Ｊ．Ｊ．Ｌｅａｒｙ，Ｄ．Ｊ．Ｂｒｉｇａｔｉ，Ｄ．
Ｃ．Ｗａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８０，４０４５−４０４９（１９８
３））。
【０００５】ビオチンを用いた検出系の１つの欠点は、
生物系にビオチンが広く分布していることである。この
欠点は、例えばビオチンの代わりにジゴキシゲニンを用
いることにより避けられる。この場合検出反応はジゴキ
シゲニン抗体を用いて行う。
生物系にビオチンが広く分布していることである。この
欠点は、例えばビオチンの代わりにジゴキシゲニンを用
いることにより避けられる。この場合検出反応はジゴキ
シゲニン抗体を用いて行う。
【０００６】ジゴキシゲニンを用いた核酸の標識のため
の現在の方法は酵素的又は光化学的に行われる（Ｇ．
Ｇ．Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｔ．Ｗａｌｔｅｒ，Ｒ．Ｓｅｉｂ
ｌ，Ｃ．Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９２，２２２−２３１（１９
９１）；Ｃ．Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｈ．−Ｊ．Ｈｏｅｌｔｋ
ｅ，Ｒ．Ｓｅｉｂｌ，Ｊ．Ｂｕｒｇ，Ｋ．Ｍｕｅｈｌｅ
ｇｇｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌ
ｅｒ ３７１，９１７−９２７（１９９０））。Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ（ＥＰ−３２４ ４７４−Ａ）による光
化学的ジゴキシゲニン試薬を用いた光化学的標識の場
合、検出するべき核酸の不可逆的変性が観察された。
の現在の方法は酵素的又は光化学的に行われる（Ｇ．
Ｇ．Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｔ．Ｗａｌｔｅｒ，Ｒ．Ｓｅｉｂ
ｌ，Ｃ．Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９２，２２２−２３１（１９
９１）；Ｃ．Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｈ．−Ｊ．Ｈｏｅｌｔｋ
ｅ，Ｒ．Ｓｅｉｂｌ，Ｊ．Ｂｕｒｇ，Ｋ．Ｍｕｅｈｌｅ
ｇｇｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌ
ｅｒ ３７１，９１７−９２７（１９９０））。Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ（ＥＰ−３２４ ４７４−Ａ）による光
化学的ジゴキシゲニン試薬を用いた光化学的標識の場
合、検出するべき核酸の不可逆的変性が観察された。
【０００７】驚くべきことに、適したスペーサーを用い
てフロクマリンに結合したジゴキシゲニン試薬を用いた
光化学的反応では、核酸の変性が観察されなかった。
てフロクマリンに結合したジゴキシゲニン試薬を用いた
光化学的反応では、核酸の変性が観察されなかった。
【０００８】本発明において、適当なスペーサーを用い
てフロクマリンに結合したジゴキシゲニン誘導体の合成
を開示し、核酸の標識のためのその利用を研究する。
てフロクマリンに結合したジゴキシゲニン誘導体の合成
を開示し、核酸の標識のためのその利用を研究する。
【０００９】本発明に従い、一般式：
【００１０】
【化２】Ｄｉｇ−Ｓ−Ｆｕ 式中、Ｄｉｇはハプテンとしてのジゴキシゲニン誘導体
であり、Ｓはスペーサー分子であり、Ｆｕは光化学的結
合可能な構造としてのフロクマリン誘導体である、の標
識試薬を合成する。
であり、Ｓはスペーサー分子であり、Ｆｕは光化学的結
合可能な構造としてのフロクマリン誘導体である、の標
識試薬を合成する。
【００１１】ジゴキシゲニン誘導体（Ｄｉｇ）は化学的
に修飾されたステロイドの誘導体であり、Ｃ−３ヒドロ
キシル基が化学的結合可能置換基により修飾されてい
る。これはカルボキシル、チオ、アミノ又はヒドロキシ
ル基、あるいはそれらの活性化形態であることができ
る。
に修飾されたステロイドの誘導体であり、Ｃ−３ヒドロ
キシル基が化学的結合可能置換基により修飾されてい
る。これはカルボキシル、チオ、アミノ又はヒドロキシ
ル基、あるいはそれらの活性化形態であることができ
る。
【００１２】適したフロクマリン及びスペーサーはＥＰ
１８７ ３３２に記載されている。
１８７ ３３２に記載されている。
【００１３】スペーサーはポリアルキルアミン、ポリエ
チレングリコール又はそれらの組み合わせである。
チレングリコール又はそれらの組み合わせである。
【００１４】ポリアルキルアミンは下記一般式：
【００１５】
【化３】
【００１６】を有する。上記式中、ＲはＨ、Ｃ1−Ｃ7−
アルキル、アリール（例えばフェニル、ナフチル又はア
ントラニル）、ヒドロキシル又はＣ1−Ｃ7−アルコキシ
であり、ｘは２−７の数であり、ｙは３−１０の数であ
り、Ｒは上記で可能な変数において異なっていることが
でき、すなわちＲはスペーサー中の−（ＣＨ2）x−Ｎ−
Ｒ単位の各繰り返しに関して同一である必要はない。ｘ
の場合も同様であり、すなわちｘはスペーサー中の−
（ＣＨ2）x−単位の各繰り返しに関して同一である必要
はない。
アルキル、アリール（例えばフェニル、ナフチル又はア
ントラニル）、ヒドロキシル又はＣ1−Ｃ7−アルコキシ
であり、ｘは２−７の数であり、ｙは３−１０の数であ
り、Ｒは上記で可能な変数において異なっていることが
でき、すなわちＲはスペーサー中の−（ＣＨ2）x−Ｎ−
Ｒ単位の各繰り返しに関して同一である必要はない。ｘ
の場合も同様であり、すなわちｘはスペーサー中の−
（ＣＨ2）x−単位の各繰り返しに関して同一である必要
はない。
【００１７】Ｒは互いに独立してＨ、Ｃ1−Ｃ4−アルキ
ル（例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピ
ル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）であ
り、ｘは２、３、４又は５であり、ｙは３、４、５又は
６であることが好ましい。
ル（例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピ
ル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）であ
り、ｘは２、３、４又は５であり、ｙは３、４、５又は
６であることが好ましい。
【００１８】特に好ましいのは、式
【００１９】
【化４】 のＮ4，Ｎ9−ジメチルスペルミン誘導体である。
【００２０】ポリエチレングリコールは下記一般式、
【００２１】
【化５】
【００２２】を有する。上記式中ｘは２−７の数であ
り、ｙは３−１０の数である。
り、ｙは３−１０の数である。
【００２３】好ましいのはｘが２、３、４又は５であ
り、ｙが３、４、５又は６のポリエチレングリコールで
ある。特に好ましいのはｘが２であり、ｙが４、５又は
６のポリエチレングリコールである。
り、ｙが３、４、５又は６のポリエチレングリコールで
ある。特に好ましいのはｘが２であり、ｙが４、５又は
６のポリエチレングリコールである。
【００２４】アミン／グリコール構造が組み合わされた
スペーサー分子下記一般式
スペーサー分子下記一般式
【００２５】
【化６】
【００２６】を有する。上記式中Ｚ1、Ｚ2及びＺ3は互
いに独立してＯ又はＮＲであり、ＲはＨ、Ｃ1−Ｃ7−ア
ルキル、アリール（例えばフェニル、ナフチル又はアン
トラニル）、ヒドロキシル又はＣ1−Ｃ7−アルコキシで
あり、ｘは２−７の数であり、ｙは３−１０の数であ
る。
いに独立してＯ又はＮＲであり、ＲはＨ、Ｃ1−Ｃ7−ア
ルキル、アリール（例えばフェニル、ナフチル又はアン
トラニル）、ヒドロキシル又はＣ1−Ｃ7−アルコキシで
あり、ｘは２−７の数であり、ｙは３−１０の数であ
る。
【００２７】好ましいのはＺ2がＯであり、Ｚ1及びＺ3
がＮＲであり、ＲがＨ、Ｃ1−Ｃ4−アルキル（例えばメ
チル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチ
ル、ｉ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）であり、ｘが２、
３、４又は５であり、ｙが３、４、５又は６であるスペ
ーサー構造である。
がＮＲであり、ＲがＨ、Ｃ1−Ｃ4−アルキル（例えばメ
チル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチ
ル、ｉ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）であり、ｘが２、
３、４又は５であり、ｙが３、４、５又は６であるスペ
ーサー構造である。
【００２８】特に好ましいのは、Ｚ2がＯであり、Ｚ1及
びＺ3がＮＲであり、ＲがＨ、メチル、エチルであり、
ｘが２であり、ｙが４の構造である。
びＺ3がＮＲであり、ＲがＨ、メチル、エチルであり、
ｘが２であり、ｙが４の構造である。
【００２９】光化学的結合可能な適した構造は特にフロ
クマリン、例えばアンゲリシン（イソプソラレン）又は
プソラレン及びそれらの誘導体であり、これらは核酸と
光化学的に反応する。
クマリン、例えばアンゲリシン（イソプソラレン）又は
プソラレン及びそれらの誘導体であり、これらは核酸と
光化学的に反応する。
【００３０】アンゲリシン誘導体は下記一般式
【００３１】
【化７】
【００３２】を有する。上記式中Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は互
いに独立してＨ又はＣ1−Ｃ7−アルキルであり、Ｒ4は
Ｈ、Ｃ1−Ｃ7−アルキル又はヒドロキシルを有する低級
アルキル、Ｃ1−Ｃ7−アルコキシ、アミノ、ハロあるい
はＮ−フタルイミド置換基である。
いに独立してＨ又はＣ1−Ｃ7−アルキルであり、Ｒ4は
Ｈ、Ｃ1−Ｃ7−アルキル又はヒドロキシルを有する低級
アルキル、Ｃ1−Ｃ7−アルコキシ、アミノ、ハロあるい
はＮ−フタルイミド置換基である。
【００３３】特に好ましいのは以下のＲ1−Ｒ4の群を含
むアンゲリシン誘導体である。
むアンゲリシン誘導体である。
【００３４】
【表１】
【００３５】異なるＲを有する他の化合物も文献から既
知の方法により合成することができる。
知の方法により合成することができる。
【００３６】適したプソラレンは下記一般式：
【００３７】
【化８】
【００３８】を有する。上記式中Ｒ1、Ｒ3及びＲ6は互
いに独立してＨ又はＣ1−Ｃ7−アルキルであり、Ｒ4は
Ｈ、Ｃ1−Ｃ7−アルキル又はヒドロキシルを有するＣ1
−Ｃ7−アルキル、Ｃ1−Ｃ7−アルコキシ、アミノ、ハ
ロあるいはＮ−フタルイミド置換基であり、Ｒ2及びＲ5
は互いに独立してＨ、ヒドロキシル、カルボキシル、カ
ルボ−Ｃ1−Ｃ7−アルコキシ又はＣ1−Ｃ7−アルコキシ
である。
いに独立してＨ又はＣ1−Ｃ7−アルキルであり、Ｒ4は
Ｈ、Ｃ1−Ｃ7−アルキル又はヒドロキシルを有するＣ1
−Ｃ7−アルキル、Ｃ1−Ｃ7−アルコキシ、アミノ、ハ
ロあるいはＮ−フタルイミド置換基であり、Ｒ2及びＲ5
は互いに独立してＨ、ヒドロキシル、カルボキシル、カ
ルボ−Ｃ1−Ｃ7−アルコキシ又はＣ1−Ｃ7−アルコキシ
である。
【００３９】アンゲリシン誘導体の方がプソラレンと比
較して一付加生成の故に有利である。
較して一付加生成の故に有利である。
【００４０】ジゴキシゲニン、スペーサー及びフロクマ
リンの結合の順序は任意である。従って中でも最初にジ
ゴキシゲニンＤｉｇをスペーサーＳと結合し、続いて生
成物をフロクマリンＦｕと反応させることができる。逆
にＦｕ−Ｓを最初に構築し、その後Ｄｉｇと反応させる
ことができる。
リンの結合の順序は任意である。従って中でも最初にジ
ゴキシゲニンＤｉｇをスペーサーＳと結合し、続いて生
成物をフロクマリンＦｕと反応させることができる。逆
にＦｕ−Ｓを最初に構築し、その後Ｄｉｇと反応させる
ことができる。
【００４１】部分の結合はそれ自体既知の方法で行う。
【００４２】
【実施例】実施例１ アミノ（ヘキサエチレングリコール）アンゲリシン（ア
ミノ−ＰＥＧ−アンゲリシン ３）の製造
ミノ−ＰＥＧ−アンゲリシン ３）の製造
【００４３】
【化９】
【００４４】４．８７ｇ（２０ミリモル）の４−アミノ
メチル−４，５’−ジメチルアンゲリシンを２５ｍｌの
ＤＭＦに溶解し、室温で３．２４ｇ（２０ミリモル）の
カルボニルジイミダゾールと反応させる。窒素下で６時
間撹拌した後、完全な反応（ＴＬＣにより）が観察され
た。溶液を、４０ｍｌのＤＭＦ中の１６．８５ｇ（６０
ミリモル）の１，１７−ジアミノ−３，６，９，１２，
１５−ペンタオキサヘプタデカンの溶液に８０℃にてゆ
っくり滴下し、混合物を７０℃でさらに１２時間撹拌す
る。冷却後、溶液を真空中で濃縮し、シリカゲル上のク
ロマトグラフィーにかける（溶離剤：クロロホルム／メ
タノール／アンモニア ９０：１０：１、Ｒf＝０．２
８）。７．１ｇ（理論値の６５％）の微黄色油が得られ
る。
メチル−４，５’−ジメチルアンゲリシンを２５ｍｌの
ＤＭＦに溶解し、室温で３．２４ｇ（２０ミリモル）の
カルボニルジイミダゾールと反応させる。窒素下で６時
間撹拌した後、完全な反応（ＴＬＣにより）が観察され
た。溶液を、４０ｍｌのＤＭＦ中の１６．８５ｇ（６０
ミリモル）の１，１７−ジアミノ−３，６，９，１２，
１５−ペンタオキサヘプタデカンの溶液に８０℃にてゆ
っくり滴下し、混合物を７０℃でさらに１２時間撹拌す
る。冷却後、溶液を真空中で濃縮し、シリカゲル上のク
ロマトグラフィーにかける（溶離剤：クロロホルム／メ
タノール／アンモニア ９０：１０：１、Ｒf＝０．２
８）。７．１ｇ（理論値の６５％）の微黄色油が得られ
る。
【００４５】実施例２ Ｎ1−（アンゲリシンアミノ）−Ｎ4，Ｎ9−ジメチルス
ペルミン（２）の製造
ペルミン（２）の製造
【００４６】
【化１０】
【００４７】４．８７ｇ（２０ミリモル）の４−アミノ
メチル−４，５’−ジメチルアンゲリシンを実施例１と
類似の方法でカルボニルジイミダゾールを用いて活性化
する。得られた溶液を、実施例１と同様にして４０ｍｌ
のＤＭＦ中の１３．８ｇ（６０ミリモル）のＮ4，Ｎ9−
ジメチルスペルミンの溶液に滴下する。冷却後、溶液を
真空中で濃縮し、残留物をシリカゲル上のクロマトグラ
フィーにかける（溶離剤：クロロホルム／メタノール／
アンモニア ３０：５：１１、Ｒf＝０．１１）。７．
１ｇ（理論値の７１％）の黄色油が得られる。
メチル−４，５’−ジメチルアンゲリシンを実施例１と
類似の方法でカルボニルジイミダゾールを用いて活性化
する。得られた溶液を、実施例１と同様にして４０ｍｌ
のＤＭＦ中の１３．８ｇ（６０ミリモル）のＮ4，Ｎ9−
ジメチルスペルミンの溶液に滴下する。冷却後、溶液を
真空中で濃縮し、残留物をシリカゲル上のクロマトグラ
フィーにかける（溶離剤：クロロホルム／メタノール／
アンモニア ３０：５：１１、Ｒf＝０．１１）。７．
１ｇ（理論値の７１％）の黄色油が得られる。
【００４８】実施例３ ジゴキシゲニン−ＰＥＧ−アンゲリシン（Ｄｉｇ−Ｐ
Ａ、３）の製造
Ａ、３）の製造
【００４９】
【化１１】
【００５０】１３．７ｍｇ（０．０３ミリモル）のアミ
ノ−ＰＥＧ−アンゲリシン １ を２ｍｌのクロロホル
ムに溶解する（分光分析のため）。
ノ−ＰＥＧ−アンゲリシン １ を２ｍｌのクロロホル
ムに溶解する（分光分析のため）。
【００５１】２ｍｌのクロロホルム中の１８．９ｍｇ
（０．０３ミリモル）のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド
ジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ε−ア
ミノカプロエート（Ｄｉｇ−ＮＨＳ）の溶液を滴下す
る。室温で２４時間撹拌した後、反応が完了する（ＴＬ
Ｃにより）。溶液を真空中で濃縮し、残留物をシリカゲ
ル上のクロマトグラフィーにかける（溶離剤：クロロホ
ルム／メタノール／アンモニア ９０：１０：１、Ｒf
＝０．４５）。２１ｍｇ（理論値の７７％）の、融点が
６３−６５℃の微黄色固体が得られる。
（０．０３ミリモル）のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド
ジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ε−ア
ミノカプロエート（Ｄｉｇ−ＮＨＳ）の溶液を滴下す
る。室温で２４時間撹拌した後、反応が完了する（ＴＬ
Ｃにより）。溶液を真空中で濃縮し、残留物をシリカゲ
ル上のクロマトグラフィーにかける（溶離剤：クロロホ
ルム／メタノール／アンモニア ９０：１０：１、Ｒf
＝０．４５）。２１ｍｇ（理論値の７７％）の、融点が
６３−６５℃の微黄色固体が得られる。
【００５２】実施例４ ジゴキシゲニン−スペルミン−アンゲリシン（Ｄｉｇ−
ＳｐＡ、４）の製造
ＳｐＡ、４）の製造
【００５３】
【化１２】
【００５４】１５ｍｇ（０．０３ミリモル）の実施例２
に記載の化合物２を、実施例３と同様にして１９．８ｍ
ｇ（０．０３ミリモル）のＮ−ヒドロキシ−コハク酸イ
ミドジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ε−
アミノカプロエート（Ｄｉｇ−ＮＨＳ）と反応させる。
に記載の化合物２を、実施例３と同様にして１９．８ｍ
ｇ（０．０３ミリモル）のＮ−ヒドロキシ−コハク酸イ
ミドジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ε−
アミノカプロエート（Ｄｉｇ−ＮＨＳ）と反応させる。
【００５５】仕上げ、シリカゲル上のクロマトグラフィ
ー（溶離剤：クロロホルム／メタノール／アンモニア
３０：５：１１、Ｒf＝０．２５）にかけた後、２４ｍ
ｇ（理論値の７７％）の、融点が１０６−１０９℃の弱
黄色の固体が得られる。
ー（溶離剤：クロロホルム／メタノール／アンモニア
３０：５：１１、Ｒf＝０．２５）にかけた後、２４ｍ
ｇ（理論値の７７％）の、融点が１０６−１０９℃の弱
黄色の固体が得られる。
【００５６】実施例５ ＤｉｇＰＡを用いたヘアピンオリゴヌクレオチドの光反
応 ５０μｇのヘアピンオリゴヌクレオチドを１００μｌの
トリス−ＨＣｌ緩衝液に取り上げる。溶液を５０℃の水
浴中に１５分間放置する。ゆっくり室温に冷却するため
に試料を水浴から取り出す。続いてさらに４００μｌの
水を加える。
応 ５０μｇのヘアピンオリゴヌクレオチドを１００μｌの
トリス−ＨＣｌ緩衝液に取り上げる。溶液を５０℃の水
浴中に１５分間放置する。ゆっくり室温に冷却するため
に試料を水浴から取り出す。続いてさらに４００μｌの
水を加える。
【００５７】光反応のために、１５μｇのハイブリッド
形成したヘアピンオリゴヌクレオチドに２０倍モル過剰
のＤｉｇＰＡを加える。続いて氷浴中のＥｐｐｅｎｄｏ
ｒｆ管にて３６６ｎｍ−３１２ｎｍのＵＶランプ下で溶
液を照明する。光反応の後にＨＰＬＣを行う。１５分以
内に反応が完了した。
形成したヘアピンオリゴヌクレオチドに２０倍モル過剰
のＤｉｇＰＡを加える。続いて氷浴中のＥｐｐｅｎｄｏ
ｒｆ管にて３６６ｎｍ−３１２ｎｍのＵＶランプ下で溶
液を照明する。光反応の後にＨＰＬＣを行う。１５分以
内に反応が完了した。
【００５８】実施例６ ＤｉｇＰＡを用いた光化学的標識 ＤｉｇＰＡを用いた光化学的標識のために、５０μｌの
１Ｍナトリウムテトラボレート緩衝液ｐＨ８．３及び５
０μｌのＤｉｇＰＡ（２μｇ／μｌ）を、２０μｌのＴ
Ｅ緩衝液中の２−５μｇのＤＮＡに加え、２回蒸留Ｈ2
Ｏで５００μｌとした。その後混合物を３１２ｎｍにて
ＵＶトランスイルミネーター（ｔｒａｎｓ−ｉｌｌｕｍ
ｉｎａｔｏｒ）で１０分間照射し、この過程の間試料を
氷上に保った。
１Ｍナトリウムテトラボレート緩衝液ｐＨ８．３及び５
０μｌのＤｉｇＰＡ（２μｇ／μｌ）を、２０μｌのＴ
Ｅ緩衝液中の２−５μｇのＤＮＡに加え、２回蒸留Ｈ2
Ｏで５００μｌとした。その後混合物を３１２ｎｍにて
ＵＶトランスイルミネーター（ｔｒａｎｓ−ｉｌｌｕｍ
ｉｎａｔｏｒ）で１０分間照射し、この過程の間試料を
氷上に保った。
【００５９】続いて光化学的標識ＤＮＡを、１／１０体
積の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．８及び１体積のイソプ
ロパノールを用いて室温にて沈澱させ、５分間放置し
た。その後ＤＮＡをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機中で１
０，０００ｒｐｍにて遠心し、上澄み液をデカンテーシ
ョンし、ＤＮＡ沈澱を７０％のエタノールで洗浄した。
試料が乾燥した後、光化学的標識ＤＮＡをＴＥ中に取り
上げた。その後ジゴキシゲニンを用いたＤＮＡの光化学
的標識を、アガロースゲル電気泳動及びジゴキシゲニン
抗体複合体を用いた点染検定により調べた。
積の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．８及び１体積のイソプ
ロパノールを用いて室温にて沈澱させ、５分間放置し
た。その後ＤＮＡをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機中で１
０，０００ｒｐｍにて遠心し、上澄み液をデカンテーシ
ョンし、ＤＮＡ沈澱を７０％のエタノールで洗浄した。
試料が乾燥した後、光化学的標識ＤＮＡをＴＥ中に取り
上げた。その後ジゴキシゲニンを用いたＤＮＡの光化学
的標識を、アガロースゲル電気泳動及びジゴキシゲニン
抗体複合体を用いた点染検定により調べた。
【００６０】ゲル電気泳動では、光化学的標識ＤＮＡは
非標識ＤＮＡよりゆっくり泳動し、それは光化学的標識
ＤＮＡバンドの場合に原点に向かって少しシフトするこ
とにより明らかである。この方法では、ゲルのウェル中
で変性ＤＮＡは観察されない。
非標識ＤＮＡよりゆっくり泳動し、それは光化学的標識
ＤＮＡバンドの場合に原点に向かって少しシフトするこ
とにより明らかである。この方法では、ゲルのウェル中
で変性ＤＮＡは観察されない。
【００６１】ジゴキシゲニンを用いた標識を、Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍからのキットを用いて
免疫学的にも調べた。この目的の場合、光化学的標識Ｄ
ＮＡを種々の濃度でニトロセルロース膜に適用し、真空
中８０℃にて固定した。続いて膜を緩衝液１（１００ｍ
Ｍのトリス／ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ７．
５）中で１分間洗浄した。その後フィルターを１００ｍ
ｌの緩衝液２（緩衝液１中０．５％の阻害剤）と共に３
０分間培養した。次にそれを緩衝液１で再度洗浄した。
抗体複合体（アルカリホスファターゼにカップリングし
た抗−ジゴキシゲニン抗体）を緩衝液１中で１：５，０
００に希釈して１５０ｍＵ／ｍｌとし、フィルターを２
０ｍｌの希釈抗体溶液と共に３０分間培養した。その後
１００ｍｌの緩衝液１で２ｘ１５分間洗浄することによ
り非−結合抗体を除去した。続いて２０ｍｌの緩衝液３
（１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣ
ｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ2 ｐＨ９．５）を用いて室温
で２分間膜を平衡化した。フィルターを１０ｍｌの染料
溶液（１０ｍｌの緩衝液３中の４５μｌのニトロブルー
テトラゾリウム溶液及び３５μｌのブロモクロロインド
イルホスフェート）と共にブラスチックの袋中で暗所に
て培養した。色点が発色した後、緩衝液４（１０ｍＭの
トリス／ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８）を用いて
膜を５分間洗浄し、発色反応を止めた。
ｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍからのキットを用いて
免疫学的にも調べた。この目的の場合、光化学的標識Ｄ
ＮＡを種々の濃度でニトロセルロース膜に適用し、真空
中８０℃にて固定した。続いて膜を緩衝液１（１００ｍ
Ｍのトリス／ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ７．
５）中で１分間洗浄した。その後フィルターを１００ｍ
ｌの緩衝液２（緩衝液１中０．５％の阻害剤）と共に３
０分間培養した。次にそれを緩衝液１で再度洗浄した。
抗体複合体（アルカリホスファターゼにカップリングし
た抗−ジゴキシゲニン抗体）を緩衝液１中で１：５，０
００に希釈して１５０ｍＵ／ｍｌとし、フィルターを２
０ｍｌの希釈抗体溶液と共に３０分間培養した。その後
１００ｍｌの緩衝液１で２ｘ１５分間洗浄することによ
り非−結合抗体を除去した。続いて２０ｍｌの緩衝液３
（１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣ
ｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ2 ｐＨ９．５）を用いて室温
で２分間膜を平衡化した。フィルターを１０ｍｌの染料
溶液（１０ｍｌの緩衝液３中の４５μｌのニトロブルー
テトラゾリウム溶液及び３５μｌのブロモクロロインド
イルホスフェート）と共にブラスチックの袋中で暗所に
て培養した。色点が発色した後、緩衝液４（１０ｍＭの
トリス／ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８）を用いて
膜を５分間洗浄し、発色反応を止めた。
【００６２】実施例７ 光化学的ジゴキシゲニンを用いた光化学的標識 光化学的ジゴキシゲニンの場合、親水性スペーサーを用
いてジコキシゲニンにカップリングしたアジドフェニル
基が、水銀蒸気照明(３５０−７００nm)を与えると例え
ばタンパク質及び核酸などの多くの化合物と非特異的に
反応する。
いてジコキシゲニンにカップリングしたアジドフェニル
基が、水銀蒸気照明(３５０−７００nm)を与えると例え
ばタンパク質及び核酸などの多くの化合物と非特異的に
反応する。
【００６３】Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒの方法に従って核酸
を光化学的ジゴキシゲニンで標識した。１０μｇの光化
学的ジゴキシゲニン溶液（ジメチルホルムアミド中１０
ｍｇ／ｍｌ）を１０μｇのＤＮＡに加え、溶液を２回蒸
留Ｈ2Ｏを用いて４０μｌとした。開けた管を氷−水中
でＰｈｉｌｉｐｓ ＨＰＬＲ ４００Ｗランプの下に１
０ｃｍ離して置き、１５分間照射した。６０μｌのトリ
ス／ＨＣｌ、１００ミリモル／ｌ、ｐＨ９、ＥＤＴＡ、
１ミリモル／ｌを加え、その後１５μｌのＮａＣｌ、５
モル／ｌを加えた。その後溶液を１００μｌの２−ブタ
ノールで２回抽出し、１０μｌのＬｉＣｌ、４モル／
ｌ、及び１００μｌの予備冷却エタノールを用いてＤＮ
Ａを沈澱させた。−７０℃にて４０分後、混合物を１
２，０００ｇで遠心し、７０％の冷エタノールでペレッ
トを洗浄し、真空中で乾燥し、４０μｌのトリス／ＨＣ
ｌ、１０ミリモル／ｌ、ＥＤＴＡ、１ミリモル／ｌ ｐ
Ｈ８中に溶解した。
を光化学的ジゴキシゲニンで標識した。１０μｇの光化
学的ジゴキシゲニン溶液（ジメチルホルムアミド中１０
ｍｇ／ｍｌ）を１０μｇのＤＮＡに加え、溶液を２回蒸
留Ｈ2Ｏを用いて４０μｌとした。開けた管を氷−水中
でＰｈｉｌｉｐｓ ＨＰＬＲ ４００Ｗランプの下に１
０ｃｍ離して置き、１５分間照射した。６０μｌのトリ
ス／ＨＣｌ、１００ミリモル／ｌ、ｐＨ９、ＥＤＴＡ、
１ミリモル／ｌを加え、その後１５μｌのＮａＣｌ、５
モル／ｌを加えた。その後溶液を１００μｌの２−ブタ
ノールで２回抽出し、１０μｌのＬｉＣｌ、４モル／
ｌ、及び１００μｌの予備冷却エタノールを用いてＤＮ
Ａを沈澱させた。−７０℃にて４０分後、混合物を１
２，０００ｇで遠心し、７０％の冷エタノールでペレッ
トを洗浄し、真空中で乾燥し、４０μｌのトリス／ＨＣ
ｌ、１０ミリモル／ｌ、ＥＤＴＡ、１ミリモル／ｌ ｐ
Ｈ８中に溶解した。
【００６４】光化学的標識を、ゲル電気泳動及びシゴキ
シゲニン抗体複合体を用いた免疫学的方法の両方により
調べた。
シゲニン抗体複合体を用いた免疫学的方法の両方により
調べた。
【００６５】アガロースゲル電気泳動の場合、光化学的
ジゴキシゲニン化ＤＮＡの大部分がゲルウェル中で変性
した形態で存在することが観察された。対照的に実施例
６に記載のＤｉｇＰＡ法では、光化学的標識ＤＮＡのバ
ンドが１つだけ見られ、ゲルウェル中に変性ＤＮＡは観
察されなかった。
ジゴキシゲニン化ＤＮＡの大部分がゲルウェル中で変性
した形態で存在することが観察された。対照的に実施例
６に記載のＤｉｇＰＡ法では、光化学的標識ＤＮＡのバ
ンドが１つだけ見られ、ゲルウェル中に変性ＤＮＡは観
察されなかった。
【００６６】光化学的ジゴキシゲニン化の免疫学的実験
を実施例６と同様にして行った。
を実施例６と同様にして行った。
【００６７】固定された光化学的ジゴキシゲニン化ＤＮ
Ａを用いた点染検定では、標識効率が実施例６に記載の
非常に穏やかなＤｉｇＰＡ法の場合より明らかに低いこ
とがさらに観察された。
Ａを用いた点染検定では、標識効率が実施例６に記載の
非常に穏やかなＤｉｇＰＡ法の場合より明らかに低いこ
とがさらに観察された。
【００６８】本発明の主たる特徴及び態様は以下の通り
である。
である。
【００６９】１．一般式
【００７０】
【化１３】Ｄｉｇ−Ｓ−Ｆｕ ［式中、Ｄｉｇはジゴキシゲニン誘導体であり、Ｓはス
ペーサー分子であり、Ｆｕはフロクマリン誘導体であ
る］の標識試薬。
ペーサー分子であり、Ｆｕはフロクマリン誘導体であ
る］の標識試薬。
【００７１】２．ジゴキシゲニン誘導体（Ｄｉｇ）が、
Ｃ−３ヒドロキシル基が化学的結合可能置換基を用いて
修飾されたステロイドの化学的修飾誘導体である上記１
項記載の標識試薬。
Ｃ−３ヒドロキシル基が化学的結合可能置換基を用いて
修飾されたステロイドの化学的修飾誘導体である上記１
項記載の標識試薬。
【００７２】３．スペーサーがポリアルキルアミン、ポ
リエチレングリコール又はそれらの組み合わせである上
記１項記載の標識試薬。
リエチレングリコール又はそれらの組み合わせである上
記１項記載の標識試薬。
【００７３】４．Ｆｕが下記一般式
【００７４】
【化１４】
【００７５】［式中Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は互いに独立して
Ｈ又はＣ1−Ｃ7−アルキルであり、Ｒ4はＨ、Ｃ1−Ｃ7
−アルキル又はヒドロキシルを有する低級アルキル、Ｃ
1−Ｃ7−アルコキシ、アミノ、ハロ又はＮ−フタルイミ
ド置換基である］のアンゲリシン誘導体である上記１項
記載の標識試薬。
Ｈ又はＣ1−Ｃ7−アルキルであり、Ｒ4はＨ、Ｃ1−Ｃ7
−アルキル又はヒドロキシルを有する低級アルキル、Ｃ
1−Ｃ7−アルコキシ、アミノ、ハロ又はＮ−フタルイミ
ド置換基である］のアンゲリシン誘導体である上記１項
記載の標識試薬。
【００７６】５．Ｆｕが下記一般式
【００７７】
【化１５】
【００７８】［式中Ｒ1、Ｒ3及びＲ5は互いに独立して
Ｈ又はＣ1−Ｃ7−アルキルであり、Ｒ4はＨ、Ｃ1−Ｃ7
−アルキル又はヒドロキシルを有するＣ1−Ｃ7−アルキ
ル、Ｃ1−Ｃ7−アルコキシ、アミノ、ハロ又はＮ−フタ
ルイミド置換基であり、Ｒ2及びＲ5は互いに独立して
Ｈ、ヒドロキシル、カルボニル、カルボ−Ｃ1−Ｃ7−ア
ルコキシ又はＣ1−Ｃ7−アルコキシである］のスポラレ
ンである上記１項記載の標識試薬。
Ｈ又はＣ1−Ｃ7−アルキルであり、Ｒ4はＨ、Ｃ1−Ｃ7
−アルキル又はヒドロキシルを有するＣ1−Ｃ7−アルキ
ル、Ｃ1−Ｃ7−アルコキシ、アミノ、ハロ又はＮ−フタ
ルイミド置換基であり、Ｒ2及びＲ5は互いに独立して
Ｈ、ヒドロキシル、カルボニル、カルボ−Ｃ1−Ｃ7−ア
ルコキシ又はＣ1−Ｃ7−アルコキシである］のスポラレ
ンである上記１項記載の標識試薬。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 591063187 Ｂａｙｅｒｗｒｋ，Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅ ｎ，ＢＲＤ (56)参考文献 特開 昭61−819（ＪＰ，Ａ) 特表 平１−503647（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/58 - 33/98
Claims (1)
- 【請求項１】 一般式 【化１】Ｄｉｇ−Ｓ−Ｆｕ ［式中、Ｄｉｇはジゴキシゲニン誘導体であり、Ｓはス
ペーサー分子であり、Ｆｕはフロクマリン誘導体であ
る］の標識試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4222254.0 | 1992-07-07 | ||
| DE4222254A DE4222254A1 (de) | 1992-07-07 | 1992-07-07 | Fotochemische Markierung von Nukleinsäuren mit Digoxigenin-Reagenzien und ihre Verwendung in Gensondentestsystemen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0694721A JPH0694721A (ja) | 1994-04-08 |
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Family
ID=6462655
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18220493A Expired - Fee Related JP3253181B2 (ja) | 1992-07-07 | 1993-06-29 | ジゴキシゲニン試薬を用いた核酸の光化学的標識 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP3253181B2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US6376669B1 (en) * | 1999-11-05 | 2002-04-23 | 3M Innovative Properties Company | Dye labeled imidazoquinoline compounds |
| US6503736B1 (en) * | 1999-11-12 | 2003-01-07 | BIOMéRIEUX, INC. | Antibodies to crosslinkers and methods for using the same |
| GB2361699B (en) * | 2000-03-28 | 2005-02-16 | Biomed Reagents Ltd | Analysis of complex biological mixtures |
| US6596490B2 (en) | 2000-07-14 | 2003-07-22 | Applied Gene Technologies, Inc. | Nucleic acid hairpin probes and uses thereof |
| US6380377B1 (en) | 2000-07-14 | 2002-04-30 | Applied Gene Technologies, Inc. | Nucleic acid hairpin probes and uses thereof |
| US20040265870A1 (en) * | 2003-04-09 | 2004-12-30 | Invitrogen Corporation | Methods of synthesizing and labeling nucleic acid molecules |
| CN102532154B (zh) * | 2012-01-11 | 2014-05-14 | 昆明医学院 | 隆萼当归线型呋喃香豆素化合物及其应用 |
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| ATE40572T1 (de) * | 1985-01-10 | 1989-02-15 | Molecular Diagnostics Inc | Photochemisches verfahren zum markieren von nucleinsaeuren zum nachweis in hybridisationsproben. |
| DE3800644A1 (de) * | 1988-01-12 | 1989-07-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum hochspezifischen nachweis von nukleinsaeuren in loesung |
| DE3813278A1 (de) * | 1988-01-12 | 1989-07-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum nachweis von nukleinsaeuren |
| DE3836656A1 (de) * | 1988-10-27 | 1990-05-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Neue digoxigenin-derivate und ihre verwendung |
| DE3940597A1 (de) * | 1989-12-08 | 1991-06-13 | Bayer Ag | Verfahren zur herstellung von di- und trialkyl-4'-phthalimidomethyl-furocumarinen |
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- 1993-06-24 EP EP93110108A patent/EP0578066B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-06-24 DE DE59308492T patent/DE59308492D1/de not_active Expired - Fee Related
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- 1993-07-02 CA CA002099543A patent/CA2099543C/en not_active Expired - Fee Related
-
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- 1995-06-06 US US08/468,452 patent/US5616731A/en not_active Expired - Lifetime
-
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- 1997-03-31 US US08/829,630 patent/US5929108A/en not_active Expired - Fee Related
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