JP7046082B2 - 新規化合物及びサンプル中の標的分子の検出のためのその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、そのフォトレドックス触媒作用時に沈殿生成物(対応するフルオロフォア)に変換する新規のプロフルオロフォア(例えば、フルオロフォア前駆体又は蛍光発生剤)ファミリーを対象とする。本発明は、この新規プロフルオロフォアファミリーと遷移金属錯体フォトレドックス触媒との反応を通して、下記式(I')のフルオロフォアが形成され得るという知見に基づいている。
用語「蛍光発生組成物」は、本発明によるプロフルオロフォアをそれ自体で又はコンジュゲートの形態でのいずれかで含む組成物であって、プロフルオロフォア又はそのコンジュゲートが、フォトレドックス触媒の近傍にある場合に、フォトレドックス触媒作用を受けることができる組成物を指し、組成物は、フォトレドックス触媒を励起するのに十分な波長で励起され、それにより、対応するフルオロフォアを生成する。
一態様では、式(I):
の化合物、又はその任意の互変異性体、異性体、コンジュゲート若しくは塩が提供される。
一実施形態では、本発明のプロフルオロフォア化合物は、以下の一般スキーム1による合成方法によって調製してもよい。アルカリ性媒体(例えば、炭酸カリウム)中の式(i)のアルデヒドを、極性溶媒(例えば、DMF)に溶解した。混合物を加熱し(例えば、80℃)、式(iia)のピリジン誘導体を固体として一部ずつ加える。得られた混合物を、数時間(例えば、6時間)撹拌する。次いで、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによって精製して、式(iii)の所望の中間生成物を得た。次いで、得られた式(iii)の化合物を、不活性雰囲気下で、極性非プロトン性溶媒(例えば、DMSO)中でアルキル化剤(例えば、ブタン-2-イルトリフルオロメタンスルホネート又は式(iv)のもの、例えば、1-ヨードプロパン)と反応させて、ピリジンからの窒素原子をアルキル化する。溶液を室温で一晩撹拌する。粗生成物を沈殿させ(例えば、ジエチルエーテル中で)、遠心分離し、洗浄して、式(v)の所望の中間体を得る。次いで、式(v)の中間体を、水溶性溶媒(例えば、乾燥エタノール)中での脱離反応(例えば、トシル酸の存在下)で式(vi)のアミドと反応させ、混合物を還流する(例えば、3時間)。次いで、溶液を0℃に冷却し、溶液を室温で温めながら酸化体媒体中(例えば、2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-1,4-ベンゾキノン(DDQ)中)で沈殿させる。数時間(例えば、2時間)後、式(I)の化合物の固体を遠心分離により回収し、水溶性溶媒(例えば、冷エタノール)で洗浄する。
- 特に標的プローブによって認識される領域の近傍において、標的分子(例えば、DNA、LNA、PNA(標的分子の領域に相補的なもの)、モルホリン、RNA、抗体、ナノボディ及びそれらの類似体又は小分子リガンド)に対して特異的親和性を有する連結基であるか、
又は
- フォトレドックス触媒を、標的分子(例えば、DNA、LNA、PNA、モルホリン、RNA、抗体、ナノボディ及びそれらの類似体又は小分子リガンド)の領域を認識するプローブへコンジュゲートさせる基に対して特異的親和性を有する基である。
[式中、少なくとも1つのR11c、R12b、R13a、R14g、及びR15d基は、以下の式(III):
一態様では、式(I)のプロフルオロフォアは、式(I)のプロフルオロフォアが遷移金属錯体フォトレドックス触媒の近傍にある場合に起こるフォトレドックス触媒作用のための蛍光発生組成物(フルオロフォア前駆体)として使用することができる。
の遷移金属錯体(フォトレドックス触媒)によって媒介することができ、前記フォトレドックス触媒は、光による励起の際に式(I)のプロフルオロフォアを含む蛍光発生組成物との単一電子移動プロセスに従事することができる。
のフルオロフォア、又はその任意の互変異性体、異性体、コンジュゲート若しくは塩の調製方法であって、フォトレドックス触媒作用によって、還元剤の存在下で、本明細書に定義される式(I)のプロフルオロフォアを含む蛍光発生組成物を、遷移金属錯体フォトレドックス触媒と反応させるステップを含む、方法が提供される。
本発明による式(I)のプロフルオロフォア又はそのコンジュゲートは、式(I)のプロフルオロフォアが遷移金属錯体フォトレドックス触媒の近傍にある場合に起こるフォトレドックス触媒作用のための蛍光発生組成物(フルオロフォア前駆体)として使用することができる。
(i)前記標的分子がサンプル中に存在する場合に、プローブが前記少なくとも1つの標的分子に結合し、標的分子が係留化基材(例えば、その表面)上に係留されるのに適した条件下で、サンプルを、(1)前記少なくとも1つの標的分子に対する係留化基材、及び(2)前記少なくとも1つの標的分子に対するプローブと接触させるステップであって、前記プローブは、遷移金属錯体フォトレドックス触媒で標識されている、ステップ;
(ii)プロフルオロフォアが遷移金属錯体フォトレドックス触媒の近傍に位置する場合に、本発明によるプロフルオロフォア又はそのコンジュゲートのフォトレドックス触媒作用を誘導するのに適した条件下で、還元剤の存在下で、本発明によるプロフルオロフォア又はそのコンジュゲートを含む組成物を、前記係留化基材と接触させるステップ;
(iii)前記係留化基材上の式(I')のフルオロフォアの形成を検出するステップであって、前記フルオロフォアの形成は、前記サンプル内の前記少なくとも1つの標的分子の存在を示す、ステップ
を含む。
(ia)還元剤の存在下で、及び前記標的分子がサンプル中に存在する場合に、プローブが前記少なくとも1つの標的分子に結合するのに適した条件下で、プロフルオロフォアコンジュゲートが遷移金属錯体フォトレドックス触媒の近傍において標的分子上に結合する場合に、本発明によるプロフルオロフォア又はそのコンジュゲートのフォトレドックス触媒作用を誘導するのに適した条件下で、サンプルを、(1)本発明によるプロフルオロフォア又はそのコンジュゲートで標識されている、前記少なくとも1つの標的分子に対するプローブ(「プロフルオロフォアプローブ」)、及び(2)遷移金属錯体フォトレドックス触媒で標識されている、前記少なくとも1つの標的分子に対するプローブと接触させるステップ;
(ib)式(I')のフルオロフォアの形成を検出するステップであって、前記フルオロフォアの形成は、前記サンプル内の前記少なくとも1つの標的分子の存在を示す、ステップ
を含む、方法。
一態様では、本発明は、特定の核酸標的配列を認識し、それに結合するプローブを提供する。
本発明の方法における使用に特に有用な試験デバイスは、例えばUS 5,798,273に記載されるような、毛管現象による反応物の移動を可能にし、本発明の標的分子又はプローブへの結合を可能にする係留化基材を含む。
本発明の別の態様は、サンプル中の少なくとも1つの標的分子の検出のためのキットであって、式(I)のプロフルオロフォア又はそのコンジュゲートと、任意選択で、還元剤、及び前記標的分子の検出のためのさらなるプローブから選択される少なくとも1つの薬剤とを含む、キットを提供する。特定の態様では、キットは、本発明による試験デバイスをさらに含む。
bp(塩基対)、COI(シトクロムcオキシダーゼ)、DDQ(2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-1,4-ベンゾキノン)、DIAD(ジイソプロピルアゾジカルボキシレート)、DMF(ジメチルホルムアミド)、DMSO(ジメチルスルホキシド)、dsDNA(二本鎖DNA)、EtOH(エタノール)、LED(発光ダイオード)、LNA(ロックド核酸)、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)、m-CPBA(メタ-クロロペルオキシ安息香酸)、PNA(ペプチド核酸)、TsOH(トシル酸)、MS(ESI)(質量分析(エレクトロスプレーイオン化))、NaAsc(アスコルビン酸ナトリウム)、NMR(核磁気共鳴)、QR(商標)コード(クイックレスポンスコード)、RP-HPLC(逆相高速液体クロマトグラフィー)、Ru(bpy)3Cl2(トリス(ビピリジン)ルテニウム(II)塩化物)、Ru(bpy)2Phen(ビス(ビピリジン)ルテニウム(II)フェナントロリン(Ru(bpy)2Phen)。
本発明のプロフルオロフォアは、一般スキーム1に従って合成することができる。以下のプロフルオロフォアは、スキーム2[Rは、H(中間体(iva)、(va)、及び化合物(1))及びN3(中間体(ivb)、(vb)、及び化合物(2))から選択される]の以下の手順に従って合成されている。
5-クロロサリチルアルデヒド(491mg、3.13mmol)(中間体(ia))及び炭酸カリウム(K2CO3、1306mg、9.4mmol)を、8mlのジメチルホルムアミド(DMF)に溶解した。混合物を、80℃に加熱し、4-(ブロモメチル)ピリジン臭化水素酸塩(中間体(iia))(800mg、3.13mmol)を、固体として一部ずつ加えた。得られた混合物を、6時間撹拌した。次いで、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによって精製して、365mgの所望の中間生成物(iii)を黄色固体として得た。収率: 47%。1H NMR(核磁気共鳴)(400 MHz, CDCl3) δ: 10.54 (s, 1H), 8.69 (d, J = 6.1 Hz, 2H), 7.86 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.51 (dd, J = 8.9, 2.8 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 6.1 Hz, 2H), 6.96 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 5.24 (s, 2H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ: 187.82, 158.64, 150.27, 144.64, 135.41, 128.51, 127.29, 126.05, 121.28, 114.38, 68.97. 質量分析(エレクトロスプレーイオン化)(MS (ESI)): C13H10ClNO2の計算値: 247.04, 実測値: 248.01 [M+H]+.
中間体(iiia)(279mg、1.13mmol)を、不活性雰囲気下で、2.2mlのDMSO中の1-ヨードプロパン(中間体(iva))(3.78g、18mmol)の溶液に混合した。溶液を室温で一晩撹拌した。粗生成物を、ジエチルエーテル中で沈殿させ、遠心分離し、3回洗浄して、中間生成物(va)を褐色油として得た。収率: 90% 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.09 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 8.29 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 7.83 - 7.70 (m, 1H), 7.35 (dd, J = 8.6, 0.7 Hz, 1H), 5.68 (s, 1H), 4.59 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 1.96 (q, J = 7.3 Hz, 1H), 0.90 (t, J = 7.4 Hz, 2H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ: 189.03, 158.38, 156.33, 145.07, 136.07, 128.38, 126.40, 126.22, 125.55, 116.59, 68.33, 62.19, 24.57, 10.70. MS (ESI): C16H17ClNO2 +の計算値: 290.09, 実測値: 290.17 [M]+.
中間生成物(vb)は、中間体(va)について記載したように、中間体(iiia)(365mg、1.47mmol)及び1-アジド-3-ヨードプロパン(中間体(ivb))(1.58g、7mmol)から調製した。収率: 75%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 10.48 (s, 0H), 9.11 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 8.30 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 7.80 - 7.74 (m, 1H), 7.34 (d, J = 8.8 Hz, 0H), 5.69 (s, 1H), 4.69 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 3.50 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 2.32 - 2.13 (m, 1H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ: 189.01, 158.36, 156.47, 145.31, 136.05, 128.36, 126.40, 126.22, 125.57, 116.61, 68.33, 58.65, 48.07, 30.13. MS (ESI): C16H16ClN4O2 +の計算値: 331.10, 実測値: 331.10 [M]+.
化合物(1)(114.5mg、0.27mmol)、2-アミノ-5-クロロベンズアミド(中間体(via))(49mg、0.29mmol)及びTsOH・H2O(11mg、0.06mmol)を、3mlの乾燥エタノール(EtOH)に溶解し、混合物を3時間還流した。次いで、溶液を0℃に冷却し、2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-1,4-ベンゾキノン(DDQ)(80mg、0.35mmol)を加え、溶液を室温に温めた。2時間後、固体を遠心分離により回収し、冷エタノールで3回洗浄した。得られたゴム状褐色沈殿物を、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)により精製して、化合物(1)を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.69 (s, 1H), 9.07 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 8.17 - 8.09 (m, 3H), 7.91 (dd, J = 8.7, 2.5 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.77 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.66 (dd, J = 8.9, 2.7 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 5.59 (s, 2H), 4.54 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.92 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ: 156.75, 154.50, 151.73, 144.99, 135.18, 132.33, 131.69, 130.84, 130.22, 129.74, 125.81, 125.36, 125.28, 125.24, 122.95, 115.59, 68.48, 62.14, 24.53, 10.66. MS (ESI): C23H20Cl2N3O2 +の計算値: 440.09, 実測値: 440.28 [M]+.
化合物(2)を、化合物(1)について記載したように、化合物(va)(580mg、1.32mmol)及び2-アミノ-5-クロロベンズアミド(270mg、1.4mmol)から調製した。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 12.71 (s, 1H), 9.08 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 8.17 - 8.09 (m, 3H), 7.92 (dd, J = 8.7, 2.5 Hz, 1H), 7.81 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.77 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.67 (dd, J = 8.9, 2.7 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 5.59 (s, 2H), 4.64 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.47 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.19 (p, J = 6.8 Hz, 2H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ: 160.43, 157.72, 157.48, 156.41, 154.00, 151.24, 147.57, 144.76, 134.71, 131.82, 131.22, 130.35, 129.76, 125.33, 124.88, 124.81, 124.77, 122.48, 115.08, 67.97, 58.13, 47.57, 29.60. MS (ESI): C23H19Cl2N6O2 +の計算値: 481.09, 実測値: 481.31 [M]+.
中間体(va)について示したように、上で得られた中間体(iiid)(300mg)のアルキル化を行い、中間体(ve)を黄色~褐色の固体として得た。収率: 90%。
13C NMR (101 MHz, DMSO-d6): δ 164.24, 157.40, 155.01, 148.55, 146.32, 144.93, 138.00, 133.80, 130.25, 129.79, 128.49, 125.96, 121.81, 117.61, 115.18, 114.91, 112.91, 67.78, 62.16, 24.54, 10.72.
本発明による方法では、対応するプロフルオロフォアがサンプル中の標的分子に結合したフォトレドックス触媒の近傍にあると、不溶性フルオロフォアの形成の検出によって、サンプル中の標的分子の検出が達成され、それにより、前記標的分子の検出及び定量化が可能になる。
標的分子に結合すべきフォトレドックス触媒を達成するために、前記フォトレドックス触媒で標識されたプローブは、標的分子に対して特異的親和性を有する必要がある。
フォトレドックス触媒へのプローブ、特に核酸プローブのカップリングは、Sadhu et al., 2013, 上記に記載される方法によって、又は以下に記載されるように、調製することができる。
光化学反応によりサンプル中のDNA標的分子を検出するための本発明の検出方法の一般原理を、図1に示されるように試験した。
各PNAプローブに相補的な領域を含む標的DNA分子の様々な濃度(60μlのリン酸緩衝生理食塩水pH7.4中、50nM、100nM、250nM、500nM、1000nM)を含有するサンプル(図1Ac)を、上記のように調製したPNAプローブ及び還元剤を含有する混合物と接触させ、プローブが標的DNAに結合して、ハイブリダイゼーションにより、標的DNA分子がビオチン及びルテニウムの両方で標識されている複合体が生じる。さらに、サンプルを、固定されたストレプトアビジンを含有するラテラルフローディップスティックの形態の係留化基材(図1Ad)と接触させて、試験ストリップ上を溶液が流れる間に、形成された複合体が、ストレプトアビジン-ビオチン相互作用により、ディップスティックの表面上に捕捉される(図1Af)。
ディップスティックを、サンプル溶液中に存在する本発明のプロフルオロフォアと接触させ、455nmのLEDランプを用いて5分間照射し、ディップスティック表面に結合したフォトレドックス触媒の位置でプロフルオロフォアとの間の光化学反応を促進し、化学結合切断をもたらし(図1Ag)、ディップスティック上に沈殿し、緑色蛍光帯を形成する対応するフルオロフォアの形成をもたらす(図1Ah)。
緑色蛍光フルオロフォアは、黒色光(365nmのUVランプ)下で係留化ディップスティック上で可視化することができ、標的DNAの濃度をそこから導き出すことができる。陰性対照は、光触媒標識PNAプローブの非存在下で実行する(図1B)。
本発明の方法を、2つのブタDNA断片に特異的なDNAプローブを用いて、サンプル中の豚肉起源の標的DNA配列を検出するその能力について試験した。
実施例2で同定された豚肉DNA特異的領域(CAGCCCGGAACCCTACTTGGCGATGATCAAATCTATAATG、配列番号3)に特異的な2つの異なる核酸配列を含む2つの「ベルクロ」プローブ。プローブ1(L'と称される)を、ストレプトアビジン-アガロースビーズの形態の係留化基材上に固定されたアンカーキャプチャーとして使用し、これは、標的DNA配列の一部(部分L)にハイブリダイズする配列番号1(CTTGGGATGAAC)の核酸配列を含む。プローブ2(R'と称される)を、標的DNAの一部(部分R)にハイブリダイズする配列番号2(CTACTAGTTTAGAT)の核酸を含む触媒プローブとして使用し、これは、実施例2に記載されるように、触媒(Ru(bpy)2Phen)にコンジュゲートさせた。
サンプル中のこのDNAの検出に使用されるためには、プローブは、標的DNA分子に対して特異的、選択的かつ高感度でなければならない。係留プローブ及び触媒プローブ上で、典型的には2又は3ヌクレオチドのみが特異的である。したがって、これらのわずかな違いを考慮すると、これまでに開発されたハイブリダイゼーション技術は、選択的ではない可能性があり、これは、プローブが豚肉DNAに特異的であり得るが、ウシDNAにも結合する可能性があり、その結果、使用したアッセイの偽陽性結果が生じることを意味する。
本発明の方法において使用される、可能性のある構築物のさらなる例を以下に提供する。
標的核酸の濃度が本方法の感度より低い場合があり得る。これは、食品の安全性(すなわち、サルモネラ(Salmonella)、カンピロバクター(Campylobacter)、リステリア(Lysteria)のような望ましくない細菌の検出)、又は微量の豚肉DNAが望ましくないハラール/コーシャ(Halal/Kosher)認証の枠組みに当てはまり得る。本方法が高感度を必要とする場合、特異的合成によって標的核酸の濃度を増加させることが可能である。第1のステップでは、標的dsDNA(すなわち、豚肉)を、この標的DNAの異なる領域(F1'及びR1')に特異的なプライマー(F1及びR1)を用いて増幅する。1つのプライマー(F1)は、ビオチンとコンジュゲートした、標的DNAの領域F1'に特異的なDNAプローブを含む係留化プローブであり、第2のプライマー(R1)は、フォトレドックス触媒(Ru bpy2 Phen)とコンジュゲートした、標的DNAの領域R1'に特異的なDNAプローブを含む触媒プローブである。増幅を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)又は任意の公知の等温反応によって行う。標的核酸がRNAベース(すなわち、A型肝炎ウイルス)である場合、逆転写活性を有するポリメラーゼが好ましいかもしれない。増幅の終わりに、一端にビオチンを、他端に触媒を含有するDNA配列が得られる(図5A)。
実施例6aでは、本発明による方法を用いた標的DNAの検出は、標的DNAの増幅に使用されるプライマーの選択に依存している。この制約は、鎖侵入戦略を採用して回避することができる。標的dsDNAの2つの特異的領域F1'及びR1'に相補的な核酸配列(例えば、PNA)を含む2つのプローブを設計する。第1のプローブは、標的DNA配列F1'に相補的な核酸配列F1を有し、係留化プローブC1'に相補的な核酸配列C1にコンジュゲートしている。第2のプローブは、標的DNA配列R1'に相補的な核酸配列R1を有し、触媒とコンジュゲートしたプローブR0'(触媒プローブ)に相補的な核酸配列R0にコンジュゲートしている(図6A)。
図7に例示されるように、標的DNAの混合物も、本発明による方法で検出することができる。
図7D)。
PNAの異なる立体化学(L、D)の使用を含む本発明の方法の例を以下に提供し、これにより、図9に示されるように、核酸鋳型化反応を迅速に進行させることが可能になる。以下のプローブを使用した:
- 標的DNA(二本鎖DNA、dsDNA)に相補的な、14マーγL-PNAオリゴマー;
- PEGリンカー、及び;
- 実施例2に従って調製された、係留化基材上に固定された7マーγD-PNAに相補的な、7マーγD-PNA。
- プローブ1の14マーγL-PNAとは異なるが、標的DNAに相補的な、14マーγL-PNAオリゴマー;
- PEGリンカー、及び;
- 実施例2に従って調製された、フォトレドックス触媒にコンジュゲートした(プローブ3の4マーγD-PNAに相補的な)、4マーγD-PNA。以下を含む、本発明のプロフルオロフォアのコンジュゲート3:
- 実施例2に従って調製された、式(I)の本発明によるプロフルオロフォアにコンジュゲートしたプローブ2の4マーγD-PNAに相補的な、4マーγD-PNA。
標的核酸配列の検出のための本発明の方法を実施するためのキットを以下に説明する。例えば、試験の前に増幅反応が行われた、標的核酸配列を検出するためのアッセイを実施することを可能にするキット(実施例7)、又は事前の増幅反応なしに、標的核酸を検出するためのアッセイを実施することを可能にし、したがって、サンプル調製(例えば、材料溶解物)及び増幅(プローブ、試験デバイス)に必要とされる材料を含むキットがある。例えば、以下を含む、キットが提供される:
- 任意選択で、再水和媒体;
- 任意選択で、増幅反応を実施するための、好ましくは増幅媒体の温度を増幅温度に維持することを可能にする、反応容器;
- 任意選択で、サンプルを破砕し、前記サンプルから標的分子を抽出するためのサンプル破砕機などのサンプリングデバイス;
- 例えば係留化プローブに対して親和性を有する係留化基材も含む試験ストリップのポーチに配置される、還元剤及び本発明によるプロフルオロフォア。
本発明の文脈内で可能なQPDとしての式(I')の様々なフルオロフォアの挙動を確認するために、以下の化合物を合成し試験した。
70mgの2-アミノベンズアミドアミド(0.51mmol)(vib)及び55μLのサリチルアルデヒド(viib)(0.51mmol)から出発して化合物(9)を合成し、以下に示されるように白色~黄色固体の最終生成物を得た。
13C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 161.84, 160.47, 154.17, 146.62, 135.51, 134.18, 128.18, 127.45, 126.54, 126.50, 121.22, 119.30, 118.34, 114.25.
メチル2-(4-ヒドロキシフェニル)アセテート(3.31g、20mmol)、パラホルムアルデヒド(3.3g、1:1重量)、及び塩化マグネシウム(1.85g、20mmol)を、75mlの乾燥アセトニトリルに懸濁した。トリエチルアミン(7mL、50mmol)を加え、反応を3時間還流した。完了したら、以下に示されるように、アセトニトリルを部分的に蒸発させ、残渣をジエチルエーテルに取り、1MのHClで抽出した。
メチル2-(3-(6-クロロ-4-オキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-2-イル)-4-ヒドロキシフェニル)アセテート(上記のようにして得られた化合物(10))(70mg、4.9mmol)から出発して、化合物(11)を合成し、該化合物は、ジオキサンと10%NaOH溶液(水中)の1:1混合物(合計10mL)に懸濁し、撹拌しながら80℃に加熱した。親化合物が完全に消費されるまで、加熱を6時間維持した。溶媒体積を蒸発により減少させ、残渣を逆相クロマトグラフィーにより精製して黄色溶液を得た。以下に示されるように、溶液のpHをHClで5に調整し、残渣をろ過し、冷水、次いで冷アセトンで洗浄した:
本発明の方法は、食料品(例えば、肉又はチーズ中に存在してもよい)、飲用調製物、医薬品、又は化粧品などのヒト又は獣医学的用途のための何らかの物質中のその存在について、標的細菌DNA断片の検出のために使用することができ、試験サンプルは、実施例6及び図5に記載されるように、等温DNA増幅(LAMP)に供される。
30mM NH4B5O8(五ホウ酸アンモニウム、Sigma)
40mM リンゴ酸(Sigma)
8mM Mg2SO4(Sigma)
0.8mM dNTPs(Promega)
0.8M ベタイン(5M溶液、PCR用、Sigma)
5% トレハロース(Sigma)
0.4U/マイクロリットル 鎖置換活性を有するポリメラーゼ(すなわち、Bst又はGspSSD) 0.0004U/マイクロリットル ピロホスファターゼApePPiase
0.1% Triton X-100
1.5マイクロM 専有プライマー
pH8.5 25℃にて
(付記)
(付記1)
式(I):
のプロフルオロフォア、又はその任意の互変異性体、異性体、コンジュゲート若しくは塩。
(付記2)
R 1 、R 3 ~R 5 、及びR 7 ~R 8 が、Hである、付記1に記載のプロフルオロフォア。
(付記3)
R 2 が、Clである、付記1又は2に記載のプロフルオロフォア。
(付記4)
R 2 が、Hである、付記1又は2に記載のプロフルオロフォア。
(付記5)
R 6 が、Clである、付記1~4のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア。
(付記6)
R 6 が、Hである、付記1~4のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア。
(付記7)
R 6 が、置換されたアミノC 1 ~C 10 アルキル、例えば、アルコキシカルボニルC 1 ~C 10 アルキルである、付記1~4のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア。
(付記8)
R 13 が、置換されていてもよいプロピル、特に、プロピル若しくはN-プロピルニトリル、並びに置換されていてもよいブチルから選択される、付記1~7のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア。
(付記9)
R 16 が、Hである、付記1~8のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア。
(付記10)
R 17 が、Hである、付記1~9のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア。
(付記11)
Zが、メチルである、付記1~10のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア。
(付記12)
Zが、-C(H)(エチル)である、付記1~8のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア。
(付記13)
以下の群:
(付記14)
式(I')
のフルオロフォアの調製方法であって、還元剤の存在下で、付記1~13のいずれか一項に記載のプロフルオロフォアを、遷移金属錯体フォトレドックス触媒と反応させるステップを含む、方法。
(付記15)
前記フルオロフォアが、
(付記16)
サンプル中の少なくとも1つの標的分子の検出方法であって、付記1~13のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア又はそのコンジュゲートを含む組成物を、前記サンプルと接触させるステップを含む、方法。
(付記17)
(i)前記標的分子がサンプル中に存在する場合に、プローブが前記少なくとも1つの標的分子に結合し、標的分子が係留化基材の表面上に係留されるのに適した条件下で、サンプルを、(1)前記少なくとも1つの標的分子に対する係留化基材、及び(2)前記少なくとも1つの標的分子に対するプローブと接触させるステップであって、前記プローブは、遷移金属錯体フォトレドックス触媒で標識されている、ステップ;
(ii)プロフルオロフォアが遷移金属錯体フォトレドックス触媒の近傍に位置する場合に、前記プロフルオロフォア又はそのコンジュゲートのフォトレドックス触媒作用を誘導するのに適した条件下で、還元剤の存在下で、付記1~13のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア又はそのコンジュゲートを含む組成物を、前記係留化基材と接触させるステップ;
(iii)前記係留化基材上の式(I')のフルオロフォアの形成を検出するステップであって、前記フルオロフォアの形成は、前記サンプル内の前記少なくとも1つの標的分子の存在を示す、ステップ
を含む、付記16に記載の方法。
(付記18)
前記ステップ(i)が、前記少なくとも1つの標的分子に結合すること、及び基材上の標的分子の係留化を確実にすることの両方が可能な、遷移金属錯体フォトレドックス触媒で標識された単一の種類のプローブの使用によって、又は(a)標的核酸配列の配列の一部、若しくは標的分子を認識する配列ストリングに共有結合した配列に対する相補的配列を特異的に認識し、基材上の標的分子の係留化を確実にするプローブ(「係留化プローブ」)、及び(b)遷移金属錯体フォトレドックス触媒で標識された、標的核酸配列の配列の一部、若しくは標的分子を認識する配列ストリングに共有結合した配列に対する相補的配列を特異的に認識するプローブ(「触媒プローブ」)などの、少なくとも2つの異なる種類のプローブの使用によって達成される、付記17に記載の方法。
(付記19)
プロフルオロフォアのコンジュゲートが、式(II):
のものである、付記16又は17に記載の方法。
(付記20)
付記19に定義される式(II)のものである、式(I)のプロフルオロフォアのコンジュゲート。
(付記21)
前記連結基が、(a)スペーシング部分、及び(b)ドッキング部分を含み、ドッキング部分(b)は、触媒プローブによって認識される領域の近傍において標的分子に結合するか、又はフォトレドックス触媒を、標的分子の領域を認識するプローブにコンジュゲートさせる基に結合し、スペーシング部分(a)は、ドッキング部分を本発明のプロフルオロフォアに共有結合させ、鋳型反応に有利な適切な形状を有する化学スペーサー、例えば、アルキルリンカー、ポリエチレングリコール、又はポリアミド鎖である、付記20に記載のコンジュゲート。
(付記22)
少なくとも1つのR 11c 、R 12b 、R 13a 、R 14g 、及びR 15d 基が、以下の式(III):
の連結基である、付記21に記載のコンジュゲート。
(付記23)
前記フルオロフォアが、以下の群:
から選択される、式(I')によるフルオロフォア。
(付記24)
サンプル中の少なくとも1つの標的分子の検出のためのキットであって、付記1~13のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア又はそのコンジュゲートと、任意選択で、還元剤、及び前記標的分子の検出のためのさらなるプローブから選択される少なくとも1つの薬剤とを含む、キット。
(付記25)
a)フォトレドックス触媒で標識された、標的分子に対して特異的親和性を有する少なくとも1つのプローブ(触媒プローブ);
b)プローブを支持体に固定するための基で標識された(係留化プローブ)、又は付記1~13のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア若しくは付記20~22のいずれか一項に記載のそのコンジュゲートで標識された、標的分子に対して特異的親和性を有する少なくとも1つのプローブ;
c)任意選択で、係留化プローブを介して標的分子を固定するための係留化支持体;
d)還元剤;
e)付記1~13のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア、又は付記20~22のいずれか一項に記載のそのコンジュゲート;
f)任意選択で、増幅反応を行うための少なくとも1つの容器、及び/又はサンプリングデバイス
を含む、付記24に記載のキット。
ブタDNAに特異的なプローブの核酸配列
配列番号1:
CTTGGGATGAAC
配列番号2:
CTACTAGTTTAGAT
配列番号3:
CAGCCCGGAACCCTACTTGGCGATGATCAAATCTATAATG
配列番号4:
CGCGACTTGATCCAG
配列番号5:
GCGCTGAACTAGGTCAGCCCGGAACCCTACTTGGCGATGATCAAATCTATAATGTAATTGTTACAGCTCATGCC
配列番号6:
GCCTGAATTAGGCCAACCCGGAACTCTGCTCGGAGACGACCAAATCTACAACGCAGTTGTAACCGCACACGCA
配列番号7:
GTGCTGAATTAGGCCAACCTGGGACCCTACTAGGAGATGATCAGATCTACAATGTCATTGTAACCGCCCATGCA
配列番号8:
GCGCAGAACTAGGACAACCAGGGACCCTTTTAGGGGACGACCAAATTTATAATGTAATCGTCACAGCCCATGCC
配列番号9:
GGTGCAGAACTGGGACAACCTGGGACACTCCTAGGAGACGACCAAATCTATAACGTAATCGTCACAGCCCATGC
配列番号10:
GCGCAGAACTAGGACAGCCCGGAACTCTCTTAGGAGACGATCAAATTTACAATGTAATCGTCACAGCCCATGCT
配列番号11:
GTGCTGAATTAGGTCAACCTGGGACCCTGCTGGGAGATGATCAGATCTACAATGTTATTGTAACTGCCCATGCA
配列番号12:
GAGCTGAACTAGGCCAACCCGGTAGTTTACTAGGTAGTGACCATATCTATAATGTCATTGTGACAGCCCATGCA
配列番号13:
GAGCCGAGCTGGGCCAGCCAGGCAACCTTCTAGGTAACGACCACATCTACAACGTTATCGTCACAGCCCATGCA
配列番号14:
GAGCTGAACTAGGACAGCCAGGCGCACTCCTAGGAGATGACCAAATCTATAATGTCATCGTCACAGCCCATGCA
配列番号15:
GAGCAGAATTAGGTCAACCAGGTGCACTTTTAGGAGATGACCAAATTTACAATGTTATCGTAACTGCCCATGCT
配列番号16:
GTGCTGAATTGGGGCAGCCTGGGACATTGCTTGGAGATGACCAAATCTATAATGTAGTTGTAACGGCTCATGCT
配列番号17:
GCGCTGAATTGGGACAGCCCGGGACGTTGCTTGGAGACGACCAAATCTATAACGTAGTTGTAACAGCTCATGCT
配列番号18:
GCGCCGAACTAGGCCAACCCGGAACTCTACTCGGAGATGACCAAATCTACAACGTAATTGTAACCGCACATGCA
配列番号19:
GCGCCGAACTAGGTCAACCCGGAACCCTACTTGGAGATGACCAGATCTACAATGTAATTGTAACTGCACACGCA
Claims (24)
- 式(I):
により表されるプロフルオロフォア化合物、又はその任意の互変異性体、幾何異性体若しくは塩。 - R1、R3~R5、及びR7~R8が、Hである、請求項1に記載のプロフルオロフォア化合物、又はその任意の互変異性体、幾何異性体若しくは塩。
- R2が、Clである、請求項1又は2に記載のプロフルオロフォア化合物、又はその任意の互変異性体、幾何異性体若しくは塩。
- R2が、Hである、請求項1又は2に記載のプロフルオロフォア化合物、又はその任意の互変異性体、幾何異性体若しくは塩。
- R6が、Clである、請求項1~4のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア化合物、又はその任意の互変異性体、幾何異性体若しくは塩。
- R6が、Hである、請求項1~4のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア化合物、又はその任意の互変異性体、幾何異性体若しくは塩。
- R6が、置換されたC1~C10アルキル、例えば、アミノC1~C10アルキル、又はアルコキシカルボニルC1~C10アルキルである、請求項1~4のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア化合物、又はその任意の互変異性体、幾何異性体若しくは塩。
- R13が、置換されていてもよいプロピル、例えば、プロピル若しくはN-プロピルニトリル、並びに置換されていてもよいブチルから選択される、請求項1~7のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア化合物、又はその任意の互変異性体、幾何異性体若しくは塩。
- R16が、Hである、請求項1~8のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア化合物、又はその任意の互変異性体、幾何異性体若しくは塩。
- R17が、Hである、請求項1~9のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア化合物、又はその任意の互変異性体、幾何異性体若しくは塩。
- Zが、メチルである、請求項1~10のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア化合物、又はその任意の互変異性体、幾何異性体若しくは塩。
- Zが、-C(H)(エチル)である、請求項1~8のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア化合物、又はその任意の互変異性体、幾何異性体若しくは塩。
- 以下の群:
から選択される、請求項1~12のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア化合物、又はその任意の互変異性体、幾何異性体若しくは塩。 - サンプル中の少なくとも1つの標的分子の検出のためのin vitro方法であって、請求項1~13のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア化合物、又はその任意の互変異性体、幾何異性体若しくは塩、又はそのコンジュゲートを含む組成物を、前記サンプルと接触させるステップを含み、プロフルオロフォア化合物の前記コンジュゲートが、式(II):
のものである、方法。 - (i)前記標的分子がサンプル中に存在する場合に、プローブが前記少なくとも1つの標的分子に結合し、標的分子が係留化基材の表面上に係留されるのに適した条件下で、サンプルを、(1)前記少なくとも1つの標的分子に対する係留化基材、及び(2)前記少なくとも1つの標的分子に対するプローブと接触させるステップであって、前記プローブは、遷移金属錯体フォトレドックス触媒で標識されている、ステップ;
(ii)プロフルオロフォアが遷移金属錯体フォトレドックス触媒の近傍に位置する場合に、前記プロフルオロフォア又はそのコンジュゲートのフォトレドックス触媒作用を誘導するのに適した条件下で、還元剤の存在下で、請求項1~13のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア、又はその任意の互変異性体、幾何異性体若しくは塩、又はそのコンジュゲートを含む組成物を、前記係留化基材と接触させるステップであって、前記コンジュゲートが、請求項16に記載される式(II)のものである、ステップ;
(iii)式(I'):
のフルオロフォア化合物、又はその任意の互変異性体、幾何異性体若しくは塩の前記係留化基材上における形成を検出するステップであって、前記フルオロフォア化合物、又はその任意の互変異性体、幾何異性体若しくは塩の形成は、前記サンプル内の前記少なくとも1つの標的分子の存在を示す、ステップ
を含む、請求項16に記載の方法。 - 前記ステップ(i)が、前記少なくとも1つの標的分子に結合すること、及び基材上の標的分子の係留化を確実にすることの両方が可能な、遷移金属錯体フォトレドックス触媒で標識された単一の種類のプローブの使用によって、又は(a)標的核酸配列の配列の一部、若しくは標的分子を認識する配列ストリングに共有結合した配列に対する相補的配列を特異的に認識し、基材上の標的分子の係留化を確実にするプローブ(「係留化プローブ」)、及び(b)遷移金属錯体フォトレドックス触媒で標識された、標的核酸配列の配列の一部、若しくは標的分子を認識する配列ストリングに共有結合した配列に対する相補的配列を特異的に認識するプローブ(「触媒プローブ」)などの、少なくとも2つの異なる種類のプローブの使用によって達成される、請求項17に記載の方法。
- 式(I):
により表されるプロフルオロフォア化合物、又はその任意の互変異性体、幾何異性体若しくは塩のコンジュゲートであって、前記コンジュゲートが、請求項16に記載される式(II)のものである、コンジュゲート。 - 前記連結基が、(a)スペーシング部分、及び(b)ドッキング部分を含み、ドッキング部分(b)は、触媒プローブによって認識される領域の近傍において標的分子に結合するか、又はフォトレドックス触媒を、標的分子の領域を認識するプローブにコンジュゲートさせる基に結合し、スペーシング部分(a)は、ドッキング部分を前記プロフルオロフォア化合物、又はその任意の互変異性体、幾何異性体若しくは塩に共有結合させ、鋳型反応に有利な適切な形状を有する化学スペーサー、例えば、アルキルリンカー、ポリエチレングリコール、又はポリアミド鎖である、請求項19に記載のコンジュゲート。
- サンプル中の少なくとも1つの標的分子の検出のためのキットであって、請求項1~13のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア化合物、又はその任意の互変異性体、幾何異性体若しくは塩、又はそのコンジュゲートと、任意選択で、還元剤、及び前記標的分子の検出のためのさらなるプローブから選択される少なくとも1つの薬剤とを含み、プロフルオロフォア化合物の前記コンジュゲートが、請求項16に記載される式(II)のものである、キット。
- a)フォトレドックス触媒で標識された、標的分子に対して特異的親和性を有する少なくとも1つのプローブ(触媒プローブ);
b)プローブを支持体に固定するための基で標識された(係留化プローブ)、又は請求項1~13のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア化合物、又はその任意の互変異性体、幾何異性体若しくは塩、又は請求項16~21のいずれか一項に記載のそのコンジュゲートで標識された、標的分子に対して特異的親和性を有する少なくとも1つのプローブ;
c)任意選択で、係留化プローブを介して標的分子を固定するための係留化支持体;
d)還元剤;
e)請求項1~13のいずれか一項に記載のプロフルオロフォア化合物、又はその任意の互変異性体、幾何異性体若しくは塩、又は請求項16~21のいずれか一項に記載のそのコンジュゲート;並びに
f)任意選択で、増幅反応を行うための少なくとも1つの容器、及び/又はサンプリングデバイス
を含む、請求項23に記載のキット。
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