CN103454235A

CN103454235A - 一种超声辅助测定血浆中细菌内毒素含量的方法

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Publication number: CN103454235A
Application number: CN2013104203689A
Authority: CN
Inventors: 陈校园; 李永桂; 邓永杰; 何楚华
Original assignee: GUANGZHOU KANG HUAI BIOLOGY SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Kangsheng Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2013-09-13
Filing date: 2013-09-13
Publication date: 2013-12-18
Anticipated expiration: 2033-09-13
Also published as: CN103454235B

Abstract

本发明涉及一种超声辅助测定血浆中细菌内毒素含量的方法，包括血浆制备，及无热原水稀释，然后加热处理，其特征在于在不同水浴加热温度及时间下，通过超声分散后采用显色基质法来检测血浆中的细菌内毒素含量。该检测方法具有灵敏度高、检测结果可靠和检测效率高的优点。

Description

一种超声辅助测定血浆中细菌内毒素含量的方法

技术领域

本发明涉及细菌内毒素检测技术领域，具体涉及了一种通过超声辅助测定血浆中细菌内毒素含量的方法。

背景技术

内毒素(endotoxin)，又称脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，是革兰氏阴性菌生长时释放和死亡时由细胞壁裂解产生的一类脂多糖类物质，是革兰阴性细菌外膜的重要组成部分，它和磷脂双层、脂蛋白等共同构成革兰阴性细菌的细胞外膜。LPS是一个由多糖和类脂A(lipid A)构成的生物大分子，整个分子可分成三个明确的区域：O-特异性多糖链(O-specific polysaccharide chain)，核心多糖(core polysaccharide)和Lipid A。细菌内毒素系在理化特性上属于兼具亲水性与疏水性的两性分子，携带正电与负电荷。内毒素是一类具有高度活性的分子，对机体具有广泛的生物学作用。内毒素对机体可引发一系列的毒害作用，是热原反应的主要诱因，极微量(纳克级)内毒素进入人体就会引起高热，血管扩张，甚至昏厥或死亡。内毒素血症是由于革兰氏阴性菌外细胞壁上的内毒素释放到血液中引起的，可出现于多种疾病过程中，如：大面积烧伤、重症肝炎、肝硬化等疾病。内毒素血症是临床最常见的致死疾病之一，其使机体免疫功能严重受损，并能引起休克、弥漫性血管内凝血、多器官功能衰竭等一系列严重的病理变化，最终导致器官坏死、不可逆休克和死亡。死亡率可达40％～90％。

由于内毒素含有负电荷、脂质和碳水化合物，因此血浆中已知许多蛋白质与内毒素结合并干扰鲎试验。具体说来，与内毒素结合的蛋白质在标准试验中可引起抑制或增强，导致假阳性和假阴性结果并影响精度。例如，丝氨酸蛋白酶抑制剂(如大豆胰蛋白酶抑制剂、α2纤维蛋白溶解酶抑制剂、α2巨球蛋白、抑肽酶、抗纤溶酶、抗凝血酶III、抗胰蛋白酶和水蛭素)妨碍内毒素的检测方法。常用的血浆标本干扰物的去除方法有：氯仿法，酸化法，稀释加热法，乙醚加热法和硫酸铵法。

目前检测内毒素的主要试剂是鲎试剂，基于鲎试剂的检测方法包括：凝胶法、显色法和浊度法。内毒素与鲎试剂接触后，能引发一系列的级联反应，最终激活鲎试剂中的凝固酶原，从而导致鲎试剂的凝固。凝胶法用于定性测试，显色法和浊度法可以用于内毒素的定量测定。显色基质法的敏感度与精确度均比其它方法优越，客观上已达到定量检测，并且仅需少量鲎试剂，是目前内毒素检测的最佳方法。

内毒素单体的分子量在10000道尔顿左右。有文献报道，内毒素分子很少能够解聚到单体，而倾向于以二聚体的形式稳定存在，因此内毒素单体的分子量为10000到20000道尔顿左右。以内毒素单体或二聚体为基本单位，在二价金属阳离子(如Ca²⁺，Mg²⁺)等作用下，会形成胶束(分子量可以从30万到100万道尔顿左右)或者胶囊(分子量大于100万道尔顿)。LPS在溶液中用漩涡振荡器一般达不到完全解聚的目的，从而影响血浆中的细菌内毒素含量检测的灵敏度和检测效率。

发明内容

本发明的目的是要提供一种测定血浆中细菌内毒素含量的方法，该方法中的血浆经过超声分散处理后，其内毒素分散均匀，有利于细菌内毒素的检测，从而提高检测的灵敏度和检测效率。

本发明提供的一种测定血浆中细菌内毒素含量的方法通过以下技术方案来实现：

一种测定血浆中细菌内毒素含量的方法，包括以下过程：血浆制备、稀释，取样进行热处理、冷却后分散处理，再与鲎试剂混合，通过显色基质法测定血浆中的内毒素，其特征在于该检测方法中的分散处理为超声处理。

上述血浆制备过程中得到的血浆可以为富血小板的血浆(PRP)或贫血小板的血浆(PPP)。稀释过程中使用的稀释剂为无热原水；稀释倍数为10倍。热处理过程中温度为25～100℃；热处理时间为5～15min。超声处理过程的超声频率为20～40kHz，超声时间为5～15min。

上述测定血浆中细菌内毒素含量的方法包括的具体步骤为：取含肝素钠抗凝剂的血液样本，在0℃～10℃下，以100倍重力加速度(g)离心10min后，吸出上层液得富血小板的血浆(PRP)，用无热原水制成10倍稀释液，25～100℃加热处理5～15min，再经冰浴冷却后，冰浴超声处理5～15min，超声频率为20～40kHz，即得检测样本I，最后取0.1ml检测样本与鲎试剂混合通过显色基质法测定血浆中的内毒素含量。

进一步地，上述方法还可以选用贫血小板的血浆替代，具体步骤为：取含肝素钠抗凝剂的血液样本，在0℃～10℃下，以1000倍重力加速度(g)离心10min后，吸出上层液得贫血小板的血浆(PPP)，用无热原水制成10倍稀释液，25～100℃加热处理5～15min，再经冰浴冷却后，冰浴超声处理5～15min，超声频率为20～40kHz，即得检测样本II，最后取0.1ml检测样本与鲎试剂混合通过显色基质法测定血浆中的内毒素含量。

所述血浆中细菌内毒素的检测方法，其采用的是终点显色基质光度测定法。

上述的超声辅助法也可以用于除血浆之外的其他体液细菌内毒素的检测，如脑脊液、尿液、腹水、乳汁或病灶组织渗出液的细菌内毒素的检测。

本发明提供的技术方案，其原理是：在适宜的条件下(温度，pH值及无干扰物质)，鲎试剂中的C因子被体液样本中的微量细菌内毒素激活，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺(pNA，λ＝405nm)。在一定时间内，pNA的生成量与细菌内毒素浓度成正相关，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。同时，对硝基苯胺(pNA)可用偶氮化试剂染成玫瑰红色(λ＝545nm)，避免了供试品本身的颜色对405nm处吸收峰的干扰。

本发明提供的技术方案具有如下有益效果：

1.本发明提供的稀释加热法，能消除血浆中的干扰成分，如蛋白酶类，菌体抗体类，抗凝血酶III，脂蛋白，尿激酶等对鲎试剂反应的干扰，避免内毒素处理剂的不足与麻烦，从而实现对血浆细菌内毒素的定性和定量检测。

2.本发明提供的超声辅助，使血浆中的细菌内毒素这种疏水物质能很好地溶解和分散在反应体系中，提供检测结果的可靠性。

3.本发明提供的检测方法，以血浆样本为例，进行十倍稀释，有利于消除干扰。

4.本发明提供的检测方法，一方面采用特定的血浆样本进行制备方法，有利于消除干扰，同时通过超声辅助，可以使内毒素均匀分散，有利于提高检测的准确性；另一方面，在检测过程中，采用外加已知浓度的内毒素标准溶液进行回收率检测试验，可进一步验证检测的准确性，从而确保人体液细菌内毒素检测的可靠性，实现对人体液细菌内毒素的定性、定量检测。

5.本发明提供的血浆细菌内毒素检测方法，其回收率检测试验测得的回收率达70％-120％，比国家标准要求的50％-200％更加准确，而且采用的本法的超声辅助血浆细菌内毒素检测，可以简便、快速的进行血浆细菌内毒素的检测，提高检测效率。

6.采用本发明提供的超声辅助进行血浆细菌内毒素检测，通过光度法测定，可实现对细菌内毒素的鉴别率达100％，同时具有检测灵敏度高的特点，达0.01EU/mL。

附图说明

附图1所示为血浆内毒素含量检测标准曲线图。

具体实施方式

本发明是通过下面的具体实施例进行描述，通过具体实施例可以更好的理解本发明，但是本发明的范围不受这些实施例的限制。

实施例1

细菌内毒素含量标准曲线制作：

步骤1、配制细菌内毒素标准溶液

标准曲线所采用的内毒素浓度梯度可以为0.01，0.025，0.05，0.075，0.1EU/mL或0.1，0.25，0.5，0.75，1.0EU/mL。其稀释方法如下(以0.1，0.25，0.5，0.75，1.0EU/mL梯度为例)：取细菌内毒素工作品1支，按细菌内毒素工作品使用说明书稀释为10EU/mL的内毒素溶液，再稀释为1.0EU/mL的内毒素溶液，以1.0EU/mL的内毒素溶液为母液按下表稀释成0.10，0.25，0.5，0.75，1.0EU/mL的浓度梯度，见表1。

表1、细菌内毒素标准溶液配制表

阴性对照为细菌内毒素检查用水。

步骤2、加样

加样步骤：取无热原试管，加入100μL细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液，或供试品，再加入100μL鲎试剂溶液，混匀，37℃温育10分钟，温育结束，加入100μL显色基质溶液，混匀，37℃温育6分钟，温育结束，加入500μL偶氮化试剂1溶液，混匀，加入500μL偶氮化试剂2溶液，混匀，最后加入500μL偶氮化试剂3溶液，混匀，静置5分钟，于545nm处读取吸光度值(见表2)。

表2、加样步骤列表

附：

显色基质：鲎试剂三肽(N-叔丁氧羰酰-L-白氨酸酰甘氨酰-L-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐溶液，Boc-Leu-Gly-Arg-pNA·HCl)；

偶氮试剂1溶液：含质量分数为0.04％的亚硝酸钠及浓度为0.48mol/L的盐酸溶液；

偶氮试剂2溶液：质量分数为0.30％的氨基磺酸铵溶液；

偶氮试剂3溶液：质量分数为0.07％的N-1-萘基乙烯基二胺盐酸盐溶液。

若制作内毒素浓度为0.01～0.1EU/mL的标准曲线，则加入100μL鲎试剂溶液混匀后，37℃温育50～60分钟，其它操作同上。

步骤3、检测与结果判断

样品经显色基质鲎试剂盒处理后，于545nm处读取吸光度，建立标准曲线：Y＝bX+a，其中Y为545nm处吸光度，X为内毒素的浓度，b为直线斜率，a为Y轴截距。

当实验数据同时满足三个条件时实验才有效：标准曲线的相关系数r≥0.980；标准曲线的最低点的Y值大于阴性对照的Y值；供试品平行管的平均值在标准曲线的区间内。

标准曲线制作中各组实验检测结果见表3，建立如附图1所示的标准曲线，建立的标准曲线方程为：Y＝1.6125X-0.0559，本实施例建立的标准曲线的相关系数r＝0.9963。

表3：标准曲线制作时各组实验检测结果列表

实施例2

超声辅助富血小板血浆内毒素含量检测法：

(1)取血液样本，在4℃下，以100g离心10min得到富血小板的血浆，用无热原水稀释10倍，75℃加热10min，冰浴冷却，20kHz下冰浴超声5min，即为检测样本。

(2)检测样本阳性液的制备：取步骤(1)制得的富血小板的血浆，先用无热原水5倍稀释，再按1∶4体积加入1.0EU/mL的细菌内毒素标准品溶液，混合均匀，制得0.5EU/mL的检测样本阳性液，备用。

(3)阳性对照液的制备：将细菌内毒素标准品用检查用水稀释成0.5EU/mL，备用。

(4)加样与检测

设置检测样本组、检测样本阳性组、阳性对照组和阴性对照组，每组设两个平行实验。每组按照表2加入相应的试剂。

样品经显色基质鲎试剂盒处理后，于545nm处读取吸光度。

将数据进行分析，根据实施例1建立的标准曲线方程，可计算出各实验组别所测得的细菌内毒素浓度。然后计算回收率，其公式为：回收率＝(C_s-C_t)*100％/C₀，其中C_s、C_t、C_o分别是检测样本阳性组、检测样本组、阳性对照组所测得的细菌内毒素浓度。

参见表4所示的检测样本及各对照组的检测结果，计算回收率：

回收率＝(C_s-C_t)*100％/C₀＝(0.53-0.011)*100％/0.55＝94.36％

实验结果分析：

在定量检测细菌内毒素时需要达到的要求是：标准曲线的相关系数r＞0.980；回收率要求在50％-200％之间，阴性对照的内毒素含量小于标准曲线的最低点浓度。

本实施例建立的标准曲线的相关系数r＝0.9920，比目前国际上规定的0.9800更加接近1；回收率为94.36％，在50％-200％范围内，且阴性对照检测值不大于标准曲线最低值，检测结果有效。

表4：检测样本及对照组的检测结果列表

实施例3

对比实验：无超声辅助富血小板血浆内毒素含量检测

(1)取血液样本，在4℃下，以100g离心10min得到富血小板的血浆，用无热原水稀释10倍，75℃加热10min，漩涡振荡器振5min，即为检测样本。

(2)检测样本阳性液的制备：取步骤(1)制得的富血小板的血浆，先用检查用水5倍稀释，再按1∶4体积加入1.0EU/mL的细菌内毒素标准品溶液，混合均匀，制得0.5EU/mL的检测样本阳性液，备用。

(3)阳性对照液的制备：将细菌内毒素标准品用无热原检查用水稀释成0.5EU/mL，备用。

(4)加样与检测

样品经显色基质鲎试剂盒处理后，于545nm处读取吸光度。

参见表5所示的检测样本及各对照组的检测结果，计算回收率：

回收率＝(C_s-C_t)*100％/C₀＝(0.31-0.009)*100％/0.45＝66.89％

实验结果分析：

本实施例建立的标准曲线的相关系数r＝0.9920，比目前国际上规定的0.9800更加接近1；回收率为66.89％，在50％-200％范围内，且阴性对照检测值不大于标准曲线最低值，检测结果有效。

表5、检测样本及对照组的检测结果列表

实施例4

对比实验：内毒素处理剂辅助富血小板血浆内毒素含量检测

(1)取血液样本，在4℃下，以100g离心10min得到富血小板的血浆，用内毒素处理剂稀释10倍，75℃加热10min，漩涡振荡器振5min，即为检测样本。

(2)检测样本阳性液的制备：取步骤(1)制得的富血小板的血浆，先用内毒素处理剂5倍稀释，再按1∶4体积加入1.0EU/mL的细菌内毒素标准品溶液，混合均匀，制得0.5EU/mL的检测样本阳性液，备用。

(4)加样与检测

样品经显色基质鲎试剂盒处理后，于545nm处读取吸光度。

参见表6所示的检测样本及各对照组的检测结果，计算回收率：

回收率＝(C_s-C_t)*100％/C₀＝(0.548-0.0116)*100％/0.565＝94.94％

实验结果分析：

本实施例建立的标准曲线的相关系数r＝0.9920，比目前国际上规定的0.9800更加接近1；回收率为94.94％，在50％-200％范围内，且阴性对照检测值不大于标准曲线最低值，检测结果有效。

表6、检测样本及对照组的检测结果列表

实施例5

各富血小板血浆内毒素含量检测法效果对比：

超声辅助、无超声(漩涡振荡器振)和内毒素处理剂的效果比较，见表7：

表7、超声辅助、无超声(漩涡振荡器振)和内毒素处理剂的效果对比列表

从表7的回收率比较结果可知，采用超声辅助测定富血小板血浆中的细菌内毒素含量与内毒素处理剂处理有同样理想的效果，但是无超声辅助的效果明显要差，同时在本发明中避免了如内毒素处理剂等的麻烦，因此，本发明采用的超声辅助测定富血小板血浆中细菌内毒素含量的检测方法具有简单、快速、灵敏度高、检测结果可靠和检测效率高的特点。

实施例6

超声辅助贫血小板血浆内毒素含量检测法：

(1)取血液样本，在4℃下，以1000g离心10min得到贫血小板的血浆，用无热原水稀释10倍，75℃加热10min，冰浴冷却，20kHz下冰浴超声5min，即为检测样本。

(2)检测样本阳性液的制备：取步骤(1)制得的贫血小板的血浆，先用无热原水5倍稀释，再按1∶4体积加入1.0EU/mL的细菌内毒素标准品溶液，混合均匀，制得0.5EU/mL的检测样本阳性液，备用。

(4)加样与检测

样品经显色基质鲎试剂盒处理后，于545nm处读取吸光度。

参见表8所示的检测样本及各对照组的检测结果，计算回收率：

回收率＝(C_s-C_t)*100％/C₀＝(0.51-0.012)*100％/0.53＝91.70％

实验结果分析：

本实施例建立的标准曲线的相关系数r＝0.9920，比目前国际上规定的0.9800更加接近1；回收率为91.70％，在50％-200％范围内，且阴性对照检测值不大于标准曲线最低值，检测结果有效。

表8：检测样本及对照组的检测结果列表(贫血小板的血浆)

实施例7

对比实验：无超声辅助贫血小板血浆内毒素含量检测

(1)取血液样本，在4℃下，以1000g离心10min得到贫血小板的血浆，用无热原水稀释10倍，75℃加热10min，漩涡振荡器振5min，即为检测样本。

(4)加样与检测

样品经显色基质鲎试剂盒处理后，于545nm处读取吸光度。

参见表9所示的检测样本及各对照组的检测结果，计算回收率：

回收率＝(C_s-C_t)*100％/C₀＝(0.29-0.008)*100％/0.43＝65.58％

实验结果分析：

本实施例建立的标准曲线的相关系数r＝0.9920，比目前国际上规定的0.9800更加接近1；回收率为65.58％，在50％-200％范围内，且阴性对照检测值不大于标准曲线最低值，检测结果有效。

表9、检测样本及对照组的检测结果列表(贫血小板的血浆)

实施例8

对比实验：内毒素处理剂辅助贫血小板血浆内毒素含量检测

(1)取血液样本，在4℃下，以1000g离心10min得到贫血小板的血浆，用内毒素处理剂稀释10倍，75℃加热10min，漩涡振荡器振5min，即为检测样本。

(2)检测样本阳性液的制备：取步骤(1)制得的贫血小板的血浆，先用内毒素处理剂5倍稀释，再按1∶4体积加入1.0EU/mL的细菌内毒素标准品溶液，混合均匀，制得0.5EU/mL的检测样本阳性液，备用。

(4)加样与检测

样品经显色基质鲎试剂盒处理后，于545nm处读取吸光度。

参见表10所示的检测样本及各对照组的检测结果，计算回收率：

回收率＝(C_s-C_t)*100％/C₀＝(0.528-0.0113)*100％/0.548＝94.29％

实验结果分析：

本实施例建立的标准曲线的相关系数r＝0.9920，比目前国际上规定的0.9800更加接近1；回收率为94.29％，在50％-200％范围内，且阴性对照检测值不大于标准曲线最低值，检测结果有效。

表10、检测样本及对照组的检测结果列表(贫血小板的血浆)

实施例9

各贫血小板血浆内毒素含量检测法效果对比：

超声辅助、无超声(漩涡振荡器振)和内毒素处理剂的效果比较，见表11：

表11、效果对比列表(贫血小板的血浆)

从表11的回收率比较结果可知，采用超声辅助测定贫血小板血浆中的细菌内毒素含量与内毒素处理剂处理有同样理想的效果，但是无超声辅助的效果明显要差，同时在本发明中避免了如内毒素处理剂等的麻烦，因此，本发明采用的超声辅助测定贫血小板血浆中细菌内毒素含量的检测方法具有简单、快速、灵敏度高、检测结果可靠和检测效率高的特点。

实施例10

超声辅助不同血浆内毒素含量检测法效果对比：

超声辅助富血小板和贫血小板的效果比较，见表12：

表12、超声辅助富血小板和贫血小板的效果对比列表

从表12的回收率比较结果可知，采用超声辅助测定富血小板或贫血小板血浆中的细菌内毒素含量有同样理想的效果，因此本发明所用的血浆可以为富血小板的血浆(PRP)或贫血小板的血浆(PPP)。

Claims

1.一种测定血浆中细菌内毒素含量的方法，包括以下过程：血浆制备、稀释，取样进行热处理、冷却后分散处理，再与鲎试剂混合，通过显色基质法测定血浆中的内毒素，其特征在于所述分散处理为超声处理。

2.根据权利要求1所述的测定血浆中细菌内毒素含量的方法，其特征在于所述血浆制备过程中得到的血浆为富血小板的血浆或贫血小板的血浆。

3.根据权利要求1所述的测定血浆中细菌内毒素含量的方法，其特征在于所述稀释过程中使用的稀释剂为无热原水；稀释倍数为10倍。

4.根据权利要求1所述的测定血浆中细菌内毒素含量的方法，其特征在于所述热处理过程中温度为25~100 ℃；热处理时间为5 ~15 min。

5.根据权利要求1所述的测定血浆中细菌内毒素含量的方法，其特征在于所述超声处理过程的超声频率为20~40 kHz，超声时间为5 ~15 min。

6.根据权利要求1所述的测定血浆中细菌内毒素含量的方法，其特征在于包括以下步骤：取含肝素钠抗凝剂的血液样本，在0℃~10℃下，以100倍重力加速度离心10 min后，吸出上层液得富血小板的血浆（PRP），用无热原水制成10倍稀释液，25~100℃加热处理5 ~15 min，再经冰浴冷却后，冰浴超声处理5 ~15 min，超声频率为20~40 kHz，即得检测样本I，最后取0.1ml检测样本与鲎试剂混合通过显色基质法测定血浆中的内毒素含量。

7.根据权利要求1所述的测定血浆中细菌内毒素含量的方法，其特征在于包括以下步骤：取含肝素钠抗凝剂的血液样本，在0℃~10℃下，以1000倍重力加速度离心10 min后，吸出上层液得贫血小板的血浆（PPP），用无热原水制成10倍稀释液，25~100℃加热处理5 ~15 min，再经冰浴冷却后，冰浴超声处理5 ~15 min，超声频率为20~40 kHz，即得检测样本II，最后取0.1ml检测样本与鲎试剂混合通过显色基质法测定血浆中的内毒素含量。

8.根据权利要求1所述的测定血浆中细菌内毒素含量的方法，其特征在于所述显色基质法采用的是终点显色基质光度测定法。

9.权利要求1-8中任一项的测定血浆中细菌内毒素含量的方法，所述方法也可以用于脑脊液、尿液、腹水、乳汁或病灶组织渗出液的细菌内毒素的检测。