KR101976964B1

KR101976964B1 - 면역 분석용 면역억제제 약물 추출 시약

Info

Publication number: KR101976964B1
Application number: KR1020177010977A
Authority: KR
Inventors: 펭보 우; 용얀 니에; 시아오주안 시
Original assignee: 상하이 인젝스 바이오테크놀로지 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2015-03-30
Filing date: 2015-05-29
Publication date: 2019-08-28
Also published as: US20180024124A1; JP6605627B2; JP2018507422A; US11573223B2; WO2016155111A1; KR20170069233A; CN104749009B; US20200232975A1; CN104749009A

Abstract

본 발명은 면역 분석용 혈액 샘플의 면역억제제 약물 추출 시약을 제공하고 추출 시약은 단백변성제와, 단백분해효소와, 계면활성제와, pH 완충용액을 포함한다. 본 발명은 상기 추출 시약을 이용하여 전혈 샘플 중의 면역억제제의 농도를 검출하는 방법 및 상기 추출 시약을 함유한 면역 검출 시약 키트를 더 제공한다. 본 발명의 추출 시약에 의하면, 전통적인 추출 방법 중의 유기용제를 사용할 필요가 없음으로 유기용제로 인한 검출 체계 중의 항체 활성에 대한 영향을 피할 수 있다. 본 발명에 따른 약물 추출 단계는 원심 처리를 수행할 필요가 없고 처리 후의 샘플을 직접 면역 검출에 응용할 수 있어 조작이 간단하고 검출 결과가 정확하고 높은 믿음성을 구비한다.

Description

면역 분석용 면역억제제 약물 추출 시약{IMMUNOSUPPRESSANT DRUG EXTRACT REAGENT FOR IMMUNOASSAY}

본 발명은 체외 진단 약제 분야에 관한 것으로, 특히 환자의 혈액 샘플 중의 면역억제제 농도 수준을 측정하기 위한 개선된 면역억제제의 약물 추출 시약 및 추출 시약을 이용한 추출 방법과 면역 검출 시약 키트에 관한 것이다.

면역억제제(Immunosuppressant)는 세포 및 체액의 면역 반응을 억제함으로써 조직 손상을 감소하는 화학 또는 생물 물질로 기관이식후의 거부반응 방지와 자신의 면역성 질병(예를 들어 류머티즘, 홍반성 낭창, 강직성 척추염, 자가면역성 용혈성 빈혈 등)에 널리 이용되고 있다.

현재, 상용되고 있는 면역억제제는 주로 미생물 대사산물, 당질 코르티코이드, 항대사물질, 항 림프구 항체, 알킬화제 등 5가지가 있고, 그 중 타크롤리무스(Tacrolimus，FK506), 사이클로스포린(Cyclosporin A，CsA), 라파마이신(Rapamycin，RPM) 등 미생물 대사산물이 가장 널리 응용되고 있으며 주로, 세포질내의 칼시뉴린의 활성을 억제함으로써 IL2 등 일련의 세포 인자의 전사을 차단하여 면역 억제 작용을 발휘하고 T 림프구의 활성화와 증식을 유효하게 억제한다.

이식 환자의 임상 치료의 경우, 면역억제제의 혈액 농도가 낮으면 면역 거부가 발생하고 면역억제제의 혈액 농도가 높으면 간장, 신장 등 기관에 독성을 발생하여 간염, 종양 등 일련의 좋지 않은 임상 사건이 발생함으로 이식 환자가 면역억제제를 합리적으로 사용하도록 할 경우, 혈액 농도를 정밀하게 검출해야 한다. 타크롤리무스, 시롤리무스, 사이클로스포린A 등 상용되는 면역억제제는 구조가 서로 다르지만 혈액에 있어서 모두 단백 결합물 방식으로 적혈구에 존재하고 이러한 면역억제제의 혈중 농도를 정밀하게 검출하려면 반드시 면역억제제를 결합된 단백으로부터 분리시켜야 하는데 이것은 이러한 면역억제제의 혈중 농도를 검출할 경우의 공통 요구이다.

현재의 면역억제제의 혈중 농도를 검출하는 방법은 주로, 수용체 결합 방법, HPLC- 액체 크로마토그래피/질량분석법(HPLC-MS), 미립자 효소 면역 측정(MEIA), 화학 발광 미립자 면역 측정(CMIA) 및 효소 결합 면역 흡착법(ELISA) 등이 있다. 여기서, 수용체 결합 방법은 주로 약물 연구에 이용되고 HPLC-MS 방법은 혈중 농도의 검출이 정밀하고 민감하지만 조작이 번거롭고 검출 시간이 길며 검출 단가가 높고 고가의 기기를 필요로 하므로 주로 과학 연구 분야에 이용되거나 또는 참조 방법으로 인정받고 있다. MEIA와 CMIA는 현재 상용되고 있는 검출 방법으로 검출의 자동화 수준이 높고 검출 결과가 정확하다. 하지만 상기 방법은 검출 중에 모두 메틸알코올, 아세토나이트릴, 에테르 등 유기용제를 추출 시약의 샘플로 하여 세포와 추출 약물을 용해시키고 그 추출 단계는 실험 조작과 실험후 처리가 불편하고 면역 검출의 감도와 정확성도 일정하게 저하시키고, 이것은 면역 반응 체계에 들어간 유기용제가 항체-약물 사이의 면역 결합 반응을 억제하는 것을 방지할 수 없어 항체의 결합력을 저하시키고 검출 감도를 저하시키기 때문이다. 그리고, 추출 시약 중의 유기용제가 휘발하여 약물 농도를 변동시키고 검출 결과의 정확성에 영향을 주게 된다.

유기용제로 인한 항체 결합 FK506에 대한 억제 작용을 절감시키기 위하여, Robert W.Siegel 등 사람들(Clinical Chemistry，2008, 54:6,1008-1017；Pat. No.: US 8022188 B2)은 유전자 돌연변이 방식으로 항체의 상보성결정부위를 개선함으로써 검출 감도를 개선하였다. 하지만 이 방법은 핵산 추출, 확장, 순서 측정, 유전자 돌연변이, 클론 선별 등 복잡한 단계가 필요로 되고 실용성이 낮다. 유기용제의 휘발로 인한 약물 농도의 변동을 저하시키기 위하여, Frank C.Grenier 등 사람들은 저휘발성의 DMSO로 혈액 약물 추출 시약(US 2008/0020401 A1)을 제조하였는데 이 방법에 이용되는 DMSO도 면역 검출 체계 중의 항체-약물 사이의 결합 반응을 엄중하게 억제하여 검출 감도를 저하시킨다. 그리고, 상기한 모든 유기용제 추출 시약과 같이 추출 시약의 용해 작용이 고농도의 2가 금속 이온(10mM 내지 100mM)에 의존하고 또한 2가 금속 이온의 농도가 변화되면 추출 효과도 변화함으로 전혈 샘플에 상용되는 착화합물 항응고제(예를 들어 EDTA)의 농도가 변화하여 추출 시약 중의 2가 금속 이온의 농도가 변화되어 서로 다른 샘플 약물에 의한 추출 효과가 서로 다르고 측정 오차가 생기게 된다.

상기 추출 시약으로 처리한 후의 샘플은 모두 불균질성 용액임으로 사용하기 전에 원심 처리를 통하여 고체의 이물질을 제거하여야 하고 이 단계 역시 조작의 난이도를 증가시키고 검출 시간을 연장시킨다.

유기용제로 인한 면역 검출에 대한 영향을 피하기 위하여, Francois Legay 등 사람들은 RAPA를 FK506로 한 치환 시약의 FK506 검출 방법(미국 특허 제6187547 B1호)을 제시하였다. FK506과 RAPA가 혈액 중에서 모두 FKBP(FK 결합 단백)과 결합하고 소량이 혈청 알부민과 지질단백질과 결합하며 또한, 고지용성의 FK506과 RAPA가 모두 세포막을 고속으로 통과할 수 있음으로 면역 분석 체계 중의 고농도의 RAPA는 고속으로 유효하게 혈액 중의 FK506을 치환할 수 있고 용해와 단백 변성을 필요로 하지 않는다. 항FK506 항체의 고도의 특이성으로 인하여 고농도의 RAPA가 FK506의 면역 검출을 간섭하지 않는다. 약물 추출을 수행할 필요가 없음으로 이 방법에 의하면 FK506을 검출하는 것이 가장 간단하고 편리하며 간섭 인자를 함유하지 않는 대부분의 샘플은 정확하게 검출할 수 있지만 일부 간섭이 강한 샘플, 특히 항체계 면역억제제를 이용한 환자의 샘플의 경우, 대응되는 간섭대책을 취하여도 이 방법으로 FK506을 검출할 경우 여전히 큰 오차가 생기게 된다.

따라서 면역억제제의 혈중 농도의 검출에 대하여 유기용제의 사용을 피하면서 정확하고 고속으로 간단하게 약물 농도를 검출할 수 있는 약물 추출 방법이 필요하다. 현재 국내외에서 상기 특징을 구비한 추출 시약과 추출 방법에 대한 보도는 없다.

유기용제로 약물을 추출할 경우의 상기 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 새로운 면역 분석에 이용되는 혈액 샘플의 면역억제제 약물 추출 시약과 방법을 제공한다. 상기 약물 추출 시약은 단백변성제와, 단백분해효소와, 계면활성제와, pH 완충용액으로 구성된다. 상기 추출 방법은 샘플과 추출 시약을 일정한 비율로 혼합하여 부화시키고 단백변성제와 단백 효소의 작용하에서 세포를 용해시켜 세포 내의 약물을 방출시키는 것을 포함한다. 본 발명에 의하면, 유기용제를 사용할 필요없이 혈액 세포를 유효하게 용해시켜 세포 내의 약물을 방출시킬 수 있다. 기존의 추출 시약에 비하여 본 발명에서 제공하는 약물 추출 시약과 방법에 의하면 용제 휘발로 인하여 약물 농도가 변화되는 문제를 피하면서 용액 매체의 항체-약물 사이의 면역 결합에 대한 억제 작용도 확실히 저하시킬 수 있다. 그리고, 본 방법으로 처리한 후의 전혈 샘플은 투명한 균질성 용액으로 처리 후의 샘플을 직접 사용할 수 있고 원심 처리를 수행할 필요가 없으며 샘플 처리 단계를 유효하게 간소화하고 검출 시간을 단축시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 첫번째 목적은 혈액 샘플로부터 면역억제제를 추출하는 추출 시약을 제공하는 것이다.

본 발명의 두번째 목적은 혈액 샘플 중의 면역억제제의 농도를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 세번째 목적은 혈액 샘플 중의 면역억제제의 농도를 검출하는 시약 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 실현하기 위하여 본 발명은 하기와 같은 기술방안을 제공한다.

본 발명의 제1측면에 따르면, 단백변성제와, 단백분해효소와, 계면활성제와, pH 완충용액을 포함하는 혈액 샘플로부터 면역억제제를 추출하는 추출 시약을 제공한다.

본 발명에 의하면, 상기 단백변성제는 요소, 염산구아니딘, 또는 기타 비 유기용제계 단백변성제로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 단백변성제는 요소이다.

본 발명에 의하면, 추출 시약 중의 상기 요소의 농도는 4㏖/ℓ 내지 12 ㏖/ℓ이고 상기 추출 시약 중의 상기 염산구아니딘의 몰 농도는 1㏖/ℓ 내지 8㏖/ℓ이며, 또한, 상기 추출 시약 중의 상기 요소의 농도가 6㏖/ℓ 내지 8㏖/ℓ이고 상기 추출 시약 중의 상기 염산구아니딘의 몰 농도가 2㏖/ℓ 내지 6㏖/ℓ인 것이 바람직하다.

본 발명에 의하면, 상기 단백분해효소는 고초균 단백 효소, 단백 효소K, 디스파아제 등 단백 효소계 또는 그 혼합물로부터 선택되고, 상기 단백분해효소가 고초균 단백 효소인 것이 바람직하다.

본 발명에 의하면, 상기 추출 시약 중의 상기 고초균 단백 효소의 량은 1U/㎖ 내지 20 U/㎖이고 2.5U/㎖ 내지 10U/㎖인 것이 바람직하다.

본 발명에 의하면, 상기 계면활성제는 트윈 20, 사포닌, Triton X-100로부터 선택되는 한가지 또는 여러 가지이고 트윈 20인 것이 바람직하다.

본 발명에 의하면, 상기 추출 시약 중의 상기 트윈 20의 체적비율은 0.005% 내지 1%(v/v)이고 0.02% 내지 0.1%(v/v)인 것이 바람직하다.

본 발명에 의하면, 상기 pH 완충용액의 pH는 6.5 내지 8.5 사이이고 7.0 내지 8.0인 것이 바람직하다.

본 발명의 제2측면에 의하면, 상기한 추출 시약을 이용하여 가열 조건하에서 혈액 샘플을 처리하고, 단백변성제, 단백분해효소, 계면활성제의 공동 작용하에 혈액 세포를 용해시켜 약물을 방출하는 동시에, 혈액 샘플을 원심 처리가 필요없고 직접 면역 분석에 이용할 수 있는 균질성 용액으로 변환시켜 정확한 면역억제제의 약물 농도를 얻는 것을 포함하는 혈액 샘플 중의 면역억제제의 약물 농도를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 의하면, 상기 면역억제제는 타크롤리무스와, 시롤리무스와, 에베롤리무스(Everolimus)와, 조타롤리무스(zotarolimus)와, 사이클로스포린(cyclosporine) 또는 기타 구조 유사물을 포함한다.

본 발명에 의하면, 상기 혈액 샘플은 기관 이식 환자 또는 기타 면역억제제를 복용한 환자의 것이다.

본 발명에 의하면, 상기 추출 시약과 혈액 샘플을 혼합할 경우, 상기 혈액 샘플과 상기 추출 시약의 체적비율은 1/1 내지 1/10이고 1/2 내지 1/5인 것이 바람직하다.

본 발명에 의하면, 상기 가열 방식으로 혈액 샘플을 처리할 경우, 가열 온도는 50℃ 내지 90℃이고 60℃ 내지 80℃인 것이 바람직하다.

본 발명에 의하면, 상기 가열 방식으로 혈액 샘플을 처리할 경우, 가열 시간은 5min 내지 50min이고 10min 내지 30min인 것이 바람직하다.

본 발명에 의하면, 상기 추출 시약과 추출 방법의 작용은 세포를 용해시켜 약물을 방출하여 혈액 샘플을 균질성 용액으로 변환시키는데 있다.

본 발명에 의하면, 상기 면역 분석은 경쟁 면역 분석 방법으로, 그 실시형태는 혈액 샘플 중의 면역억제제와 고정량의 면역억제제가 공동으로 경쟁하여 한정수량의 항 면역억제제 항체에 결합되는 것이다.

본 발명에 의하면, 상기 면역 분석은 고상(solid phase) 면역 분석 방법을 이용하고 그 실시형태는 고상 용기의 표면에 면역 시약을 고정시키고 경쟁하여 결합 반응을 완성한 후, 검출 시약을 세척, 분리, 검출 시약의 유리 및 결합을 통하여 검출 대상의 농도를 검출하는 것이다.

본 발명에 의하면, 상기 고상 용기는 미세공, 시험관 또는 기타 형식의 용기를 말한다.

본 발명에 의하면, 상기 면역 분석은 하기 단계를 포함한다:

1) 혈액 샘플을 처리한다. 샘플과 추출 시약을 혼합하고 가열한 후 실온으로 회복시킨다.

2) 면역 반응시킨다. 면역 시약을 고정한 고상 용기에 처리후의 샘플과, 표기한 항 면역억제제 항체와 고정량의 면역억제제를 투입하고, 또는, 처리후의 샘플과, 표기한 고정량의 면역억제제와 항 면역억제제 항체를 투입하고 고정량의 면역억제제와 샘플 중의 면역억제제가 경쟁하여 한정수량의 항 면역억제제 항체에 결합되고 면역 복합물은 동시에 고상 시약에 의하여 포획된다.

3) 분리한다. 분리된 유리 검출 시약과 결합된 검출 시약을 세척한다.

4) 검출한다. 고상 시약이 포획한 면역 복합물에 포함된 트레이서에서 발생되는 신호를 검출하고 신호 강도와 면역억제제 농도의 관계 곡선(교정 곡선)을 통하여 면역억제제의 농도를 측정한다.

상기한 혈액 샘플은 항응고 전혈 샘플을 말하고 EDTA-K(Na)와, 구연산나트륨(칼륨)과, 헤파린 항응고 전혈 샘플을 포함하고 EDTA-K(Na) 항응고 전혈인 것이 바람직하다.

본 발명의 제3측면에 의하면, a) 항 면역억제제 항체와, b)상기한 추출 시약과, c) 면역억제제와, d) 교정품과, e) 완충용액을 포함하는 혈액 샘플 중의 면역억제제 농도를 검출하는 시약 키트을 제공한다. 여기서, 면역억제제 항체 또는 면역억제제는 트레이서제로 표기하고 검출 시약으로 한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 항 면역억제제 항체는 특이하게 면역억제제 약물에 결합 가능한 항체를 말하고, 다클론성 항체 또는 단클론성 항체일 수 있고 단클론성 항체인 것이 바람직하다.

본 발명에 의하면, 상기 추출 시약은 단백변성제와, 단백분해효소와, 계면활성제와, pH 완충용액으로 구성된다.

본 발명에 의하면, 상기 검출 시약은 트레이서로 표기한 항체, 항원 또는 면역억제제 반항원을 말한다.

본 발명에 의하면, 상기 트레이서는 검출 가능한 신호를 발생할 수 있는 물질을 말하고 효소와, 화학 발광 물질과, 방사성 물질과, 형광 물질과, 예를 들어 Eu³⁺, Sm³ ⁺, Tb³ ⁺, Dy³ ⁺ 등 희토류 이온과, 이들의 킬레이트 리간드를 포함하고 바이오틴, 디곡신 등 소분자 간접 트레이서일 수도 있다.

본 발명에 의하면, 상기 완충 용액은 pH 완충용액과, 단백질과, 계면활성제와, 검출 간섭 제거제로 구성되고, 검출 시약을 희석시켜 백그라운드 신호를 검출하거나 이호항체를 제거하는 등 검출에 대한 간섭 물질의 영향을 저하시킨다.

본 발명에 의하면, 상기 교정품은 농도을 파악한 면역억제제를 함유한 용액 또는 냉동 건조 제품을 말하고 교정 곡선을 구축하는데 이용된다. 매트릭스 효과를 저하시키기 위하여 본 발명에 있어서 사람의 전혈을 기질로 하여 교정품을 제조한다.

본 발명에서 제공하는 혈액 샘플 추출 시약은 전통적인 유기용제에 기반한 추출 시약의 하기와 같은 장점을 보류하였다:

동일하게 세포를 고속으로 용해시켜 약물을 방출하는 효과를 가지고,

동일하게 샘플 간섭 물질을 비활성화하는 효과를 가지며, 추출 시약의 작용하에서 샘플 중의 이호항체, 류머티즘 인자 등 간섭 물질은 모두 유효하게 비활성화되고,

이와 동시에 본 발명에서 제공하는 샘플 추출 시약은 또한 전통적인 유기용제에 기반한 추출 시약이 구비하지 못한 하기 장점을 구비한다:

1) 유기용제를 함유하지 않음으로 유기 시약이 휘발되어 약물 농도에 영향을 미치는 것을 피할 수 있고,

2) 유기용제를 함유하지 않음으로 추출 매체의 항체 결합 약물에 대한 억제 작용을 유효하게 저하시키고 샘플의 추출과 실험을 수행한 후의 샘플 처리가 더욱 간단하고,

3) 2가 금속 이온을 함유하지 않음으로 서로 다른 샘플 사이에서 복합 작용을 구비하는 항응고제의 농도 차이로 인한 약물 추출 효과에 대한 영향을 제거할 수 있고,

4) 처리후의 혈액 샘플이 모두 균질성 용액임으로 원심 처리를 수행할 필요없이 직접 검출할 수 있어 조작을 간소화하고 검출 시간을 단축시키며,

5) 믿음성이 더욱 높은 검출 결과를 얻을 수 있고,

6) 상기 특성에 기반하여 본 발명에서 제공하는 추출 시약의 검출 방법을 더욱 간단하게 전자동 검출 기기에 응용할 수 있으며 또는 본 발명에서 제공하는 추출 시약의 검출 방법에 기반하여 이에 적합한 전자동 검출 기기를 더욱 간단하게 개발할 수 있다.

본 발명의 상기한 면역억제제 추출 시약의 유효성은 효율적인 세포 용해, 단백 변성과 이에 대응되는 약물 방출 능력에 기반한 것이다. 따라서 본 발명은 사람의 혈액 샘플의 면역억제제 추출에 응용될 수 있을 뿐만 아니라 사람의 혈액과 각종 동물의 혈액 샘플의 면역억제제외의 기타 체내에서 결합 상태인 약물 또는 약물이 아닌 물질의 추출에 응용될 수도 있다.

도 1은 추출 시약 중의 농도가 다른 트윈 20으로 인한 FK506 추출 효과에 대한 영향을 나타내djT다.
도 2는 추출 시약 중의 농도가 다른 단백변성제로 인한 FK506 추출 효과에 대한 영향을 나타내었다.
도 3은 추출 시약 중의 농도가 다른 단백 효소로 인한 FK506 추출 효과에 대한 영향을 나타내었다.
도 4는 샘플 추출중의 서로 다른 부화 온도로 인한 교정 곡선에 대한 영향을 나타내었다.
도 5는 서로 다른 부화 시간으로 인한 교정 곡선에 대한 영향을 나타내었다.
도 6은 서로 다른 3가지 전처리액으로 인한 교정 곡선에 대한 영향을 나타내었다.
도 7a는 본 발명의 상기 추출 시약에 기반한 FK506-TRFIA 검출값과 HPLC-MS 측정값의 상관성을 나타내었다.
도 7b는 ABBOTT-i2000 전처리액에 기반한 FK506-TRFIA 검출값과 HPLC-MS 측정값의 상관성을 나타내었다.
도 7c는 소린 전처리액에 기반한 FK506-TRFIA 검출값과 HPLC-MS 측정값의 상관성을 나타내었다.

특별한 설명이 없는 한 특허청구범위와 명세서에서 사용되는 용어는 하기와 같이 정의된 것이다.

Ⅰ, 면역억제제

본 발명 중의 상기 면역억제제는 신체의 면역 세포의 증식과 관련 기능을 억제하고 신체의 면역 반응을 저하시킬 수 있는 각종 약물을 말한다. 본 발명 중의 상기 면역억제제가 타크롤리무스, 시롤리무스, 에베롤리무스, 타크롤리무스 또는 사이클로스포린을 말하는 것이 바람직하다.

Ⅱ, 추출 시약

본 발명 중의 상기 추출 시약은 단백변성제, 단백분해효소, 계면활성제, pH 완충용액으로 구성된 혼합물이다. 단백변성제와, 단백분해효소와, 계면활성제가 공동으로 작용하여 세포를 고속으로 용해시켜 단백 결합의 면역억제제를 방출한다.

Ⅲ, 면역억제제의 추출

본 발명 중의 상기 면역억제제의 추출은 상기한 추출 시약을 이용하여 샘플 중의 결합 상태의 약물을 추출하여 성분을 검출할 수 있게 하는 과정을 말한다.

측정 대상의 혈액 샘플과 추출 시약을 적당한 비율로 혼합한다. 10㎕ 내지 50㎕ 혈액 샘플과 50㎕ 내지 200㎕ 추출 시약을 혼합하는 것이 바람직하고, 25㎕ 혈액 샘플과 170㎕ 추출 시약을 혼합하는 것이 더욱 바람직하다. 균일하게 와류 혼합한 후, 가열하여 부화시킨다. 선택되는 부화 온도는 단백분해효소가 작용을 발휘하는데 가장 적합한 온도이고 선택되는 부화 온도와 부화 시간은 면역억제제의 충분한 해리를 보장하는 동시에 단백분해효소를 유효하게 비활성화시킬 수 있는 것이어야 한다. 일반적으로 부화 온도는 50℃ 내지 90℃이고 부화 시간은 5min 내지 50min이며, 60℃ 내지 80℃에서 10min 내지 30min 부화시키는 것이 바람직하다. 부화가 끝난 후, 혈액 샘플과 추출 시약의 혼합물은 균질성 용액이고 직접 면역 분석에 응용할 수 있다.

Ⅳ, 면역 검출

면역 검출은 항체-항원(또는 반항원) 사이의 특이한 결합 반응을 이용하여 각종 물질을 검출하는 분석 방법을 말한다. 본 발명 중의 상기 면역 검출은 면역억제제의 정량을 측정한다. 상기 면역 검출 시약 키트는 주로 추출 시약과, 항체와, 측정 대상물과 경쟁하여 항체에 결합되는 고정량의 측정 대상물과, 완충용액을 분석하는 교정품을 포함한다. 검출모드의 차이에 따라 표기 항체 또는 측정 대상물을 선택할 수 있다.

본 발명 중의 상기 추출 시약의 유효성은 효율적인 세포 용해, 단백 변성과 이에 대응되는 약물 방출 능력에 기반한 것이다. 따라서 본 발명은 사람의 혈액 샘플의 면역억제제 추출에 응용될 수 있을 뿐만 아니라 사람의 혈액과 각종 동물의 혈액 샘플의 면역억제제외의 기타 결합 상태의 약물 또는 약물이 아닌 물질의 추출에 응용될 수도 있다. 테스트 샘플이 면역억제제를 복용한 환자의 항응고 전혈 샘플인 것이 바람직하다.

본 발명의 면역 검출 시약 키트는 본 시약 키트의 조작을 설명하는 설명서를 포함한다. 상기 설명서를 외부 포장 재료에 고정시킬 수 있고 또는 따로 한장의 용지 형식으로 시약 키트에 놓여있을 수 있다. 상기 설명서는 인쇄물 또는 손으로 쓴 문자형식의 재료일 수도 있고, 또는 본 설명서를 기억하여 그 정보를 단말 사용자에 전단할 수 있는 매체, 예를 들어 광디스크, 자기디스크 등 전자기억매체일 수도 있고 이에 한정되는 것은 아니다.

요소는 상기 추출 시약의 주요 성분이다. 상용되는 단백변성제인 요소는 고농도에서 단백질 골격 상의 두개 인접한 펩타이드 결합의 카보닐기 산소 원자와 양수소 결합을 형성하여 단백질의 2, 3급 구조를 파괴하고 단백질 사슬을 충분히 신장시키며 단백질의 원래 물리 화학적 성질과 생물 활성을 상실하게 된다. 한편 요소가 저농도일 경우, 단백질 변성에 대한 요소의 작용이 현저하게 저하된다. 요소의 이 특성이 기반하여 6㏖/ℓ 내지 10㏖/ℓ의 고농도의 요소로 세포를 용해시키고 혈액의 단백을 변성시키며 면역억제제를 방출할 수 있다. 이와 동시에 요소를 함유한 소량의 추출 시약 샘플을 반응 용기에 투입한 후, 완충용액으로 희석시켜 요소의 농도를 원래 농도의 1/10 내지 1/5로 저하시키면 반응 용기 내의 항체 활성에 대한 요소의 영향이 현저하게 저하된다.

고초균 단백 효소는 본 발명 중의 상기 추출 시약의 다른 한 주요 성분이다. 고초균 단백 효소는 60℃ 내지 80℃에서 최대의 단백 가수분해 활성을 발휘할 수 있고 이 온도에서 효소의 활성이 고속으로 저하(우수일(牛樹), 한보금(韓芹). 고초균 단백 효소의 순화 및 효소학 성질, 생물 기술 세계, 2014,3,11 내지 12)되므로 이 온도 구간에서 고초균 단백 효소는 단기간 내에 효소 분해 작용을 발휘하고 세포 용해와 단백 변성을 촉진할 수 있으며, 이와 동시에 그 과정에 있어서 효소는 일부가 비활성화된다. 그리고, 효소를 함유한 추출 시약을 실온으로 냉각시키면 효소의 활성도 온도가 저하됨에 따라 저하된다(우수일(牛樹), 한보금(韓芹). 고초균 단백 효소의 순화 및 효소학 성질, 생물 기술 세계, 2014,3,11 내지 12). 그리고, 소량의 추출 시약 샘플을 반응 용기에 투입한 후, 단백 효소가 완충용액에 의하여 희석된다. 이상의 3가지 원인으로 인하여 추출 후의 샘플 내에 남은 효소의 활성으로 인한 반응 용기내의 항체 활성에 대한 영향이 현저하게 저하된다.

계면활성제는 본 발명 중의 상기 추출 시약의 다른 한 중요한 성분이다. 본 발명에 있어서의 계면활성제의 주요한 작용은 요소와 단백 효소의 공동 작용을 통하여 세포의 파괴를 촉진하고 세포가 파괴된 후의 혈액 샘플을 균일성 상태로 변환시킨다. 강렬한 계면활성제(예를 들어 SDS)는 고효율적인 세포 파괴 작용을 구비하지만 강렬한 단백 변성 작용이 항체의 활성에 엄중한 영향을 미치게 된다. 본 발명에서 사용하는 비 이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈 20은 최적화된 작업 농도에서 공동으로 세포를 용해시켜 용해도를 증가시키는 양호한 작용을 나타내는 동시에 면역 분석의 백그라운드 신호를 절감시키는데 유리하다.

아래 구체적인 실시예를 결합하여 본 발명을 더욱 설명한다. 여기서, 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

하기 실시예에 있어서 특별히 기재되지 않는 한, 우선 본 발명의 상기한 추출 시약을 이용하여 혈액 샘플에 처리를 수행하고 그 다음 면역억제제의 농도를 검출한다.

하기 실시예에 있어서 특별히 기재되지 않는 한, %는 질량 체적비율(w/v)이다.

(실시예 1) FK506-TRFIA(Time Resolved Fluorescence Immunoassay)

본 실시예에 있어서 상기 FK506-TRFIA는 고상 이차항체에 기반한 경쟁 면역 분석 방법이고, 즉, 염소 항-마우스(goat anti-mouse) 항체의 이차항체 피막의 미세공에 처리후의 교정품/샘플과, 항FK506 단클론성 항체와, 바이오틴으로 표기한 FK506을 첨가하고 바이오틴으로 표기한 FK506과 교정품 또는 샘플 중의 FK506이 경쟁하여 한정수량의 항FK506 단클론성 항체에 결합하고 형성된 면역 복합물이 염소 항-마우스 항체의 이차항체를 통하여 미세공의 표면에 포획된다. 세척하여 결합되지 않은 바이오틴으로 표기한 FK506을 제거하고 유로퓸 이온(Eu³ ⁺)으로 표기한 스트렙타비딘(Streptavidin)(SA-Eu³⁺)을 첨가하며 미세공 내부 표면의 면역 복합물중의 바이오틴과 결합시킨다. 세척하여 결합되지 않은 SA-Eu³ ⁺를 제거하고 면역 복합물의 Eu³ ⁺는 해리 보강을 통하여 안정적인 형광 조화물을 형성하고 형광 강도에 근거하여 FK506 농도의 표준 곡선을 구축하고 교정 곡선을 통하여 샘플 중의 FK506 농도를 확정한다.

추출 시약은 50mM Tris-HCl 완충용액이고 pH는 8.0이며 요소8㏖/ℓ와, 고초균 단백 효소5U/㎖와, 0.05% 트윈 20을 함유한다.

170㎕ 추출 시약과 25㎕ 혈액 샘플 또는 교정품을 혼합하고 와류 혼합시켜 충분히 혼합시키고 70℃의 수욕에서 20min 부화시키고 꺼내어 실온으로 회복시킨다.

피막에 염소 항-마우스 항체 이차항체(Abcam 회사)가 있는 미세공 내에 25㎕ 처리후의 혈액 샘플/교정품과 100㎕ 0.2 ㎍/㎖ TBST-BSA(50mM Tris-HCl, pH는 7.5이고 0.9% NaCl과, 0.05% 트윈 20와, 0.05% NaN₃와, 0.5% BSA를 함유)를 희석시킨 FK506 단클론성 항체(상해강요(上海耀)회사)를 첨가하여 균일하게 혼합시키고 실온(20℃ 내지 25℃℃)에서 진동판으로 30min 부화시키고,

각 미세공에 50㎕의 0.05 ㎍/㎖ 바이오틴으로 표기한 FK506(절강해정(漸江海正)제약유한회사)를 함유한 TBST-BSA 용액을 첨가하고 계속하여 30min 반응시키고,

TBST 완충용액으로 미세공을 2회 세척하고,

150㎕의 2 ㎍/㎖ SA-Eu³ ⁺(소주신파(蘇州新波)생물기술유한회사)를 함유하는 TBST-BSA 완충용액을 첨가하고 진동판으로 20min 부화시켜 미세공 표면의 바이오틴과 접속시키고,

TBST 완충용액으로 미세공판을 6회 세척하고 보강액(소주신파(蘇州新波)생물기술유한회사)을 첨가하고 진동판으로 5min 부화시키며 시간 분해 형광 분석장치(Victor 1420, Perkin-Elmer)로 형광 강도를 검출하고 형광 강도 및 교정 곡선에 기반하여 측정 대상인 샘플에 함유된 약물의 농도를 계산한다.

검출 결과의 분석 FK506 교정품 농도를 X축으로 하고 검출된 형광 강도 신호의 값을 Y축으로 하며 4개 파라미터를 적합화시켜 회귀방정식 및 적합 곡선을 얻었다. 측정 대상의 샘플 신호값을 회귀방정식에 대입하면 샘플의 농도를 얻을 수 있다. 본 발명의 검출 결과의 분석을 예를 들어 ELISACalc 소프트 등 전용 컴퓨터 연산 분석 소프트웨어로 수행할 수 있어 대량의 샘플의 고속 분석에 편리하다.

(실시예 2) 추출 시약 중의 농도가 다른 트윈 20으로 인한 FK506 추출 효과에 대한 영향

본 실시예에 있어서 추출 시약은 50mM Tris-HCl 완충용액이고 PH는 8.0이며 요소 8㏖/ℓ와, 고초균 단백 효소 5U/ml와, 농도가 다른 트윈 20을 포함한다. 측정 대상 샘플은 건강한 사람의 전혈을 매체로 제조한 서로 다른 농도의 FK506을 함유하는 교정품이다. 조작 단계는 실시예 1과 동일하다. 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이 추출 시약 중의 트윈 농도가 증가됨에 따라 형광값은 현저하게 저하되는 경향을 나타내었다. 트윈의 농도가 0.10%(v/v)를 초과할 경우 형광값의 저하가 특히 선명하다. 0.10% 내지 0.20%(v/v)의 트윈 20을 함유하는 추출 시약을 반응 체계에 도입하여 트윈 20의 농도는 약 0.01% 내지 0.02%(v/v)이고 이러한 저농도의 트윈 20은 대부분의 면역 반응 체계에 있어서 고상 항체를 해리시키지 않고 항체 활성을 명확히 손상시키지 않음으로 이 현상은 체계에 포함된 요소와 관련되는 것이고 요소와 트윈 20의 공동 작용으로 고상 표면의 항체를 해리시키고 검출 신호를 저하시킨다.

추출 시약에 트윈 20이 함유되지 않았을 경우 교정 곡선의 각 교정품점의 형광 강도와 억제율은 양호하지만, 이때 일부 샘플(약20%)이 검출 중에 혈병이 미세공의 벽에 접착되는 현상이 발생하여 검출 정밀성을 저하시키고 측정값에 오차가 발생하고, 이와 반대로 추출 시약 중의 소량의 트윈 20은 이러한 현상을 피할 수 있다. 본 실시예에 의하면, 본 발명의 상기 추출 시약 중의 계면활성제인 트윈 20의 농도가 0.02% 내지 0.1%(v/v)인 것이 바람직하다.

(실시예 3) 추출 시약 중의 농도가 다른 단백변성제로 인한 FK506 추출 효과에 대한 영향

본 실시예에 있어서 추출 시약은 50mM의 pH가 8.0인 Tris-HCl 완충용액이고 트윈 20 0.05%(v/v)와, 고초균 단백 효소 5U/㎖와, 농도가 다른 요소 또는 염산구아니딘을 함유한다. 측정 대상 샘플은 건강한 사람의 전혈을 매체로 제조한 농도가 서로 다른 FK506을 포함한 교정품이다. 조작 단계는 실시예 1과 동일하다. 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이 단백변성제(요소 또는 염산구아니딘) 농도가 증가됨에 따라 각 교정품의 형광 강도는 모두 저하되는 경향을 나타내었다. 단백변성제가 항체-FK506 사이의 면역 반응을 억제하고 단백변성제가 약물의 방출을 촉진하여 FK506 농도가 상승한 것이 각 교정품의 형광 강도가 저하되는 원인이다. 단백변성제를 함유하지 않는(단백 효소만을 포함) 추출 시약의 경우, 각 교정품의 형광 강도가 높고 억제율이 낮으며, 이러한 실험 조건하에서 단백변성제를 함유하지 않는 추출 시약에 함유된 단백 효소가 전혈 샘플 중의 단백질이 결합한 FK506을 충분히 방출시키는데 부족함을 표시한다. 그리고 단백변성제를 함유하지 않은 추출 시약으로 처리한 후의 전혈 샘플은 덩어리형 이물질을 함유한 혼탁한 용액이고 샘플링하는데 불편하고 검출의 정밀성도 낮다.

도 2에 나타낸 바와 같이 추출 시약 중의 요소의 농도가 2 ㏖/ℓ로부터 8 ㏖/ℓ로 증가될 경우, FK506을 함유하지 않은 교정품A 및 저농도의 FK506 교정품(예를 들어 3ng/㎖)의 형광 강도는 적게 저하되고 항체-FK506 사이의 면역 반응에 대한 요소의 억제 작용이 낮음을 표시하지만 고농도의 FK506 교정품(20ng/㎖ 내지 30ng/㎖)의 경우, 요소 농도가 증가됨에 따라 형광 강도는 선명하게 저하되고 고농도의 요소의 경우에만 단백질 변성과 FK506의 방출을 충분히 촉진할 수 있음을 알 수 있다. 추출 시약 중의 요소의 농도가 6㏖/ℓ로부터 8 ㏖/ℓ로 증가될 때, 각 FK506 교정품의 형광 강도와 억제율은 모두 크게 변화하지 않고 추출 시약 중의 6㏖/ℓ 내지 8㏖/ℓ의 요소가 표본 변성에 대한 작용이 포화에 가까움을 표시한다. 요소에 비하여 염산구아니딘은 더욱 강한 단백 변성 작용을 나타내었다. 추출 시약 중의 염산구아니딘의 농도가 1㏖/ℓ로부터 6 ㏖/ℓ로 증가될 때, FK506을 함유하지 않은 교정품A의 형광 강도는 선명하게 저하되고 항체-FK506 사이의 면역 반응에 대한 염산구아니딘의 억제 작용이 강함을 표시한다. 이와 동시에 염산구아니딘의 농도가 상승함에 따라 고농도의 FK506 교정품의 형광 강도의 저하 정도도 저농도의 FK506 교정품의 형광 강도의 저하 정도보다 크고 약물의 충분한 방출이 염산구아니딘의 농도에 일정하게 의존하고 있음을 표시한다.

요소에 기반한 추출 시약으로 인한 항체-FK506 면역 결합 반응에 대한 억제가 약하고 FK506을 고효율적으로 방출할 수 있으며 처리후의 샘플이 투명한 균질성 용액임으로 본 발명 중의 상기 추출 시약 중의 6㏖/ℓ 내지 8 ㏖/ℓ 요소가 단백변성제인 것이 바람직하다.

(실시예 4) 추출 시약 중의 농도가 다른 단백 효소로 인한 FK506 추출 효과에 대한 영향

요소, 염산구아니딘 등 변성제가 존재하는 상황하에서 추출 시약 중의 단백 효소의 농도는 단기간 내에 세포를 파괴하고 단백의 변성을 촉진하며 단백 결합 약물을 방출할 수 있는 정도여야 한다. 이와 동시에 샘플을 처리한 후에 남은 단백 효소의 활성은 면역 결합 반응에 명확한 불량 영향을 미치게 된다.

본 실시예에 있어서 추출 시약은 50mM의 pH가 8.0인 Tris-HCl 완충용액이고 트윈 20 0.05%(v/v)와, 요소 8㏖/ℓ와, 농도가 다른 고초균 단백 효소를 함유한다. 측정 대상의 샘플은 건강한 사람의 전혈을 매체로 제조한 농도가 서로 다른 FK506을 함유하는 교정품이다. 조작 단계는 실시예 1과 동일하다. 검출 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이 추출 시약에 고초균 단백 효소를 함유하지 않을 경우, 농도가 서로 다른 FK506 교정품의 억제율은 모두 낮은 수준이였고 변화가 불규칙적이며, 이때 샘플 중의 FK506이 대부분이 결합 상태임을 표시한다. 그리고 고초균 단백 효소를 함유하지 않는 추출 시약으로 처리한 후의 샘플은 균질성이 부족하다. 추출 시약 중의 고초균 단백 효소의 농도가 2.5U/㎖ 내지 10.0 U/㎖일 경우, 교정품 각 점의 억제율은 대략 일치하고 각 교정품은 모두 호박색의 투명한 균질성 액체이다. 도 3에 나타낸 바와 같이 추출 시약 중의 고초균 단백 효소의 사용량이 5U/㎖ 내지 10U/㎖일 경우, 교정품 각 점의 형광 강도와 억제율은 대략 일치하고 고초균 단백 효소의 사용량이 10 U/㎖ 초과일 경우, 교정품 각 점의 형광 강도는 고속으로 저하되고 고농도의 고초균 단백 효소는 항체-항원 사이의 결합 반응을 손상시킴을 표시한다. 상기한 현상에 기반하여 본 발명의 상기 추출 시약 중의 고초균 단백 효소의 사용량이 2.5U/㎖ 내지 10U/㎖인 것이 바람직하다.

(실시예 5) 서로 다른 부화 온도로 인한 교정 곡선과 혈액 샘플 측정값에 대한 영향본 실시예에 있어서 추출 시약은 50mM의 Tris-HCl 완충용액이고 pH는 8.0이며 트윈 20 0.05%(v/v)와, 요소 8㏖/ℓ와, 고초균 단백 효소 5U/㎖를 포함하고 추출 시약과 샘플을 균일하게 혼합한 후, 서로 다른 온도로 20min 부화시켰다.

측정 대상 샘플은 건강한 사람의 전혈을 매체로 제조한 농도가 서로 다른 FK506을 함유한 교정품 및 12개의 ABBOTT 회사의 ARCHITECT i2000 시스템 전용 시약(FK506 화학 발광 미립자 면역 검출 시약)으로 측정한 EDTA 항응고 전혈 임상 샘플(중국인민해방군 제2군의대학 제3부속병원으로부터 획득)(측정값은 표1에 나타냄)이다.

이봉비들의 방법을 참조하여(이봉비(李鵬飛), 유려홍(劉麗宏), 마평(馬萍), 등: 고효율적인 액상 크로마토 그램 질량 분석 방법의 타크롤리무스 임상 혈중 농도의 모니터링에 있어서의 응용, 질량스펙트럼학보, 2008, 29, 137 내지 143) HPLC-MS/MS 방법에 따라 상기 샘플을 여러번 측정하여 측정값을 표 1에 나타내었다.

[표 1]샘플 추출중의 서로 다른 부화 온도로 인한 혈액 샘플 측정값(ng/㎖)에 대한 영향
HPLC-MS 측정값(ng/㎖)		1.2	1.6	2.2	3.5	4.0	5.2	6.7	8.6	11.9	16.1	23	37
ABBOTT i2000 측정값(ng/㎖)		1.0	1.3	2.6	3.2	3.4	5.0	6.1	9.2	13.5	15.8	20.1	>30
서로 다른 부화 온도로 본 방법에서 검출한 혈액 샘플 농도값(ng/㎖)	90℃	1.0	1.1	1.3	2.6	3.1	3.1	4.1	5.5	5.8	8.5	12.1	15.6
	80℃	0.8	1.1	1.5	2.2	3.0	4.9	5.4	6.2	15.2	11.2	19.6	31.4
	70℃	1.1	1.4	2.5	3.3	3.7	5.0	5.8	9.5	12.7	14.9	21.5	35.9
	60℃	0.4	1.3	1.6	2.6	2.9	4.0	5.3	8.8	10.0	9.9	15.5	29.4
	50℃	0.1	0.5	0.8	1.2	1.1	1.5	1.9	2.3	3.8	6.1	9.9	21.6
	40℃	0.5	1.2	1.8	2.2	3.4	4.5	4.6	3.7	9.4	11.2	15.9	29.9
	30℃	0.3	1.7	1.9	3.0	2.9	4.7	5.1	4.6	9.9	15.0	18.9	22.7

본 발명에 있어서 가열 부화 방식으로 혈액 샘플을 처리하는 것은 단기간 내에 단백 효소의 효소 분해 작용을 충분히 발휘시키는 동시에 가열 부화중에 일부분의 단백 효소의 활성을 상실하게 하고 후속되는 면역 반응중의 항체 활성에 대한 단백 효소로 인한 영향을 저하시키기 위한 것이다. 표 1과 도 4에 나타낸 바와 같이 부화 온도가 60℃ 미만일 경우, 부화 온도가 저하되고 형광 강도도 선명하게 저하되며 샘플 측정값은 참조 방법(HPLC-MS 방법)의 측정값 미만이고 비규칙적으로 변화한다. 이 현상은 샘플 처리 중에 부화 온도가 낮으면 세포 용해, 단백 변성과 약물 방출을 충분히 수행할 수 없음을 표시한다. 이와 동시에 부화 온도가 낮을 경우, 샘플을 추출한 후에 남은 단백 효소의 활성이 항체(고상 이차항체와 항FK506 항체)의 면역 반응 활성에 큰 영향을 주고 형광 강도가 저하된다. 부화 온도가 70 내지 80℃일 경우, 교정 곡선의 형광 강도가 높고 억제율도 상대적으로 안정적이다. 부화 온도가 70℃일 경우, 샘플의 측정값과 HPLC-MS 및 ABBOTT i2000의 측정값은 모두 양호한 일치성을 구비한다. 부화 온도가 90℃일 경우, 샘플의 측정값은 저하되는 경향을 나타내었다. 상기한 바와 같이 본 발명의 상기한 추출 시약으로 샘플을 처리하는 가열 부화 온도는 60℃ 내지 80℃이다.

(실시예 6) 서로 다른 부화 시간으로 인한 교정 곡선과 혈액 샘플 측정값에 대한 영향

본 실시예에 있어서 추출 시약은 50mM의 Tris-HCl 완충용액이고 pH는 8.0이며 트윈 20 0.05%(v/v)와, 요소 8㏖/ℓ와, 고초균 단백 효소 5U/㎖를 함유하고 추출 시약과 샘플을 균일하게 혼합한 후, 70℃에서 서로 다른 시간 동안 부화시킨다. 측정 대상 샘플은 건강한 사람의 전혈을 매체로 제조한 농도가 서로 다른 FK506을 함유한 교정품 및 실시예 5에 기재된 12개의 ABBOTT 회사의 ARCHITECT i2000 시스템 전용 시약(FK506 화학 발광 미립자 면역 검출 시약)으로 측정한 EDTA 항응고 전혈 임상 샘플(중국인민해방군제2군의대학제3부속병원으로부터 획득)이다.

도 5에 나타낸 바와 같이 샘플의 처리 과정에서 가열 부화 시간이 5min로부터 40min로 연장되면 교정품 각 점의 형광 강도는 선명하게 상승하는 경향을 나타내었다. 가열 부화 시간을 5min로부터 10min으로 연장시킬 경우, 형광 강도가 선명하게 증가되고 가열 부화 시간이 10min 미만일 경우, 체계에 남은 단백 효소의 활성이 효소 분해 항체를 통하여 검출 신호를 절감시킴을 표시한다. 5min 내지 40min내의 서로 다른 부화 시간의 경우, 샘플의 측정값은 모두 HPLC-MS와 ABBOTT-i2000의 측정값과 양호한 일치성을 나타내었다(표 2). 부화 시간이 길면 남은 단백 효소의 활성이 더욱 작아지기 때문에 본 발명의 샘플 처리 과정의 가열 부화 시간은 10min 내지 30min를 선택한다.

[표 2]샘플 추출중의 서로 다른 부화 시간으로 인한 혈액 샘플 측정HPLC-MS
측정값(ng/㎖)		1.2	1.6	2.2	3.5	4	5.2	6.7	8.6	11.9	16.1	23	37
ABBOTT i2000 측정값(ng/㎖)		1	1.3	2.6	3.2	3.4	5	6.1	9.2	13.5	15.8	20.1	>30
서로 다른 부화 시간으로 본 방법으로 검출한 혈액 샘플 농도값(ng/㎖)	5min	1.3	1.5	1.9	3	4.9	5.8	6.1	7.5	10.8	18.2	25.3	33.5
	10min	0.9	1.6	2.8	3.8	4.1	5.9	6.8	11.2	12.8	16.8	26.9	35.1
	20min	1	1.9	2.5	3.2	4.3	5.5	7.8	8.9	11.7	17.1	22.2	35
	30min	1.2	1.6	2	3.1	3.9	4.3	6.3	8	9.4	15.2	22.9	32.1
	40min	1.4	1.5	1.8	3.2	4.3	6	7.2	10.2	13.2	15.8	20.4	35.8

(실시예 7) 서로 다른 전처리액의 실혐 비교

본 실시예에 있어서 본 발명의 상기 FK506-TRFIA 중의 교정 곡선과 샘플 측정값에 대한 소린 회사(PRO-Trac™ II Tacrolimus ELISA，DiaSorin), 애보트 회사(ABBOTTARCHITECT i2000 System)와 본 발명의 상기 전처리액의 영향을 비교한다.

소린 전처리액으로 샘플을 처리한다: 원심 시험관에 50㎕ 전혈 샘플과 300㎕ 효소 분해액(소린의료(상해)유한회사로부터 구입, 로트 번호 305102)을 첨가하고 20초동안 진동하면서 균일하게 혼합하고 실온에서 15min 방치한 후, 75℃의 수욕 가마에 투입하여 15min 가열하고 시험관을 꺼내여 20초동안 진동하면서 균일하게 혼합하고 1800×g로 10min 원심 처리한다. 상청액을 꺼내어 샘플로 한다.

ABBOTT 전처리액으로 샘플을 처리한다: 원심 시험관에 200㎕ 전혈 샘플과 200㎕ 전혈 침전제(애보트 무역(상해)유한회사로부터 구입, 309221)를 첨가하고 10초동안 진동하면서 균일하게 혼합하고 10000×g로 5 내지 6min 원심 처리한다. 상청액을 꺼내여 샘플로 한다.

본 발명의 상기 추출 시약으로 샘플을 처리한다: 실시예 1과 동일하다.

상기한 3가지 방법으로 55개의 HPLC-MS 방법으로 측정한 EDTA 항응고 전혈 임상 샘플(중국인민해방군 제2군의대학 제3부속병원으로부터 획득)을 처리하고 실시예 1에 기재된 단계에 따라 처리후의 각 샘플을 검출하였다. HPLC-MS를 참조 방법으로 하고 서로 다른 전처리액으로 인한 FK506-TRFIA 중의 교정 곡선(각 교정품에 대하여 평행한 4개의 공을 측정)(도 6)과 측정값에 대한 영향을 관찰하였다(도 7a, 도 7b, 도 7c).

도 6에 나타낸 바와 같이 상기 FK506 검출 방법에 있어서 유기용제를 주요 성분으로 하는 ABBOTT-i2000 전처리액이 검출에 큰 영향을 미치고 교정 곡선의 형광 강도가 가장 낮고 평행한 4개의 공을 측정한 각 교정품의 형광 강도의 평형성이 낮고 유기용제가 반응 체계에 불량한 영향을 가져옴을 표시한다. 소린 전처리액과 본 발명의 상기 추출 시약에 기반한 FK506 검출은 비슷하게 평형을 이룬 교정 곡선을 구비하고 교정품의 각 점의 정밀성도 우수하지만 본 발명의 상기 추출 시약을 통하여 얻은 형광 강도가 가장 높고 본 발명의 상기 추출 시약이 약물을 유효하게 방출시킬 수 있고 반응 체계에 대한 매체의 영향이 더욱 온화함을 말한다.

도 7a, 도 7b, 도 7c에 나타낸 바와 같이 3가지 방법으로 처리한 55개 샘플에 있어서 본 발명의 상기 추출 시약, ABBOTT-i2000 전처리액, 소린 전처리액에 기반한 FK506-TRFIA 검출값과 HPLC-MS 측정값의 상관 계수는 각각 0.981, 0.957, 0.951이고 본 발명의 상기 추출 시약에 기반한 FK506-TRFIA 검출값과 HPLC-MS 방법의 측정값의 일치성이 가장 우수함을 표시한다.

Claims

단백변성제와, 단백분해효소와, 계면활성제와, pH 완충용액으로 구성되는 면역 분석용 혈액 샘플의 면역억제제 약물 추출 시약으로서,
상기 단백변성제는 요소 또는 염산구아니딘이고, 상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제이며, 상기 면역억제제 약물은 타크롤리무스, 시롤리무스, 에베롤리무스, 조타롤리무스 또는 사이클로스포린을 포함하는 것인 면역 분석용 혈액 샘플의 면역억제제 약물 추출 시약.
제1항에 있어서,
상기 추출 시약 중의 상기 요소의 몰 농도는 4㏖/ℓ 내지 12㏖/ℓ이고 상기 추출 시약 중의 상기 염산구아니딘의 몰 농도는 1㏖/ℓ 내지 8㏖/ℓ인 것을 특징으로 하는 추출 시약.
제2항에 있어서,
상기 추출 시약 중의 상기 요소의 몰 농도가 6㏖/ℓ 내지 8㏖/ℓ이고 상기 추출 시약 중의 상기 염산구아니딘의 몰 농도가 2㏖/ℓ 내지 6㏖/ℓ인 것을 특징으로 하는 추출 시약.
제1항에 있어서,
상기 단백분해효소가 고초균 단백 효소, 단백 효소K, 디스파아제로부터 선택되는 한가지 또는 여러 가지인 것을 특징으로 하는 추출 시약.
제4항에 있어서,
상기 단백분해효소가 고초균 단백 효소인 것을 특징으로 하는 추출 시약.
제5항에 있어서,
상기 추출 시약 중의 상기 고초균 단백 효소의 량이 2.5U/㎖ 내지 10U/㎖인 것을 특징으로 하는 추출 시약.
제1항에 있어서,
상기 계면활성제가 트윈 20, 사포닌, Triton X-100으로부터 선택되는 한가지 또는 여러 가지인 것을 특징으로 하는 추출 시약.
제7항에 있어서,
상기 계면활성제가 트윈 20인 것을 특징으로 하는 추출 시약.
제8항에 있어서,
상기 추출 시약 중의 상기 트윈 20의 체적비율이 0.005% 내지 1%(v/v)인 것을 특징으로 하는 추출 시약.
제9항에 있어서,
상기 추출 시약 중의 상기 트윈 20의 체적비율이 0.02% 내지 0.1%(v/v)인 것을 특징으로 하는 추출 시약.
제1항에 있어서,
상기 pH 완충용액의 pH가 6.5 내지 8.5 사이인 것을 특징으로 하는 추출 시약.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 추출 시약을 이용하여 가열 방식으로 혈액 샘플을 처리하고, 그 다음 면역 분석을 통하여 그 중에 함유된 약물 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 혈액 샘플 중 면역억제제의 약물 농도 검출 방법.
제12항에 있어서,
상기 면역억제제가 타크롤리무스, 시롤리무스, 에베롤리무스, 조타롤리무스, 또는 사이클로스포린을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서,
상기 추출 시약과 상기 혈액 샘플을 혼합할 때, 상기 혈액 샘플과 상기 추출 시약의 체적비율이 1/1 내지 1/10인 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서,
상기 추출 시약과 상기 혈액 샘플을 혼합할 때, 상기 혈액 샘플과 상기 추출 시약의 체적비율이 1/2 내지 1/5인 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서,
상기 가열 온도가 50℃ 내지 90℃이고 상기 가열 시간이 5min 내지 50min인 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서,
상기 가열 온도가 60℃ 내지 80℃이고 상기 가열 시간이 10min 내지 30min인 것을 특징으로 하는 방법.
a) 면역억제제 약물과 특이적 결합된 항체와, b) 상기 면역억제제를 함유하는 교정품과, c) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 추출 시약과, d) 검출 시약을 포함하고, 상기 검출 시약이 트레이서로 표지된 항체, 항원 또는 반 항원인 것을 특징으로 하는 혈액 샘플 중의 면역억제제 농도를 검출하는 시약 키트.
제18항에 있어서,
상기 트레이서가 효소와, 화학 발광 물질과, 방사성 물질과, 형광 물질과, 희토류 이온과, 바이오틴과, 디곡신을 포함하고, 상기 희토류 이온이 Eu³⁺, Sm³⁺, Tb³⁺, Dy³⁺ 및 이들의 킬레이트 리간드를 포함하는 것을 특징으로 하는 시약 키트.
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