KR20110132334A

KR20110132334A - 코아굴로겐 원료 및 그의 제조 방법, 그것을 이용한 생물 유래의 생리 활성 물질의 측정 방법 및 측정 장치

Info

Publication number: KR20110132334A
Application number: KR1020117019609A
Authority: KR
Inventors: 가쯔미 야부사끼
Original assignee: 코와 가부시키가이샤
Priority date: 2009-02-19
Filing date: 2010-02-19
Publication date: 2011-12-07
Also published as: US20120040385A1; WO2010095718A1; JP2010190801A; CN102326082A; JP5437660B2; US8790885B2; EP2400302A1; EP2400302A4; CA2753062A1

Abstract

본 발명은 LAL 시약 또는 생물 유래의 생리 활성 물질에 오염된 LAL 시약 등에 있어서의 코아굴로겐의 기능을 유지한 채로 응고 효소 활성을 불가역적으로 불활성화하여, 시약에 이용 가능한 코아굴로겐 원료를 취득하는 기술을 제공한다. LAL 시약을 어느 소정 온도에서 소정 시간에 걸쳐 가열 처리함으로써, LAL 시약 중의 효소 활성만을 불가역적으로 실활시킨다. 그 때, 활성화한 응고 효소에 의해 가수분해되어 코아굴린이 되어 겔화나 응집 반응을 야기한다는, 코아굴로겐 본래의 활성은 유지시킨다.

Description

코아굴로겐 원료 및 그의 제조 방법, 그것을 이용한 생물 유래의 생리 활성 물질의 측정 방법 및 측정 장치{COAGULOGEN RAW MATERIAL, PROCESS FOR PRODUCING SAME, AND METHOD AND APPARATUS FOR MEASURING ORGANISM-DERIVED BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCE USING SAME}

본 발명은 엔도톡신이나 β-D-글루칸 등의 생물 유래의 생리 활성 물질의 검출 또는 농도 측정을 신속 또는 고감도로 계측하기 위한 시약, 그의 제조 방법 및 그것을 이용한 측정 방법 및 측정 장치에 관한 것이다.

엔도톡신은 그램 음성균의 세포벽에 존재하는 리포다당으로서, 가장 대표적인 발열성 물질이다. 이 엔도톡신에 오염된 수액, 주사약제, 혈액 등이 인체에 들어 가면 발열이나 쇼크 등이 위독한 부작용을 야기할 우려가 있다. 이 때문에, 상기한 약제 등은 엔도톡신에 의해 오염되지 않도록 관리하는 것이 의무가 되어 있다.

그런데, 투구게의 혈구 추출물(이하, 「LAL: Limulus amoebocyte lysate」라고도 함) 중에는, 엔도톡신에 의해서 활성화되는 효소인 세린 프로테아제가 존재한다. 그리고, LAL과 엔도톡신이 반응하는 때에는, 엔도톡신의 양에 따라서 활성화된 세린 프로테아제에 의한 효소 캐스케이드에 의해서, LAL 중에 존재하는 코아굴로겐이 코아굴린으로 가수분해되고 회합하여 불용성의 겔이 생성된다. 이 LAL의 특성을 이용하여 엔도톡신을 고감도로 검출하는 것이 가능하다.

또한, β-D-글루칸은 진균에 특징적인 세포막을 구성하고 있는 폴리사카라이드(다당체)이다. β-D-글루칸을 측정함으로써 칸디다나, 스페르길루스, 크립토코커스와 같은 일반적인 임상에서 자주 보이는 진균뿐만아니라, 희귀한 진균도 포함하는 광범위한 진균 감염증의 스크리닝 등에 유효하다.

β-D-글루칸의 측정에 있어서도, 투구게의 혈구 추출 성분이 β-D-글루칸에 의해서 응고(겔 응고)하는 특성을 이용하여, β-D-글루칸을 고감도로 검출하는 것이 가능하다.

이 엔도톡신이나 β-D-글루칸 등의, 투구게의 혈구 추출 성분에 의해서 검출 가능한 생물 유래의 생리 활성 물질(이하, 소정 생리 활성 물질이라고도 함)의 검출 또는 농도 측정을 행하는 방법으로서는, 소정 생리 활성 물질의 검출 또는 농도 측정(이하, 단순히 「소정 생리 활성 물질의 측정」이라고도 함)를 하여야 할 시료와 LAL을 바탕으로 제조된 시약(LAL 시약)을 혼화한 혼화액을 정치하고, 일정 시간 후에 용기를 전도시키고, 시료를 늘여 떨어뜨려 그 유무에 의해 겔화하였는지 어떤지를 판정하여, 시료에 일정 농도 이상의 엔도톡신이 포함되는가 아닌가를 조사하는 반정량적인 겔화법이 있다. 또한, LAL 시약과 소정 생리 활성 물질과의 반응에 의한 겔의 생성에 수반하는 시료의 탁도를 경시적으로 계측하고 해석하는 비탁법이나, 효소 캐스케이드에 의해 가수분해되어 발색하는 합성 기질을 이용하는 비색법 등이 있다.

상기한 비탁법에 의해서 소정 생리 활성 물질의 측정을 행하는 경우에는, 건열 멸균 처리된 유리제 측정 셀에 측정 시료와 LAL 시약의 혼화액을 생성시킨다. 그리고, 혼화액의 겔화를 외부로부터 광학적으로 측정한다. 그러나, 비탁법에 있어서는 특히 소정 생리 활성 물질의 농도가 낮은 시료에 있어서 혼화액이 겔화하기까지 매우 많은 시간을 요하는 경우가 있다. 이에 비하여, 소정 생리 활성 물질의 단시간 측정이 가능한 방법이 요구되고 있다. 측정 시료와 LAL 시약과의 혼화액을 예를 들면 자성 교반자를 이용하여 교반함으로써 겔 미립자를 생성시키고, 겔 입자에 의해 산란되는 레이저광의 강도 또는 혼화액을 투과하는 광의 강도로부터, 시료 중의 소정 생리 활성 물질의 존재를 단시간에 측정할 수 있는 레이저 산란 입자 계측법 등이 제안되어 있다.

LAL 시약은 투구게의 혈구 추출물을 주원료로 하여 제조된다. 이 때문에, 제조상 어떤 확률로 엔도톡신이나 β-D-글루칸이 혼입되게 되어, 시약으로서 이용할 수 없는 폐기물이 될 가능성이 있다. 또한, 엔도톡신 또는 β-D-글루칸의 어떠한 측정법도 측정 시약의 원료가 유한 자원인 투구게의 혈구 추출물이기 때문에, 시약의 사용량을 감소시키거나, 또는 시약 제조 상의 손실을 감소시킨다고 하는 대처가 필요하게 된다.

시약의 사용량을 감소시키는 시도로서는, 단순히 시료 용량을 감소시키는 것은 물론, 측정 감도를 높여 결과적으로 측정 횟수를 감소시키는 것도 효과적이다. 한편, 제조 상의 손실을 감소시키기 위해서는 엔도톡신이나 β-D-글루칸에 의한 오염을 얼마나 억제할지와 같은 것이 중요하다. 또한, 제조 중에 시약으로서 사용할 수 없게 된 원료로부터 엔도톡신이나 β-D-글루칸을 제거하고 재이용하거나, 보조적인 시약의 첨가물로서 이용하거나 하는 것 등도 생각해야만 한다. 보조적인 시약의 첨가물로서 이용하는 경우, 시약의 점성의 조정제로서의 역할이나, 겔화·응집에서의 중심적 역할을 담당하는 코아굴로겐 원료로서의 이용 등이 생각된다.

그러나, 예를 들면 엔도톡신에 오염되어 사용할 수 없게 된 원료 중의 엔도톡신을 제거하는 것만으로는 이미 활성화되어 버린 효소군을 제거하는 것은 불가능하다. 원료 중의 효소 활성만을 불활성화하여 코아굴로겐의 기능, 즉 활성화된 응고 효소에 의해 가수분해되어 코아굴린이 되어 겔화·응집 반응을 발생시키는 기능을 유지한 원료의 제조 방법은 보고되어 있지 않았다.

일본 특허 제2667695호 공보 일본 특허 공개 제2004-061314호 공보 일본 특허 공개 (평)10-293129호 공보

본 발명은 상술한 문제점을 감안하여 안출된 것으로서, 그의 목적으로 하는 바는, LAL 시약 또는 생물 유래의 생리 활성 물질에 오염된 LAL 시약 등에 있어서의 코아굴로겐의 기능을 유지한 채로 응고 효소 활성을 불가역적으로 불활성화하여, 시약에 이용 가능한 코아굴로겐 원료를 취득하는 기술을 제공하는 것이다.

상기한 과제를 해결하기 위한 본 발명은 약간의 소정 생리 활성 물질의 혼입을 허용하는 LAL 시약을 어느 온도 조건 하에서 가열 처리함으로써, LAL 시약 중의 효소 활성만을 불가역적으로 실활시킨 것을 최대의 특징으로 한다. 본 발명에서는, 그 때, 활성화한 응고 효소에 의해 가수분해되어 코아굴린이 되어 겔화·응집 반응을 야기한다는, 코아굴로겐 본래의 활성은 유지시킨다.

보다 상세하게는, 본 발명은 소정의 효소군과 코아굴로겐을 포함한 투구게의 혈구 추출물인 LAL과, 생물 유래의 소정의 생리 활성 물질을 반응시키고, 상기 생리 활성 물질에 의해서 상기 효소군이 활성화되어 생기는 효소 캐스케이드에 의해서 코아굴로겐이 코아굴린으로 가수분해되는 것을 이용하여, 상기 생리 활성 물질을 검출 또는 상기 생리 활성 물질의 농도를 측정할 때에 사용되는 코아굴로겐 원료의 제조 방법으로서, LAL을 소정 온도에서 소정 시간에 걸쳐 가열 처리함으로써 상기 LAL 중의 상기 효소군의 적어도 일부를 실활시킴과 동시에 코아굴로겐의 활성은 유지시키는 것을 특징으로 한다.

이것에 따르면, LAL 중의 효소 캐스케이드를 구성하는 효소군의 적어도 일부를 실활시킴으로써 효소 캐스케이드의 발생을 억제하여, 엔도톡신이나 β-D-글루칸 등의 오염에 의해서도 가수분해되어 코아굴린이 되기 어려운 코아굴로겐 원료를 취득하는 것이 가능해진다.

또한, 이것에 따르면, 엔도톡신이나 β-D-글루칸 등의 오염에 의해 사용 불가가 된 LAL 시약의 코아굴로겐을, 기능을 유지한 채로 취득할 수 있기 때문에, 투구게의 혈구로부터 얻어지는 유한의 자원을 보다 유효하게 활용하는 것이 가능해진다.

여기서, 소정의 효소군이란 예를 들면 LAL 중의 C 인자, B 인자, G 인자, 응고 효소 전구체 등, 엔도톡신이나 β-D-글루칸 등에 의해 효소 캐스케이드를 발생시켜 최종적으로 코아굴로겐을 가수분해하는 응고 효소를 발생시키는 원인이 되는 효소류를 뜻하고 있다. 즉, LAL 중의 모든 효소를 실활시키지 않더라도 적어도 일부의 효소가 실활하여, 엔도톡신이나 β-D-글루칸 등에 의해서도, 최종적으로 코아굴로겐을 가수분해하는 응고 효소가 생기지 않게 되면 본 발명의 목적은 달성할 수 있다.

또한, 상기에서 생물 유래의 소정의 생리 활성 물질이란 LAL 중의 소정의 효소군을 활성화시켜 효소 캐스케이드를 발생시켜서, 최종적으로 코아굴로겐을 가수분해하는 응고 효소를 발생시키는 특성을 갖는 생리 활성 물질을 의미하고 있고, 예로서는 상술한 바와 같이, 엔도톡신이나 β-D-글루칸을 들 수 있다. 단, 동등한 특성을 갖는 다른 생리 활성 물질도 포함하는 취지이고, 상술한 2 물질에 한정하는 것은 아니다.

또한, 상기에서 LAL이 용액으로서 공급되는 경우에는, 소정 온도는 60℃ 이상으로 할 수도 있다. 여기서, 발명자의 예의 연구에 의해, 용액으로서의 LAL 시약을 60℃ 이상으로 가열 처리함으로써 세린 프로테아제 등의 효소군의 효소 활성을 대략 완전히 실활시킬 수 있는 것을 알게 되었다. 따라서, LAL이 용액으로서 공급되는 경우에 소정 온도를 60℃ 이상으로 함으로써 보다 확실하게 엔도톡신이나 β-D-글루칸 등에 오염되더라도 가수분해되어 코아굴린이 되지 않는 코아굴로겐 원료를 취득하는 것이 가능해진다.

또한, 상기에서 LAL이 용액으로서 공급되는 경우에는, 소정 온도는 80℃ 이하로 할 수도 있다. 여기서, 발명자의 예의 연구에 의해, LAL 시약을 80℃보다 높은 온도까지 가열 처리하여 효소 활성을 실활시킨 경우에는, LAL 중의 단백질의 변성에 의해 시약이 백탁하여 버리는 것을 알게 되었다. 그렇게 하면, 소정 생리 활성 물질의 검출이나 농도 측정을, 시약의 투과광이나 산란광에 의해서 광학적인 수법에 의해서 행하는 목적에는 적합하지 않게 되어 버릴 우려가 있다. 따라서 본 발명에서는, LAL이 용액으로서 공급되는 경우에는 소정 온도를 80℃ 이하로 함으로써 광학적인 측정에도 적합한, 보다 이용가치가 높은 코아굴로겐 원료를 취득하는 것이 가능해진다.

또한, 상기에서 LAL이 용액으로서 공급되는 경우에는, 소정 시간은 10분 이상 8시간 이하로 할 수도 있다. 여기서, 용액으로서의 LAL 시약을 60℃ 이상으로 가열 처리한 경우, 가열 시간은 10분 정도에서, 세린 프로테아제 등의 효소군의 효소 활성을 대략 완전히 실활시킬 수 있는 것을 알게 되었다. 따라서, 소정 시간을 10분 이상으로 함으로써 넓은 범위의 가열 온도에서 세린 프로테아제 등의 효소군의 효소 활성을 대략 완전히 실활시킬 수 있다. 또한, 가열 시간이 너무나 긴 경우에는, 저온에서도 LAL 중의 단백질이 변성하여 백탁이 생길 우려가 있다. 따라서 본 발명에서는, 소정 시간을 10분 이상 8시간 이하로 함으로써 보다 확실하게 엔도톡신이나 β-D-글루칸 등에 오염되더라도 가수분해되어 코아굴린이 되지 않아, 광학적인 측정에 적합한 코아굴로겐 원료를 취득하는 것이 가능해진다.

또한, 상기에서 LAL이 동결 건조체로서 공급되는 경우에는, 소정 온도는 100℃ 이상 250℃ 이하로 할 수도 있다. 여기서, LAL이 동결 건조체로서 공급되는 경우에는, 용액으로서 공급되는 경우와 비교하여 보다 높은 온도에서 가열 처리할 필요가 있는 것을 알게 되었다. 이 경우에는, LAL 시약을 100℃ 이상 250℃ 이하로 함으로써 보다 확실하게, 엔도톡신이나 β-D-글루칸 등에 오염되더라도 가수분해되어 코아굴린이 되지 않고, 광학적인 측정에도 적합한, 보다 이용가치가 높은 코아굴로겐 원료를 취득하는 것이 가능해진다.

또한, 이 경우에는, 소정 시간은 300분 이상으로 할 수도 있다. 여기서, LAL이 동결 건조체로서 공급되는 경우에는, LAL 시약을 120℃에서 300분에 걸쳐 가열함으로써 세린 프로테아제 등의 효소군의 효소 활성을 대략 완전히 실활시킬 수 있는 것을 알게 되었다. 따라서, 소정 시간을 300분 이상으로 함으로써 보다 넓은 범위의 가열 온도에서 보다 확실하게, 엔도톡신이나 β-D-글루칸 등의 오염에 의해서도 가수분해되어 코아굴린이 되지 않는 코아굴로겐 원료를 취득하는 것이 가능해진다.

또한, 본 발명은 소정의 효소군과 코아굴로겐을 포함한 투구게의 혈구 추출물인 LAL과, 생물 유래의 소정의 생리 활성 물질을 반응시키고, 상기 생리 활성 물질에 의해서 상기 효소군이 활성화되어 생기는 효소 캐스케이드에 의해서 코아굴로겐이 코아굴린으로 가수분해되는 것을 이용하여, 상기 생리 활성 물질을 검출 또는 상기 생리 활성 물질의 농도를 측정할 때에 사용되는 코아굴로겐 원료로서,

LAL을 소정 온도에서 소정 시간에 걸쳐 가열 처리함으로써 상기 LAL 중의 상기 효소군의 적어도 일부를 실활시킨 것을 특징으로 하는 코아굴로겐 원료일 수도 있다.

이 코아굴로겐 원료에 있어서는, 소정 생리 활성 물질과의 반응으로 효소 캐스케이드를 발생시키는 효소군이 실활되어 있기 때문에, 소량의 소정 생리 활성 물질에 의한 오염에 의해 코아굴로겐이 가수분해되어 코아굴린이 되는 것을 억제할 수 있어, 보다 핸들링이 좋은 코아굴로겐 원료를 얻을 수 있다. 또한, 이 경우에 있어서도, LAL이 용액으로서 공급되는 경우에는, 소정 온도는 60℃ 이상으로 할 수도 있다. 또한, 80℃ 이하로 할 수도 있다. 또한, 소정 시간은 10분 이상 8시간 이하로 할 수도 있다. 한편, LAL이 동결 건조체로서 공급되는 경우에는, 소정 온도는 100℃ 이상 250℃ 이하로 할 수도 있다. 또한, 소정 시간은 300분 이상으로 할 수도 있다.

또한, 본 발명에서는, 상기에서 얻어진 코아굴로겐 원료와, 가열 처리되어 있지 않은 LAL을 혼합함으로써 상기 가열 처리되어 있지 않은 LAL에서의 코아굴로겐 농도를 높인 것을 특징으로 하는, 상기 생리 활성 물질의 검출 또는 상기 생리 활성 물질의 농도 측정에 사용되는 LAL 시약으로 할 수도 있다.

즉, 소정의 효소군을 실활시킨 코아굴린 원료를, 열처리를 하지 않은 LAL에 가함으로써 통상보다 코아굴로겐의 농도가 높은 LAL 시약을 제조할 수 있다. 이에 따라, 소정 생리 활성 물질과의 반응에 의해 활성화된 효소군에 의해서 가수분해되어 코아굴린이 되는 코아굴로겐의 양을 상대적으로 증가시킬 수 있다. 따라서, 소정 생리 활성 물질에 의한 LAL 시약의 겔화를 보다 현저하게 할 수 있어, 소정 생리 활성 물질의 측정을 보다 고감도로 할 수 있다.

또한, 본 발명에서는, 상기에서 얻어진 코아굴로겐 원료에 있어서의 코아굴로겐을, 상기 코아굴로겐보다 대직경의 다수의 미립자의 표면에 결합 또는 흡착시켜 제조된 것을 특징으로 하는 엔도톡신 측정용의 코아굴로겐 결합 마이크로비드로 할 수도 있다.

여기서, 코아굴로겐을 예를 들면 수지제의 미립자 상에 결합 또는 흡착시킨 상태의 LAL에 엔도톡신 등의 소정 생리 활성 물질을 작용시키면, LAL 단체에 소정 생리 활성 물질을 작용시킨 경우와 비교하여, 보다 큰 응집덩어리를 조기에 생성하는 것을 알게 되었다. 이것은, 미립자 상의 코아굴로겐이 LAL 중의 효소 캐스케이드에 의해 가수분해되어 코아굴린이 되고, 이들이 미립자끼리를 회합시키는 것에 의한다. 또한, 이 응집 반응은 시료의 탁도나 색의 영향을 받기 어려운 것, 나아가서는, 이 응집 반응은 LAL 단체로 야기되는 응집 반응보다도 매우 강대한 것도 명확하게 되었다.

본 발명에서는, 이 현상을 이용하여, LAL 중의 효소군을 실활시켜 얻어진 코아굴로겐 원료를 미립자 상에 결합 또는 흡착시킨 시약(이하, 「코아굴로겐 결합 마이크로비드」라고도 함)을 제조하였다. 이 코아굴로겐 결합 마이크로비드와 LAL을 혼합시킨 시약에 엔도톡신을 포함하는 시료를 작용시킴으로써, LAL 중에 원래 존재한 코아굴로겐이 코아굴린이 되어 응집함과 동시에, 미립자 상에 결합 또는 흡착된 코아굴로겐이 코아굴린이 되어 미립자끼리를 회합시켜 보다 큰 응집덩어리를 조기에 생성시킨다. 이에 따르면, LAL 시약과 시료의 혼화액에 있어서의 겔 입자의 생성을 대폭 촉진할 수 있다. 그 결과, 소정 생리 활성 물질의 검출 또는 농도의 측정을 보다 신속하게, 또한 고감도로 할 수 있다.

또한, LAL 중에 포함되는 코아굴로겐을 미립자 상에 결합 또는 흡착시킬 때는, 우선 단백질을 결합, 흡착하는 것이 가능한 관능기를 미립자의 표면에 존재시킨다. 그리고, 종래의 방법에 따르면, 그 상태에서 LAL을 작용시켜, 코아굴로겐을 미립자 표면에 화학적으로 결합시키거나, 정전적, 친수적, 소수적으로 흡착시킨다. 그 때의 LAL 중의 반응은 장시간에 미치기 때문에, 종래의 방법으로는, 미립자나 사용하는 시약류, 물 등에 미량으로 혼재하는 소정 생리 활성 물질이 단백질에 있어서의 효소군과 반응하여, 코아굴로겐이 코아굴린으로 가수분해되어, 코아굴로겐과 미립자의 결합·흡착 반응 중에 미립자의 응집이 개시하여 버리는 것이 생각된다. 그리고 이 경우에는, 효소의 활성화에 의해서 시약 중의 코아굴로겐이 가수분해되어 소비되어 버릴 우려가 있다.

이러한 문제점에 대하여, 종래에는, 코아굴로겐을 미립자의 표면에 결합 또는 흡착시킬 때는, LAL 시약과 미립자의 현탁액을 혼합함과 동시에, LAL 중의 효소군과 소정 생리 활성 물질과의 반응을 억제하는 억제제를 첨가할 필요가 있어, 코아굴로겐을 미립자의 표면에 결합 또는 흡착시키는 작업이 복잡하고 비용적으로도 불리한 상황이었다. 이에 비하여 본 발명에서는, 코아굴로겐 원료의 제조 과정에서 LAL 중의 효소군을 실활시키기 때문에, 억제제를 첨가하는 공정을 생략하는 것이 가능하다. 이에 따라, 보다 간단히 또는 보다 저렴한 비용으로 코아굴로겐을 미립자 상에 결합 또는 흡착시킨 시약을 제조하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명은 상기한 코아굴로겐 원료와, 가열 처리되어 있지 않은 LAL을 혼합함으로써, 상기 가열 처리되어 있지 않은 LAL에서의 코아굴로겐 농도를 높인 LAL 시약과, 상기 소정의 생리 활성 물질을 포함하는 시료를 혼화시켜,

상기 소정의 생리 활성 물질에 의해서 상기 LAL 시약 중의 효소군이 활성화되어 생기는 효소 캐스케이드에 의해서 농도가 높아진 상기 코아굴로겐이 코아굴린으로 가수분해되는 것을 이용하여, 상기 소정의 생리 활성 물질을 검출 또는 상기 소정의 생리 활성 물질의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 생물 유래의 생리 활성 물질의 측정 방법일 수도 있다.

이 생물 유래의 생리 활성 물질의 측정 방법에 따르면, 보다 높은 농도의 코아굴로겐을 이용하여, 소정 생리 활성 물질의 측정을 행할 수 있다. 따라서, 소정 생리 활성 물질과 LAL과의 반응에 의한 겔화를 보다 현저하게 할 수 있어, 소정 생리 활성 물질의 측정을 보다 고감도로 할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기한 코아굴로겐 결합 마이크로비드와, 가열 처리되어 있지 않은 LAL과, 상기 소정의 생리 활성 물질을 포함하는 시료를 혼화시킴으로써,

상기 소정의 생리 활성 물질에 의해서 상기 가열 처리되어 있지 않은 LAL에서의 효소군이 활성화되어 생기는 효소 캐스케이드에 의해서 상기 미립자의 표면에 결합 또는 흡착한 코아굴로겐이 코아굴린으로 가수분해되고, 상기 미립자끼리가 가교되는 것을 이용하여, 상기 소정의 생리 활성 물질을 검출 또는 상기 소정의 생리 활성 물질의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 생물 유래의 생리 활성 물질의 측정 방법일 수도 있다.

이 소정 생리 활성 물질의 측정 방법에 따르면, LAL 중의 효소군을 실활시켜 얻어진 코아굴로겐 원료를 미립자 상에 결합 또는 흡착시킨 코아굴로겐 결합 마이크로비드와 가열 처리되어 있지 않은 LAL을 혼합시킨 시약에 엔도톡신을 포함하는 시료를 작용시킨다. 이에 의해, LAL 중에 원래 존재한 코아굴로겐이 코아굴린이 되어 응집함과 동시에, 미립자 상에 결합 또는 흡착된 코아굴로겐이 코아굴린이 되어 미립자끼리를 회합시켜 보다 큰 응집덩어리를 조기에 생성시킨다. 이것에 따르면, LAL 시약과 시료와의 혼화액에 있어서의 겔 입자의 생성을 대폭 촉진할 수 있다. 그 결과, 소정 생리 활성 물질의 검출 또는 농도의 측정을 보다 신속하게, 또한 고감도로 할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기한 코아굴로겐 결합 마이크로비드와, 가열 처리되어 있지 않은 LAL과, 상기 소정의 생리 활성 물질을 포함하는 시료와의 혼화액을 광이 입사 가능하도록 유지하며, 상기 혼화액에서의 반응을 진행시키는 혼화액 유지 수단과,

상기 혼화액 유지 수단 중의 상기 혼화액을 교반하는 교반 수단과,

상기 혼화액 유지 수단 중의 혼화액에 광을 입사하는 광 입사 수단과,

상기 입사광의 상기 혼화액에서의 투과광을 수광하고 전기 신호로 변환하는 수광 수단과,

상기 수광 수단에서 변환된 전기 신호로부터 취득되는 상기 혼화액의 투과율로부터 상기 시료 중의 상기 생리 활성 물질의 농도를 도출하는 도출 수단

을 구비하는 것을 특징으로 하는 생물 유래의 생리 활성 물질의 교반 비탁 측정 장치일 수도 있다.

본 발명에서는, LAL 중의 효소군을 실활시켜 얻어진 코아굴로겐 원료를 미립자 상에 결합 또는 흡착시킨 코아굴로겐 결합 마이크로비드와, 가열 처리되어 있지 않은 LAL과, 소정 생리 활성 물질을 포함하는 시료를 혼화시켜 혼화액 유지 수단에 넣는다. 그리고, 이 혼화액을 교반 수단에 의해 교반함으로써 소정 생리 활성 물질로 활성화된 응고 효소에 의한 코아굴로겐의 가수분해 및, 가수분해로 얻어진 코아굴린에 의한 미립자의 회합을 촉진한다.

그리고, 광 입사 수단으로부터 입사된 광 중, 상기 혼화액을 투과하여 수광 소자에 닿은 광의 강도를 측정한다. 또한, 도출 수단에 있어서는 상기 혼화액의 투과율로부터 소정 생리 활성 물질의 농도가 도출된다.

여기에 있어서, 미립자 상에 결합 또는 흡착된 코아굴로겐의 가수분해가 진행하여 코아굴린이 생성되면, 코아굴린이 미립자끼리를 회합시켜 보다 큰 응집덩어리를 조기에 생성시킨다. 여기서, 코아굴로겐 결합 마이크로비드와 가열 처리되어 있지 않은 LAL과 소정 생리 활성 물질을 포함하는 시료와의 혼화액은, 혼화시점에서는, 다량의 마이크로비드의 미립자가 분산하고 있기 때문에 강하게 탁화되어 있다. 그리고, 코아굴린의 생성에 의한 미립자의 회합이 진행하면 미립자의 농도가 급격히 감소하기 때문에 혼화액의 투과율이 급격히 상승한다.

본 발명에서의 교반 비탁 측정 장치에서는, 통상의 비탁법에 관한 측정 장치와 달리, 코아굴린의 생성에 수반하는 미립자의 회합에 기인하는 투과율의 급격한 상승을 측정하기 때문에, 혼화액을 교반하는 것에 의한 반응의 촉진 효과와 더불어, 측정 시간을 대폭 단축할 수 있음과 동시에, 매우 고감도로 소정 생리 활성 물질의 측정을 행할 수 있다.

또한, 상기한 본 발명의 과제를 해결하는 수단에 대해서는, 가능한 한 조합시켜 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서는, LAL 시약 또는 생물 유래의 생리 활성 물질에 오염된 LAL 시약 등에 있어서의 코아굴로겐의 기능을 유지한 채로 응고 효소 활성을 불가역적으로 불활성화하여, 시약에 이용 가능한 코아굴로겐 원료를 취득하는 것이 가능해진다.

도 1은 본 발명의 실시예에서의 LAL 시약 수용액의 가열 온도와 잔존 응고 효소 비활성과의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에서의 LAL 시약 동결 건조체의 가열 시간과 잔존 응고 효소 비활성과의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예에서의 비탁 계측 장치의 개략 구성을 도시한 도면이다.
도 4는 활성형 응고 효소에 의한 코아굴로겐의 겔화·응집 과정과 코아굴로겐 결합 마이크로비드의 응집 과정을 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 코아굴로겐 결합 마이크로비드법과 비탁법에 있어서의 엔도톡신 용량 반응을 비교한 그래프이다.
도 6은 엔도톡신 또는 β-D-글루칸에 의해 LAL이 겔화하는 과정 및, 그의 검출 방법에 대해서 설명하기 위한 개략도이다.

LAL과 엔도톡신이 반응하여 겔이 생성되는 과정은 잘 조사되어 있다. 즉, 도 6에 도시된 바와 같이, 엔도톡신이 LAL 중의 세린 프로테아제인 C 인자에 결합하면, C 인자는 활성화하여 활성형 C 인자가 되고, 활성형 C 인자는 LAL 중의 별도의 세린 프로테아제인 B 인자를 가수분해하여 활성화시켜 활성화 B 인자로 한다. 이 활성화 B 인자는 즉시 LAL 중의 응고 효소의 전구체를 가수분해하여 응고 효소로 하고, 또한 이 응고 효소가 LAL 중의 코아굴로겐을 가수분해하여 코아굴린을 생성한다. 그리고, 생성된 코아굴린이 서로 회합하여 불용성의 겔을 또한 생성하고, LAL 전체가 이것에 감겨 겔화한다고 생각되고 있다.

또한, 마찬가지로 β-D-글루칸이 LAL 중의 G 인자에 결합하면, G 인자는 활성화하여 활성형 G 인자가 되고, 활성형 G 인자는 LAL 중의 응고 효소의 전구체를 가수분해하여 응고 효소로 한다. 그 결과, 엔도톡신과 LAL의 반응과 마찬가지로, 코아굴린이 생성되고, 생성된 코아굴린이 서로 회합하여 불용성의 겔을 또한 생성한다.

이 일련의 반응은 포유동물에 보이는 크리스마스 인자나 트롬빈 등의 세린 프로테아제를 통한 피브린겔의 생성 과정에 유사하다. 이러한 효소 캐스케이드 반응은 극히 소량의 활성화 인자이어도, 그 후의 캐스케이드를 연쇄하여 활성화하여 가기 때문에 매우 강한 증폭 작용을 갖는다. 따라서, LAL을 이용한 소정 생리 활성 물질의 측정법에 따르면, 서브피코그램/mL 오더의 매우 미량의 소정 생리 활성 물질을 검출하는 것이 가능하게 되어 있다.

소정 생리 활성 물질을 정량하는 것이 가능한 측정법으로서는 상술한 바와 같이 비탁법, 및 레이저광 산란 입자 계측법을 들 수 있다. 이들 측정법은 이 LAL의 효소 캐스케이드 반응에 의해서 생성되는 코아굴린의 회합물을 전자는 시료의 탁도로서, 후자는 계 내에 생성되는 겔의 미립자로서 검출함으로써 고감도의 측정을 가능하게 하고 있다.

특히 레이저광 산란 입자 계측법에서는, 계 내에 생성된 겔의 미립자를 직접측정하기 때문에, 비탁법보다도 고감도이고, 또한 일반적으로 LAL과 검체로 이루어지는 시료를 강제적으로 교반하기 때문에, 비탁법과 비교하여 단시간에 겔의 생성을 검출할 수 있다.

또한, 엔도톡신의 별도의 측정법으로서 비색법이 있다. 이것은 도 6에 도시된 바와 같이, LAL의 효소 캐스케이드 반응을 이용하면서도, 코아굴린 겔에 의한 시료의 탁도를 측정하는 것은 아니라, 응고 효소에 의해 가수분해를 받아 발색하는 합성 기질을 이용하여, 합성 기질을 포함한 LAL과 검체를 반응시키고, 그의 흡광도 변화를 측정하는 방법이다. 이 비색법에 있어서는, 계 내에 생성되어 가는 발색 물질의 농도를 측정하기 때문에, 시료에 있어서의 겔의 생성을 측정하는 비탁법이나 레이저광 산란 입자 계측법과 비교하면, 단시간에 저농도의 소정 생리 활성 물질을 측정할 수 있다.

그런데, 상기한 각각의 측정법으로 엔도톡신이나 β-D-글루칸을 측정하기 위한 LAL 시약을 제조하는 과정에서 엔도톡신 또는 β-D-글루칸이 혼입되면, 혼입된 물질의 양에도 의존하지만, 시약의 제조 도중에서 원료가 겔화하게 되어 시약으로서 사용 불가능이 되는 경우가 있다. 그 때의 혼입량이 예를 들어 근소하더라도, 이미 진술한 바와 같이 LAL 시약은 효소의 캐스케이드에 의한 증폭 작용을 갖기 때문에, 시약의 제조에 장시간을 요하는 경우에는, 시약 전체가 겔화하여 버리는 경우도 있을 수 있다.

엔도톡신에 대해서는 폴리믹신 B나 폴리리신 등의 흡착 물질이 알려져 있고, LAL 시약에 적용함으로써 혼입한 엔도톡신을 제거하는 것도 가능하다. 그러나, 이미 활성화하여 버린 C 인자, B 인자, 및 응고 효소는 효소 캐스케이드의 최하류의 코아굴로겐을 가수분해하는 방향으로 계속 기능하기 때문에, 엔도톡신을 제거하는 것만으로는 LAL 시약의 겔화를 방지할 수 없다. 이것은 β-D-글루칸에 대해서도 동일하다.

이하에, 엔도톡신 또는 β-D-글루칸이 극히 미량 혼입되더라도, 제조 도중에 겔화하는 것을 억제할 수 있는 LAL 시약 또는 LAL을 소재로 한 코아굴로겐 원료의 제조법의 예를 기술한다. 그러나 본 발명의 LAL 시약 및 코아굴로겐 원료의 제조법은 이하의 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 코아굴로겐 원료의 소재로서는 투구게의 혈구 추출물, 그것을 이용하여 제조된 LAL 시약, 및 이들에 극히 미량의 엔도톡신 또는 β-D-글루칸이 혼입되었기 때문에 시약으로서 이용할 수 없게 된 폐기물 등을 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적이 기능을 가진 코아굴로겐 원료의 제조에 있는 것으로부터, 이미 코아굴로겐의 대다수가 코아굴린이 되어 겔화하여 버린 것은 제외한다. 이들의 소재에 대하여 필요에 따라서 엔도톡신을 흡착하는 물질, β-D-글루칸을 흡착하는 물질, 엔도톡신의 작용을 실활시키는 물질, β-D-글루칸의 작용을 실활시키는 물질 중의 적어도 하나 이상을 첨가할 수도 있다.

엔도톡신을 흡착하는 물질로서는 폴리믹신 B, 폴리리신, 폴리오르니틴, 폴리에틸렌이민 등, 또는 C 인자 자체나 C 인자가 엔도톡신을 결합하는 부위를 포함하는 단백질이나 폴리펩티드, 엔도톡신을 결합하는 항체 등을 예시할 수 있다. 엔도톡신을 실활시키는 물질로서는, 철 이온, 알루미늄 이온, 크롬 이온, 니켈 이온, 코발트 이온, 망간 이온을 포함하는 수용액, 및 이들을 공급하는 금속편 등을 예시할 수 있다.

마찬가지로, β-D-글루칸과 결합하는 물질로서는 렉틴, 또는 G 인자 자체 또는 G 인자가 β-D-글루칸을 결합하는 부위를 포함하는 단백질이나 폴리펩티드, β-D-글루칸을 결합하는 항체 등을 예시할 수 있다. 또한, β-D-글루칸을 불활성화하기 위해서는, 소재의 수소 이온 농도를 낮추는 것에 의해 β-D-글루칸의 용해성을 낮추어서 석출시켜 버리는 것도 생각된다.

이와 같이 필요에 따라서 최적의 첨가물을 혼합시킨 소재에 대하여, 다음으로 가열 처리를 행한다. 이 가열 처리를 적당한 가열 온도, 가열 시간에 행함으로써, 소재 중의 소정의 효소군인 C 인자, 활성형 C 인자, B 인자, 활성형 B 인자, G 인자, 활성형 G 인자, 응고 효소 전구체, 응고 효소의 적어도 일부를 불가역적으로 불활성화시킨다. 그리고, 엔도톡신이나 β-D-글루칸과의 반응에 의해서 응고 효소가 생기지 않도록 한다. 그렇게 하면, 가령 엔도톡신이나 β-D-글루칸에 오염되더라도, 가수분해되어 코아굴린이 되어 겔화하는 것이 없는 코아굴로겐 원료를 얻을 수 있다.

이 경우의 가열 처리는 소재의 상태에 따라 가열 온도와 가열 시간을 적절하게 조정하면 좋다. 예를 들면, 소재가 용액인 경우, 반응시키는 온도가 40℃ 이상 140℃ 이하인 것이 바람직하고, 60℃ 이상 100℃ 이하인 것이 더욱 바람직하다. 바람직한 가열 시간은 가열 온도에 따라서 크게 다르지만, 30초 이상 72시간 이하인 것이 바람직하고, 10분 이상 8시간 이하인 것이 더욱 바람직하다.

가열 온도를 너무 높게 하거나, 가열 시간을 너무 길게 하거나 하면, LAL 시약 또는, LAL 중의 단백질이 변성하여 백탁하게 되어, 시료의 탁도를 측정하는 방법에는 사용이 곤란하게 되거나, 코아굴로겐이 변성하여 기능을 잃어 버리거나 할 가능성이 있기 때문에 주의를 요한다.

한편, 소재가 이미 동결 건조체로 되어있는 LAL 시약인 경우에는, 소재가 용액인 경우와 달리, 보다 높은 가열 온도와 보다 긴 가열 시간이 필요해진다. 가열 온도는 80℃ 이상 300℃ 이하가 바람직하고, 100℃ 이상 250℃ 이하가 더욱 바람직하다. 바람직한 가열 시간은 수용액의 경우와 같이 가열 온도에 따라 다르지만, 30초 이상 72시간 이하가 바람직하고, 10분 이상 8시간 이하가 더욱 바람직하다.

이와 같이 가열 처리한 소재는 필요에 따라서 다양한 금속염 또는 암모늄염, 산, 알칼리, 나아가서는, 완충액 등에 의해 pH를 조정하거나, 필요에 따라서 계면활성제나 당류 등을 첨가할 수도 있다.

이와 같이 제조한 코아굴로겐 원료는 그대로로는 엔도톡신이나 β-D-글루칸을 작용시키더라도 겔화 또는 응집 반응을 일으키지 않는다. 그러나, 활성화한 응고 효소를 작용시키거나, 또는 가열 처리하지 않은 LAL 시약과 혼화 후에 엔도톡신이나 β-D-글루칸을 작용시킴으로써 빠르게 코아굴린으로 가수분해되어 겔화 또는 응집 반응이 야기된다.

또한, 본 발명에 의해 제조한 코아굴로겐 원료는 엔도톡신이나 β-D-글루칸의 측정 감도의 향상, 측정 시간의 단축, 측정 편리성의 향상 등에 도움이 되게 하는 것이 가능하다. 즉, 본 발명의 코아굴로겐 원료를 가열 처리하지 않은 LAL 시약과 혼화함으로써, 통상보다도 코아굴로겐 농도가 높은 LAL 시약을 제조하는 것이 가능하다. 이 LAL 시약에 엔도톡신이나 β-D-글루칸을 작용시킴으로써, 보다 신속하고 고감도의 측정이 가능해진다.

또한, 예를 들면, 본 발명에 의한 코아굴로겐 원료를 폴리스티렌 라텍스의 미소한 입자 표면에 결합 또는 흡착시킨 상태의 LAL 시약을 제조함으로써, 종래의 비탁법에 의한 엔도톡신 측정보다도 대폭적인 시간 단축이 가능한 측정법을 실현할 수 있다.

즉, 코아굴로겐 원료를 폴리스티렌 라텍스의 미립자(이하, 비드라고도 함)의 표면에 결합 또는 흡착시킨 LAL 시약에, 엔도톡신이나 β-D-글루칸에 의해서 활성화된 응고 효소를 작용시키면, 코아굴로겐이 효소 캐스케이드에 의해 가수분해되어 코아굴린이 되고, 이들이 미립자끼리를 회합시킨다. 따라서, 본 발명에 의해 취득된 코아굴로겐 원료에 있어서의 코아굴로겐을 미립자에 결합 또는 흡착하여 둠으로써 보다 효율적으로 미립자끼리를 회합시키는 것이 가능해져, 보다 조기에 응집덩어리를 생성시키는 것이 가능해진다.

본 발명의 코아굴로겐 원료에 있어서의 코아굴로겐을 비드에 결합시키기 위해서는, 비드가 갖는 전하로 흡착시키는 방법, 비드의 이온적 성질을 이용하는 방법, 비드 표면에 코아굴로겐 원료 중의 단백질과 반응 가능한 관능기를 형성하고, 그 관능기와 단백질 중의 아미노기 또는 카르복실기를 이용하여 화학적으로 결합시키는 방법 등이 생각되는데, 어떠한 방법을 사용해도 된다.

그런데, 종래, LAL의 소재를 개변하여 이와 같이 비드에 결합 또는 흡착시키는 조작을 하면, 제조에 걸리는 시간이 수시간 이상이라는 장기간에 미치기 때문에, 다른 소재 중에 미량으로 혼입된 엔도톡신이나 β-D-글루칸이 영향을 주거나, 또는 작업 중에 이들의 생리 활성 물질이 미량으로 혼입되거나 하여, 원료가 겔화하게 되어, 그대로로는 목적으로 하는 물질을 얻을 수 없는 경우가 있었다.

이에 대하여, 종래는, 원료에 대하여 각종 효소 저해제를 첨가하는 대책이 생각되었다. 이 효소 저해제로서는, 디이소프로필플루오로포스페이트, 벤즈아미딘, 페닐메탄술포닐 플루오라이드, 4-(2-아미노에틸)-벤젠술포닐 플루오라이드, 6-아미디노-2-나프틸-4-구아니디노벤조에이트 디메탄술포네이트, p-아미디노페닐메틸술포닐 플루오라이드, 아프로티닌, 안티팬, 류펩틴, 에코틴, PPACK(Phe-Pro-Arg-클로로메틸케톤), α2-마크로글로불린, 트립신 억제제 등을 예시할 수 있다.

그러나, 본 발명의 코아굴로겐 원료를 이용한 경우에는, LAL 중의 효소 기능만이 불가역적으로 불활성화되어 있음과 동시에 코아굴로겐 활성은 유지되어 있다. 따라서, 상기한 바와 같은 효소 저해제를 첨가할 필요도 없고, 비드에의 결합 또는 흡착 조작 중에 소재 중에 혼입된 엔도톡신이나 β-D-글루칸에 의한 원료의 겔화를 방지할 수 있다.

이하에, 본 발명의 코아굴로겐 원료의 제조 방법의 상세에 대해서 나타낸다. 제조예는 제조 방법의 일례를 나타낸 것으로서, 본 발명에 따른 제조 방법은 이하의 제조예의 조건에 한정되는 것은 아니다.

〔제조예 1〕

LAL 시약의 동결 건조체(리물루스 ES-II 싱글 테스트 와코, 와코 쥰야꾸 제조, 이하 ES-II라 함)에 소정량(0.15 mL)의 주사용 증류수(오쯔카 세이야꾸 제조)를 가하고 보르텍스 믹서로 혼화하였다. 그 후, 미리 소정 온도(후술함)로 가열해 놓은 알루미늄 블록 히터(HDB-1N, 애즈원 제조, 이하 특별한 언급이 없는 한 알루미늄 블록 히터로서 이 기종을 사용함)에 세트하고 소정 시간(후술함)의 가열을 행하였다. 가열 후 곧바로 얼음 중에서 냉각하여 코아굴로겐 원료의 수용액을 얻었다.

〔제조예 2〕

LAL 시약(ES-II)의 동결 건조체를 그대로, 미리 120℃로 가열해 놓은 알루미늄 블록 히터에 세트하고 소정 시간(후술함)의 가열을 행하였다. 가열 후 곧바로 얼음 중에서 냉각하여 코아굴로겐 원료의 동결 건조체를 얻었다.

〔제조예 3〕

제조예 1, 및 제조예 2에서 얻어진 코아굴로겐 원료의 효소 활성의 불가역적인 실활과 코아굴로겐 기능의 유지를, 엔도톡신의 정량이 가능한 레이저 산란 입자 계측법을 이용하여 평가하였다. 레이저 산란 입자 계측법에 있어서는, 시료를 교반하기 위한 스테인리스제의 교반자(φ1 mm, 길이 5 mm)를 내재한, φ7 mm, 길이 50 mm의 전용의 유리 용기를 사용하였다. 이 용기를 엔도톡신프리로 하기 위해서, 용기의 개구부를 알루미늄박으로 덮고, 또한 20개씩 알루미늄박으로 작게 나누어 곤포한 것을 철제의 건열 처리관에 채우고, 250℃에서 3시간 가열 처리하여, 엔도톡신을 열분해하였다. 이와 같이 건열 처리에 의해 엔도톡신프리로 한 측정 용기를 제조하여 시험에 사용하였다.

〔제조예 4〕

본 발명에 의한 코아굴로겐 원료의 코아굴로겐 기능, 즉 활성화한 응고 효소에 의해 코아굴로겐이 가수분해되어 겔화하거나, 또는 응집 반응을 나타내는지를 조사하기 위해서, 응고 효소의 활성화물을 이하와 같이 하여 얻었다. 즉, 가열 처리하지 않은 LAL 시약(ES-II)에 1.0 EU/mL의 농도의 엔도톡신 수용액 200 μL를 작용시키고, 제조예 3에 의해 제조한 측정 용기에 LAL 시약과 엔도톡신 수용액의 혼합물을 이주(移注)하고, 37℃로 보온하면서 용기 내부의 스테인리스 교반자를 용기저면 방향으로 배치한 교반기에 의해 회전하여 반응을 진행시켰다.

레이저광 산란 입자 계측법에서는, 엔도톡신에 의해 겔화한 LAL 시약이 교반에 의해 미소한 응집덩어리로서 출현하고, 그 응집덩어리의 출현 시간과 시료 중의 엔도톡신의 농도는 양 대수 플롯에서 직선으로 플로팅된다는 것이 알려져 있다. 이 조건의 경우, 약 6분으로 응집이 검출되었지만, 응집 검출 후에도 교반을 계속하여, 측정 개시로부터 20분의 시점에서 용기를 장치로부터 취출하고, 용기 내부의 겔 응집물을 전량 회수하고, 엔도톡신프리의 일회용 원심관에 이주하고, 15000 rpm(로터 반경 7 cm)에서 2분간 원심하여 코아굴린 중합체가 주성분인 겔 성분을 침전시켰다. 별도의 방법에 의해, 원심 상청에는 코아굴로겐이 포함되어 있지 않은 것을 확인하였다. 이 제조법에 의해 엔도톡신에 의해서 활성화한 응고 효소를 제조하였다.

〔제조예 5〕

LAL 시약(ES-II)에 소정 농도(후술함)의 엔도톡신 수용액 0.2 mL를 가하고 보르텍스 믹서로 혼화한 후, 미리, 100℃로 가열해 놓은 알루미늄 블록 히터에 세트하여 20분간의 가열을 행하였다. 가열 후 곧바로 얼음 중에서 냉각하여 엔도톡신이 혼입된 코아굴로겐 원료의 수용액을 얻었다.

〔제조예 6〕

표면이 카르복실화된 폴리스티렌 라텍스 미립자(폴리비즈 카르복실레이트 마이크로스피어스(Polybeads Carboxylate Microspheres), 0.45 ㎛, 고형분 2.63％, 폴리사이언시스사(Polysciences Inc.) 제조, 이하, 카르복실 비드라 함)의 현탁액 0.5 mL를 엔도톡신프리의 스크류캡부 원심관(용량 2.0 mL)에서 15000 rpm에서 5분간 원심하고, 상청액을 제거하였다. 이어서, 주사용 증류수를 가하여 2.0 mL로 하고, 현탁시킨 후에 다시 원심하여 상청액을 제거하였다. 이 원심 조작에 의한 상청액 제거를 또 한번 반복한 후, 주사용 증류수 1 mL에 재현탁하고, 또한 그 후, 엔도톡신프리의 스크류캡부 원심관(용량 15 mL)에 이주하였다. 또한, 4 mL의 주사용 증류수를 가한 후에 오토클레이브(121℃, 20분)을 걸어, 비드에 혼입하는 엔도톡신을 불활성화 및 제거하였다.

오토클레이브 후의 카르복실 비드를 용량 2 mL의 스크류캡부 원심관에 이주하고, 상술한 요령으로 원심과 상청액 제거, 또한 주사용 증류수에의 재현탁을 세트로 하는 세정 조작을 합계 2회 행하였다. 다음으로, 주사용 증류수로 용해하여, 농도가 20 mg/mL가 되도록 제조한 수용성 카르보디이미드(WSC, 도진도 래보레이토리스 제조) 수용액 10 mL에 0.1 M 아세트산 완충(pH 4.98) 2 mL를 혼합하고, 이것을 공경 φ0.2 ㎛의 멸균용 필터(밀리포어 제조)에 통과시키고, 이 중의 0.5 mL에 상기한 카르복실 비드의 침전물을 재현탁시켰다.

또한, LAL 시약(ES-II)의 동결 건조체에 주사용 증류수(오쯔카 세이야꾸 제조) 0.5 mL를 가하여 용해하고, 60℃에서 10분간 가열을 행하였다. 이 가열 처리에 의해 얻어진 본 발명의 코아굴로겐 원료 0.5 mL와 상술한 방법으로 제조한 카르복실 비드 현탁액 0.5 mL, 또한 1.0％가 되도록 제조한 비이온성 계면활성제인 트리톤(Triton) X-100 수용액(주사용 증류수로 제조한 후, 공경 φ0.2 ㎛의 멸균용 필터로 여과)을 10 μL 혼합하고, 실온에서 2시간 반응시켰다.

이 반응에 의해, 카르복실 비드의 카르복실기가 카르보디이미드로 활성화된 후, 코아굴로겐의 아미노기와 아미드 결합을 일으켜, 비드 표면에 코아굴로겐이 화학적으로 결합된다. 반응 후, 상기한 바와 같이 원심, 상청액 제거, 주사용 증류수에 의한 재현탁을 2회 행하여 반응물을 세정하였다. 이어서, 0.25 M의 아미노에탄올 수용액(주사용 증류수로 제조한 후, 공경 φ0.2 ㎛의 멸균용 필터로 여과)을 100 μL 가하고, 실온에서 20분간 교반하고, 카르복실 비드 상의 활성화한 카르복실기 중 미반응된 것을 불활성화시켰다. 그 후, 마찬가지로 주사용 증류수로 합계 3회 세정하고, 5 mL의 주사용 증류수에 재현탁시키고, 상술한 1.0％의 트리톤 X-100 수용액과 2％의 아지드화나트륨 수용액(주사용 증류수로 제조한 후, 공경 φ0.2 ㎛의 멸균용 필터로 여과)을 각각 50 μL씩 가하여 코아굴로겐 결합 마이크로비드를 얻었다.

이하에, 본 발명의 실시예에 대해서 설명한다.

〔실시예 1〕

제조예 1에 있어서, 알루미늄 블록 히터의 지시 온도를 40℃, 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 100℃ 및 120℃ 중 어느 하나의 조건에 있어서, 가열 시간을 10분으로 하여 제조한 코아굴로겐 원료로부터 100 μL를 취하고, 제조예 3에서 제조한 측정 용기에 넣었다. 거기에, 2.0 EU/mL의 농도의 엔도톡신 수용액 100 μL를 가하여 작용시키고, 레이저 산란 입자 계측 장치(PA-200, 고와 제조, 이하 PA-200라 함)로 측정을 행하였다. 가열 처리 없음의 경우의 측정 농도(C=1.0EU/mL)와, 가열한 LAL 시약에서의 측정 농도(S)로부터, 가열된 후에 잔존하는 효소 활성인 잔존 응고 효소 비활성(A)을 이하의 식으로 정의하여 도출하였다.

도 1에는, 얻어진 잔존 응고 효소 비활성(A)과 LAL 시약 수용액의 가열 온도와의 관계를 나타낸다. 도 1에 도시한 바와 같이, 가열 시간을 10분으로 한 경우에는, 가열 온도가 60℃ 이상으로 되면 효소 활성이 완전히 소실하는 것을 알 수 있었다. 또한, 도시하지 않지만, 가열 온도가 높을수록 제조 후의 코아굴로겐 원료 수용액은 백탁하는 현상이 관찰되었다. 예를 들면, 120℃에서 가열하여 코아굴로겐 원료 수용액을 제조한 경우, 상당한 부분이 열변성에 의한 것이라고 보이는 백탁과 불용물로 변화되어 있어, 실사용에는 적합하지 않은 것을 알았다.

〔실시예 2〕

제조예 1에 있어서, 알루미늄 블록 히터의 지시 온도를 40℃, 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 100℃ 및 120℃ 중 어느 하나의 조건에 있어서, 가열 시간을 10분으로 하여 제조한 코아굴로겐 원료 (150 μL)에, 제조예 4에서 얻어진 활성화한 응고 효소 수용액 50 μL를 가하여 작용시키고, 보르텍스 믹서로 5초간 혼화시켰다. 그 시료를 제조예 3에서 제조한 측정 용기에 이주하고, 레이저 산란 입자 계측 장치(PA-200)로 응집 개시 시간의 측정을 행하였다.

표 1에 각각의 가열 온도에 대한 응집 개시 시간을 나타내었지만, 어느 가열 온도에서도 활성화한 응고 효소 수용액을 첨가하고 나서 3분 정도에서 응집이 개시하고 있어, 코아굴로겐의 기능은 가열에 의한 영향을 거의 받고 있지 않은 것이 나타내어졌다. 또한, 120℃라는 고온에서 처리한 경우에는, LAL 시약 중의 대부분의 단백질은 열변성하여 응고하여 버리지만, 그 중에 잔존하는 코아굴로겐 자체는 기능을 유지하고 있어, 활성화한 응고 효소 수용액의 첨가로부터 4분 정도에서 응집이 개시하였다. 이것으로부터, 코아굴로겐은 매우 가열에 강한 것이 나타내어졌다. 또한, 표 1로부터 알 수 있는 바와 같이, LAL 시약을 80℃ 이하에서 가열 처리하여 효소 활성을 실활시킨 경우에는, LAL 시약에 백탁은 거의 보이지 않았다. 따라서, LAL 시약을 80℃ 이하에서 가열 처리하여 효소 활성을 실활시킴으로써, 광학적인 측정에도 적합한, 보다 이용가치가 높은 코아굴로겐 원료를 취득하는 것이 가능해지는 것을 알 수 있었다.

〔실시예 3〕

제조예 2에 있어서, 가열 시간을 10분, 30분, 60분, 120분 및 300분 중 어느 하나의 시간으로 하여, LAL 시약(리물루스 ES-II 싱글 테스트 와코, 와코 쥰야꾸 제조)를 개봉하지 않고서 그대로 가열 처리한 코아굴로겐 원료의 동결 건조체에 1.0 EU/mL의 엔도톡신 수용액 (200 μL)을 첨가하였다. 그리고, 보르텍스 믹서로 5초간 혼화한 후, 제조예 3에 의해 제조한 측정 용기에 이주하여, 레이저광 산란 입자 계측 장치(PA-200)로, 가열 처리 후에 잔존하는 효소의 활성을 조사하였다. 그리고, 상술한 수학식 1로 정의되는 잔존 응고 효소 비활성(％)을 산출하였다.

도 2에는 본 실시예에서 얻어진 잔존 응고 효소 비활성과, LAL 시약 동결 건조체의 가열 처리 시간과의 관계를 나타낸다. 도 2에 도시한 바와 같이, 실시예 1의 경우와 비교하여, 고온 하에서 장시간의 가열 처리를 행하더라도, 여간해서 효소 활성이 완전히 소실되지 않는 것을 알 수 있다. 그러나, 120℃에서 300분의 가열 처리에 의해, 잔존 응고 효소 비활성은 0.2％ 정도로 감소하였다. 이와 같이 제조한 코아굴로겐 원료에서는, 원료를 물에 용해시켰을 때의 수용액의 색이 약간 황변하는 경향이 보였지만, 백탁이나 응고 불용물의 발생은 없고, 물에 빠르게 용해하였다.

〔실시예 4〕

실시예 4에 있어서는, 미리 엔도톡신이 혼입된 상태에서 LAL 시약을 가열 처리한 경우의, 혼입한 엔도톡신의 농도와 가열 처리에 의한 효소의 불활성화의 정도와의 관계를 조사하였다. 제조예 5에 있어서, 미리 혼입시켜 놓은 엔도톡신 수용액의 엔도톡신 농도 10, 1, 0.1 EU/mL로서, 각각의 농도의 엔도톡신이 혼입된 코아굴로겐 원료를 얻었다.

다음으로, 본 실시예에서는, 상기한 엔도톡신이 혼입된 코아굴로겐 원료와 비교하기 위한 대조 코아굴로겐 원료를, 엔도톡신을 포함하지 않는 주사용 증류수(오쯔카 세이야꾸 제조) 0.2 mL로 용해한 LAL 시약을 제조예 5에 도시된 절차로 가열함으로써 제조하였다. 또한, 엔도톡신 수용액의 희석 계열을 만들고, 각각 200 μL를 가열 처리하지 않은 LAL 시약(ES-II)에 넣고 보르텍스 믹서로 5초간 교반한 후, 각각의 시료로부터 100 μL를 취하고, 상기한 컨트롤 코아굴로겐 원료 100 μL와 혼화하고, 레이저광 산란 입자 계측 장치(PA-200)로 엔도톡신 농도의 검량선을 얻었다.

다음으로, 가열 처리하지 않은 LAL 시약(ES-II)을 주사용 증류수(오쯔카 세이야꾸 제조) 200 μL로 용해하고, 그 중의 100 μL를 상기한 미리 엔도톡신이 혼입된 각각의 코아굴로겐 원료 100 μL와 보르텍스 믹서로 5초간 혼화시켰다. 그리고, 레이저광 산란 입자 계측 장치(PA-200)로 엔도톡신 농도를 상기에서 얻어진 검량선에 대조하여 산출하였다. 얻어진 결과를 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 어느 시료에 있어서도 측정된 엔도톡신 농도는 실제로 혼입된 엔도톡신 농도보다 낮았다. 그리고, 표 중의 가열 후의 활성 잔존율이 나타낸 바와 같이, 얻어진 엔도톡신 농도의 실제의 값으로부터의 저하의 정도는, 혼입시킨 엔도톡신의 농도가 낮을수록 컸다. 이와 같이, 미리 혼입시킨 엔도톡신의 농도가 낮을수록 가열 처리에 의한 효소의 불활성화의 효과가 큰 것이 나타내어졌다.

〔실시예 5〕

제조예 6에 의해 제조된 코아굴로겐 결합 마이크로비드를 이용하여 엔도톡신 수용액의 희석 계열 중의 엔도톡신 농도를 교반비탁법을 이용하여 측정하였다(이하, 이 측정법을 코아굴로겐 결합 매크로비드법으로 함). 교반비탁법은 종래법의 비탁법과 달리, 시료를 교반하면서, 시료의 투과율의 변화의 정도로부터 엔도톡신의 농도를 측정한다.

도 3에는 본 실시예의 교반 비탁 측정 장치로서의 비탁 계측 장치 (1)의 개략 구성을 나타낸다. 본 실시예의 교반비탁법에 있어서는, 시료는 혼화액 유지 수단으로서의 전용의 유리제 용기 (2)에 이주한다. 유리제 용기 (2)의 주위를 둘러싸도록 보온기 (5)가 설치되어 있다. 이 보온기 (5)의 내부에는 도시하지 않은 전열선이 구비되어 있고, 이 전열선에 통전됨으로써, 유리제 용기 (2)를 약 37℃로 보온하도록 되어 있다. 이 유리제 용기 (2) 중에는 스테인리스제의 교반자 (3)이 구비되어 있다. 이 교반자 (3)은 유리제 용기 (2)의 하부에 설치된 교반기 (4)의 작용에 의해서 유리제 용기 (2) 중에서 회전한다. 즉, 교반기 (4)는 모터 (4a)와 모터 (4a)의 출력축으로 설치된 영구자석 (4b)로 이루어져 있다. 그리고, 모터 (4a)에 통전됨으로써 영구자석 (4b)가 회전한다. 이 영구자석 (4b)에서의 자계가 회전하기 때문에, 스테인리스제의 교반자 (3)이 회전자계의 작용으로 회전한다. 이 교반자 (3)과 교반기 (4)는 교반 수단에 상당한다.

또한, 비탁 계측 장치 (1)에는 광 입사 수단으로서의 광원 (6)과 수광 수단으로서의 수광 소자 (9)가 설치되어 있다. 광원 (6)으로부터 출사한 광은 개구 (7)을 통과한 후, 보온기 (5)에 설치된 입사구멍 (5a)를 통과하여 유리제 용기 (2) 중의 시료에 입사된다. 유리제 용기 (2) 중의 시료를 투과한 광은 보온기 (5)에 설치된 출사구멍 (5b)로부터 출사되어, 개구 (8)을 통과하여 수광 소자 (9)에 조사된다. 수광 소자 (9)에서는, 수광한 광의 강도에 따른 광전 신호를 출력한다. 이 광전 신호의 출력으로부터, 도출 수단으로서의 연산 장치 (10)에 있어서 시료의 투과율이 산출된다.

열처리하지 않은 LAL 시약(ES-II) 2개를 200 μL의 주사용 증류수에 용해시키고, 거기에, 제조예 6에서 제조한 코아굴로겐 결합 마이크로비드 50 μL를 넣고 보르텍스 믹서로 5초간 교반하여 코아굴로겐 결합 마이크로비드-LAL 시약 혼합물을 얻었다. 엔도톡신 수용액의 희석 계열, 즉, 2, 0.2, 0.02, 0.002 EU/mL 중 어느 하나의 50 μL와 상기한 코아굴로겐 결합 마이크로비드-LAL 시약 혼합물 50 μL를 상기한 제조예 3에 준하여 제조한 유리제 용기 (2)에 넣고 비탁 계측 장치 (1)로 측정을 행하였다.

코아굴로겐 결합 마이크로비드법에서는, 작용시킨 엔도톡신에 의해 LAL 시약 중의 응고 효소가 활성화되면, 동일하게 LAL 시약 중에 포함되는 코아굴로겐이 코아굴린이 되고, 동시에, 코아굴로겐 결합 마이크로비드 상의 코아굴로겐도 가수분해되어 코아굴린이 되는데, 비드가 이들 코아굴린에 의해 가교되어 큰 응집덩어리를 형성한다. 시료에는, 당초, 다량의 단체 비드가 포함되어 있어 강하게 탁해져 있지만, 응집에 의해 단체의 비드 농도가 급격히 감소하기 때문에, 시료의 광투과율이 상승한다. 코아굴로겐 결합 마이크로비드법에서는 이 광의 투과율의 급격한 상승에 의해 응집덩어리의 발생 개시 시간을 결정한다.

도 4에는, 종래의 활성형 응고 효소에 의한 코아굴로겐의 겔화·응집 과정과, 코아굴로겐 결합 마이크로비드법에 있어서의 코아굴로겐의 겔화·응집 과정을 나타낸다. 도 4의 (A)에 도시된 것은 종래의 활성형 응고 효소에 의한 코아굴로겐의 겔화·응집 과정이다. 도면에 도시한 바와 같이, 입경으로서 수 nm 정도의 코아굴로겐 (100)이 활성형 응고 효소에 의해서 가수분해되어 코아굴린 (101)이 된다. 이들 코아굴린 (101)은 응집하여 다량체가 되고 교반비탁법에서는 겔 입자를 형성한다. 그 후, 시간의 경과와 함께 코아굴린 (101)의 응집은 더욱 진행하여 겔 입자의 입경은 서서히 커진다. 그리고, 비교적 긴 래그 타임이 경과한 시점에 측정 가능한 수 ㎛ 내지 수십 ㎛의 입경의 겔 입자 (102)가 된다.

이에 비하여, 코아굴로겐 결합 마이크로비드법에서는, 도 4의 (B)에 도시된 바와 같이, 비드 (103) 상에 결합한 코아굴로겐 (100)에 활성형 응고 효소가 작용하면, 비드 (103) 상의 코아굴로겐 (100)이 효소 캐스케이드에 의해서 가수분해되어 코아굴린 (101)이 되어, 코아굴린 (101)이 응집하는 과정에서는 코아굴린 (101)이 비드 (103)끼리를 회합시킨다. 이것에 의해, 코아굴린 (101)과 비드 (103)을 주성분으로 하는 입자의 직경이 조급히 커져, 단시간의 래그 타임에 있어서 측정 가능한 입경을 얻게 된다. 또한, 이 응집 반응은 LAL 단체로 야기되는 응집 반응보다도 매우 강대한 것도 명확하게 되어 있다.

또한, 본 실시예에서는, 코아굴로겐 결합 마이크로비드법을 이용한 경우와 비교하기 위해서 비탁법에 의해서도 엔도톡신 농도 측정을 행하였다. 비탁법으로서는, 열처리하지 않은 LAL 시약에 주사 용수 100 μL, 엔도톡신 수용액 희석 계열 중 어느 하나 농도의 시료를 100 μL 넣고 비탁법 장치(톡시노미터 ET-2000, 와코 쥰야꾸 제조)로 측정을 행하였다. 코아굴로겐 결합 마이크로비드법과 비탁법의 비교 결과를 도 5에 나타내었는데, 양 측정법 모두 횡축에 엔도톡신 농도, 종축에 검출 시간을 취하면, 그 양축 대수 플롯은 직선에 근사되었다. 근사 곡선은 코아굴로겐 결합 마이크로비드법이 Y=-0.190X+0.738, 비탁법에서는 Y=-0.349X+0.869인 것으로부터, 코아굴로겐 결합 마이크로비드법이 비탁법에 비하여 대폭 측정 시간을 단축 가능한 것, 작용시키는 엔도톡신의 농도가 낮을수록 측정에 요하는 시간의 차가 크게 벌어지는 것이 나타내어졌다. 측정에 요하는 실시간 등을 표 3에 통합하였다.

본 실시예에 있어서, 비드 (103)의 소재는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 폴리스티렌 라텍스 수지 외에, 실리카, 실리콘 수지, 셀룰로오스 수지, 폴리비닐알코올 수지, 히드록시인회석 등을 예시할 수 있고, 폴리스티렌 라텍스 수지, 실리카, 셀룰로오스 수지가 바람직하다.

또한, 비드 (103)의 크기는 응집에 의해 조기에 광학적으로 검출 가능하게 되는 조건과, 제조 시의 핸들링의 용이함, 계 내에의 분산의 용이함 등으로부터, 0.05 ㎛에서 50 ㎛의 범위인 것이 이용된다. 비드 (103)의 표면에 코아굴로겐을 결합시키기 위해서는, 정전적, 친수적 또는 소수적으로 코아굴로겐을 흡착시키는 방법과, 화학적으로 결합시키는 방법이 생각된다.

1: 비탁 계측 장치
2: 유리제 용기
3: 교반자
4: 교반기
4a: 모터
4b: 자석
5: 보온기
5a: 입사 구멍
5b: 출사 구멍
6: 광원
7: 개구
8: 개구
9: 수광 소자
10: 연산 장치
100: 코아굴로겐
101: 코아굴린
102: 응집 입자
103: 비드

Claims

소정의 효소군과 코아굴로겐을 포함한 투구게의 혈구 추출물인 LAL과, 생물 유래의 소정의 생리 활성 물질을 반응시키고, 상기 생리 활성 물질에 의해서 상기 효소군이 활성화되어 생기는 효소 캐스케이드에 의해서 코아굴로겐이 코아굴린으로 가수분해되는 것을 이용하여, 상기 생리 활성 물질을 검출 또는 상기 생리 활성 물질의 농도를 측정할 때에 사용되는 코아굴로겐 원료의 제조 방법으로서,
LAL을 소정 온도에서 소정 시간에 걸쳐 가열 처리함으로써 상기 LAL 중의 상기 효소군의 적어도 일부를 실활시킴과 동시에 코아굴로겐의 활성은 유지시키는 것을 특징으로 하는 코아굴로겐 원료의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 LAL은 용액으로서 공급되고,
상기 소정 온도는 60℃ 이상인 것을 특징으로 하는 코아굴로겐 원료의 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 LAL은 용액으로서 공급되고,
상기 소정 온도는 80℃ 이하인 것을 특징으로 하는 코아굴로겐 원료의 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LAL은 용액으로서 공급되고,
상기 소정 시간은 10분 이상 8시간 이하인 것을 특징으로 하는 코아굴로겐 원료의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 LAL은 동결 건조체로서 공급되고,
상기 소정 온도는 100℃ 이상 250℃ 이하인 것을 특징으로 하는 코아굴로겐 원료의 제조 방법.
제1항 또는 제5항에 있어서, 상기 LAL은 동결 건조체로서 공급되고,
상기 소정 시간은 300분 이상인 것을 특징으로 하는 코아굴로겐 원료의 제조 방법.
소정의 효소군과 코아굴로겐을 포함한 투구게의 혈구 추출물인 LAL과, 생물 유래의 소정의 생리 활성 물질을 반응시키고, 상기 생리 활성 물질에 의해서 상기 효소군이 활성화되어 생기는 효소 캐스케이드에 의해서 코아굴로겐이 코아굴린으로 가수분해되는 것을 이용하여, 상기 생리 활성 물질을 검출 또는 상기 생리 활성 물질의 농도를 측정할 때에 사용되는 코아굴로겐 원료로서,
LAL을 소정 온도에서 소정 시간에 걸쳐 가열 처리함으로써 상기 LAL 중의 상기 효소군의 적어도 일부를 실활시킨 것을 특징으로 하는 코아굴로겐 원료.
제7항에 있어서, 상기 LAL은 용액으로서 공급되고,
상기 소정 온도는 60℃ 이상인 것을 특징으로 하는 코아굴로겐 원료.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 LAL은 용액으로서 공급되고,
상기 소정 온도는 80℃ 이하인 것을 특징으로 하는 코아굴로겐 원료.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LAL은 용액으로서 공급되고,
상기 소정 시간은 10분 이상 8시간 이하인 것을 특징으로 하는 코아굴로겐 원료.
제7항에 있어서, 상기 LAL은 동결 건조체로서 공급되고,
상기 소정 온도는 100℃ 이상 250℃ 이하인 것을 특징으로 하는 코아굴로겐 원료.
제7항 또는 제11항에 있어서, 상기 LAL은 동결 건조체로서 공급되고,
상기 소정 시간은 300분 이상인 것을 특징으로 하는 코아굴로겐 원료.
제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 코아굴로겐 원료와, 가열 처리되어 있지 않은 LAL을 혼합함으로써 상기 가열 처리되어 있지 않은 LAL에서의 코아굴로겐 농도를 높인 것을 특징으로 하는, 상기 생리 활성 물질의 검출 또는 상기 생리 활성 물질의 농도 측정에 사용되는 LAL 시약.
제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 코아굴로겐 원료에서의 코아굴로겐을, 상기 코아굴로겐보다 대직경의 다수의 미립자의 표면에 결합 또는 흡착시켜 제조된 것을 특징으로 하는 엔도톡신 측정용의 코아굴로겐 결합 마이크로비드.
제13항에 기재된 LAL 시약과, 상기 소정의 생리 활성 물질을 포함하는 시료를 혼화시킴으로써,
상기 소정의 생리 활성 물질에 의해서 상기 LAL 시약 중의 효소군이 활성화되어 생기는 효소 캐스케이드에 의해서, 농도가 높아진 상기 코아굴로겐이 코아굴린으로 가수분해되는 것을 이용하여, 상기 소정의 생리 활성 물질을 검출 또는 상기 소정의 생리 활성 물질의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 생물 유래의 생리 활성 물질의 측정 방법.
제14항에 기재된 코아굴로겐 결합 마이크로비드와, 가열 처리되어 있지 않은 LAL과, 상기 소정의 생리 활성 물질을 포함하는 시료를 혼화시킴으로써,
상기 소정의 생리 활성 물질에 의해서 상기 가열 처리되어 있지 않은 LAL에서의 효소군이 활성화되어 생기는 효소 캐스케이드에 의해서 상기 미립자의 표면에 결합 또는 흡착한 코아굴로겐이 코아굴린으로 가수분해되고, 상기 미립자끼리가 가교되는 것을 이용하여, 상기 소정의 생리 활성 물질을 검출 또는 상기 소정의 생리 활성 물질의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 생물 유래의 생리 활성 물질의 측정 방법.
제14항에 기재된 코아굴로겐 결합 마이크로비드와, 가열 처리되어 있지 않은 LAL과, 상기 소정의 생리 활성 물질을 포함하는 시료와의 혼화액을 광이 입사 가능하도록 유지하며, 상기 혼화액에서의 반응을 진행시키는 혼화액 유지 수단과,
상기 혼화액 유지 수단 중의 상기 혼화액을 교반하는 교반 수단과,
상기 혼화액 유지 수단 중의 혼화액에 광을 입사하는 광 입사 수단과,
상기 입사광의 상기 혼화액에서의 투과광을 수광하고 전기 신호로 변환하는 수광 수단과,
상기 수광 수단에서 변환된 전기 신호로부터 취득되는 상기 혼화액의 투과율로부터 상기 시료 중의 상기 생리 활성 물질의 농도를 도출하는 도출 수단
을 구비하는 것을 특징으로 하는 교반 비탁 측정 장치.