CN103764028A - 凝固控制剂和包含凝固控制剂的装置 - Google Patents

Abstract

用于控制血液样品凝血液的装置、试剂盒和方法。凝固控制剂是下列之至少一种：柠檬酸盐，鱼精蛋白盐，其同源物和衍生物，苄脒或对-氨基苄脒。也涵盖添加剂诸如水溶性聚合物和糖。所述装置和试剂盒包含容器（10），其含有有效量的凝血酶和凝固控制剂。所述方法组合凝血酶和凝固控制剂以在血液样品中稳定化凝血酶或加速其活性。

Description

凝固控制剂和包含凝固控制剂的装置

【相关申请的交叉引用】

本申请要求2011年7月5日提交的美国临时专利申请No.61/504,496的提交日期的优先权，其公开内容通过引用在本文合并。

【背景技术】

血清是在使血液凝块之后留下的全血液的液体部分。血清之外是在凝集过程期间消耗或截留的全血组分，即红细胞、白细胞、血小板和凝血因子。由此，血清包括在凝集期间不使用的全部蛋白，也包括糖、脂肪、酶、抗体、抗原、激素、带电粒子（即,电解质）和外源物质（例如,药物和微生物）。因此，血清是实施用来诊断及监测肌肉和器官功能，代谢平衡和基本生理学功能的临床测试的优先测试底物。由于已通过凝集过程移出不需要的物质的干扰，血清也优选用于实施其他分析测试诸如酶、电解质、蛋白和葡萄糖测定。

血清通过凝结的血液的离心来获得。在过去，自全血产生血清曾是被动过程，其中将新鲜收集的血液加入玻璃试管，并允许其凝块。或者，其他血清管可含有氧化硅或鞣花酸来刺激凝血级联。血液，一旦自身体移出，具有天然的凝块趋势，且其暴露于表面诸如玻璃以更有效方式促进凝结。与玻璃表面接触导致凝血因子活化，所述凝血因子以通常被称为凝血级联的机理相互作用。在此过程中，无活性凝血因子化学上转变为活性酶，其随后再转变另一无活性前体。凝血级联的最终结果是可溶性血浆蛋白纤维蛋白原转变为不溶性蛋白，纤维蛋白，其中纤维蛋白凝块截留白细胞、红细胞和血小板而形成固体胶质团。此过程中不消耗的物质，诸如上述那些，保持无胶质团及见于液体基质，即血清。

上述被动凝结过程造成几个问题。自正常健康个体的血液可在玻璃试管中经30分钟或更久凝块，而自可具有凝血蛋白缺乏的患病个体或自接收抗凝治疗（即,口服抗凝剂或肝素）的患者的血液可需要大量时间以凝块（即,2-8小时）。因而，有与血样本的获得和分析测试的性能关联的延迟，由此影响临床医师快速提供最佳患者护理的能力。此外，自缺乏凝血蛋白的个体或接收抗凝治疗的患者的血液可无法形成完全和充足的纤维蛋白团块。例如，肝素化的血液样本的不完全的凝结导致用于实施化学测试的差质量的血清底物。此外，自肝素抗凝结的血液的血清，起初无法凝结，可一旦放进分析装置中而开始凝块，由此阻塞系统及导致仪器关闭。

为了改善凝块形成过程的可预测性和均一性，技师向血液样本常规添加凝块促进剂凝血酶和/或具有“凝血酶-样”活性的紧密相关的酶（例如巴曲酶）。凝血酶活跃地将纤维蛋白原转变为纤维蛋白，由此相比更慢玻璃-活化的凝结过程更有效形成凝块。在血收集管中使用凝血酶和/或另一酶的一个缺点是这些蛋白作为基于氧化硅的接触通路活化物不那么稳定。例如，暴露于水份及提升的温度可灭活凝血酶。但是，基于氧化硅的方法常常无法给出完全血凝结，产生可干扰血液样品诸如自全血获得的血清的测试的部分凝结的物质。

【发明概述】

在本文公开的是无菌及真空的用于收集血清的容器，其包含第一端和第二端和至少一个限定接收血液的贮器部分的内部壁，其中贮器包含凝血酶和至少一种凝固控制剂及可由用于向贮器供给血液的针穿刺的闭合件。

在本文所述的一些实施方式中，凝固控制剂是具有小于约500g/mol的分子量的多羧酸。在一些实施方式中，多羧酸是柠檬酸盐或异柠檬酸盐（“柠檬酸盐”）。在进一步实施方式中，多羧酸凝固控制剂浓度为约0.5mM～约100mM的浓缩制剂。在仍进一步实施方式中，多羧酸凝固控制剂浓度为约1mM～约50mM的浓缩制剂。

在其他实施方式中，凝固控制剂是鱼精蛋白盐或其同源物或衍生物。在进一步实施方式中，鱼精蛋白凝固控制剂的浓度为约0.05mg/mL～约5mg/mL的血液样品。在仍进一步实施方式中，鱼精蛋白凝固控制剂的浓度为约0.25mg/mL～约0.5mg/mL的血液样品。

在其他实施方式中，凝固控制剂是凝血酶的弱竞争性抑制物。弱抑制是通过使样品经历不有利于抑制物结合的条件而以抑制凝血酶活性的方式可反转的。在一些实施方式中，凝血酶的弱竞争性抑制物是具有小于约500g/mol的分子量的小分子。在一些实施方式中，凝血酶的弱竞争性抑制物具有大于约0.1μM的抑制常数。在一些实施方式中，凝血酶的弱竞争性抑制物是式(I)的化合物：

其中R选自：-NR¹R²；-NO₂；取代的或未经取代的、直链或支链的具有1～6个碳原子的烷基；卤素；-CO(O)R¹；-CO-NR¹R²；-OH；或-OR₁；

R¹和R²可相同或不同，且可选自：氢，卤素，取代的或未经取代的、直链或支链的C₁～C₁₀烷基及-(CH₂)_x-芳基；以及

x是1～10的整数。

在进一步例示实施方式中，凝固控制剂是苄脒。在另一例示实施方式中，凝固控制剂是对-氨基苄脒。在进一步实施方式中，式（I）的凝固控制剂浓度为约0.5mM～约20mM的浓缩制剂。在仍进一步实施方式中，式（I）的凝固控制剂浓度为约1mM～约10mM的浓缩制剂。

在另一实施方式中，容器还包括收集容器，其进一步包含选自下列的添加剂：水溶性聚合物和糖。在另一实施方式中，水溶性聚合物选自：聚乙烯吡咯烷酮、多糖和聚乙二醇。在进一步实施方式中，所述糖选自：葡聚糖、海藻糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和山梨糖醇。

在另一实施方式中，容器还包含分离元件。在进一步实施方式中，分离元件包含机械分离元件。在另一实施方式中，分离元件包含凝胶组合物。在进一步实施方式中，凝胶组合物包含触变的凝胶。在仍进一步实施方式中，凝胶组合物含于胶囊。

在另一实施方式中，容器还包含收集的血。

本文还公开了收集血液的方法，包括提供以对于稳定化凝血酶而言足够的浓度包含凝血酶和凝固控制剂的容器和/或加速其活性，及向容器添加血液样品。

本文还公开了收集血液的方法，包括提供以减少血清样品中纤维蛋白的浓度而言足够的浓度包含凝血酶和凝固控制剂的容器，及向容器添加血液样品。

本文还公开了收集血液的方法，包括提供以对于稳定化凝血酶而言足够的浓度包含凝血酶和凝固控制剂的容器，及向容器添加血液样品。

在上述方法的一些实施方式中，凝固控制剂是具有小于约500g/mol的分子量的多羧酸。在一些实施方式中，在上述方法中，多羧酸是柠檬酸盐。在一些实施方式中，凝固控制剂浓度为约0.5mM～约100mM的浓缩制剂。

在上述方法中，凝固控制剂是之前描述且以之前描述的浓度存在的鱼精蛋白盐或其同源物或衍生物。在一些实施方式中，凝固控制剂浓度为约0.05mg/mL～约5mg/mL的血液样品。

在一些实施方式中，凝固控制剂是凝血酶的弱竞争性抑制物。在一些实施方式中，凝血酶的弱竞争性抑制物是具有小于约500g/mol的分子量的小分子。在一些实施方式中，凝血酶的弱竞争性抑制物具有大于约0.1μM的抑制常数。在一些实施方式中，凝血酶的弱竞争性抑制物是之前描述的式（I）的化合物。

在以上描述的方法的一些实施方式中，凝固控制剂是以之前描述的浓度存在的对-氨基苄脒。在一些实施方式中，式（I）的凝固控制剂浓度为约0.5mM～约20mM的浓缩制剂。

在上述方法的一些实施方式中，收集容器还包含选自之前描述的水溶性聚合物和糖的添加剂。

本文还公开了收集血液的方法，包括提供以对于加速凝血酶活性而言足够的浓度包含凝血酶和凝固控制剂的容器，及向容器添加血液样品。在上述方法的一些实施方式中，凝固控制剂是以之前描述的浓度的上述鱼精蛋白盐或其同源物或衍生物。

在上述方法的一些实施方式中，方法还包括在容器中提供具有小于约500g/mol的分子量的多羧酸或凝血酶的弱竞争性抑制物中的至少一种。在上述方法的一些实施方式中，方法还包括在容器中提供具有小于约500g/mol的分子量的多羧酸和凝血酶的弱竞争性抑制物二者。在收集方法的一些实施方式中，多羧酸是之前描述的浓度的之前定义的柠檬酸盐。在一些实施方式中，凝血酶的弱竞争性抑制物是具有小于约500g/mol的分子量的小分子。在一些实施方式中，凝血酶的弱竞争性抑制物具有大于约0.1μM的抑制常数。在一些实施方式中，凝血酶的弱竞争性抑制物是之前描述的式（I）的化合物。在收集方法的一些实施方式中，凝固控制剂是以上描述的浓度的以上描述的对-氨基苄脒。

在一些实施方式中，用于控制方法的收集容器还包括选自下列的添加剂：水溶性聚合物和糖。

本文还公开了收集血液的方法，包括提供以对于减少血液样品中纤维蛋白的浓度而言足够的浓度包含凝血酶和凝固控制剂的容器，及向容器添加血液样品。

在用于收集的方法的一些实施方式中，凝固控制剂是之前描述的浓度的之前描述的具有小于约500g/mol的分子量的多羧酸。

在用于收集的方法的一些实施方式中，凝固控制剂是鱼精蛋白盐或其同源物或衍生物或之前描述的浓度的之前描述。

在用于收集的方法的一些实施方式中，凝固控制剂是以上描述的式（I）的化合物。

在用于收集的方法的一些实施方式中，凝固控制剂是以上描述的浓度的之前描述的对-氨基苄脒。在用于收集的方法的一些实施方式中，收集容器还包含选自下列的添加剂：水溶性聚合物和糖。

【附图说明】

图1描绘适合于在当前发明中使用的收集容器。

图2是显示鱼精蛋白在缓和纤维蛋白团块形成中的效应的图表。

图3是显示鱼精蛋白浓度和凝结时间之间的关系的图表。

图4是显示鱼精蛋白对凝血酶活性的效应的图表。

图5是显示鱼精蛋白对凝血酶活性的效应的图表。

图6是显示p-氨基苄脒对凝血酶活性的效应的图表。

图7是显示p-氨基苄脒对凝血酶活性的效应的图表。

【发明详述】

在本文描述的是用于增强、促进、稳定化、加速或控制凝固酶的作用（下文被称为“控制凝固”）的方法，装置和试剂盒。通过增强、促进或控制凝固酶的作用，这是指血会相比血单独或含有凝血酶或凝血酶-样物质（下文“凝血酶”）添加的血液的样品更完全地和/或更快速凝结或凝块。更具体而言，描述用于稳定化、加速或另外控制凝固酶将纤维蛋白原转变为纤维蛋白和/或另外减少血液样品（例如血清）中不溶性纤维蛋白和/或纤维蛋白原的量的能力的方法和装置。

根据本文所述的一实施方式，是具有含（1）一定量的凝血酶（或凝血酶-样物质）及（2）一定量的至少一种凝固控制剂的容器的装置。凝血酶和凝固控制剂用于与血液样品混合，优选在其收集后立即混合。但是，可将凝血酶或凝固控制剂之任何在样品收集之后加入样品。

如本文所用，术语“血液样品”是指任何含有至少一些能凝结的血组分的生物学样品。在一些实施方式中，血液样品是全血。在其他实施方式中，血液样品（例如血清）源于全血液样品，其中血液的一种或更多组分已通过离心移出。在仍其他实施方式中，血液样品是血浆浓缩物。

容器可包括任何样品收集装置，包括管诸如试管和离心管；闭合的系统血收集装置，诸如收集袋；注射器，尤其预填充的注射器；导管；微-孔和其他多-孔板；阵列；管道；实验室容器，诸如细颈瓶，旋转瓶，滚瓶，管形瓶，显微镜载玻片，显微镜载玻片组件，盖玻片，膜和多孔底物和组件；移液管和移液管端，等；组织和其他生物学样品收集容器，包括刺血针，毛细管和可自贝克顿·迪金森得到的

品牌产品；可自贝克顿·迪金森得到的牌静脉血收集管，包括那些预包装凝血酶的管；及任何适合于保持生物学样品的其他容器，以及涉及转移样品的容器和元件。可将凝固控制剂导入这些容器之任何，只要它们符合在本文描述的标准。

容器可包含塑料或玻璃（即由塑料或玻璃生产），只要是其符合本发明的标准。在一些实施方式中，容器包含聚丙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、纤维素塑料、聚四氟乙烯，且也可使用其他氟化的聚合物。在其他实施方式中，容器包含聚烯烃，聚酰胺，聚酯，硅酮，聚氨基甲酸酯，环氧树脂，丙烯酸脂类，聚丙烯酸酯，聚砜，聚甲基丙烯酸酯，PEEK，聚酰亚胺和氟聚合物诸如PTFE特氟隆

FEP特氟隆

聚(亚乙烯基氟)，PVDF和过氟烷氧基树脂。包括氧化硅玻璃的玻璃产品也用于生产容器。一种例示玻璃产品是可从Corning Glass，Corning，N.Y得到的

陶瓷容器可根据本发明的实施方式使用。纤维素产品诸如纸及强化的纸容器也可作为容器材料。

根据本发明的一实施方式，将容器用凝血酶或凝固控制剂中的至少一种预处理，并以即用形式包装。在其他实施方式中，容器用凝血酶和凝固控制剂二者预处理。一般而言，包装的容器是无菌的，也包装进无菌包装材料中。包装集（或“试剂盒”）可含有用于使用，存储，航运和/或操作的使用说明。

作为本发明的部分使用的凝血酶可来自任何来源，包括天然的和合成来源的那些。在一些实施方式中，使用牛凝血酶。在其他实施方式中，使用来自其他物种的凝血酶。在仍其他实施方式中，使用重组凝血酶。重组凝血酶可经修饰，使得其相比未修饰的凝血酶改善了稳定性或抵抗由其他血组分灭活。在优选的实施方式中，凝血酶是α-凝血酶。α-凝血酶为本领域技术人员所熟知及在本文详细描述。容器中使用的凝血酶浓度为约0.1～约100单元（u）/ml血量（u/ml）。在一些实施方式中，容器中使用的凝血酶浓度为约1～约20U/ml血量。

容器也包含至少一种凝固控制剂。不被任何特定理论束缚，认为，凝固控制剂能达到以下情况中的至少一种：（1）至少部分稳定化凝血酶；（2）至少部分减少血液样品（例如血清）中不溶性纤维蛋白和/或纤维蛋白原的量；或（3）至少部分加速凝血酶的作用。

在本文所述的一实施方式中，凝固控制剂是鱼精蛋白，或其盐或水合物。可使用任何鱼精蛋白或其衍生物，只要其符合上述要求保护的发明的标准。在一些实施方式中，鱼精蛋白源于鲑鱼精子及具有SEQ ID NO:1的序列（SEQ ID NO:1：PRRRRSSSR PVRRRRRPRVSRRRRRRGGR RRR）。自其他相关的来源的鱼精蛋白序列可另外地被认为它们具有非常类似序列和也可具有期望性质。不被任何特定理论束缚，认为，鱼精蛋白可稳定化凝血酶或加速其活性。

在本文所述的一实施方式中，凝固控制剂是凝血酶的有弱活性的-位点竞争性（由此可反转的）抑制物。认为，该抑制物的添加在血收集装置和含凝血酶的制剂的包装的组合的货架期期间稳定化凝血酶。不被任何特定理论束缚，认为，有弱活性的-位点竞争性抑制物通过减缓其自身-毁坏性自溶活性稳定化凝血酶。当用血液稀释时，认为，弱抑制物自凝血酶解离，由此允许其在其参与凝块形成之前变得在样品中更佳分散。

在一些实施方式中，凝血酶的有弱活性的-位点竞争性抑制物是具有小于约500g/mol的分子量的小分子。在一些实施方式中，凝血酶的弱竞争性抑制物具有大于约0.1μM的抑制常数（Ki）。在其他实施方式中，凝血酶的弱竞争性抑制物具有为约0.1μM～约1000μM之间的抑制常数。在一些实施方式中，凝血酶的弱竞争性抑制物包含式（I）的化合物。

在一些实施方式中，有弱活性的-位点竞争性抑制物是诸如由上述式（I）表示的取代的或未经取代的苄脒。

在一实施方式中，式（I）的化合物是苄脒。在仍其他实施方式中，凝固控制剂选自：对-氨基苄脒、间-氨基苄脒及邻-氨基苄脒。

在本文所述的另一实施方式中，凝固控制剂是低分子量多羧酸化合物（或其盐），具有小于约500g/mol的分子量。例如，适合的多羧酸化合物可具有式C(O)OH-R¹-R²(C(O)OH)-R³-C(O)OH，其中R¹，R²和R³可相同或不同，且可为取代的或未经取代的脂肪族或芳族基团，且其中R¹、R²或R³中任一个可含有任意数的另外的羧酸基。在一些实施方式中，多羧酸化合物是柠檬酸盐钠。在其他实施方式中，多羧酸化合物是异柠檬酸盐。

不被任何特定理论束缚，认为，柠檬酸盐通过减小其切割及转变为欠有活性的形式（例如β-凝血酶或γ-凝血酶）的速度来稳定化α-凝血酶。而且，不被任何特定理论束缚，认为，相比与TRIS、磷酸盐、组氨酸或HEPES缓冲剂之一组合的α-凝血酶，柠檬酸盐能相对更佳地稳定化α-凝血酶。

在一实施方式中，将柠檬酸盐凝固控制剂与另外的选自下列的组分组合：水溶性聚合物和糖。例示水溶性聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮，多糖和聚乙二醇。例示糖包括葡聚糖、环糊精、海藻糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和山梨糖醇。实际上，另外的组分可选自为药学制剂领域技术人员所熟知的常见的药学赋形剂。

不被任何特定理论束缚，认为，水溶性聚合物可作为结合剂作用，以辅助制剂向血收集装置表面的喷雾应用。

在其他实施方式中，将柠檬酸盐凝固控制剂与表面活性剂组合。适合的表面活性剂的例包括属于被称为“硅氧烷烷氧基化物”的化合物类的那些。

在一些实施方式中，含凝血酶的柠檬酸盐溶液的pH范围为约5.5～约7.5之间。

在一些实施方式中，柠檬酸盐凝固控制剂含有其他盐、缓冲剂或蛋白质。在其他实施方式中，柠檬酸盐溶液基本上无其他盐，缓冲剂或蛋白质。在仍其他实施方式中，柠檬酸盐溶液无白蛋白、氯化钠或TRIS-HCl中的至少一种。

本领域技术人员能基于本文提供的指导选择适合于本文所述的用途的适当的浓度的凝固控制剂。当然，依赖于样品管中提供的凝血酶量，使用的凝血酶类型，向容器应用制剂的方法，血液样品体积和收集的血液样品类型而可需要不同浓度的凝固控制剂。变化的浓度的不同凝固控制剂的混合物也可用于提供期望的结果。例如，可将凝血酶与鱼精蛋白和式（I）的化合物二者组合以提供期望效果。类似地，可将凝血酶与鱼精蛋白和多羧酸二者组合。像这样，可依赖于样品类型及旨在的用途定制含有凝血酶和凝固控制剂的装置。

在将鱼精蛋白加入含有凝血酶的样品的一些实施方式中，当分散在血液样品中时，鱼精蛋白以约0.25mg/mL～约5mg/mL的浓度存在。在将鱼精蛋白加入含有凝血酶的样品的其他实施方式中，当分散在血液样品中时，鱼精蛋白以约0.25mg/mL～约0.5mg/mL的浓度存在。

在一些实施方式中，凝血酶的弱竞争性抑制物以上述抑制恒定值的约1～约200倍的浓度存在。在将式（I）的化合物加入含有凝血酶的制剂的一些实施方式中，式（I）的化合物在待应用的液体凝血酶制剂（例如由喷雾剂）中以约0.5mM～约20mM的浓度存在，并在血收集装置表面干燥。在将式（I）的化合物加入含有凝血酶的制剂的其他实施方式中，式（I）的化合物在待应用的液体凝血酶制剂（例如由喷雾剂）中以约1mM～约10mM浓度存在，并在血收集装置表面干燥。

在将柠檬酸盐单独或组合另外的组分加入含有凝血酶的制剂的一些实施方式中，柠檬酸盐在待应用的液体凝血酶制剂（例如由喷雾剂）中以约0.5mM～约100mM的浓度存在，并在血收集装置表面干燥。在将柠檬酸盐单独或组合另外的组分加入含有凝血酶的制剂的其他实施方式中，柠檬酸盐在待应用的液体凝血酶制剂（例如由喷雾剂）中以约1mM～约50mM的浓度存在，并在血收集装置表面干燥。

任何凝固控制剂可单独或组合缓冲溶液使用。缓冲溶液为本领域普通技术人员所熟知，且可容易适于在本发明中使用。

凝固控制剂、凝血酶和任何添加剂或缓冲剂可位于容器的任何表面。凝血酶和凝固控制剂可位于相同的表面或不同表面，可相互混合，或可彼此分离（为方便起见，任何关于凝血酶或凝固控制剂的使用的参考文献也一并推定为将它们部分包括在本文中）。凝血酶和/或凝固控制剂也可位于用于闭合该装置的塞子和密封件上，或位于放置在该装置之内的机械或其他插入物上。凝血酶和/或凝固控制剂位于沿着容器的至少一个内部壁的任何处或贮器部分之内的任何处。凝血酶或凝固控制剂的位置通过几个变量确定，包括应用模式，使用的特定凝固控制剂，容器的内部体积和内部压力，及放进容器中的生物学样品体积。

可将凝血酶，凝固控制剂，及添加剂或缓冲剂由本领域知晓的任何方法应用于容器。凝血酶和凝固控制剂可由相同的手段或由不同手段应用。同样，它们可一起或独立地应用。例如，凝血酶和/或凝固控制剂可喷射到表面（作为液体,粉剂或凝胶）、喷雾干燥、松散地分注或冷冻干燥到容器内部壁表面。在一实施方式中，凝血酶和/或凝固控制剂在液体溶液中，及喷射或另外放进容器中。随后，溶液可由为本领域所知的方法诸如，例如，冷冻干燥来冻干。例如，通过冷冻溶液，然后在冷冻之后缓慢加温，同时应用真空，冷冻干燥的粉末留在收集管中。也可将添加剂诸如赋形剂，例如，PVP或海藻糖在冷冻干燥之前加入凝血酶和/或凝固控制剂，从而得到的稳定化剂在容器中颗粒化。或者，凝血酶和/或凝固控制剂，诸如当为凝胶或液体形式时，例如，可定位在容器的贮器部分内。一般而言，为了在容器中布置期望的量的凝血酶和/或凝固控制剂，液剂化固体形式的凝血酶和/或凝固控制剂，然后将适当的量的液体分注进容器中。液体可经喷雾干燥，布置进容器底部或随后冷冻干燥。在另一方面，凝血酶和/或凝固控制剂形成到液体或固体气雾剂中，并喷射到容器内部的一个或更多表面。

在一些实施方式中，为了在收集点立即凝结血液样品，容器用于直接自患者抽全血液样品，由此用作血清收集管。装置可为用于收集血液的真空的系统。或者，装置可为用于收集血液的部分-真空的或非-真空的系统。真空的系统的适合的例是闭合的管。手动注射抽吸管是部分-真空的和非-真空的系统二者的适合的例。非-真空的系统也可包括自动抽吸系统。

图1显示典型血容器10，其包括限定内部室14的容器12。在例证的实施方式中，容器12是具有侧壁16，关闭的底端18及打开顶端20的中空管。任选地，分离部件13提供在容器室14之内。分离部件13用于辅助，例如，通过离心分离样品组分。容器12尺寸定为收集适合的体积的生物学流体，优选血。当需要无菌产物时，优选用于将开放端20覆盖到闭合容器12的闭合件22。对于常规管，螺旋帽通常是足够的。对于真空的收集管，通常采用紧密-安装的弹性插塞，以在需要的存储时期期间含有真空。闭合件22形成能有效关闭容器12及将生物学样品保留在室14中的密封件。闭合件22可为各种形式之一，包括但不限于橡胶闭合件，

闭合件，金属密封件，金属条带的橡胶密封件和不同聚合物和设计的密封件。保护性屏蔽24可叠压闭合件22。容器12也根据本发明含有凝血酶和/或凝固控制剂。容器可含有凝血酶和/或凝固控制剂之一种或二者。当然，可在样品收集之前或在样品收集之后添加其他凝血酶和/或凝固控制剂。

容器12可由玻璃、塑料或本文所述的其他适合的材料制造。塑料材料可为氧不通透材料或可含有氧不通透层或半透层。或者，容器12可由水和空气可渗透性塑料材料制造。

室14的压力选择为将预定的体积的生物学样品抽进室14。闭合件22使得其可由针26或其他插管穿孔，以将生物学样品导入本领域知晓的容器12。优选地，闭合件22是可重封的。用于闭合件22的适合的材料包括，例如，硅酮橡胶，天然的橡胶，卤代丁基橡胶，苯乙烯丁二烯橡胶，乙烯-丙烯共聚物和聚氯丁二烯。

容器12的适合的例包括单-壁管和多-层管。适合的容器12的更特定例公开于Cohen的美国专利No.5,860,937，其通过引用以其整体在此合并。

例如，制造本发明的装置的一个有用的过程涉及获得容器；向容器添加凝血酶和/或凝固控制剂；干燥或冷冻干燥凝血酶和/或凝固控制剂；使容器真空；及将容器灭菌。凝血酶和/或凝固控制剂可以溶液形式分注进容器中。在向收集容器添加凝血酶和/或凝固控制剂之前或之后，可将分离部件加入容器，如果需要。适合的冷冻干燥/真空化过程的一例如下：将布置有凝血酶和/或控制剂的容器在约-40℃的温度，约760mm的压力冷冻约6～8小时；将容器随温度自-40℃渐变到约25℃，在约0.05mm的压力，干燥约8～10小时；及容器然后在约25℃温度，约120mm压力下真空化约0.1小时。在一些实施方式中，灭菌技术采用用钴60辐射进行辐射。

在一些实施方式中，使用具有用于分离血组分的分离部件13（例如,机械分离元件,凝胶或其他分离部件，包括过滤纸等）的样品收集管。在该方面，管内部和/或分离部件外部可用凝血酶和/或凝固控制剂处理。在该情况中，凝血酶和/或凝固控制剂可在分离介质的外部表面喷雾干燥和/或冷冻干燥。

容器12也可为用于血清收集或制备的容器。该容器包含，除了凝血酶和/或凝固控制剂之外，用于自人或动物全血分离血清的元件。自全血分离血清的元件可为分离部件诸如凝胶制剂或机械培养基。在一些实施方式中，凝胶是触变的聚合物凝胶制剂。凝胶可为同聚物或共聚物和可包括聚酯，聚丙烯酸或基于硅酮的凝胶。

适合于在本文使用的其他可商购的血收集管包括以下血收集管，全部由贝克顿·迪金森公司，Franklin Lakes，N.J，以属于贝克顿·迪金森公司的全部注册和商标出售：

牌SST^TM管，货号包括但不限于367983、367977和367986；

牌血清管，货号包括但不限于367812及367815，

牌凝血酶管，货号包括但不限于367755和366525，

牌RST管，货号包括但不限于368771或368774和任何

牌血清和血清分隔管。如上所述，随本文所述的凝血剂涵盖任何适合的收集装置，真空的或非-真空的。当然，本领域技术人员可根据本发明修饰任何容器，以致使其适合于使用。

根据另一实施方式，试剂盒具有至少2个容器，包含本文所述的凝血酶和凝固控制剂。例如，试剂盒具有第一收集管，例如，内有分离元件的血浆分离管，及用于测试的第二管，其例如，用于将收集的血浆倾倒或另外分注到第一收集管。任选地，试剂盒可包括管-到-管转移装置，以防止倾倒或其他不安全的转移实践的需求，这种情况下，第二管会处于减压下，以吸入血浆。使用该试剂盒会将样品收集进第一管中，用或不用离心凝结血组分，将目标样品转移到第二测试管，及实施测试。第二测试管可具有各种尺寸，依赖于期望的测试。试剂盒也可包括包装和/或用于使用的使用说明。

在一实施方式中，用于收集及存储生物学样品的试剂盒具有第一无菌及真空的容器，其中第一容器内有凝血酶和至少一种凝固控制剂及可由针穿刺的闭合件；及第二容器，其中第二容器也具有凝固控制剂。

根据本文所述的另一实施方式是促进或增强血组分的凝固或凝结的方法，包括提供以对于（i）稳定化和/或加速凝血酶活性，或（ii）减少样品中可溶性纤维蛋白的量而言足够的浓度包含凝血酶和凝固控制剂的容器；及向容器添加全血液样品。

例示方法包括获得血液样品及将样品导入包含凝血酶和凝固控制剂的容器。在一些实施方式中，无需任何介入过程步骤自患者直接将血液样品抽进容器。尽管不限于特定操作理论，认为，直接自患者收集生物学样品，诸如当收集全血液样品，并将样品直接导入已包含（即用剂预处理的）凝血酶和凝固控制剂的容器时，基本上辅助稳定化或加速或另外控制凝固酶作用的或减少存在于样品中的可溶性纤维蛋白的量。描述的方法是用本文公开的任何容器，添加剂和另外的抗-促凝剂而有用的。

【实施例】

【实施例1：鱼精蛋白对血清样品中纤维蛋白团块的缓和效应】

将硫酸鱼精蛋白首先以约250mg/mL的浓度重悬浮于约0.5M盐酸。然后将此溶液用5N氢氧化钠滴定至约6的pH。立即实施此滴定至约pH6，由于鱼精蛋白延长的暴露于低pH，其被认为，会导致水解和活性的损失。也相信盐酸的更稀释的溶液可用于制备鱼精蛋白溶液。

然后将鱼精蛋白溶液以约1:1的比与约pH6.0的约40mM柠檬酸盐钠中约1250U/mL的凝血酶的溶液（含有约20mg/mL的硅氧烷烷氧基化物表面活性剂，及2mg/mL聚乙烯吡咯烷酮（PVP））混合。

将得到的试剂过滤，并以每发20μL喷射进13×100mm聚对苯二甲酸乙二酯（PET）管中。然后通过强制通热风将管干燥，并真空化及塞塞子。

管填充新鲜抽取的人血，并使在约1～约3.5分钟（随机化的）之间凝块，然后离心。得到的血清就0～3级的血清隔室中“纤维蛋白团块”的存在由视觉评定评分，3是最严重的。展示“纤维蛋白团块”的结果，如在图2中所示。纤维蛋白团块的缺失（“0”的等级评定）指示凝结反应是快速和完全的，在离心步骤之前全部纤维蛋白(ogen)沉淀。

如显示于图2，约0.5mg/mL浓度的鱼精蛋白显著地改善管的性能。随着鱼精蛋白的添加，用约5U/mL或约10U/mL凝血酶，8管中的仅1管具有可见纤维蛋白团块。这与无鱼精蛋白的管形成对比，其中用约5U/mL凝血酶而在8管中的7管具有可见团块，及用约10U/mL凝血酶而在8管中的6管具有可见团块。因此，认为，鱼精蛋白凝固控制剂添加到也含有凝血酶的血液样品容器缓和该团块（可归因于离心前凝血酶对纤维蛋白原的不完全的作用）形成的趋势。

【实施例2：凝血酶的鱼精蛋白加速凝结作用】

将约6的pH的约20mM的柠檬酸盐中凝血酶和鱼精蛋白的溶液与液剂化的商业冷冻干燥的人血浆以约1:1的比混合，并在StagoCompact凝血分析仪上测试。得到的凝结时间测量为对于给定凝血酶浓度的凝血酶功能和鱼精蛋白浓度。图3的图上列的浓度表示与血浆混合之前凝血酶/鱼精蛋白溶液。

结果显示随着增加鱼精蛋白浓度而降低凝结时间。像这样，认为，鱼精蛋白的添加增强凝血酶凝结活性。不被任何特定理论束缚，断定鱼精蛋白由（1）直接加速凝血酶的酶促作用；（2）由在血浆中的内源性抑制物防止凝血酶灭活；（3）加速纤维蛋白的沉淀或这些效应的一些组合加速凝结时间。

【实施例3：用凝血酶和鱼精蛋白的加速的稳定性结果】

在约6.0的pH的约20mM柠檬酸盐中制备凝血酶（约1250U/mL）、鱼精蛋白（约125mg/mL或约62.5mg/mL），及硅氧烷烷氧基化物表面活性剂的混合物。将约20μL的此混合物喷射进13×100mm PET管。通过强制通热风将管干燥，真空化及存储于冰箱。在研究起初，将管开盖及放进之前平衡至约50℃和约45%相对湿度的控制的环境室中。以各种时间间隔将管移出，并在Stago Compact凝血分析仪上评价凝血酶活性。结果示于图4。误差条指示用5个重复就凝血酶活性的95%置信区间。图4清楚地显示用鱼精蛋白相比不用鱼精蛋白，经时凝血酶活性更佳。

当对初始值标准化随后时间点的凝血酶活性时，得到的曲线可用于比较各制剂的相对稳定性（见图5）。从图中观察到，具有含有硫酸鱼精蛋白的制剂的血液样品相比与无鱼精蛋白的凝血酶制剂组合的血液样品更稳定。

【实施例4：用凝血酶和对-氨基苄脒的加速的稳定性结果】

评价凝固控制剂对-氨基苄脒，以确定是否其在加速的稳定性条件下改善了喷射的凝血酶的稳定性。不被任何特定理论束缚，认为，对-氨基苄脒在极其高湿度条件下稳定化喷雾干燥的凝血酶，其中凝血酶自溶降解可为快速的，甚至在室温下。

在约6.1的pH的约5mM柠檬酸盐或异柠檬酸盐中制备凝血酶。以约3mM的浓度添加对-氨基苄脒。将约16μL的此溶液喷射进13×100mm PET管。通过强制通热风将管干燥，并真空化。然后将密封的管放进之前平衡至约43℃和约75%相对湿度的控制的环境室中。以各种时间间隔将管移出，并在Stago Compact凝血分析仪上评价凝血酶活性。结果示于图6和图7。误差条指示用5个重复就凝血酶活性的95%置信区间。图中的数据指示，在使用之前，凝固控制剂对-氨基苄脒在包装的产品中经时保存凝血酶稳定性（相比柠檬酸盐单独）。

尽管在本文已参照特定实施方式描述本发明，需知，这些实施方式是仅是本发明的原理和应用的例证。因此明白，可对例证性实施方式进行多种修饰及可不离开由随附的权利要求定义的本发明的精神和范围而作出其他设置。

Claims (43)

1.用于收集血清的容器，其包含第一端和第二端以及至少一个限定接收血液的贮器部分的内部壁，其中所述贮器包含凝血酶和至少一种凝固控制剂，及闭合件。

2.权利要求1的容器，其中所述凝固控制剂是具有小于约500g/mol的分子量的多羧酸化合物。

3.权利要求2的容器，其中所述多羧酸化合物选自：柠檬酸盐或异柠檬酸盐。

4.权利要求2的容器，其中所述凝固控制剂浓度为约0.5mM～约100mM的浓缩制剂。

5.权利要求4的容器，其中所述凝固控制剂浓度为约1mM～约50mM的浓缩制剂。

6.权利要求1的容器，其中所述凝固控制剂是鱼精蛋白盐或其同源物或衍生物。

7.权利要求6的容器，其中所述凝固控制剂浓度为约0.05mg/mL～约5mg/mL的血液样品。

8.权利要求7的容器，其中所述凝固控制剂浓度为约0.25mg/mL～约0.5mg/mL的血液样品。

9.权利要求1的容器，其中所述凝固控制剂是凝血酶的具有大于0.1μM的抑制常数的弱竞争性抑制物。

10.权利要求9的容器，其中所述凝血酶的弱竞争性抑制物是式(I)的化合物：

其中R选自：-NR¹R²；-NO₂；取代的或未经取代的、直链或支链的具有1～6个碳原子的烷基；卤素；-CO(O)R¹；-CO-NR¹R²；-OH；或-OR¹；

R¹和R²可相同或不同，且可选自：氢、取代的或未经取代的、直链或支链的C₁～C₁₀烷基及-(CH₂)_x-芳基；以及

x是1～10的整数。

11.权利要求9的容器，其中所述凝固控制剂是苄脒。

12.权利要求11的容器，其中所述凝固控制剂是对-氨基苄脒。

13.权利要求10的容器，其中所述凝固控制剂浓度为约0.5mM～约20mM的浓缩制剂。

14.权利要求13的容器，其中所述凝固控制剂浓度为约1mM～约10mM的浓缩制剂。

15.权利要求1的容器，其中所述收集容器还包含选自下列的添加剂：水溶性聚合物和糖。

16.权利要求15的容器，其中所述水溶性聚合物选自：聚乙烯吡咯烷酮、多糖和聚乙二醇。

17.权利要求15的容器，其中所述糖选自：葡聚糖、环糊精、海藻糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和山梨糖醇。

18.权利要求1的容器，还包含分离元件。

19.权利要求18的容器，其中所述分离元件包含凝胶组合物。

20.权利要求19的容器，其中所述凝胶组合物包含触变的凝胶。

21.权利要求20的容器，其中所述凝胶组合物含于胶囊。

22.权利要求18的容器，其中所述分离元件包含机械分离元件。

23.权利要求1的容器，其中所述闭合件是可由针穿刺的且其中容器还包含通过针导入到容器中的血液。

24.收集血液的方法，包括提供以对于稳定化凝血酶而言足够的浓度包含凝血酶和凝固控制剂的容器，及向容器添加血液样品。

25.权利要求24的容器，其中所述凝固控制剂是具有小于约500g/mol的分子量的多羧酸化合物。

26.权利要求25的容器，其中所述多羧酸化合物选自：柠檬酸盐或异柠檬酸盐。

27.权利要求25的方法，其中所述凝固控制剂浓度为约0.5mM～约100mM的浓缩制剂。

28.权利要求24的方法，其中所述凝固控制剂是鱼精蛋白盐或其同源物或衍生物。

29.权利要求28的方法，其中所述凝固控制剂浓度为约0.05mg/mL～约5mg/mL的血液样品。

30.权利要求24的容器，其中所述凝固控制剂是凝血酶的具有大于0.1μM的抑制常数的弱竞争性抑制物。

31.权利要求30的方法，其中所述凝血酶的弱竞争性抑制物是式(I)的化合物：

其中R选自：-NR¹R²；-NO₂；取代的或未经取代的、直链或支链的具有1～6个碳原子的烷基；卤素；-CO(O)R¹；-CO-NR¹R²；-OH；或-OR¹；

R¹和R²可相同或不同，且可选自：氢、取代的或未经取代的、直链或支链的C₁～C₁₀烷基及-(CH₂)_x-芳基；以及

x是1～10的整数。

32.权利要求31的方法，其中所述凝固控制剂是苄脒。

33.权利要求31的方法，其中所述凝固控制剂浓度为约0.5mM～约20mM的浓缩制剂。

34.权利要求24的方法，其中所述容器还包含选自下列的添加剂：水溶性聚合物和糖。

35.收集血液的方法，其包括提供以对于加速凝血酶活性而言足够的浓度包含凝血酶及鱼精蛋白盐或其同源物或衍生物的容器，及向容器添加血液样品。

36.权利要求35的方法，其中所述鱼精蛋白盐或同源物或衍生物浓度为约0.05mg/mL～约5mg/mL的血液样品。

37.权利要求35的方法，其中所述方法还包括在所述容器中组合低分子量多羧酸或凝血酶的弱竞争性抑制物中的至少一种。

38.权利要求37的方法，其中所述方法包括在所述容器中组合低分子量多羧酸和凝血酶的弱竞争性抑制物二者。

39.权利要求37的方法，其中所述凝血酶的弱竞争性抑制物是式I的化合物：

其中R选自：-NR¹R²；-NO₂；取代的或未经取代的、直链或支链的具有1～6个碳原子的烷基；卤素；-CO(O)R¹；-CO-NR¹R²；-OH；或-OR¹；

R¹和R²可相同或不同，且可选自：氢、取代的或未经取代的、直链或支链的C₁～C₁₀烷基及-(CH₂)_x-芳基；以及

x是1～10的整数。

40.权利要求39的方法，其中所述凝固控制剂是苄脒。

41.权利要求37的方法，其中所述低分子量多羧酸浓度为约0.5mM～约100mM的浓缩制剂。

42.权利要求37的方法，其中所述凝血酶的弱竞争性抑制物以为约0.5mM～约20mM的浓缩制剂的浓度存在。

43.权利要求35的方法，其中所述方法还包括在所述容器中组合选自下列的添加剂：水溶性聚合物和糖。

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