CN114891729B - 叶酸在促进人多能性干细胞向心肌细胞分化中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开叶酸在促进人多能性干细胞向心肌细胞分化中的应用，并进一步公开了一种用于人多能性干细胞向心肌细胞分化的培养基组合。所述培养基组合包含第一诱导分化培养基、第二诱导分化培养基和/或第三诱导分化培养基。本发明还公开了一种促进人多能性干细胞向心肌细胞分化的方法。本发明首次发现叶酸可以促进人多能性干细胞向心肌细胞分化，通过添加叶酸可在7‑10天将人多能性干细胞分化为可以搏动的人心肌细胞，15天可获得cTnT表达阳性比例高于80％的心肌细胞，大幅提高诱导人多能性干细胞分化获得心肌细胞的效率，为开发用于心肌细胞分化的培养基策略提供了新的见解。

Description

叶酸在促进人多能性干细胞向心肌细胞分化中的应用
技术领域
本发明涉及干细胞生物学与再生医学技术领域。更具体地，涉及叶酸在促进人多能性干细胞向心肌细胞分化中的应用。
背景技术
心脏疾病是现代社会高发病率和高致死率的重大疾病之一，严重威胁着人类健康和社会稳定。成年人的心肌细胞几乎不具备分裂增殖的能力，在发生诸如心肌梗塞、心肌缺血等心脏组织坏死性疾病时，不能通过心肌细胞的再生来修复坏死组织，所以这类疾病引起的心脏功能衰退是不可逆转的，至今仍缺少行之有效的治疗方法。目前，临床上大多通过药物治疗，只能达到缓解的效果，增加心肌收缩力，提高心脏的泵血能力，但心脏负担的加重反而导致病情恶化。用正常的心肌细胞移植替换已坏死的细胞是从根本上治疗这类心脏疾病的方法之一，但因为人成体心肌细胞已失去自我增殖的能力，寻找人心肌细胞的来源成为目前再生医学治疗心脏疾病亟需解决的问题。
人多能性干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs，包含人胚胎干细胞hESCs和人诱导多能干细胞hiPSCs)是一种多潜能干细胞，能在体外自我更新，诱导分化为内胚层、中胚层和外胚层三个胚层来源的细胞，提供了大量潜在的基于细胞替代疗法的应用。其中，中胚层来源的细胞如心肌细胞等，广泛应用于心脏疾病、器官发育、药物研发、药效评测、药毒测试和细胞治疗的基础研究和临床前研究。使用干细胞分化来的心肌细胞进行替代治疗，为彻底治疗心脏疾病提供了可能。因此，建立高效的心肌细胞定向分化方法是获得心肌细胞的关键。
目前，利用人多能性干细胞诱导分化为心肌细胞的产品和方法较多，但是，分化产品来源不稳定、批间差异大、体外扩增和分化潜能差、价格高昂等缺点严重制约行业的发展。因此，急需研发化学成分明确、无动物源成分、批次稳定且分化效率高的人心肌细胞分化产品以促进人多能性干细胞向心肌细胞分化。
发明内容
本发明的一个目的在于提供叶酸在促进人多能性干细胞向心肌细胞分化中的应用。
本发明的第二个目的在于提供一种用于人多能性干细胞向心肌细胞分化的培养基组合，该培养基组合中各培养基具有成分明确、无异源成分、批次稳定、分化效率高等特点。
本发明的第三个目的在于提供一种促进人多能性干细胞向心肌细胞分化的方法，该方法可在7-10天将人多能性干细胞分化为可以搏动的人心肌细胞，15天可获得cTnT(心肌细胞标志物)表达阳性比例高于80％的心肌细胞。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
根据上述第一个目的，本发明提供叶酸在促进人多能性干细胞向心肌细胞分化中的应用。
可选的，所述叶酸的浓度为1μM～3μM。
根据上述第二个目的，本发明提供用于人多能性干细胞向心肌细胞分化的培养基组合，其包含第一诱导分化培养基、第二诱导分化培养基和/或第三诱导分化培养基；
所述第一诱导分化培养基包含基础培养基、叶酸、其他诱导分化组分和小分子化合物A；
所述第二诱导分化培养基包含基础培养基、叶酸、其他诱导分化组分和小分子化合物B；
所述第三诱导分化培养基包含基础培养基、叶酸和其他诱导分化组分。
可选的，所述叶酸的浓度为1μM～3μM。
可选的，所述基础培养基包括RPMI 1640培养基、IMDM培养基、DMEM/F12培养基中的一种或几种。
可选的，所述其他诱导分化组分包括转铁蛋白、L-抗坏血酸、亚硒酸钠、乙醇胺、L-肉毒碱、过氧化氢酶、还原型谷胱甘肽、胰岛素、超氧化物歧化酶、T3、半乳糖酶、腐胺、皮质酮、亚油酸、亚麻酸、孕酮、DL-α生育酚、DL-α-生育酚乙酸酯、油酸、哌酸和生物素中的一种或几种。优选的，所述其他诱导分化组分包括转铁蛋白、L-抗坏血酸、亚硒酸钠、乙醇胺、L-肉毒碱、腐胺、亚油酸和生物素。更优选的，所述转铁蛋白的浓度为10ng/mL～30ng/mL，所述L-抗坏血酸的浓度为100μg/mL～500μg/mL，所述亚硒酸钠的浓度为10ng/mL～20ng/mL，所述乙醇胺的浓度为1μg/mL～3μg/mL，所述L-肉毒碱的浓度为1μg/mL～5μg/mL，所述腐胺的浓度为10ng/mL～20ng/mL，所述亚油酸的浓度为0.5μg/mL～2μg/mL，所述生物素的浓度为0.1μg/ml～0.5μg/ml；最优选的，所述转铁蛋白的浓度为20ng/mL，所述L-抗坏血酸的浓度为300μg/mL，所述亚硒酸钠的浓度为15ng/mL，所述乙醇胺的浓度为2μg/mL，所述L-肉毒碱的浓度为3μg/mL，所述腐胺的浓度为15ng/mL，所述亚油酸的浓度为1μg/mL，所述生物素的浓度为0.3μg/ml。
可选的，所述小分子化合物A为GSK-3β抑制剂(Wnt信号通路激活剂)，为CHIR99021、LY2090314、SB216763、SB415286中的一种或几种。
可选的，所述小分子化合物B为Wnt信号通路抑制剂，为WntC59、IWP1、IWP2、IWP3、IWP4、IWR1、IWR2、IWR3、IWR4、IWR5中的一种或几种。
优选的，所述GSK-3β抑制剂(Wnt信号通路激活剂)为CHIR99021，其浓度为1μM～10μM，更优选的为5μM；所述Wnt信号通路抑制剂为IWP2，其浓度为1μM～10μM，更优选的为5μM。Wnt信号通路的适当调节足以实现有效的心肌分化，CHIR99021是一种有效的药理性Wnt信号通路的激活剂，可促进人多能性干细胞快速有效地转化为中胚层；IWP2是一种Wnt信号抑制剂，可选择性阻断Wnt棕榈酰化，因此使用CHIR99021和IWP2来激活和抑制经典Wnt信号传导。
根据上述第三个目的，本发明还提供一种促进人多能性干细胞向心肌细胞分化的方法，该方法包括至少四个阶段：
诱导分化前阶段：用TeSR-E8、mTeSR1或E8培养基中的一种或多种传代培养人多能性干细胞，培养2-5天，至细胞密度为80％-100％；其中包括在含有10μM Y27632的TeSR-E8、mTeSR1或E8培养基中培养1天；
第一诱导分化阶段：用上述第一诱导分化培养基诱导分化培养2天；
第二诱导分化阶段：用上述第二诱导分化培养基诱导分化培养2天；
第三诱导分化阶段：用上述第三诱导分化培养基诱导分化培养5-10天。
可选的，该方法还包括在诱导分化前阶段将人多能性干细胞在含有Vitronectin或Matrigel基质的人多能性干细胞培养基中培养扩增的步骤；具体的，所述人多能性干细胞以1-6×104细胞/cm2的密度接种到Vitronectin或Matrigel基质包被的培养皿中。
此外，本发明适用于无饲养层细胞培养体系中培养的人多能性干细胞分化为心肌细胞，要求保护由上述方法获得的人心肌细胞及其应用。
本发明的有益效果如下：
本发明首次发现叶酸可以促进人多能性干细胞向心肌细胞分化，利用本发明包含叶酸的培养基组合将未分化的人多能性干细胞高效率且有选择性地诱导分化为心肌细胞，通过添加叶酸可在7-10天将人多能性干细胞分化为可以搏动的人心肌细胞，15天可获得cTnT(心肌细胞标志物)表达阳性比例高于80％的心肌细胞，大幅提高诱导人多能性干细胞分化获得心肌细胞的效率，为人类心脏发育、疾病研究、药物开发、毒性分析以及细胞替代疗法等心脏相关医学研究提供良好的细胞资源，也为开发用于心肌细胞分化的培养基策略提供了新的见解。
本发明用于人多能性干细胞向心肌细胞分化的培养基组合中各培养基化学成分明确、无动物源性成分、批次稳定且分化效率高。该培养基组合由于不存在引入动物源性和人源性病原微生物的风险，在临床应用中更加安全。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出人多能性干细胞向心肌细胞分化示意图。
图2示出诱导分化前阶段结束实施例1和对比例的细胞状态和密度图(4×，标尺：500μM；10×，标尺：200μM)。
图3示出第一诱导分化阶段结束分化后实施例1和对比例的细胞状态和密度图(4×，标尺：500μM；10×，标尺：200μM)。
图4示出第二诱导分化阶段结束分化后实施例1和对比例的细胞状态和密度图(4×，标尺：500μM；10×，标尺：200μM)。
图5示出第三诱导分化阶段结束分化后实施例1和对比例的细胞状态和密度图(4×，标尺：500μM；10×，标尺：200μM)。
图6示出实施例1心肌细胞cTnT表达情况(2组，重复1和2)。
图7示出实施例2心肌细胞cTnT表达情况(2组，重复1和2)。
图8示出实施例3心肌细胞cTnT表达情况(2组，重复1和2)。
图9示出实施例4(高浓度组)心肌细胞cTnT表达情况(2组，重复1和2)。
图10示出实施例5(低浓度组)心肌细胞cTnT表达情况(2组，重复1和2)。
图11示出对比例心肌细胞cTnT表达情况。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
针对现有技术中存在的问题，例如血清、血清替代物或动物源性成分的使用风险，及分化得到的心肌细胞的纯度和效率较低等问题，本发明提供叶酸在促进人多能性干细胞向心肌细胞分化中的应用。
叶酸(folate/folic acid)，也称维生素B9、维生素M，是一种水溶性维生素，是8种B族复合维生素之一，13种必需维生素之一。叶酸在心血管发育中起着至关重要的作用，可作为心脏保护剂或治疗剂。但是其对多能干细胞的培养及定向分化的作用尚未有明确的结论。
本发明发现了叶酸对多能干细胞向心肌细胞分化的促进作用，特定浓度下，效果尤其显著。例如，所述叶酸的浓度为1μM～3μM，具体可以为1μM、1.5μM、2μM、2.5μM和3μM等。
本发明以上述发现为基础，提供了一种用于人多能性干细胞向心肌细胞分化的含有叶酸的培养基组合。该培养基组合中各培养基化学成分明确、无动物源性成分，能稳定实现高效率的分化，获得高纯度的心肌细胞。利用该培养基组合分化人多能性干细胞获得心肌细胞分化率高于80％，并且批次间稳定。所述培养基组合包含第一诱导分化培养基、第二诱导分化培养基和/或第三诱导分化培养基；其中，
所述第一诱导分化培养基包含基础培养基、叶酸、其他诱导分化组分和小分子化合物A；
所述第二诱导分化培养基包含基础培养基、叶酸、其他诱导分化组分和小分子化合物B；
所述第三诱导分化培养基包含基础培养基、叶酸和其他诱导分化组分。
在本发明的具体实施方式中，所述叶酸的浓度为1μM～3μM，具体可以为1μM、1.5μM、2μM、2.5μM和3μM等。
在本发明的具体实施方式中，所述基础培养基包括RPMI 1640培养基、IMDM培养基、DMEM/F12培养基中的一种或几种。
在本发明的具体实施方式中，所述其他诱导分化组分包括转铁蛋白、L-抗坏血酸、亚硒酸钠、乙醇胺、L-肉毒碱、过氧化氢酶、还原型谷胱甘肽、胰岛素、超氧化物歧化酶、T3、半乳糖酶、腐胺、皮质酮、亚油酸、亚麻酸、孕酮、DL-α生育酚、DL-α-生育酚乙酸酯、油酸、哌酸和生物素中的一种或几种。优选的，所述其他诱导分化组分包括转铁蛋白、L-抗坏血酸、亚硒酸钠、乙醇胺、L-肉毒碱、腐胺、亚油酸和生物素；各组分的浓度为转铁蛋白的浓度为10ng/mL～30ng/mL，L-抗坏血酸的浓度为100μg/mL～500μg/mL，亚硒酸钠的浓度为10ng/mL～20ng/mL，乙醇胺的浓度为1μg/mL～3μg/mL，L-肉毒碱的浓度为1μg/mL～5μg/mL，腐胺的浓度为10ng/mL～20ng/mL，亚油酸的浓度为0.5μg/mL～2μg/mL，生物素的浓度为0.1μg/ml～0.5μg/ml；具体的，转铁蛋白的浓度为20ng/mL，L-抗坏血酸的浓度为300μg/mL，亚硒酸钠的浓度为15ng/mL，乙醇胺的浓度为2μg/mL，L-肉毒碱的浓度为3μg/mL，腐胺的浓度为15ng/mL，亚油酸的浓度为1μg/mL，生物素的浓度为0.3μg/ml。
在本发明的具体实施方式中，所述小分子化合物A为GSK-3β抑制剂(Wnt信号通路激活剂)，为CHIR99021、LY2090314、SB216763、SB415286中的一种或几种。
在本发明的具体实施方式中，所述小分子化合物B为Wnt信号通路抑制剂，为WntC59、IWP1、IWP2、IWP3、IWP4、IWR1、IWR2、IWR3、IWR4、IWR5中的一种或几种。
在本发明的优选实施方式中，所述GSK-3β抑制剂(Wnt信号通路激活剂)为CHIR99021，其浓度为1μM～10μM，具体的为5μM；所述Wnt信号通路抑制剂为IWP2，其浓度为1μM～10μM，具体的为5μM。Wnt信号通路的适当调节足以实现有效的心肌分化，CHIR99021是一种有效的药理性Wnt信号通路的激活剂，可促进人多能性干细胞快速有效地转化为中胚层；IWP2是一种Wnt信号抑制剂，可选择性阻断Wnt棕榈酰化，因此使用CHIR99021和IWP2来激活和抑制经典Wnt信号传导。
在本发明的具体实施方式中，一种促进人多能性干细胞向心肌细胞分化的方法，包括至少四个阶段：
诱导分化前阶段：用TeSR-E8、mTeSR1或E8培养基中的一种或多种传代培养人多能性干细胞，培养2-5天，至细胞密度为80％-100％；其中包括在含有10μM Y27632的TeSR-E8、mTeSR1或E8培养基中培养1天；
第一诱导分化阶段：用上述第一诱导分化培养基诱导分化培养2天；
第二诱导分化阶段：用上述第二诱导分化培养基诱导分化培养2天；
第三诱导分化阶段：用上述第三诱导分化培养基诱导分化培养5-10天。
本发明通过在第一诱导分化阶段、第二诱导分化阶段和第三诱导分化阶段的培养基中添加叶酸来提高人多能性干细胞向心肌细胞分化的效率。
本领域技术人员可以想到的是，为了达到更稳定的分化效果，在诱导分化前阶段还包括将人多能性干细胞在含有Vitronectin或Matrigel基质的人多能性干细胞培养基中培养扩增的步骤。在本发明具体的实施方式中，诱导分化前将人多能性干细胞以1-6×104细胞/cm2的密度接种到Vitronectin或Matrigel基质包被的培养皿中。
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。如果没有特别说明，本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及以端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明中实施例中所使用的基础培养基RPMI 1640(Gibco)购自Thermo FisherScientific公司，叶酸购自Merck(Sigma)公司，其他诱导分化组分购自Merck(Sigma)公司，小分子化合物购自R&D System、Selleck公司，其他材料均为本领域常用材料。
实施例1用于人多能性干细胞向心肌细胞分化的培养基组合
一种用于人多能性干细胞向心肌细胞分化的培养基组合，包含第一诱导分化培养基、第二诱导分化培养基和第三诱导分化培养基；其中，
所述第一诱导分化培养基由基础培养基、叶酸、其他诱导分化组分和小分子化合物A组成；
所述第二诱导分化培养基由基础培养基、叶酸、其他诱导分化组分和小分子化合物B组成；
所述第三诱导分化培养基由基础培养基、叶酸和其他诱导分化组分组成；
各培养基中各组分组成及浓度如下：
叶酸的浓度为1.5μM；
基础培养基为RPMI 1640培养基；
其他诱导分化组分由转铁蛋白、L-抗坏血酸、亚硒酸钠、乙醇胺、L-肉毒碱、腐胺、亚油酸和生物素组成，其中，转铁蛋白的浓度为20ng/mL，L-抗坏血酸的浓度为300μg/mL，亚硒酸钠的浓度为15ng/mL，乙醇胺的浓度为2μg/mL，L-肉毒碱的浓度为3μg/mL，腐胺的浓度为15ng/mL，亚油酸的浓度为1μg/mL，生物素的浓度为0.3μg/ml；
小分子化合物A为CHIR99021，其浓度为5μM；
小分子化合物B为IWP2，其浓度为5μM。
实施例2用于人多能性干细胞向心肌细胞分化的培养基组合
一种用于人多能性干细胞向心肌细胞分化的培养基组合，包含第一诱导分化培养基、第二诱导分化培养基和第三诱导分化培养基；其中，
所述第一诱导分化培养基由基础培养基、叶酸、其他诱导分化组分和小分子化合物A组成；
所述第二诱导分化培养基由基础培养基、叶酸、其他诱导分化组分和小分子化合物B组成；
所述第三诱导分化培养基由基础培养基、叶酸和其他诱导分化组分组成；
各培养基中各组分组成及浓度如下：
叶酸的浓度为2μM；
基础培养基为RPMI 1640培养基；
其他诱导分化组分由转铁蛋白、L-抗坏血酸、亚硒酸钠、乙醇胺、L-肉毒碱、腐胺、亚油酸和生物素组成，其中，转铁蛋白的浓度为20ng/mL，L-抗坏血酸的浓度为300μg/mL，亚硒酸钠的浓度为15ng/mL，乙醇胺的浓度为2μg/mL，L-肉毒碱的浓度为3μg/mL，腐胺的浓度为15ng/mL，亚油酸的浓度为1μg/mL，生物素的浓度为0.3μg/ml；
小分子化合物A为CHIR99021，其浓度为5μM；
小分子化合物B为IWP2，其浓度为5μM。
实施例3用于人多能性干细胞向心肌细胞分化的培养基组合
一种用于人多能性干细胞向心肌细胞分化的培养基组合，包含第一诱导分化培养基、第二诱导分化培养基和第三诱导分化培养基；其中，
所述第一诱导分化培养基由基础培养基、叶酸、其他诱导分化组分和小分子化合物A组成；
所述第二诱导分化培养基由基础培养基、叶酸、其他诱导分化组分和小分子化合物B组成；
所述第三诱导分化培养基由基础培养基、叶酸和其他诱导分化组分组成；
各培养基中各组分组成及浓度如下：
叶酸的浓度为2.5μM；
基础培养基为RPMI 1640培养基；
其他诱导分化组分由转铁蛋白、L-抗坏血酸、亚硒酸钠、乙醇胺、L-肉毒碱、腐胺、亚油酸和生物素组成，其中，转铁蛋白的浓度为20ng/mL，L-抗坏血酸的浓度为300μg/mL，亚硒酸钠的浓度为15ng/mL，乙醇胺的浓度为2μg/mL，L-肉毒碱的浓度为3μg/mL，腐胺的浓度为15ng/mL，亚油酸的浓度为1μg/mL，生物素的浓度为0.3μg/ml；
小分子化合物A为CHIR99021，其浓度为5μM；
小分子化合物B为IWP2，其浓度为5μM。
实施例4(高浓度组)用于人多能性干细胞向心肌细胞分化的培养基组合
一种用于人多能性干细胞向心肌细胞分化的培养基组合，包含第一诱导分化培养基、第二诱导分化培养基和第三诱导分化培养基；其中，
所述第一诱导分化培养基由基础培养基、叶酸、其他诱导分化组分和小分子化合物A组成；
所述第二诱导分化培养基由基础培养基、叶酸、其他诱导分化组分和小分子化合物B组成；
所述第三诱导分化培养基由基础培养基、叶酸和其他诱导分化组分组成；
各培养基中各组分组成及浓度如下：
叶酸的浓度为3μM；
基础培养基为RPMI 1640培养基；
其他诱导分化组分由转铁蛋白、L-抗坏血酸、亚硒酸钠、乙醇胺、L-肉毒碱、腐胺、亚油酸和生物素组成，其中，转铁蛋白的浓度为20ng/mL，L-抗坏血酸的浓度为300μg/mL，亚硒酸钠的浓度为15ng/mL，乙醇胺的浓度为2μg/mL，L-肉毒碱的浓度为3μg/mL，腐胺的浓度为15ng/mL，亚油酸的浓度为1μg/mL，生物素的浓度为0.3μg/ml；
小分子化合物A为CHIR99021，其浓度为5μM；
小分子化合物B为IWP2，其浓度为5μM。
实施例5(低浓度组)用于人多能性干细胞向心肌细胞分化的培养基组合
一种用于人多能性干细胞向心肌细胞分化的培养基组合，包含第一诱导分化培养基、第二诱导分化培养基和第三诱导分化培养基；其中，
所述第一诱导分化培养基由基础培养基、叶酸、其他诱导分化组分和小分子化合物A组成；
所述第二诱导分化培养基由基础培养基、叶酸、其他诱导分化组分和小分子化合物B组成；
所述第三诱导分化培养基由基础培养基、叶酸和其他诱导分化组分组成；
各培养基中各组分组成及浓度如下：
叶酸的浓度为1μM；
基础培养基为RPMI 1640培养基；
其他诱导分化组分由转铁蛋白、L-抗坏血酸、亚硒酸钠、乙醇胺、L-肉毒碱、腐胺、亚油酸和生物素组成，其中，转铁蛋白的浓度为20ng/mL，L-抗坏血酸的浓度为300μg/mL，亚硒酸钠的浓度为15ng/mL，乙醇胺的浓度为2μg/mL，L-肉毒碱的浓度为3μg/mL，腐胺的浓度为15ng/mL，亚油酸的浓度为1μg/mL，生物素的浓度为0.3μg/ml；
小分子化合物A为CHIR99021，其浓度为5μM；
小分子化合物B为IWP2，其浓度为5μM。
对比例用于人多能性干细胞向心肌细胞分化的培养基组合
一种用于人多能性干细胞向心肌细胞分化的培养基组合，包含第一诱导分化培养基、第二诱导分化培养基和第三诱导分化培养基；其中，
所述第一诱导分化培养基由基础培养基、其他诱导分化组分和小分子化合物A组成；
所述第二诱导分化培养基由基础培养基、其他诱导分化组分和小分子化合物B组成；
所述第三诱导分化培养基由基础培养基和其他诱导分化组分组成；
各培养基中各组分组成及浓度如下：
基础培养基为RPMI 1640培养基；
其他诱导分化组分由转铁蛋白、L-抗坏血酸、亚硒酸钠、乙醇胺、L-肉毒碱、腐胺、亚油酸和生物素组成，其中，转铁蛋白的浓度为20ng/mL，L-抗坏血酸的浓度为300μg/mL，亚硒酸钠的浓度为15ng/mL，乙醇胺的浓度为2μg/mL，L-肉毒碱的浓度为3μg/mL，腐胺的浓度为15ng/mL，亚油酸的浓度为1μg/mL，生物素的浓度为0.3μg/ml；
小分子化合物A为CHIR99021，其浓度为5μM；
小分子化合物B为IWP2，其浓度为5μM。
试验例1促进人多能性干细胞向心肌细胞分化的方法
一种促进人多能性干细胞向心肌细胞分化的方法，示意图如图1所示，具体包括如下四个阶段：
S1、诱导分化前阶段：
D-2将即将用于定向分化的人多能性干细胞以1-6×104细胞/cm2的密度接种到Vitronectin或Matrigel基质包被的培养皿中；
用含有10μM Y27632的TeSR-E8、mTeSR1或E8培养基培养人多能性干细胞，培养1天；
D-1用TeSR-E8、mTeSR1或E8培养基继续传代培养1-4天，至细胞密度为80％-100％；
S2、第一诱导分化阶段：
D0将TeSR-E8、mTeSR1或E8培养基分别替换为实施例1-5和对比例中的第一诱导分化培养基，诱导分化培养2天；
S3、第二诱导分化阶段：
D2将实施例1-5和对比例所述的第一诱导分化培养基分别替换为相应的实施例1-5和对比例中的第二诱导分化培养基，诱导分化培养2天；
S4、第三诱导分化阶段：
D4将实施例1-5和对比例所述的第二诱导分化培养基分别替换为相应的实施例1-5和对比例中的第三诱导分化培养基诱导分化培养5-10天。
整个过程中观察细胞的跳动情况，每个阶段结束后观察细胞状态和密度，在第三诱导分化阶段后流式检测心肌细胞cTnT表达情况，结果如图2-9所示：
图2所示分别为实施例1和对比例在诱导分化前阶段结束后的细胞状态和密度图。由图可以看出，实施例1和对比例细胞此时的状态和汇合度无差异，汇合度达90％左右。
图3所示分别为实施例1和对比例在第一诱导分化阶段结束分化后的细胞状态和密度图。由图可以看出，实施例1和对比例细胞此时均呈现分化阶段，细胞较为致密的铺于孔底板。
图4所示分别为实施例1和对比例在第二诱导分化阶段结束分化后的细胞状态和密度图。由图可以看出，实施例1和对比例细胞继续分化，开始出现分层现象，实施例1的分层较对比例分层明显。
图5所示分别为实施例1和对比例在第三诱导分化阶段结束分化后的细胞状态和密度图。由图可以看出，实施例1的分层较对比例明显。观察细胞的跳动情况发现实施例1细胞跳动强劲有力，且跳动区域较大、跳动持续稳定，对比例稍差。
图6所示为实施例1心肌细胞cTnT表达情况(2组，重复1和2)。将人多能性干细胞诱导分化成心肌细胞，流式检测心肌细胞标志基因cTnT的表达情况，可以看出实施例1获得高纯度的心肌细胞，分化效率分别为86.38％、86.73％。
图7所示为实施例2心肌细胞cTnT表达情况(2组，重复1和2)。将人多能性干细胞诱导分化成心肌细胞，流式检测心肌细胞标志基因cTnT的表达情况，可以看出实施例2获得高纯度的心肌细胞，分化效率分别为83.29％、82.24％。
图8所示为实施例3心肌细胞cTnT表达情况(2组，重复1和2)。将人多能性干细胞诱导分化成心肌细胞，流式检测心肌细胞标志基因cTnT的表达情况，可以看出实施例3获得高纯度的心肌细胞，分化效率分别为80.65％、80.92％。
图9所示为实施例4(高浓度组)组心肌细胞cTnT表达情况(2组，重复1和2)。将人多能性干细胞诱导分化成心肌细胞，流式检测心肌细胞标志基因cTnT的表达情况，可以看出高浓度组获得高纯度的心肌细胞，分化效率分别为81.82％、81.71％。
图10所示为实施例5(低浓度组)心肌细胞cTnT表达情况(2组，重复1和2)。将人多能性干细胞诱导分化成心肌细胞，流式检测心肌细胞标志基因cTnT的表达情况，可以看出低浓度组获得高纯度的心肌细胞，分化效率分别为83.69％、82.09％。
图11所示为对比例心肌细胞cTnT表达情况(2组，重复1和2)。将人多能性干细胞诱导分化成心肌细胞，流式检测心肌细胞标志基因cTnT的表达情况，分化效率分别为53.71％、56.62％，明显低于实施例1-5的分化效率。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (7)

1.一种促进人多能性干细胞向心肌细胞分化的方法，其特征在于，该方法包括至少四个阶段：
诱导分化前阶段：用TeSR-E8、mTeSR1或E8培养基中的一种或多种传代培养人多能性干细胞，培养2-5天，至细胞密度为80％-100％；其中包括在含有10μM Y27632的TeSR-E8、mTeSR1或E8培养基中培养1天；
第一诱导分化阶段：用第一诱导分化培养基诱导分化培养2天；
第二诱导分化阶段：用第二诱导分化培养基诱导分化培养2天；
第三诱导分化阶段：用第三诱导分化培养基诱导分化培养5-10天；
所述第一诱导分化培养基由基础培养基、叶酸、其他诱导分化组分和小分子化合物A；
所述第二诱导分化培养基由基础培养基、叶酸、其他诱导分化组分和小分子化合物B；
所述第三诱导分化培养基由基础培养基、叶酸和其他诱导分化组分；
其中，所述叶酸的浓度为1μM～3μM；
所述其他诱导分化组分由转铁蛋白、L-抗坏血酸、亚硒酸钠、乙醇胺、L-肉毒碱、腐胺、亚油酸和生物素组成；所述转铁蛋白的浓度为10ng/mL～30ng/mL，所述L-抗坏血酸的浓度为100μg/mL～500μg/mL，所述亚硒酸钠的浓度为10ng/mL～20ng/mL，所述乙醇胺的浓度为1μg/mL～3μg/mL，所述L-肉毒碱的浓度为1μg/mL～5μg/mL，所述腐胺的浓度为10ng/mL～20ng/mL，所述亚油酸的浓度为0.5μg/mL～2μg/mL，所述生物素的浓度为0.1μg/ml～0.5μg/ml；
所述小分子化合物A为CHIR99021，所述CHIR99021的浓度为1μM～10μM；
所述小分子化合物B为IWP2，所述IWP2的浓度为1μM～10μM。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基础培养基包括RPMI 1640培养基、IMDM培养基、DMEM/F12培养基中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转铁蛋白的浓度为20ng/mL，所述L-抗坏血酸的浓度为300μg/mL，所述亚硒酸钠的浓度为15ng/mL，所述乙醇胺的浓度为2μg/mL，所述L-肉毒碱的浓度为3μg/mL，所述腐胺的浓度为15ng/mL，所述亚油酸的浓度为1μg/mL，所述生物素的浓度为0.3μg/ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CHIR99021的浓度为5μM。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述IWP2的浓度为5μM。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在诱导分化前阶段将人多能性干细胞在含有Vitronectin或Matrigel基质的人多能性干细胞培养基中培养扩增的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述人多能性干细胞以1-6×104细胞/cm2的密度接种到Vitronectin或Matrigel基质包被的培养皿中。
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