CN103316342A

CN103316342A - MiR-31抑制剂用于抑制血管损伤后再狭窄的用途

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Publication number: CN103316342A
Application number: CN2013100626326A
Authority: CN
Inventors: 韩雅玲; 汪洁; 闫承慧; 张效林; 陶杰; 李洋; 田孝祥
Original assignee: General Hospital of Shenyang Military Region
Current assignee: General Hospital of Shenyang Military Region
Priority date: 2013-02-28
Filing date: 2013-02-28
Publication date: 2013-09-25

Abstract

本发明涉及microRNA的医药用途，具体涉及miR-31的抑制剂用于制备预防或治疗血管损伤后再狭窄的药物或产品的用途，用于制备治疗血管损伤的药物或产品的用途，用于制备抑制血管平滑肌细胞增殖和/或迁移的药物或产品的用途，或者用于制备抑制血管损伤引起的血管平滑肌细胞表型转化的药物或产品的用途。本发明还涉及含有miR-31的抑制剂的组合物或动脉支架。本发明所述的miR-31或其抑制剂可以作为药物成分或器械成分，用于预防或治疗血管损伤后再狭窄。

Description

MiR-31抑制剂用于抑制血管损伤后再狭窄的用途

技术领域

本发明涉及microRNA及其抑制剂的医药用途，具体涉及miR-31抑制剂用于制备抑制血管损伤后再狭窄的药物中的用途。本发明还涉及miR-31用于调控细胞E1A激活基因阻遏子蛋白的用途，和用于调控血管平滑肌细胞表型转化的用途。

背景技术

动脉粥样硬化（AS）、经皮冠状动脉介入治疗（PCI）术后再狭窄（RS）、移植后动脉病以及肺动脉高压等许多心血管系统疾病作为危害人类健康的危重疾病受到广泛关注。近年研究发现，成熟血管壁的血管平滑肌细胞（VSMC）在血管损伤后发生表型逆转，由生理状态下的分化表型（收缩表型）转变为去分化表型（合成表型），并获得增殖、迁移及合成、分泌大量细胞外基质的能力。VSMC由分化表型向去分化表型的转化是AS及PCI术后RS等疾病发生过程中新生内膜形成和管腔狭窄的重要病理基础。因此，对VSMC表型转化机制的研究是增生性血管病防治研究的重要方向。然而，在当今表型调控的研究领域，VSMCs表型基因表达的调控机制还有待明确。

人E1A激活基因阻遏子（human cellular repressor ofE1A-stimulated gene,hCREG）基因是1998年哈佛医学院Gill克隆的一个细胞分化调控基因（Veal E，Mol Cell Biol，1998；18(9):5032-5041）。前期研究证实，在VSMC由合成型向分化型转化的过程中，CREG蛋白及mRNA的表达水平显著升高（Han Ya-Ling,Zhonghua Yi Xue ZaZhi,2005；85(1):49-53；Han Ya-Ling,J Mol Cell Cardiol，2011；50(4):723-30；Han Ya-Ling,J Mol Cell Cardiol，2010；48(6):1225-35），并且hCREG蛋白表达能明显抑制体外培养的人胸廓内动脉平滑肌细胞-HITASY的增殖并促进其分化（Han Ya-Ling,Chinese Journal ofCellular and Molecular Immunology,2005;21(5):570-574；Han Ya-Ling,Prog Biochem Biophys,2004;31(12):1099-1105；Han Ya-Ling,ProgBiochem Biophys,2005;32(6):517-522）。研究还发现，在球囊损伤后的大鼠颈动脉血管中，血管中膜的CREG基因的表达明显下降，且过表达CREG可以抑制VSMC的增殖和新生内膜的形成（Han Ya-Ling，Cardiovasc Res,2008；78(3):597-604；Han Ya-Ling，J Vasc Surg，2008；48(1):201-9），同时，经外膜包裹导入的pLNCX2-hCREG逆转录病毒有效抑制了球囊拉伤后小鼠颈动脉狭窄的发生（Han Ya-Ling，ChineseJournal of Pathophysiology,2007;23(10):1873-1877）。上述研究提示，hCREG是调控VSMCs分化的重要因子，在临床PCI术后RS的防治研究中具有潜在重要意义。但是，调控CREG基因表达的上游信号分子机制尚未阐明。

近年研究发现，miRNA（microRNA,miR）在基因表达调控方面具有重要作用，是基因调控领域的一个新的发现和突破口。miRNAs是一类内生的、非编码的小RNA，它通过抑制或者降解靶基因的mRNA，负性调节靶基因的表达。细胞中大约有30%的基因可受到miRNAs的直接调控。而且，单个miRNA可调节多个基因的表达。因此，miRNA是一个重要的转录因子，并且对细胞生物功能的调节起到了重要的作用。最近报道指出，miRNAs参与了很多心血管系统疾病的发生，其中与VSMCs表型转化基因有单一结合靶点的miRNAs的发现，揭示了心血管系统稳态的调节及血管损伤治疗靶点选择的重要机制。有研究指出，miR-31与肿瘤细胞的增殖、分化、迁移和转移有关，但其对于VSMC是否有调控作用，值得更加深入的研究。

发明内容

本发明通过大量实验证实，miR-31通过与hCREG mRNA3’UTR区结合，调控hCREG蛋白的表达，进而参与VSMC从分化表型到去分化表型的调控，由此完成了本发明。

本发明第一方面涉及miR-31的抑制剂用于制备预防或治疗血管损伤后再狭窄的药物或产品的用途，用于制备治疗血管损伤的药物或产品的用途，用于制备预防或治疗动脉粥样硬化的药物或经皮冠状动脉介入治疗前/后的辅助药物的用途，用于制备抑制血管平滑肌细胞增殖和/或迁移的药物或产品的用途，或者用于制备抑制血管损伤引起的血管平滑肌细胞表型转化的药物或产品的用途。

根据本发明第一方面的用途，其中所述的血管损伤为动脉粥样硬化介入治疗、移植后动脉病或肺动脉高压引起的血管损伤。优选地，其中所述动脉粥样硬化介入治疗是指经皮冠状动脉介入治疗。

本发明第二方面涉及组合物，其含有miR-31的抑制剂，所述组合物用于预防或治疗血管损伤后再狭窄，或者用于预防或治疗血管损伤，用于治疗动脉粥样硬化，或者用于经皮冠状动脉介入治疗前/后的辅助治疗。

根据本发明第二方面的组合物，其中所述的血管损伤为动脉粥样硬化介入治疗、移植后动脉病或肺动脉高压引起的血管损伤。优选地，其中所述动脉粥样硬化介入治疗是指经皮冠状动脉介入治疗。

本发明第三方面涉及动脉支架，所述动脉支架包被有miR-31的抑制剂。

根据本发明第三方面的动脉支架，其为冠状动脉支架。

根据本发明第三方面的动脉支架，所述动脉支架可用于预防或治疗血管损伤后的再狭窄，优选地，其中所述的血管损伤为动脉粥样硬化介入治疗、移植后动脉病或肺动脉高压引起的血管损伤。优选地，其中所述动脉粥样硬化介入治疗是指经皮冠状动脉介入治疗。

本发明第四方面涉及miR-31用于下调细胞（离体的或在体的）中E1A激活基因阻遏子蛋白（hCREG）、α平滑肌肌动蛋白（SMα-actin）或调宁蛋白（Calponin）表达水平的用途，或者用于促进细胞（离体的或在体的）由分化表型向去分化表型转化的用途。

本发明第五方面涉及miR-31的抑制剂用于上调细胞（离体的或在体的）中E1A激活基因阻遏子蛋白（hCREG）、α平滑肌肌动蛋白或调宁蛋白表达水平的用途，用于促进细胞（离体的或在体的）由去分化表型向分化表型转化的用途，或者在制备用于上调细胞（离体的或在体的）中E1A激活基因阻遏子蛋白（hCREG）、α平滑肌肌动蛋白或调宁蛋白表达水平、促进细胞（离体的或在体的）由去分化表型向分化表型转化的制剂中的用途。

本发明第六方面涉及检测miR-31或其抑制剂表达水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断血管损伤后的再狭窄和血管平滑肌细胞增生性的血管疾病。

本发明第七方面涉及试剂盒，所述试剂盒包括检测miR-31或其抑制剂表达水平的试剂，所述试剂盒用于诊断血管损伤后的再狭窄和血管平滑肌细胞增生性的血管疾病。

本发明第八方面涉及筛选用于预防或治疗血管损伤后再狭窄的药物的方法，所述方法包括筛选miR-31的抑制剂的步骤；优选地，所述方法包括根据miR-31设计其反义RNA，或者将miR-31与候选物质接触，检测miR-31的表达，并选择特异抑制miR-31表达的候选物质。

根据本发明上述任一方面的用途、组合物、动脉支架、方法、试剂盒，其中所述的miR-31的抑制剂可以是能够特异抑制miR-31对靶基因的调控作用的任何物质,可以是在细胞中特异抑制miR-31表达的物质，也可以是与miR-31具有特异性相互作用，例如与miR-31特异性结合的物质,或者特异抑制miR-31与DICER或RISC的相互作用的物质

在本发明中，所述miR-31既指含有5’AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU3’（SEQ ID NO：1）序列的内生的、非编码的微小RNA（此序列来自于miRBase数据库（MI0000089）），也指体外合成的具有SEQ ID NO：1所示序列的微小RNA，也指仅包括能够行使miR-31功能的核心序列（例如第2～8个核苷酸）的microRNA分子。所述微小RNA的体外合成方法为本领域公知，为了保持微小RNA在体外操作时的稳定性，可以进行适当的修饰。

在本发明中，所述miR-31抑制剂具有本领域公知的含义，其可以是能够特异抑制miR-31对靶基因的调控作用的任何物质,可以是在细胞中特异抑制miR-31表达的物质，也可以是与miR-31具有特异性相互作用，例如与miR-31特异性结合的物质,或者特异性抑制miR-31与DICER或RISC的相互作用的物质。

在本发明的实施方案中，所述miR-31的抑制剂（anti-miR，抑制物）是指miR-31的反义寡核苷酸抑制剂。microRNA的反义寡核苷酸抑制剂的设计和制备方法为本领域所公知。在本发明的具体实施方案中，所述miR-31的反义寡核苷酸抑制剂是指化学合成及修饰的、与特异miRNA序列（特别是核心序列，例如第2-8个核苷酸）互补的单链核酸分子，其能够特异性抑制内生miRNAs功能，通过特异的靶向单个miRNA分子，从而削弱内源miRNA对其靶基因的调控作用，影响靶基因的表达（Stenvang J,Petri A,Lindow M,Obad S,Kauppinen S.，Inhibition of microRNA function by antimiRoligonucleotides，Silence.2012Jan9;3(1):1.doi:10.1186/1758-907X-3-1.）。反义寡核苷酸抑制剂可以有不同的长度和化学修饰，如磷酸骨架的硫代修饰，核糖的2’-O-烷基化修饰，包括2’-O-甲基、2’-O-甲氧乙基、2’-F等，以及肽核酸（peptide nucleic acid,PNA）、锁核酸（locked nucleic acid,LNA）等修饰。

当用于上述用途时，所述miR-31或其抑制剂可以单独使用，也可以与其它分子连接后使用，例如与胆固醇、靶细胞受体等连接，或者连接入载体后使用。

在本发明中，所述血管损伤主要是指动脉血管损伤。

在本发明中，所述血管损伤是指动脉粥样硬化引起的血管损伤，或者在治疗动脉粥样硬化时引起的血管损伤，例如通过球囊扩张或放入支架引起的血管损伤，或者移植后动脉病或肺动脉高压引起的血管损伤。

在本发明中，所述动脉粥样硬化既包括动脉粥样硬化较早期阶段的血管狭窄期，也包括动脉粥样硬化严重时的血管梗塞期。

在本发明中，所述经皮冠状动脉介入治疗是指经导管通过各种方法扩张狭窄的冠状动脉，从而达到解除狭窄，改善心肌血供的治疗方法。

在本发明中，所述VSMC增生性的血管疾病是指以VSMC表型转化为形成新生内膜形成和管腔狭窄重要病理基础的疾病，如血管重塑、血管成形术后再狭窄及动脉粥样硬化等。

在本发明中，所述动脉支架是指用于支撑人体内因病变而狭窄、闭塞的血管，恢复血液流通的管状器件，采用金属或高分子材料加工制成，可长期或暂时留于人体血管内。在管腔球囊扩张成形的基础上，在病变段置入内支架以达到支撑狭窄闭塞段血管、减少血管弹性回缩及再塑形、保持管腔血流通畅的目的，既包括外周动脉支架，也包括冠状动脉支架。

在本发明中，所述再狭窄是指在局部血管发生损伤时，所作出的导致血管管腔再狭窄的普遍性生物学反应。这里主要指医源性损伤引起的血管再狭窄，损伤过程主要由动脉重塑和内皮增生组成。

在本发明中，所述VSMC表型转化是指VSMC在分化表型和去分化表型之间的转化。

在本发明中，所述细胞包括但不限于VSMC、血管内皮细胞、血管成纤维细胞、心肌成纤维细胞。

在本发明中，所述上调/下调细胞中蛋白的表达是指提高或降低细胞中蛋白质水平或mRNA水平的至少20%、30%、40%、50%。其中所述的上调或下调是与未干预的细胞例如转染对照载体组的细胞进行比较。

发明的有益效果

本发明证实miR-31可以通过与hCREG基因结合来调控VSMC的表型转化，并且冠脉支架术后再狭窄病人血清中miR-31的表达明显增高，表明miR-31的抑制剂可用于制备预防或治疗血管损伤后再狭窄的药物或器械。

附图说明

图1.人hCREG3’-UTR表达载体的构建示意图

图2.用PDGF和去血清处理人VSMC后，miR-31、hCREG及表型转化标记物的表达变化情况.

(A)VSMCs用PDGF-BB处理48小时后，hCREG及表型转化标记物蛋白表达变化。上图为4组细胞中SMα-actin、calponin及hCREG的比较Western blot图，β-actin是内参。下图为统计分析图。0浓度组与不同浓度PDGF-BB处理组比较，*P<0.05实验重复六遍。

(B)VSMCs用去血清饥饿（0.1%）处理后，hCREG及表型转化标记物蛋白表达变化。上图为4组细胞中SMα-actin、calponin及

hCREG的比较Western blot图，β-actin是内参。下图为统计分析图。0小时组与不同时间点去血清饥饿组比较，*P<0.05实验重复六遍。

(C)VSMCs用PDGF-BB处理48小时后，荧光实时定量PCR

（qRT-PCR）检测miR-31的表达变化。0浓度组与不同浓度PDGF-BB处理组比较，*P<0.05实验重复六遍。

(D)VSMCs用去血清饥饿（0.1%）处理后，qRT-PCR检测miR-31的表达变化。0小时组与不同时间点去血清饥饿组比较，*P<0.05实验重复六遍。

(E)VSMCs用PDGF-BB处理48小时后，反转录PCR（RT-PCR）检测CREG mRNA的表达变化。0浓度组与不同浓度PDGF-BB处理组比较，*P<0.05实验重复五遍。

(F)VSMCs用去血清饥饿（0.1%）处理后，RT-PCR检测hCREGmRNA的表达变化。0小时组与不同时间点去血清饥饿组比较，*P<0.05实验重复五遍。

数据采用均数±标准误(±SE)表示。

图3.miR-31调节体外培养VSMCs的表型转化.

(A)miR-31模拟物不同浓度转染VSMCs48小时后，qRT-PCR检测各组miR-31的表达变化.0浓度组与不同浓度miR-31模拟物组比较，*P<0.05，实验重复五遍。

(B)miR-31抑制物不同浓度转染VSMCs48小时后，qRT-PCR检测各组miR-31的表达变化。0浓度组与不同浓度miR-31抑制物组比较，*P<0.05，实验重复五遍。

(C)miR-31模拟物、miR-140模拟物、oligo对照转染VSMCs后，qRT-PCR检测各组miR-31的表达变化。空白对照组与其他转染组比较，*P<0.05实验重复五遍。

(D)miR-31抑制物、miR-140抑制物、oligo对照转染VSMCs后，qRT-PCR检测各组miR-31的表达变化。空白对照组与其他转染组比较，*P<0.05实验重复五遍。

(E)miR-31模拟物、miR-31抑制物、oligo对照转染VSMCs后，western blot检测各组SMα-actin蛋白的表达变化。左图为4组细胞中SMα-actin的Western blot图，β-actin是内参。右图为统计分析图。空白对照组与其他转染组比较，*P<0.05实验重复三遍。

数据采用均数±标准误(±SE)表示。

图4.在培养的人VSMCs中，hCREG为miR-31的靶基因。

(A)miR-31模拟物、miR-31抑制物、oilgo对照转染VSMCs后，western blot检测各组hCREG蛋白的表达变化。上图为4组细胞中hCREG蛋白的Western blot图，β-actin是内参。下图为统计分析图。空白对照组与其他转染组比较，*P<0.05实验重复三遍。

(B)miR-31模拟物、miR-31抑制物、oilgo对照转染VSMCs后，qRT-PCR检测各组hCREG mRNA的表达变化。空白对照组与其他转染组比较，*P<0.05，＊＊P<0.001，实验重复五遍。

(C)miR-31模拟物、miR-31抑制物、oilgo对照转染VSMCs后，免疫荧光检测VSMCs中SMα-actin（红）和hCREG（绿）的表达变化。图中蓝色为DAPI染色的细胞核，右列图为融合图像，比例尺=10μm。

(D)miR-31模拟物、miR-140模拟物、oilgo对照转染HEK293cells后，qRT-PCR检测miR-31和miR-140的表达变化。空白对照组与其他转染组比较，*P<0.05，实验重复五遍。

(E)miR-31模拟物、miR-140模拟物、oilgo对照分别转染hCREG3’-UTR双荧光报告基因组和靶点保护剂组后（HEK293细胞中），荧光酶标仪检测各组荧光活性变化。空白对照组与其他转染组比较，*P<0.05，实验重复三遍。

数据采用均数±标准误(±SE)表示。

图5.miR-31通过其靶基因hCREG调节VSMCs的表型转化。

(A)CREG shRNA、sh-RNA对照转染VSMCs后，western blot检测hCREG蛋白的表达变化.上图为三组细胞中hCREG的western blot图，β-actin是内参。下图为统计分析图。空白对照组与其他转染组比较，*P<0.05实验重复三遍。

(B)miR-31inhibitor分别转染VSMCs组、sh-RNA对照组、hCREGshRNA组后（VSMCs中），western blot检测SMα-actin蛋白的表达变化.上图为三组细胞中SMα-actin的western blot图，β-actin是内参。下图为统计分析图，图中设空白对照组SMα-actin表达为0%，miR-31抑制物转染VSMCs组为100%。miR-31抑制物转染VSMCs组与其他转染组比较，*P<0.05实验重复三遍。

数据采用均数±标准误(±SE)表示。

图6.qRT-PCR检测miR-31在正常人、冠心病病人（未再狭窄）及再狭窄病人血清中的表达情况。再狭窄病人组与冠心病病人组比较，**P<0.001。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明实验数据均为百分数。两样本率的比较应用卡方检验，统计学处理均应用SPSS17.0软件包处理。P<0.05为有统计学差异。

其中Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司（11668-019）；

microRNA模拟物（miR-31模拟物：MSY0000089；miR-140模拟物：MSY0000431）、HiPerFect转染试剂（301704）、抑制剂（miR-31抑制剂：MIN0000089；miR-140抑制剂：MIN0000431）、靶点保护剂（MTP0003516）及对照物（AllStars Hs Cell Death siRNA：1027298）购自德国Qiagen公司；

双荧光报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司（E1910）；

microRNA分离提取试剂盒购自德国Macherey Nagel公司（740971.25）；

microRNA荧光定量PCR试剂盒购自德国Qiagen公司（218073）；

microRNA血清提取试剂盒购自德国Qiagen公司（217004）；

VSMC来源于人胸廓内动脉，由发明人制备并保存，命名为HITASY，参见Y.Han,B.Luan,M.Sun,L.Guo,P.Guo,J.Tao,J.Deng,G.Wu,S.Liu,C.Yan,S.Li,Glycosylation-independent binding toextracellular domains11-13of mannose-6-phosphate/insulin-like growthfactor-2receptor mediates the effects of soluble CREG on the phenotypicmodulation of vascular smooth muscle cells,J Mol Cell Cardiol50(2011)723-730.。

实施例1.hCREG3’-UTR表达载体的构建及鉴定

携带hCREG3’-UTR（货号：HmiT021565-MT01）及不携带hCREG3’-UTR的表达载体（货号：CmiT000001-MT01）均由美国基因复能公司合成。载体构建图见图1。

其中携带hCREG3’-UTR的表达载体为pEZX-MT01hCREG3’-UTR；

不携带hCREG3’-UTR的表达载体为空载体pEZX-MT01。

送TakaRa公司测序鉴定，证实携带hCREG3’-UTR的表达载体序列与GenBank（NM003851）公开的hCREG3’-UTR序列完全一致。

实施例2．稳定转染细胞克隆的筛选及鉴定

应用Lipofectamine2000试剂将pEZX-MT01hCREG3’-UTR载体转染至人HEK293细胞中。转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺至6孔板，使其在转染日密度达到90%。细胞铺板在2mL含血清、不含抗生素的正常生长的培养基中。转染前每孔细胞换为2mL不含血清和抗生素的DMEM培养基。用250μl无血清培养基（DMEM培养基）稀释4μgDNA（即携带hCREG3’-UTR及不携带hCREG3’-UTR的表达载体），250μl DMEM培养基稀释8μl Lipofectamine2000试剂，5分钟内同稀释的DNA混合，室温保温20分钟。直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。37°C，5%CO₂培养8小时后，弃掉每孔中的培养基，重新加入2mL含10%胎牛血清及1%抗生素的DMEM培养基。37°C，5％的CO₂中培养24小时后1：10传代，次日加入G418(1000μg/mL)以筛选稳定转染的细胞克隆。将稳定转染的HEK293细胞及未转染的对照细胞分别在10cm培养皿中培养至80%～90%融合，加Trizol裂解液1mL，提取细胞总RNA。根据GenBank(AB720111.1）登录的Moss transformation vector pTN82DNA中G418抗性基因（neomycin phosphotransferase）的序列，设计并合成的G418抗性基因RT-PCR引物如下：

上游引物为:5'-ACAACAGACAATCGGCTGCTC-3'（SEQ IDNO：2）；Tm=64℃

下游引物为：5'-CCATGGGTCACGACGAGATC-3'（SEQ ID NO：3）；Tm=64℃

将提取的RNA合成cDNA后（TakaRa公司的cDNA第一链合成试剂盒。扩增条件是：37°C，15分钟;85°C,5秒），通过下列反应体系和反应条件扩增出G418cDNA编码序列共500个碱基。

具体条件：

95℃3分钟

94℃30秒；59℃30秒；72℃1分钟30个循环

72℃10分钟

扩增产物经0.8%的琼脂糖凝胶分离检测，用EB染色显影。稳定转染pEZX-MT01hCREG3’-UTR表达载体的HEK293细胞裂解产物，可检测到大小约为500bp的cDNA表达条带。由此获得了稳定转染pEZX-MT01hCREG3’-UTR表达载体的HEK293细胞。

实施例3.miR-31、hCREG及VSMC表型转化标记物的表达变化相关性检测。

为了初步验证miR-31与hCREG及VSMC表型转化的关系，采用PDGF和去血清处理的方法构建VSMC表型转化模型，分别提取各组VSMC中的蛋白、总RNA及miRNA进行hCREG、VSMC表型转化标记物（SMα-actin和Calponin为VSMC的分化标记物，增多表示VSMC向分化表型转化，减少表示VSMC细胞向合成表型转化）及miR-31的表达检测。提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE后，分别以1：1000Anti-SMα-actin、1：1000Anti-Calponin（美国Sigma公司）及1：2000Anti-hCREG单克隆抗体（美国Santa cruz公司）作为一抗，以辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠抗体（中杉金桥公司）作为二抗行westernblot检测，用ECL试剂盒（Amersham公司）发光显影。人VSMC裂解产物，用hCREG抗体、SMα-actin抗体及Calponin抗体可分别检测到大小约为38kD、42kD及34kD的融合蛋白表达条带。提取细胞总RNA，hCREG RT-PCR引物及扩增反应条件如实施例6。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶分离检测，用EB染色显影。人VSMC的裂解产物，可检测到大小约为350bp的hCREG cDNA表达条带。提取细胞miRNA，提取的产物经2%的琼脂糖凝胶分离检测，用EB染色显影。在人VSMC细胞的裂解产物中，可检测到大小约为20bp的microRNA表达条带。miRNA cDNA的合成及荧光定量PCR方法如实施例4，检测完成后所得到的CT值，用2-ΔΔCT进行计算。（结果见图2）

结果显示，miR-31在分化型VSMC中表达减少，在合成型VSMC中表达增多，hCREG的表达与miR-31的表达负性相关。提示miR-31与hCREG的表达以及VSMC的表型转化密切相关。

实施例4．人VSMC细胞及人HEK293细胞中microRNA的提取和检测

通过离心收集107左右数量的转染有miR-31模拟物或抑制剂，或者转染有与该实验无关的miRNA阳性对照—miR-140模拟物或抑制剂的人VSMC细胞及人HEK293细胞，加入300μl ML缓冲液，上下吹吸几次后，将溶解的细胞注入有紫色环过滤柱的2mL、有盖的离心管（德国Macherey Nagel公司）中，11000转，4℃离心1分钟。离心后，收集过滤液上层清液，转移至1.5mL离心管中，丢弃紫色过滤柱，给离心管中加入150μl无水乙醇,快速震荡5秒，在20-25℃室温开盖孵育5分钟。在有蓝色环过滤柱的2mL有盖的离心管中，加入带沉淀的样本，14000转，4℃离心1分钟，弃掉蓝色过滤柱，保留过滤液。加入300μl MP试剂至过滤液中，快速震荡5秒，11000转，4℃离心3分钟。吸取上清液加入有白色环过滤柱的2mL有盖的离心管中，11000转，4℃离心1分钟，丢弃过滤柱，保留过滤液。给过滤液中加入800μl MX试剂，快速震荡5秒。在有绿色环过滤柱的2mL无盖的收集管中，加入725μl样本，11000转，4℃离心30秒，丢弃过滤液，保留绿色环过滤柱，重复此步骤直至样本滤完。在过滤柱中加入600μl MW1试剂，11000转，4℃离心30秒，丢弃过滤液，放置在原离心管上。在过滤柱中加入700μl MW2试剂，11000转，4℃离心30秒，丢弃过滤液，将过滤柱放置在原离心管上。在过滤柱中加入250μlMW2试剂，11000转，4℃离心2分钟，丢弃过滤液，完全干燥滤过膜。将绿色环过滤柱放入新的2mL有盖离心管中，加入30μl的RNase-freeH₂O，室温放置1分钟，11000转，4℃离心30秒，保留过滤液，提取完成。

提取的产物经2%的琼脂糖凝胶分离检测，用EB染色显影。在人VSMC和人HEK293细胞的裂解产物中，可检测到大小约为20bp的microRNA表达条带。

将提取的microRNA合成cDNA（Qiagen公司的cDNA第一链合成试剂盒），其反应体系和反应条件如下。

具体条件：

37°C60分钟

95°C5分钟

合成cDNA后，应用荧光定量PCR方法和ABI7300系统，通过下列反应体系和反应条件进行扩增和检测：

95℃15分钟

94℃15秒；55℃30秒；70℃34秒40个循环

60℃1分钟

检测完成后所得到的CT值，用2^-ΔΔCT进行计算。结果显示，在人VSMC和HEK293细胞中，转染miR-31模拟物后，miR-31的表达明显升高，而转染miR-31抑制物后，miR-31的表达明显受到抑制，而转染miR-140模拟物和抑制剂后，miR-31的表达不发生明显变化。组间比较均有统计学差异（P<0.05）（见图3A～D及图4D）。

以上实验结果表明，miR-31模拟物可使miR-31的表达升高，同时miR-31抑制剂可使miR-31表达减少。

实施例5.microRNA模拟物（miRNA Mimics）和microRNA靶点保护剂（miScript Target Protector）对稳定转染pEZX-MT01hCREG3’-UTR表达载体的人HEK293细胞的转染及其双荧光报告基因的检测

应用HiPerFect转染试剂将miR-31模拟物和靶点保护剂转染至稳定转染pEZX-MT01hCREG3’-UTR表达载体的人HEK293细胞中。转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺至24孔板（含10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培养基中），分别设为空白对照组、转染对照组、miR-31模拟物转染组、microRNA靶点保护剂转染组、miR-31模拟物和miR-31靶点保护剂共转染组（共5组），37°C，5％的CO₂中培养，使其在转染日密度达到90%。转染前，人HEK293细胞每孔细胞换为500μl含血清不含抗生素的DMEM培养基。转染所需试剂配制及操作过程如下：

①

②

③

④

在每个玻璃试管中加入以上转染溶液，涡旋混匀，放置5-10分钟后，将转染溶液轻滴于每孔细胞中，每孔大约滴加100μl。人HEK293细胞转染12小时后，弃掉每孔培养基，加入2mL含10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培养基。37°C，5％的CO₂中培养36小时后，进行双荧光报告基因的检测（见图4E）。

在24孔板的每孔中添加100μl的1×PLB裂解液，室温轻摇15分钟后，将PLB溶解物转移至新的试管中。用白色不透明的96孔板，按分组每孔添加20μl PLB溶解物，再加入100μl LARII试剂，5-10秒后，放入荧光酶标仪中检测荧光活性，检测完后取出96孔板，每孔中加入100μlStop&Glo试剂，在终止萤火虫荧光素酶反应的同时，激活海肾荧光素酶的活性，再放入荧光酶标仪中检测荧光活性。

结果显示，空白对照组、转染对照组与microRNA靶点保护剂转染组相比无明显差异，miR-31模拟物转染组与空白组相比较，荧光活性明显降低，miRNA模拟物和microRNA靶点保护剂共转染组与miR-31模拟物转染组相比，荧光活性明显回升。组间比较均有统计学差异（P<0.05）（见图4E）。

以上实验结果表明，miR-31可直接结合在其靶基因hCREG的3’-UTR区并抑制其表达。

实施例6.microRNA模拟物（miRNA Mimics）和抑制剂（miRNAInhibitors）对人VSMCs的转染及其hCREG和VSMC表型转化标记物表达的检测

应用HiPerFect转染试剂（HiPerFect Transfection Reagent）将miR-31模拟物和抑制剂转染至VSMC中。转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺至6孔板及铺有玻璃片的6孔板中（含10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培养基中），分别设为空白对照组、转染对照组、miR-31模拟物转染组和miR-31抑制物s转染组（共4组），37°C，5％的CO2中培养，使其在转染日密度达到90%。转染前，人VSMC每孔细胞换为400μl含10%胎牛血清不含抗生素的DMEM培养基。转染所需试剂配制及操作过程如下：

①

②

③

在每个玻璃试管中加入以上转染溶液，涡旋混匀，放置5-10分钟后，将转染溶液轻滴于每孔细胞中，每孔大约滴加400-450μl。人VSMC转染3小时后，每孔中加入含10%胎牛血清和抗生素的DMEM培养基1600μl。37°C，5%CO₂转染9小时后，弃掉每孔培养基，加入2mL含10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培养基。37°C，5％的CO₂中培养36小时后，收取细胞和铺有细胞的玻璃片。

蛋白的提取和检测：给收取的细胞中加入蛋白裂解液100μl（含蛋白酶抑制剂2μl），提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE后，分别以1：1000Anti-SMα-actin1：2000Anti-hCREG单克隆抗体（美国Santa cruz公司）作为一抗，以辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠抗体（中杉公司）作为二抗行Western blot检测，用ECL试剂盒（Amersham公司）发光显影。人VSMC裂解产物，用hCREG抗体、SMα-actin抗体可分别检测到大小约为38kD、42kD及34kD的融合蛋白表达条带。结果显示空白对照组与转染对照组的蛋白表达无差异，miR-31模拟物转染组与空白对照组相比，hCREG蛋白和SMα-actin蛋白的表达明显减少，miR-31抑制物转染组与空白对照组相比，hCREG蛋白、SMα-actin蛋白的表达明显增多（见图4A和图3E）。组间比较均有统计学差异（P<0.05）。

RNA的提取和检测：将收取的细胞中加入Trizol裂解液，提取细胞总RNA，根据GenBank（NM003851）登录的hCREG基因cDNA序列中的开放阅读框，设计并合成的hCREG RT-PCR引物如下：

上游引物为：5’-TTCGCCGACG TCCTCTCGCT-3’（SEQ IDNO：4）；Tm=66℃

下游引物为：5’-CCACCAAAGT AGTCCAGGAC-3’（SEQ IDNO：5）；Tm=62°C

将提取的RNA合成cDNA后，通过下列反应体系和反应条件扩增出hCREG cDNA编码序列共350个碱基。

具体条件：

95℃3分钟

94℃30秒；68℃90秒35个循环

72℃10分钟

扩增产物经1%的琼脂糖凝胶分离检测，用EB染色显影。人VSMC的裂解产物，可检测到大小约为350bp的cDNA表达条带。结果显示空白对照组与转染对照组cDNA表达无差异，miR-31模拟物转染组与空白对照组相比，hCREG cDNA的表达明显减少，miR-31抑制物转染组与空白对照组相比，hCREG cDNA表达明显增多。组间比较均有统计学差异（P<0.05）（见图4B）。

细胞的免疫荧光染色：将铺于玻璃片上的VSMC细胞用4%的多聚甲醛固定1小时，再用10%的马血清封闭2小时，分别以1：1000Anti-SMα-actin、1：2000Anti-hCREG单克隆抗体（美国Santa cruz公司）作为一抗，以1:300荧光标记羊抗小鼠抗体或兔抗羊抗体(美国Invitrogen公司)作为二抗行免疫荧光染色，用DAPI染细胞核。人VSMC用SMα-actin抗体、hCREG抗体及DAPI可分别检测到红色、绿色和蓝色的荧光表达。结果显示空白对照组与转染对照组的蛋白表达无差异，miR-31模拟物转染组与空白对照组相比，SMα-actin蛋白、hCREG蛋白的表达明显减少，miR-31抑制物转染组与空白对照组相比，SMα-actin蛋白、hCREG蛋白的表达明显增多（见图4C）

以上实验结果表明，miR-31可调控人VSMCs的表型转化，并且对hCREG蛋白的表达也有调节作用。

实施例7.miR-31抑制剂（miRNA Inhibitors）的转染及对hCREG和VSMC表型转化标记物表达调控作用的检测

为了进一步验证miR-31是否通过靶基因hCREG调控VSMC的表型转化，我们应用Lipofectamine2000将hCREG sh-RNA转染至人VSMC中，构建hCREG低表达模型，分别设为空白对照组、转染对照组（shcontrol）、hCREG低表达组（sh-CREG组），共3组。转染方法参考文献（Y.Han,J Mol Cell Cardiol,2010;48(6):1225-1235）。再用HiPerFect转染试剂将miR-31抑制剂转染至以上各组细胞中，分别设为空白对照组、miR-31抑制剂转染组，sh control+miR-31抑制剂转染组、sh-CREG+miR-31抑制剂转染组，共4组，转染方法参照实施例6。提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE后，用hCREG抗体、SMα-actin抗体可分别检测到大小约为38kD和42kD的融合蛋白表达条带。（结果见图5A和B）

结果显示，与空白组相比较，sh-CREG组中hCREG蛋白的表达明显减少；与miR-31抑制剂转染组相比较，sh-CREG+miR-31抑制剂转染组中VSMC表型转化标记物SMα-actin蛋白的表达明显减少，说明hCREG表达减少后，miR-31抑制剂对VSMC表型转化标记物的调节作用明显下降。提示miR-31对VSMC表型转化的调控主要是通过其靶基因hCREG发挥作用的。

实施例8．临床药物洗脱支架术后再狭窄病人血清microRNA的提取和检测

为了进一步验证miR-31与VSMC增殖性疾病的关系，收集年龄性别匹配的37例正常人血清（正常人组）、31例药物洗脱支架术后未再狭窄病人血清（冠心病组）及32例药物洗脱支架术后再狭窄病人血清（再狭窄组）（参见表1），提取microRNA。收集200μl血清，加入1mL QIAzol裂解液，上下吹吸数次，室温放置5分钟。加入200μl三氯甲烷，剧烈震荡15秒，室温放置2-3分钟，12000转，4℃离心15分钟。离心后液体分为三层，吸取上层清液置入新的离心管中，加入900μl的无水乙醇，上下吹吸几次后，将700μl液体加入2mL带过滤住的离心管中，10000转，离心15秒，丢弃过滤液，重复此步骤直至滤完。向过滤柱上加入700μl的RWT试剂，10000转，离心15秒，丢弃过滤液。过滤柱上再加入500μl的RPE试剂，10000转，离心15秒，丢弃过滤液，此步骤重复一遍。放置过滤柱于RNase-free的2mL无盖离心管上方，13000转，离心2分钟，丢弃过滤液。放置过滤柱于RNase-free的1.5mL有盖离心管上方，加入30μl RNase-free H₂O，10000转，离心1分钟，保留过滤液。

提取的产物用分光光度剂进行检测，可检测到大小约为20μg/mL浓度的RNA含量。血清中microRNA cDNA的合成和检测方法与细胞的检测方法相同（结果见图6）。

结果显示，药物洗脱支架术后再狭窄病人血清中miR-31的表达明显高于未再狭窄组，组间比较均有统计学差异（P<0.05）。提示miR-31抑制剂有可能用于制备对PCI术后再狭窄具有抑制作用的药物及其器械（如将该药物包被于冠状动脉支架表面从而抑制内膜增生导致的再狭窄）。

表1.病人临床基本数据资料

BMI为身高体重指数。

1研究人群由63名冠心病病人与其性别年龄匹配的37名正常人组成，比较发现两组之间的甘油三酯及空腹血糖指标有统计学差异，其余指标无统计学差异。

2再将63名冠心病病人分为32名再狭窄病人和31名未再狭窄病人进行分析，比较发现再狭窄组与未再狭窄组之间甘油三酯、空腹血糖及其他指标均无差异统计学。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.MiR-31的抑制剂用于制备预防或治疗血管损伤后再狭窄的药物或产品的用途，用于制备治疗血管损伤的药物或产品的用途，用于制备预防或治疗动脉粥样硬化的药物或经皮冠状动脉介入治疗前/后的辅助药物的用途，用于制备抑制血管平滑肌细胞增殖和/或迁移的药物或产品的用途，或者用于制备抑制血管损伤引起的血管平滑肌细胞表型转化的药物或产品的用途。

2.权利要求1的用途，其中所述的血管损伤为动脉粥样硬化介入治疗、移植后动脉病或肺动脉高压引起的血管损伤。

3.组合物，其含有miR-31的抑制剂，所述组合物用于预防或治疗血管损伤后再狭窄，用于预防或治疗血管损伤，用于治疗动脉粥样硬化，或者用于经皮冠状动脉介入治疗前/后的辅助治疗。

4.权利要求3的组合物，其中所述的血管损伤为动脉粥样硬化介入治疗、移植后动脉病或肺动脉高压引起的血管损伤。

5.动脉支架，其包被有miR-31的抑制剂。

6.权利要求5的动脉支架，所述动脉支架可用于预防或治疗血管损伤后的再狭窄，优选地，其中所述的血管损伤为动脉粥样硬化介入治疗、移植后动脉病或肺动脉高压引起的血管损伤。

7.MiR-31用于下调细胞（离体的或在体的）中E1A激活基因阻遏子蛋白（hCREG）、α平滑肌肌动蛋白或调宁蛋白表达水平的用途，或者用于促进细胞（离体的或在体的）由分化表型向去分化表型转化的用途。

8.MiR-31的抑制剂用于上调细胞（离体的或在体的）中E1A激活基因阻遏子蛋白（hCREG）、α平滑肌肌动蛋白或调宁蛋白表达水平的用途，用于促进细胞（离体的或在体的）由去分化表型向分化表型转化的用途，或者在制备用于上调细胞（离体的或在体的）中E1A激活基因阻遏子蛋白（hCREG）、α平滑肌肌动蛋白或调宁蛋白表达水平、促进细胞（离体的或在体的）由去分化表型向分化表型转化的制剂中的用途。

9.检测miR-31或其抑制剂表达水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断血管损伤后的再狭窄和血管平滑肌细胞增生性的血管疾病。

10.试剂盒，所述试剂盒包括检测miR-31或其抑制剂表达水平的试剂，所述试剂盒用于诊断血管损伤后的再狭窄和血管平滑肌细胞增生性的血管疾病。

11.筛选用于预防或治疗血管损伤后再狭窄的药物的方法，所述方法包括筛选miR-31的抑制剂的步骤；优选地，所述方法包括根据miR-31设计其反义RNA，或者将miR-31与候选物质接触，检测miR-31的表达，并选择特异抑制miR-31表达的候选物质。

12.根据权利要求1-2、7-9任一项的用途、权利要求3或4的组合物、权利要求5或6的动脉支架、权利要求9的方法、权利要求10的试剂盒，其中所述的miR-31的抑制剂可以是能够特异抑制miR-31对靶基因的调控作用的任何物质,可以是在细胞中特异抑制miR-31表达的物质，也可以是与miR-31具有特异性相互作用，例如与miR-31特异性结合的物质,或者特异抑制miR-31与DICER或RISC的相互作用的物质。