CN104777213A - 肌动蛋白结合蛋白2筛选平滑肌功能障碍疾病治疗药物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉药物研发领域，具体公开了一种肌动蛋白结合蛋白2在筛选平滑肌功能障碍疾病治疗药物中的用途。本发明以Transgelin2作为药物作用的靶蛋白，设计并初步筛选出22个可能的小分子化合物，然后通过进一步的细胞实验从中筛选出2个确实具有舒张气道平滑肌功能的小分子药物，可用于气道平滑肌舒张药物的制备；为将Transgelin2蛋白用于平滑肌功能障碍可能引起的包括血管平滑肌痉挛性疾病、肠管平滑肌痉挛性疾病、气管平滑肌痉挛性疾病，以及内分泌疾病在内的多种疾病的治疗提供指导和参考。

Description

肌动蛋白结合蛋白2筛选平滑肌功能障碍疾病治疗药物的用途

技术领域

本发明涉及药物研发领域，具体公开了一种肌动蛋白结合蛋白2筛选平滑肌功能障碍疾病治疗药物的新用途。

背景技术

肌动蛋白结合蛋白2(Transgelin2,SM22-Alpha Homolog)于1998年首次被发现，其基因定位于染色体1q21-q25，但到目前为止，该蛋白功能及作用机制还不清楚。Transgelin2蛋白表达定位在细胞膜、肌动蛋白微丝、胞浆等部位，含1个钙调蛋白同源结构域(calponinhomolog domain)，可以和细胞骨架蛋白等结合。现有文献提示该蛋白与平滑肌细胞形态和B细胞免疫功能相关，且可能是结肠直肠癌等肿瘤标志物。

MT-2(Metallothionein，MT)是金属硫蛋白家族中重要成员之一，主要生理特性表现为金属离子结合性和还原性，能与锌、铜、铁、镉等二价离子可逆性结合以维持体内金属离子平衡，也可通过巯基(-SH)与机体氧自由基结合，具有较强还原性。MT-2还参与细胞增殖、凋亡、分化等生物学过程，并和癌症、呼吸及神经系统等疾病密切相关。

然而，尚无对MT-2蛋白与Transgelin2蛋白之间的关系，以及Transgelin2参与哮喘治疗药物研发相关的研究。

发明内容

本发明的目的在于公开一种筛选平滑肌功能障碍疾病治疗药物的新方法，为以肌动蛋白结合蛋白2（Transgelin2，SM22-Alpha Homolog）为筛选药物的靶点，为平滑肌功能障碍疾病的治疗和药物筛选提供一条便捷的途径。

本发明第一方面公开了肌动蛋白结合蛋白2（Transgelin2）在筛选平滑肌功能障碍疾病治疗药物中的用途。

本发明所述的平滑肌功能包括平滑肌的舒张与收缩。

所述平滑肌功能障碍疾病治疗药物包括：核酸、碳水化合物、脂类、小分子、多肽或蛋白。

所述核酸包括：反义寡核苷酸、双链RNA（dsRNA）、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA（esiRNA）或者短发夹RNA（shRNA）。

进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA（siRNA）。

优选的，所述肌动蛋白结合蛋白2作为药物作用于平滑肌细胞表面的受体，用来筛选平滑肌功能障碍疾病治疗药物。

更优的，所述平滑肌功能障碍疾病治疗药物包括心血管疾病治疗药物，高血压及高血压带来的脑卒中、心绞痛、心肌梗死、心力衰竭、肾功能衰竭等合并症治疗药物，脑缺血性疾病治疗药物，心肌缺血性疾病治疗药物，肾功能低下和外周血管痉挛性疾病治疗药物，胃肠痉挛性绞痛治疗药物，肠易激综合症治疗药物及肠易激综合症引起的胃肠功能紊乱治疗药物，舒张气道平滑肌药物，气道重塑治疗药物，泌尿生殖道肾绞痛治疗药物，膀胱刺激症治疗药物等。

进一步的，所述平滑肌为气道平滑肌。

优选的，所述用途为肌动蛋白结合蛋白2在筛选舒张气道平滑肌的疾病治疗药物中的用途。例如，可用于基于舒张气道平滑肌的哮喘疾病治疗药物的筛选。

以肌动蛋白结合蛋白2作为药物作用于气道平滑肌细胞的受体，参考肌动蛋白结合蛋白2的三级结构，本发明设计了22种可能的小分子化合物，并最终从设计出的22个可能的化合物中筛选得到异槲皮素和芹甙元-7-葡萄糖苷两种物质，对平滑肌细胞具有实际意义的舒张作用，可用于哮喘的治疗。

肌动蛋白结合蛋白2的基因定位于染色体1q21-q25，该蛋白是一种已知蛋白，但其功能及作用机制还不清楚。Transgelin2蛋白表达定位在细胞膜、肌动蛋白微丝、胞浆等部位，含1个钙调蛋白同源结构域(calponin homolog domain)，可以和细胞骨架蛋白等结合。现有文献提示该蛋白与平滑肌细胞形态和B细胞免疫功能相关，且可能是结肠直肠癌等肿瘤标志物。

平滑肌广泛分布于人体消化道、呼吸道以及血管和泌尿、生殖等系统，平滑肌功能障碍可引起包括血管平滑肌痉挛性疾病、肠管平滑肌痉挛性疾病、气管平滑肌痉挛性疾病，以及内分泌疾病在内的多种疾病。本发明通过研究发现了Transgelin2筛选哮喘治疗药物的新用途：肌动蛋白结合蛋白2可以作为药物作用于气道平滑肌细胞的受体，筛选出能够舒张气道平滑肌、降低哮喘模型大鼠的气道阻力、改善肺顺应性，和/或治疗气道重塑的药物；一方面，该发现为哮喘治疗药物的研发提供了新的途径，另一方面，也为心血管疾病，高血压及高血压带来的脑卒中、心绞痛、心肌梗死、心力衰竭、肾功能衰竭等合并症，由血管痉挛引起的脑缺血性疾病，心肌缺血性疾病，由肾血管痉挛引起的肾功能低下和外周血管痉挛性疾病，胃肠痉挛性绞痛，肠易激综合症及肠易激综合症引起的胃肠功能紊乱，哮喘，泌尿生殖道肾绞痛及膀胱刺激症等平滑肌功能障碍疾病的治疗具有指导意义和参考价值。

本发明第二方面公开了一种筛选平滑肌功能障碍疾病治疗药物的方法，包括以肌动蛋白结合蛋白2（Transgelin2）作为药物作用靶点来筛选药物。

优选的，所述平滑肌功能障碍疾病治疗药物为舒张气道平滑肌的药物。

更优选的，所述平滑肌功能障碍疾病治疗药物为哮喘疾病治疗药物。

所述平滑肌功能障碍疾病治疗药物包括：核酸药物、碳水化合物药物、脂类药物、小分子药物、多肽药物或蛋白药物。

优选的，所述平滑肌功能障碍疾病治疗药物能与异槲皮素或芹甙元-7-葡萄糖苷竞争性地结合肌动蛋白结合蛋白2。

以小分子药物举例来说，大多数药物是通过干涉细胞中的酶或受体的功能来实现其要药效的，酶或受体都是蛋白质，在它们的表面有很多可被小分子占住的空位，当小分子如同锁的钥匙一样结合在酶或受体上的空位时，这些小分子即称配体。当一种药物与配体具有相同或相似的形状，则这种药物便可以结合到酶或受体上，结合药物酶或受体将向细胞发送一个信号，使细胞发生一系列的生理反应。结合药物的酶或受体即为药物作用的直接靶点(靶蛋白)。

本发明第三方面公开了异槲皮素在制备舒张气道平滑肌药物中的用途；以及芹甙元-7-葡萄糖苷在制备舒张气道平滑肌药物中的用途。

本发明还公开了一种舒张气道平滑肌药物，含有异槲皮素或芹甙元-7-葡萄糖苷。

优选的，所述异槲皮素或芹甙元-7-葡萄糖苷为舒张气道平滑肌药物的唯一有效量成分。

优选的，所述药物制剂还含有药学上可接受的载体。

药学上可接受的载体为各种药学上常用的辅料和/或赋形剂，包括(但不限于)糖类（如乳糖、葡萄糖和蔗糖），淀粉（如玉米淀粉和土豆淀粉），纤维素及其衍生物（如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素），黄蓍胶粉末，麦芽，明胶，滑石，固体润滑剂（如硬脂酸和硬脂酸镁），硫酸钙，植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油，多元醇（如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇），海藻酸，乳化剂（如Tween、聚氧乙烯蓖麻油），润湿剂（如月桂基硫酸钠），着色剂，调味剂，压片剂、稳定剂，抗氧化剂，防腐剂，无热原水，等渗盐溶液和磷酸盐缓冲液等；该载体可根据需要提高配方的稳定性、活性及生物有效性等。

本发明的舒张气道平滑肌药物可以按照药剂学上的通用方法制成任何常规的制剂形式。

较优的，本发明所述舒张气道平滑肌药物为针剂或气雾剂。

本发明含有异槲皮素或芹甙元-7-葡萄糖苷的舒张气道平滑肌药物可以通过吸入、经鼻、静脉内、口服、皮下、肌肉内或经皮途径施用。

优选的，所述舒张气道平滑肌药物为哮喘疾病治疗药物。

本发明最后一方面公开了一种舒张气道平滑肌的方法，包括对患者施用异槲皮素或芹甙元-7-葡萄糖苷。

较优的，异槲皮素或芹甙元-7-葡萄糖苷作用于患者的气道平滑肌。

较优的，所述施用的方式包括吸入、口服或注射。

较优的，所述施用的方式为将异槲皮素或芹甙元-7-葡萄糖苷通过气雾剂递送至患者。

本发明揭示了Transgelin2蛋白的新功能，本发明通过Transgelin2的配体金属硫蛋白MT-2发现了Transgelin2可作为药物作用于气道平滑肌细胞的受体，筛选平滑肌功能障碍疾病治疗药物的新功能。本发明以Transgelin2作为药物作用的靶蛋白，设计并初步筛选出22个可能的小分子化合物，然后通过进一步的细胞实验从中筛选出2个确实具有舒张气道平滑肌的小分子药物，可用于气管平滑肌痉挛性疾病例如哮喘疾病的治疗以及哮喘治疗药物的制备。可见，以Transgelin2蛋白筛选平滑肌功能障碍疾病治疗药物，具有筛选切实有效、筛选效率高的优点；为将Transgelin2蛋白用于平滑肌功能障碍可能引起的包括血管平滑肌痉挛性疾病、肠管平滑肌痉挛性疾病、气管平滑肌痉挛性疾病，以及内分泌疾病在内的多种疾病的治疗提供指导和参考。

附图说明

图1：RNAi沉默后Transgelin2蛋白的western blot验证结果图

图2：Pull down实验的western blot结果

图3：Transgelin2蛋白条带质谱图

图4：Enolase1蛋白条带质谱图

图5：不同浓度MT-2蛋白特异性结合曲线和Scatchard受体放射分析(n=3)

图6：不同浓度MT-2蛋白对RNAi转染4天平滑肌细胞特异性结合曲线

图7：不同抗体和蛋白孵育后MT-2碘标记蛋白特异性结合百分比图

图8：细胞轴长变化结果

图9：大鼠气管平滑肌细胞细胞指数（cell index）的变化

:具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

实施例1Transgelin2蛋白及其特异性配体MT-2蛋白相互作用的检测

1.实验材料

1.1带有His标签的MT-2蛋白

按照NCBI组织分布信息，选择正常大鼠肺组织，异硫氰酸胍一步法抽提总RNA，AMV逆转录酶合成cDNA，作为MT-2基因PCR扩增模板，在DNA taq酶的作用下进行PCR扩增（扩增引物见表1，扩增产物序列如SEQ ID NO:2所示），PCR扩增程序为：94℃预变性5min后，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，共进行35个循环，最后72℃延伸5min。

扩增产物经EcoR I酶和Xho I酶酶切后，T4DNA连接酶连接到pET32a载体的相应酶切位点，获得重组载体，测序检测正确的重组载体经42℃热激转化至BL21(DE3)感受态细胞。在37℃利用1mM IPTG(终浓度)诱导表达获得MT-2重组蛋白。采用肠激酶处理MT-2融合蛋白，并利用S-TAG亲和层析和阴离子交换树脂纯化方法，获得带有His标签的MT-2蛋白。

表1引物序列

1.2Transgelin2低表达气管平滑肌细胞

利用RNA干扰技术，将transgelin2表达降低，获得Transgelin2低表达气管平滑肌细胞；其中RNA干扰的具体方法如下：

1)转染前一天，以合适的气管平滑肌细胞密度接种到6孔培养板上。转染时，细胞要达到80%融合；

2)按照siRNA（表2所示）和fugene（购自美国普洛麦格公司）转染试剂以3：1比例混合，室温孵育15min后加入要转染的细胞中；

3)转染6h后换成完全培养基，转染后4天提取蛋白检测transgelin2蛋白表达，发现transgelin2蛋白表达量降为原先的5%，RNA干扰后的western blot结果见图1。

表2RNA干扰序列

2.实验方法及分析

2.1His pull-down实验

将含有His标签的MT-2重组蛋白和大鼠气管平滑肌细胞裂解液混合孵育24h后(4℃，置冰上)，加入Ni-NTA琼脂糖凝胶，充分孵育后5000rpm离心10min，弃上清。加入不同浓度咪唑溶液，充分孵育后5000rpm离心10min，保留上清。取各组上清同时进行非变性胶电泳和western blot鉴定，western blot结果见图2；根据western blot结果切取相应胶上的条带进行质谱鉴定，结果发现pulldown两条条带，经质谱鉴定，一条是transgelin2(肌动蛋白结合蛋白2，蛋白编码序列参考genebank编号Gene ID:304983)，另一条为Enolase1(磷酸丙酮酸水合酶-1)，质谱结果见图3-4。

2.2特异性结合实验

利用同位素法和scatchard分析方法观察细胞内配体MT-2蛋白对Transgelin2正常表达和低表达气管平滑肌细胞结合改变，具体方法如下：

1）正常气管平滑肌细胞

利用碘125标记MT-2蛋白后，向铺有正常气管平滑肌细胞的六孔板中依次加入终浓度为2nM-160nM标记的MT-2蛋白，孵育15min，用PBS洗两次，每次1ml。再用600μl胰酶消化，15min后用600μl DMED中和，取1ml细胞悬液检测γ射线强度。利用常规scatchard分析方法计算平衡解离常数和最大结合量。

实验结果见图5，该结果证明MT-2蛋白在大鼠气管平滑肌细胞表面存在单一受体，其平衡解离常数Kd值为33.4nM，最大结合值Bmax为110pM，每个细胞表面结合位点数为6.6×10⁵。

2）低表达气管平滑肌细胞

利用RNAi（SEQ ID NO：5-6）转染4天的Transgelin2低表达平滑肌细胞同样进行上述MT-2放射受体分析（transgelin2蛋白表达量降为原先的5%)，结合曲线见图6，共9个点，拟合曲线R²=0.9239。Scatchard受体放射分析MT-2对RNAi转染4天平滑肌细胞平衡解离常数Kd值仍为33.4nM，但Bmax下降为23.3nM（共6个点，Scatchard方程R²=0.8078）。

但同样利用siRNA的方法检测enolase1表达下降细胞时，发现Kd值和最大结合量没有改变。

根据前期质谱结果，利用不同抗体拮抗后（包括未标记MT-2蛋白、Transgelin2抗体、Enolase1抗体、D2DR抗体、及BSA蛋白，其中transgelin2抗体购自Proteintech Group公司，enolase1抗体购自cell signaling technology公司，D2DR抗体购自santa cruz公司），再检测MT-2碘125标记蛋白和细胞表面受体特异性结合情况，从而初步验证可能的受体。具体方法为：选取未标记MT-2蛋白，Transgelin2抗体、Enolase1抗体、以及D2DR抗体，向铺有大鼠气管平滑肌细胞的培养皿上清中加入浓度分别为10nM，20nM，50nM的上述因子，孵育5min后，加入碘125标记的MT-2蛋白，按照前述标注受体放射分析，检测MT-2碘125标记蛋白和细胞表面受体特异性结合情况。结果如图7所示，经未标记碘125的MT-2蛋白和transgelin2抗体分别孵育拮抗后，MT-2碘125标记蛋白特异性结合CPM值均明显下降，在本实验体系内，最大降幅分别为空白对照组的72.8%和69.9%。D2DR抗体孵育拮抗后，MT-2碘125标记蛋白特异性结合CPM值没有显著性改变。

综合上述结果可知，MT-2在大鼠气管平滑肌细胞表面受体为Transgelin2蛋白

实施例2细胞内配体MT-2蛋白对Transgelin2低表达气管平滑肌细胞收缩舒张效应的影响

1.实验方法

将Transgelin2低表达气管平滑肌细胞悬液加入特制玻璃底的培养皿，等细胞贴壁后在培养上清中添加不同浓度MT-2蛋白（0、100、200和400ng/ml），利用奥林巴斯xcellence活细胞工作站偏正光立体成像方法，观察10min前后视野中30个细胞轴长改变（轴长改变=干预后轴长－干预前轴长，单位为μm），实验结果见图8。

将Transgelin2低表达气管平滑肌细胞悬液加入xCELLigence实时细胞分析仪，待细胞贴壁后在培养上清中添加不同浓度MT-2蛋白（0、100、200、400ng/ml），和不同观察试剂：400ng/ml特布他林（TB），400ng/ml氢化可的松（HC），孵育30min，再加入20μM Ach刺激，记录10min前后大鼠气管平滑肌细胞细胞指数（cell index）的变化，实验结果见图9。

将大鼠气管平滑肌细胞悬液加入3%鼠尾胶原蛋白中，待细胞-胶原复合物形成后，加入不同浓度MT-2蛋白（0、100、200和400ng/ml）孵育，ImageJ软件观察收缩启动后4h，8h，24h等不同时间点细胞-胶原复合物面积改变，计算实验组（MT-2蛋白添加量100、200、400ng/ml）收缩比例对比control组（MT-2蛋白添加量为0）收缩比例的比值（实验组与control组收缩比例的比值=实验组收缩比例/control组收缩比例），实验结果见表3。

表3实验组与control组收缩比例的比值结果

2.实验结果分析：

（1）对比正常气管平滑肌细胞和Transgelin2低表达气管平滑肌细胞发现MT-2蛋白对transgelin2低表达细胞舒张效应降低，且没有呈现剂量依赖关系，仅100ng/ml组出现舒张效应，舒张最大差值也下降为正常细胞组同浓度的1/4倍(100ng/ml组的1.6微米对比正常细胞组的6.2μm)，结果见图8。

（2）对于Transgelin2低表达细胞，各组加入乙酰胆碱后，10min内差值变化如下。提示30min孵育100、200、400ng/ml MT-2蛋白，400ng/ml TB，400ng/ml HC不能显著降低Ach引起的收缩效应。对比正常ASM细胞，数据提示，MT-2蛋白对Transgelin2低表达细胞的抑制效应显著降低。具体结果见图9。

（3）正常ASM经100、200、400ng/ml MT-2蛋白孵育30min后，细胞-胶原复合物收缩有显著变慢趋势，其中4h时间点，control组和200，400ng/ml MT-2相比有统计学差别，P<0.05；8h时间点，control组和400ng/ml MT-2相比有统计学差别，P<0.05；24h时间点，control组和400ng/ml MT-2相比有统计学差别，P<0.05。而Transgelin2低表达气管平滑肌细胞加入200，400ng/ml MT-2孵育后，各时间点收缩比例对比control组，无显著性改变。具体数据见表3。

实施例3Transgelin2筛选哮喘治疗药物的用途研究

本实施例的目的在于以Transgelin2蛋白为药物作用于气道平滑肌细胞表面的受体，设计针对该靶蛋白的小分子药物，并从中筛选出有效的哮喘治疗药物。

1.实验方法

1）小分子化合物的设计

以Transgelin2蛋白三维结构为基础(PDB号码：1WYM)，以Transgelin2抗体（ProteintechGroup公司）序列（a46-a63,QPGRENFQNWLKDGTVLC，共18个氨基酸，SEQ ID NO：1）作为主要目标位点，进行基于分子对接的小分子虚拟筛选。虚拟筛选所采用的软件为maestro2010软件(主要模块包括glide模块，ligperp,protein preparation wizard等)，小分子的准备参数（默认参数）：质子化的时候ph控制在5-9；使用epik立场；立体构型：选择的是Retainspecified chiralities(vary from3D structure)；设定边长30A的盒子，采用SP的方法对接，取排名前1500个分子改用XP的方法对接，选取打分好于-6的分子，最终初步获得22个可能的作用小分子。

2）化合物的筛选

利用罗氏实时细胞分析系统（xCELLigence RTCA DP,Roche），测试筛选出的22个可能的小分子化合物对气管平滑肌电阻值的影响，从而推断化合物对细胞的收缩舒张效应。

具体实验方法如下：

1)将3000个平滑肌细胞分布至含电极的测试小孔中，过夜让细胞贴壁；

2)待系统细胞指数至1.0，加入0.1、1、10、50和100um(终浓度)的各小分子化合物，孵育30min；以PBS为基线，DMSO作为阴性对照，以特布他林作为阳性对照。

3)再加入20um乙酰胆碱(Ach)刺激10min，并全程记录上述过程中电阻值改变。

2.实验结果

表4小分子化合物对细胞的收缩舒张效应

由上述数据可知，异槲皮素（CAS号为：21637-25-2，分子式为C₂₁H₂₀O₁₂）和芹甙元-7-葡萄糖苷（CAS号为：578-74-5，分子式为C₂₁H₂₀O₁₀）这两种化合物对细胞具有实际意义的舒张作用，具有治疗哮喘的功能。可见，以MT-2的受体蛋白Transgelin2作为药物作用靶点筛选出的22个可能的小分子化合物中，有两种化合物确实具有舒张气道平滑肌的作用，可用作哮喘治疗药物。

Claims (7)

1.肌动蛋白结合蛋白2在筛选平滑肌功能障碍疾病治疗药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肌动蛋白结合蛋白2作为药物作用于平滑肌细胞表面的受体，用来筛选平滑肌功能障碍疾病治疗药物。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述平滑肌功能障碍疾病治疗药物为心血管疾病治疗药物，高血压治疗药物，高血压带来的脑卒中、心绞痛、心肌梗死、心力衰竭、肾功能衰竭合并症治疗药物，脑缺血性疾病治疗药物，心肌缺血性疾病治疗药物，肾功能低下和外周血管痉挛性疾病治疗药物，胃肠痉挛性绞痛治疗药物，肠易激综合症治疗药物，肠易激综合症引起的胃肠功能紊乱治疗药物，舒张气道平滑肌药物，气道重塑治疗药物，泌尿生殖道肾绞痛治疗药物，或者膀胱刺激症治疗药物。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述平滑肌功能障碍疾病治疗药物为舒张气道平滑肌药物。

5.一种筛选平滑肌功能障碍疾病治疗药物的方法，包括以肌动蛋白结合蛋白2作为药物作用靶点来筛选药物。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述平滑肌功能障碍疾病治疗药物为核酸药物、碳水化合物药物、脂类药物、小分子药物、多肽药物或蛋白药物。

7.如权利要求6所述的药物，其特征在于，所述平滑肌功能障碍疾病治疗药物能与异槲皮素或芹甙元-7-葡萄糖苷竞争性地结合肌动蛋白结合蛋白2。