CN110358766A - 一种基于全基因组CRISPR/Cas9文库筛选异种移植抗原基因的方法 - Google Patents

一种基于全基因组CRISPR/Cas9文库筛选异种移植抗原基因的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于全基因组CRISPR/Cas9文库筛选异种移植抗原基因的方法，属动物基因编辑技术领域。基于CRISPR/Cas9基因编辑系统，针对猪基因组范围内的全部基因各设计1‑2条靶向sgRNA，构建sgRNA慢病毒载体随机敲除文库并转染至HEK293T细胞中，收集病毒再转染至猪PK15细胞中，将转入病毒的猪PK15细胞包被到灵长类的胸腺或肾包膜下，或用人血清进行体外培养，分别在不同的时间内回收存活的细胞，再对回收的活细胞建立单细胞DNA文库或进行单细胞培养扩增后提取DNA，再用慢病毒载体上的通用引物扩增含有sgRNA的上述DNA片段，对敲除的单细胞基因位点进行定型，最终确定并查找出相关基因的信息。本发明的实施对猪作为异种器官移植过程中猪细胞表面新抗原的挖掘具有重要的指导意义。

Description

一种基于全基因组CRISPR/Cas9文库筛选异种移植抗原基因 的方法
技术领域
本发明属于动物生物技术领域，具体地说，涉及一种基于全基因组CRISPR/Cas9文库筛选异种移植抗原基因的方法。
背景技术
器官移植作为治疗终末端器官衰竭患者的一种有效途径，在临床上得到了广泛应用。然而，我国目前每年可以实施临床器官移植的数量约为1万例，而等待器官移植的病人则有150万，等待器官移植与可进行器官移植患者的数量比值为150:1，器官短缺的形势依然很严峻。近年来，随着我国心脏病以及糖尿病等疾病患者的大幅增长，使得发展成为终末期肾、心、胰岛等组织器官衰竭的病人正在或将急剧增加，对器官移植需求的压力也将越来越大。而且，从2015年1月1日起，我国已经全面停止使用死囚器官作为移植供体来源，公民去世后自愿器官捐献将成为我国器官移植使用的最终来源，这势必导致器官供体本已日益短缺的形势更加严峻。因此，器官的严重短缺，最终将给病人家庭、社会和国家带来沉重负担，已成为全球性的社会问题，寻找新的供体来源来解决目前器官短缺的难题是当今社会面临的首要问题。目前，异种器官移植被公认为解决全球人类器官供体严重不足的有效途径，更有甚者认为是唯一途径。
谈到异种移植，人们首先都会想到并认为与人类血缘系统最为接近的非人类灵长类是最佳的供体源，但作为临床异种移植供体，非人类灵长类存在诸如伦理问题、高风险交联物种传播感染、性成熟晚、与人类的器官大小不匹配，不易操作等问题。因此，非灵长类并不被认为是异种器官移植的合适供体（Cooper et al., 2002；Yang and Sykes, 2007；Ekser et al., 2012）。猪易于饲养、繁殖快、器官大小与人类相匹配，生理和代谢方面与人类相近，人-猪共患病发生的可能性较小，涉及伦理问题较少，并可通过基因修饰来增强供体器官的匹配性（Vodicka et al., 2005; Lutz et al., 2013）。因此，猪被公认是最适合用作异种移植供体的物种。
目前，针对猪作为异种器官移植过程中存在的生物安全、免疫排斥反应及器官功能障碍的三大共性问题，研究者已利用基因编辑技术和体细胞核移植技术相结合的方法产生了不同基因修饰的克隆猪，在一定程度上克服异种移植物的免疫排斥反应，延长器官移植的存活时间。然而，异种移植过程中仍面临着很多由抗原抗体引起的免疫排斥反应。因猪细胞表面本身携带有大量抗原具有，且大部分抗原还未被检测到（Byrne et al., 2013），对其进行基因编辑修饰较困难。因此，在未知猪抗原信息及数量的前提下，基于CRISPR/Cas9基因编辑系统，通过在猪基因组中构建针对不同基因敲除的sgRNA病毒载体文库，对猪细胞中异种抗原基因进行敲除，利用全基因组测序的方法确定猪细胞表面多种异种移植抗原基因的信息。这将最大限度地挖掘出异种移植过程中猪细胞表面的新抗原，为进一步对抗原基因的编辑和修饰奠定基础。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种基于全基因组CRISPR/Cas9文库筛选异种移植抗原基因的方法，本方法在未知猪抗原信息及数量的前提下，基于CRISPR/Cas9基因编辑系统，通过在猪基因组中构建针对不同基因敲除的sgRNA病毒载体文库，对猪细胞中异种抗原基因进行敲除，利用全基因组测序的方法确定猪细胞表面多种异种移植抗原基因的信息。这将最大限度地挖掘出异种移植过程中猪细胞表面的新抗原，节省抗原的筛选时间和节约经费投入，对开发异种器官移植供体猪抗原基因的修饰具有重大的意义。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于全基因组CRISPR/Cas9文库筛选异种移植抗原基因的方法，具体步骤为：
1）文库的设计
根据NCBI上猪的全基因组序列，基于CRISPR/Cas9基因编辑系统，对猪基因组中各个基
因信息各设计1-2个靶向sgRNA序列，构建sgRNA敲除文库；
2）病毒载体的包被
利用CustomArray芯片合成仪合成Array sgRNA oligo并对其进行纯化，再用PhusionHS
Flex (NEB)引物扩增sgRNA oligo并胶回收目的片段；lenti-CRISPR-GFP载体在限制性内切酶BsmBI（NEB）的作用下酶切后并回收目的酶切载体；在Gibson ligation （NEB）重组酶的作用下，将上述酶切载体与回收片段进行重组，所获得的重组载体再转染至electrocompetent cell（Lucigen）中，再将转化产物涂到羧苄青霉素的平板中，挑取单克隆扩增后提取无内毒素重组质粒，将质粒转染至HEK293T细胞中，60h后收集上清获得病毒载体；
3）病毒载体的转染
将不同的病毒量转染至猪PK15细胞，检测GFP表达量MOI，根据MOI值确定猪PK15细胞最佳的病毒体积，再按最佳病毒体积将病毒载体感染至PK15细胞，48h后，观察细胞GFP的表达率，并进一步确定病毒感染滴度；
4）文库的筛选
将病毒载体感染的PK15细胞经离心后吸弃上清液，换液后培养7天，将7天后存活的细胞或流式分选后培养数天的GPF阳性细胞移植到肾包膜或胸腺下，移植后收集GFP阳性细胞或存活细胞；将换液后培养7天后的细胞或GFP阳性细胞在人血清中培养3.5-12h，收集存活细胞经流式分选获得GFP阳性细胞或直接收集GFP存活细胞；将上述回收的细胞进行单细胞扩增后提取DNA，PCR扩增sgRNA区域选定打靶基因，TA克隆后测序。
本发明的有益效果：
本发明在未知的大量猪抗原信息的前提下，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，通过sgRNA病毒载体文库的构建，对猪细胞中异种抗原基因进行敲除，确定猪细胞表面多种异种移植抗原基因的信息，最大限度地挖掘出异种移植过程中猪细胞表面的新抗原，节省抗原的筛选时间和节约经费投入，对开发异种器官移植供体猪抗原基因的修饰具有重大的意义。
附图说明
图1为本发明的流程图。
具体实施方式
实施例
一种基于全基因组CRISPR/Cas9文库筛选异种移植抗原基因的方法，具体操作过程按以下步骤进行：
1）文库的设计
通过NCBI上公布的猪全基因组序列，对猪全基因组上的每个基因上设计1或2 个sgRNA，sgRNA的设计要求：sgRNA中不使用4个碱基连续出现的结构；GC含量大约50%；两个sgRNA打靶PAM之间的距离在30bp以上；sgRNA设计在每个基因的前1-3外显子上。
2）病毒载体的包被
Array sgRNA oligo，用上海金斯瑞的CustomArray芯片合成仪的B3 synthesizer 系统和Sigma的SAFC Proligo reagents合成sgRNA序列；
合成好的sgRNA oligo用28-30%的氢氧化铵在65度下孵育过夜，将其从Array上洗脱，干燥，并用TE buffer溶解，并用Qiagen的QIAquick spin column试剂盒进行纯化；
扩增纯化好的sgRNA oligo,用Phusion HS Flex (NEB)引物：
ArrayF: TAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG
ArrayR：ACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC
引物扩增sgRNA oligo，并用2%的胶进行胶回收纯化，回收片段大小为128bp。
lenti-CRISPR载体的酶切准备：
Lenti-CRISPR-GFP标记的载体3ug，限制性内切酶BsmBI（NEB）3ul,配置40ul体系，37度2小时，用1%的胶回收酶切产物，片段大小为14873bp、1890bp和12983bp，回收12983bp这条带。
重组：
将10ng回收片段和25ng酶切载体用Gibson ligation （NEB）重组酶重组，将0.5ul重组载体通过GenePulser（BioRad）的转入到25ul electrocompetent cell（Lucigen）中,为了确保没有损失，做36个平行实验，最终将转化产物涂到245mm X 245mm的含有50ug/ml的羧苄青霉素的平板中（Corning），文库能达到166X的覆盖度，单个的克隆点挑取下来混合后用无内毒素的大提质粒试剂盒提取质粒（Qiagen）。
3）载体的转染
HEK293T细胞种植到T225瓶中（Broad RNAi Platform），细胞密度达到40%时准备转染，转染前1小时换液（加入预热的13ml无血清Opti-MEM）
转染体系
a.Mix 1 （20ug lentiCRISPR 质粒文库，10 ug pVsVg质粒，15ug pSPAX2质粒，200ul的Plus reagent (Life Technologies)）
b.Mix 2（4ml OptiMEM，100ul Lipofectamine 2000）Mix 2混合好后放置5min然后与Mix1混合室温放置20min,再加入到细胞中。
转染6小时后换液，去除原培养液加入含有1%的BSA（Sigma）的30ml10%胎牛血清的DMEM培养液，转染后的细胞在培养60h后在3000rpm4度离心10min收集上清，上清液经0.45μm低蛋白结合膜过滤(Millipore Steriflip HV/PVDF)，然后在24000rpm4℃离心2h，用含有1%的BSA（Sigma）10%胎牛血清的DMEM培养液冲悬，并在4度下过夜，分装后于-80℃保存。
4）病毒的转染
MOI的梯度摸索实验：
将3x106的猪PK15细胞接种到12孔板中，用标准培养液培养；
每个孔中分别滴入5-50ul的病毒（0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50） 并且每个孔中加入8ug/ml polybrene（Sigma）；
48h后 12孔板在2000rpm37下离心2小时，吸掉上清液，细胞消化后经过流式细胞仪分析GFP表达量MOI=（GFP阳性细胞数/总的过流式细胞数）X100
MOI值为0.4时（0.3-0.5）是最佳病毒感染量
感染操作步骤：
安实验要求将细胞铺板（例如12孔板），细胞数以第二天密度为40%为宜，37度培养过夜；
感染前，从冰箱取出病毒并在冰上慢慢融化，吸取原细胞培养液，加入1/2体积的培养液，此培养液含有病毒原液（用MOI值为0.4时的病毒体积）和8ug/ml的polybrene的新鲜培养基，37度感染4h,4h后补齐培养液至正常体积，感染48h后，通过荧光显微镜观察GFP表达率（大约40%）
病毒感染滴度的确定：
将生长状态良好的猪PK15细胞消化后稀释至1x105/ml，加入到96孔板、100ul/孔（1x104个细胞），每种病毒需要6个孔，37度培养过夜；
在EP管中做10倍稀释，连续6个稀释度；
将稀释好的病毒与细胞孵育过夜，吸去带有病毒的培养液，在每个孔中加入100ul完全培养液；
在荧光显微镜下观察结果，对荧光比例合适( 10-30%之间)的孔进行细胞计数或者用流式细胞仪分析,并计算滴度。
其计算公式如下:
滴度( TU/ml ) =细胞数x荧光百分比x 103/病毒原液体积(μl)。
举例:③号管对应孔的荧光比例为30% ,细胞总数为8x104 ,
滴度( TU/ml) =8x 104x 30%x103/0.1=2.4x108
如果要感染2x 105个细胞, MOI= 0.4 ,则需要病毒体积为=2x 105x 0.4/2.4x108 (ml ) =0.00033 ml=0.33μl.
5）文库的筛选
细胞的筛选：
48h后，12孔板在2000rpm 37度下，离心2小时，吸掉上清液；
a.换液后培养7天，7天后将存活的细胞手术移植到肾包膜下或者胸腺下，一定时间回收细胞，用流式分选GFP阳性细胞；
b. 换液后培养7天后，用流式分选GFP阳性细胞，将分选回的细胞培养数天，回复状态后再将细胞手术移植到肾包膜下或者胸腺下，一定时间回收细胞；
c. 换液后培养7天后，将病毒感染后的细胞在人50%血清中培养3.5或者12小时后收集存活细胞，用流式分选GFP阳性细胞;
d. 换液后培养7天后，用流式分选GFP阳性细胞，将病毒感染后的细胞在人50%血清中培养3.5或者12小时后收集存活细胞；
细胞基因型的鉴定：
将a、b、c和d中回收的细胞极度稀释后培养形成克隆点后提取DNA，PCR扩增sgRNA区域选定打靶基因，然后PCR扩增该基因的打靶区域，TA克隆后测序；
将a、b、c和d中回收的细胞直接提取混合细胞群的DNA后，建立DNA文库，用2代测序技术测序筛选打靶细胞基因型。
因猪本身携带有大量的抗原，且大量的抗原基因还未被检测到，从而在异种移植过程中未能实现所有抗原基因的修饰，通过本发明的实施，在未知的大量猪抗原信息的前提下，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，通过sgRNA病毒载体文库的构建，对猪细胞中异种抗原基因进行敲除，确定猪细胞表面多种异种移植抗原基因的信息，这将最大限度地挖掘出异种移植过程中猪细胞表面的新抗原，节省抗原的筛选时间和节约经费投入，对开发异种器官移植供体猪抗原基因的修饰具有重大的意义。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (4)

1.一种基于全基因组CRISPR/Cas9文库筛选异种移植抗原基因的方法，其特征在于：具体步骤为：
1）文库设计
根据NCBI上猪的全基因组序列，基于CRISPR/Cas9基因编辑系统，对猪基因组中各个基
因信息各设计1-2个靶向sgRNA序列，构建sgRNA敲除文库；
2）病毒载体的包被
利用CustomArray芯片合成仪合成Array sgRNA oligo并对其进行纯化，再用PhusionHS
Flex引物扩增sgRNA oligo并胶回收目的片段；lenti-CRISPR-GFP载体在限制性内切酶BsmBI的作用下酶切后并回收目的酶切载体；在Gibson ligation重组酶的作用下，将上述酶切载体与回收片段进行重组，所获得的重组载体再转染至electrocompetent cell中，再将转化产物涂到羧苄青霉素的平板中，挑取单克隆扩增后提取无内毒素重组质粒，将质粒转染至HEK293T细胞中，60h后收集上清获得病毒载体；
3）病毒载体的转染
将不同的病毒量转染至猪PK15细胞，检测GFP表达量MOI，根据MOI值确定猪PK15细胞最佳的病毒体积，再按最佳病毒体积将病毒载体感染至PK15细胞，48h后，观察细胞GFP的表达率，并进一步确定病毒感染滴度；
4）文库的筛选
将病毒载体感染的PK15细胞经离心后吸弃上清液，换液后培养7天，将7天后存活的细胞或流式分选后培养数天的GPF阳性细胞移植到肾包膜或胸腺下，移植后收集GFP阳性细胞或存活细胞；将换液后培养7天后的细胞或GFP阳性细胞在人血清中培养3.5-12h，收集存活细胞经流式分选获得GFP阳性细胞或直接收集GFP存活细胞；将上述回收的细胞进行单细胞扩增后提取DNA，PCR扩增sgRNA区域选定打靶基因，TA克隆后测序。
2.根据权利要求1所述的一种基于全基因组CRISPR/Cas9文库筛选异种移植抗原基因的方法，其特征在于：步骤1）中，所述的sgRNA设计不使用4个碱基连续出现的结构，且GC含量大于50%，两个sgRNA打靶PAM之间的距离在30bp以上。
3.根据权利要求1所述的一种基于全基因组CRISPR/Cas9文库筛选异种移植抗原基因的方法，其特征在于：步骤1）中，所述的文库覆盖度大于166X。
4.根据权利要求1所述的一种基于全基因组CRISPR/Cas9文库筛选异种移植抗原基因的方法，其特征在于：步骤2）中，所述的sgRNA oligo胶回收片段大小为128bp，lenti-CRISPR-GFP载体的酶切产物胶回收片段大小为12983bp。
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