CN110878127B - 长效重组GLP1-Fc-CD47蛋白及其制备和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及含有CD47信号的长效重组GLP‑1‑Fc融合蛋白及其制备和用途。具体地，本发明涉及一种全新组合的融合蛋白，包含GLP‑1多肽、Fc片段以及CD47信号多肽。所述融合蛋白首次发现可以以四聚体形式存在，比同类二聚体Fc融合蛋白更稳定，有效延长体内半衰期。本发明还对GLP‑1和Fc片段进行了突变，提高GLP‑1生物活性，并减少抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)效应，降低潜在的细胞毒性和免疫原性。此外，所述融合蛋白中的CD47信号多肽首次在融合蛋白中应用，可以减少巨噬细胞的清除，在人体内可降低给药频率。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体地涉及含有CD47信号的长效重组GLP-1-Fc融合蛋白及其制备和用途。
背景技术
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是由肠道L细胞分泌的一种肠促胰素，GLP-1通过作用于GLP-1受体(GLP-1R)而发挥生理作用，该受体属于G蛋白偶联受体家族，通过G蛋白激活cAMP，使细胞内cAMP水平增加，并激活蛋白激酶A，导致细胞内级联反应发生。在正常生理状态下，其主要生理功能是刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，抑制胰α细胞分泌胰高血糖素，抑制食欲，延缓胃排空，尤为重要的是，GLP-1的促胰岛素分泌作用依赖于血糖浓度。在非胰岛素依赖型糖尿病(II型糖尿病)病人中，GLP-1的促胰岛素和抑制胰高血糖素分泌功能受损，但没有完全消失，能够被生理浓度或者超生理浓度的GLP-1修复。给II型糖尿病病人持续注射GLP-1能改善血糖控制和降低体重。因此GLP-1是治疗II型糖尿病的很好的药物靶标。
然而天然存在的GLP-1进入血液后，主要被血液中的二肽基肽酶IV(DPPIV)酶降解，在体内半衰期非常短(～2-3分钟)，应用于临床受限。研发具有更长半衰期的GLP-1受体激动剂或DPPIV酶的抑制剂是两个主要策略，目前这两类药物均已上市。与治疗糖尿病的其他类药物相比，基于GLP-1的药物治疗的主要优势是发生低血糖的风险很低，对于GLP-1受体激动剂而言，还能获得额外的有益效应：降低体重和保护β细胞功能等。在临床上GLP-1受体激动剂已显示出很好的降糖药效，其降低HbA1c的能力与噻唑烷二酮类化合物、低剂量的二甲双胍及磺酰胺类药物相近，强于α糖苷酶抑制剂和DPPIV抑制剂。常见的不良反应主要是胃肠道反应，如恶心、呕吐等，很可能是由GLP-1受体激动剂的延缓胃排空作用引起的，长效激动剂可以改善胃肠道副作用。
目前已被FDA批准上市的GLP-1受体激动剂有早期的短效激动剂：艾塞那肽(一天给药两次)、利拉鲁肽、利西拉来(一天给药一次)及近期的长效激动剂(一周给药一次)艾塞那肽微球剂型、阿必鲁肽、杜拉鲁肽和索玛鲁肽。其中杜拉鲁肽是通过融合表达GLP-1与人免疫球蛋白IgG4的Fc端，从而使GLP-1在血液中的半衰期延长。在我国，获得CFDA批准上市的GLP-1受体激动剂有艾塞那肽、利拉鲁肽及艾塞那肽微球注射液。上市药物GLP-1-Fc融合蛋白(杜拉鲁肽)在体内的半衰期只有4.5-4.7天。目前上市药物中给药频率最低的为一周给药一次。
因此，本领域亟需开发一种新型、安全、并能长期有效治疗糖尿病的药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型、安全、并能长期有效治疗糖尿病的药物。
本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白的结构如下式I所示：
A-B-C-D (I)
式中，各“-”独立地为连接肽或肽键；
A为无或CD47信号多肽；
B为GLP-1多肽；
C为Fc片段；
D为无或CD47信号多肽；
并且A和D不同时为无。
在另一优选例中，所述A为无，D为CD47信号多肽。
在另一优选例中，所述融合蛋白的结构如下式II所示：
B-C-D (II)
式中B、C和“-”的定义如上(式I)所述，D为CD47信号多肽。
在另一优选例中，所述GLP-1多肽包括天然GLP-1及GLP-1突变体。
在另一优选例中，所述天然GLP-1的序列如SEQ ID NO.:1中所示。
在另一优选例中，所述GLP-1突变体对应于天然GLP-1存在选自下组的氨基酸突变：第8位丙氨酸(Ala)、第22位甘氨酸(Gly)、第34位赖氨酸(Lys)、第36位精氨酸(Arg)、或其组合。
在另一优选例中，所述GLP-1突变体对应于天然GLP-1存在选自下组的突变：A8G、G22E、K34R、R36G、R36A、R36V、R36L、或其组合。
在另一优选例中，所述GLP-1突变体的序列如SEQ ID NO.:2-7中任一所示。
在另一优选例中，所述GLP-1多肽的序列如SEQ ID NO.:1-7中任一所示。
在另一优选例中，所述Fc片段为免疫球蛋白IgG的Fc片段，较佳地为IgG4的Fc部分，更佳地，所述Fc片段包括IgG4的铰链区、CH2和CH3结构域。
在另一优选例中，所述Fc片段包括天然的Fc片段及Fc突变体。
在另一优选例中，所述Fc突变体在对应于IgG4的Fc片段存在选自下组的突变：S228P、F234A、L235A、或其组合。
在另一优选例中，所述Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.:9所示。
在另一优选例中，所述CD47信号多肽为具有CD47功能或活性的多肽。
在另一优选例中，所述CD47功能或活性指不被巨噬细胞吞噬或减少巨噬细胞的清除的功能。
在另一优选例中，所述CD47信号多肽为具有特异性结合SIRPα的表位的多肽。
在另一优选例中，所述CD47信号多肽为含有如SEQ ID NO.:10所示的核心序列的多肽。
在另一优选例中，所述CD47包括人源、鼠源或其他物种来源的CD47蛋白。
在另一优选例中，所述CD47信号多肽包括CD47全长蛋白、CD47蛋白的活性片段、突变体、衍生物或类似物。
在另一优选例中，所述CD47蛋白的活性片段、突变体、衍生物或类似物具有CD47功能或活性，较佳地，含有核心序列GNYTCEVTELTREGETIIELK(SEQ ID NO.:10)。
在另一优选例中，所述CD47信号多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:10或21所示。
在另一优选例中，所述B和C之间通过连接肽P1连接，所述连接肽P1具有柔性，可使融合蛋白中GLP-1能与下游GLP-1受体有效结合。
在另一优选例中，所述连接肽P1由甘氨酸和丝氨酸组成，较佳地，所述连接肽P1的氨基酸酸序列如SEQ ID NO.:8所示(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)。
在另一优选例中，所述C和D之间通过连接肽P2连接，所述连接肽P2包含3-4个甘氨酸，较佳地由3-4个甘氨酸组成。
在另一优选例中，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO.:13、14或15所示的氨基酸序列。
本发明的第二方面，提供了一种寡聚体，所述寡聚体包含本发明第一方面所述的融合蛋白。
在另一优选例中，所述寡聚体为二聚体、三聚体、四聚体或五聚体。
在另一优选例中，所述寡聚体为本发明第一方面所述的融合蛋白的四聚体。
本发明的第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的融合蛋白。
在另一优选例中，所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.:18、19或20所示的序列。
本发明的第四方面，提供了一种载体，所述载体包括本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。
在另一优选例中，所述载体为质粒，优选地杆状质粒(Bacmid DNA)。
本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第四方面所述的载体、或染色体中整合有外源的本发明第三方面所述的多核苷酸、或表达本发明第一方面所述的融合蛋白、或表达本发明第二方面所述的寡聚体。
在另一优选例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
在另一优选例中，所述宿主细胞为HEK293细胞。
本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第一方面所述的融合蛋白或本发明第二方面所述的寡聚体，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一优选例中，所述药物组合物用于治疗糖尿病、肥胖症及其他降低血糖和/或降低体重可获益的疾病。
本发明的第七方面，提供了如本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的寡聚体、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的载体、本发明第五方面所述的宿主细胞的用途，用于制备预防和/或治疗糖尿病、肥胖症及其他降低血糖和/或降低体重可获益的疾病的药物或制剂。
在另一优选例中，所述糖尿病为II型糖尿病或其相关疾病。
在本发明的第八方面，提供了一种本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的寡聚体或本发明第六方面所述的药物组合物的用途，用于预防和/或治疗糖尿病、肥胖症及其他降低血糖和/或降低体重可获益的疾病，优选地II型糖尿病或其相关疾病。
本发明的第九方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的寡聚体或本发明第六方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述疾病为糖尿病、肥胖症及其他降低血糖和/或降低体重可获益的疾病，优选地II型糖尿病或其相关疾病。
本发明的第十方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的融合蛋白，所述方法包括步骤(a)：培养本发明第五方面所述的宿主细胞，从而得到本发明第一方面所述的融合蛋白。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤(b)：纯化步骤(a)中得到的融合蛋白。
本发明的第十一方面，提供了一种GLP-1突变体，所述GLP-1突变体对应于天然GLP-1存在选自下组的氨基酸突变：第8位丙氨酸(Ala)、第22位甘氨酸(Gly)、第34位赖氨酸(Lys)、第36位精氨酸(Arg)、或其组合。
在另一优选例中，所述GLP-1突变体对应于天然GLP-1存在选自下组的突变：A8G、G22E、K34R、R36G、R36A、R36V、R36L、或其组合。
在另一优选例中，所述GLP-1突变体选自下组：
(a)氨基酸序列对应于SEQ ID NO.:1所示的序列存在以下突变的多肽：A8G、G22E、K34R和R36G；
(b)氨基酸序列对应于SEQ ID NO.:1所示的序列存在以下突变的多肽：A8G、G22E、K34R和R36V；
(c)氨基酸序列对应于SEQ ID NO.:1所示的序列存在以下突变的多肽：A8G、G22E、K34R和R36L；
(d)氨基酸序列对应于SEQ ID NO.:1所示的序列存在以下突变的多肽：A8G、G22E、K34R和R36A。
在另一优选例中，所述GLP-1突变体的序列如SEQ ID NO.:4-7中任一所示。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了重组蛋白的SDS-PAGE和非还原SDS-PAGE蛋白胶图。其中，1：蛋白marker，2：L1，3：L1-mu，4：L1-self，5：L1-self-mu。
图2显示了L1-self系列重组蛋白在体外大鼠血清中稳定性结果。其中，药物L1，L1-self，L1-self-mu，L1T-mu，L1-mu的稳定性，以各自浓度为0.03nM，0d的活性作为100％。
图3显示了L1系列重组蛋白动物体内的活性测试结果。其中，给药剂量均为30nmol/kg，皮下注射给药，与溶剂对照组(vehicle)相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次获得了一种新型的安全、长效治疗II型糖尿病的药物。所述药物是一种含有CD47信号的长效重组GLP-1-Fc融合蛋白，包含GLP-1、Fc片段以及CD47信号多肽。所述融合蛋白首次发现可以以四聚体形式存在，比同类二聚体Fc融合蛋白更稳定，有效延长体内半衰期。本发明还对GLP-1和Fc片段进行了突变，提高GLP-1生物活性，并减少ADCC效应，降低潜在的细胞毒性和免疫原性。此外，所述融合蛋白中的CD47信号多肽可以减少巨噬细胞的清除，在人体内预计可达到更低的给药频率。在此基础上，发明人完成了本发明。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是由肠道L细胞分泌的一种肠促胰素，GLP-1通过作用于GLP-1受体而发挥生理作用，该受体属于G蛋白偶联受体家族，通过G蛋白激活cAMP，使细胞内cAMP水平增加，并激活蛋白激酶A，导致细胞内级联反应发生。在正常生理状态下，其主要生理功能是刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，抑制胰α细胞分泌胰高血糖素，抑制食欲，延缓胃排空，尤为重要的是，GLP-1的促胰岛素分泌作用依赖于血糖浓度。在II型糖尿病病人中，GLP-1的促胰岛素和抑制胰高血糖素分泌功能受损，但没有完全消失，能够被生理浓度或者超生理浓度的GLP-1修复。给II型糖尿病病人持续注射GLP-1能改善血糖控制和降低体重。因此GLP-1是治疗II型糖尿病的很好的药物靶标。
目前已被FDA批准上市的GLP-1受体激动剂有早期的短效激动剂：艾塞那肽(一天给药两次)、利拉鲁肽、利西拉来(一天给药一次)及近期的长效激动剂(一周给药一次)艾塞那肽微球剂型、阿必鲁肽、杜拉鲁肽和索玛鲁肽。其中杜拉鲁肽是通过融合表达GLP-1与人免疫球蛋白IgG4的Fc端，从而使GLP-1在血液中的半衰期延长。IgG4在体内的半衰期大约21天，然而上市药物GLP-1-Fc融合蛋白(杜拉鲁肽)在体内的半衰期只有4.5-4.7天。杜拉鲁肽以二聚体的形式存在，单体分子量为29.8kDa，分子较小，能够通过肾小球滤过膜，加速清除。
在本发明中，GLP-1如本发明第一方面所述。所述GLP-1多肽包括天然的GLP-1及GLP-1突变体。在另一优选例中，所述天然GLP-1的序列如SEQ ID NO.:1中所示。在另一优选例中，所述GLP-1突变体的序列如SEQ ID NO.:2-7中任一所示。
SEQ ID NO.:1 GLP1(7-37)氨基酸序列
7His-8Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly
SEQ ID NO.:2 Gly8-GLP1(7-37)氨基酸序列
7His-8Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly
SEQ ID NO.:3 Gly8-Glu22-Gly36-GLP1(7-37)氨基酸序列
7His-8Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-22Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-36Gly-Gly
SEQ ID NO.:4 Gly8-Glu22-Arg34-Gly36-GLP1(7-37)氨基酸序列
7His-8Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-22Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-34Arg--Gly-36Gly-Gly
SEQ ID NO.:5 Gly8-Glu22-Arg34-Val36-GLP1(7-37)氨基酸序列
7His-8Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-22Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-34Arg-Gly-36Val-Gly
SEQ ID NO.:6 Gly8-Glu22-Arg34-Leu36-GLP1(7-37)氨基酸序列
7His-8Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-22Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-34Arg-Gly-36Leu-Gly
SEQ ID NO.:7 Gly8-Glu22-Arg34-Ala36-GLP1(7-37)氨基酸序列
7His-8Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-22Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-34Arg-Gly-36Ala-Gly
Fc片段
人免疫球蛋白IgG是人体内抗体的主要存在形式，有四种亚型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。本发明选择IgG4的Fc部分融合GLP-1，减少ADCC效应，降低潜在的细胞毒性。优选地，本发明在所述IgG4的Fc部分引入氨基酸突变(F234A,L235A)，进一步减少ADCC效应，降低细胞毒性。优选地，本发明在所述IgG4的Fc部分引入氨基酸突变(S228P)，减少GLP-1-Fc单体的形成。
在另一优选例中，所述Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.:9所示。
Ala-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Glu-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe-Asn-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn-Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser-Val-Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly(SEQ ID NO.:9)
CD47信号多肽
在本发明中，所述CD47信号多肽为具有CD47功能或活性的多肽。
在另一优选例中，所述CD47功能或活性指不被巨噬细胞吞噬的功能。
在另一优选例中，所述CD47信号多肽为具有特异性结合SIRPα的表位的多肽。
在另一优选例中，所述CD47信号多肽为含有如SEQ ID NO.:10所示的核心序列(self)的多肽。
在另一优选例中，所述CD47包括人源、鼠源或其他物种来源的CD47蛋白。
在另一优选例中，所述CD47信号多肽包括CD47全长蛋白、CD47蛋白的活性片段、突变体、衍生物或类似物。
在另一优选例中，所述CD47蛋白的活性片段、突变体、衍生物或类似物具有CD47功能或活性，较佳地，含有核心序列(self)GNYTCEVTELTREGETIIELK(SEQ ID NO.:10)。
在另一优选例中，所述CD47信号多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:10或21所示。
本发明在融合蛋白中引入CD47信号多肽后，可以形成更稳定的四聚体，减少肾小球过滤，并降低巨噬细胞的清除，从而显著延长药效持续时间，在人体内降低给药频率。
在另一优选例中，CD47信号多肽(self)的氨基酸序列如SEQ ID NO.:10所示。
Gly-Asn-Tyr-Thr-Cys-Glu-Val-Thr-Glu-Leu-Thr-Arg-Glu-Gly-Glu-Thr-Ile-Ile-Glu-Leu-Lys(SEQ ID NO.:10)
在另一优选例中，人源CD47蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:21所示。
Met-Trp-Pro-Leu-Val-Ala-Ala-Leu-Leu-Leu-Gly-Ser-Ala-Cys-Cys-Gly-Ser-Ala-Gln-Leu-Leu-Phe-Asn-Lys-Thr-Lys-Ser-Val-Glu-Phe-Thr-Phe-Cys-Asn-Asp-Thr-Val-Val-Ile-Pro-Cys-Phe-Val-Thr-Asn-Met-Glu-Ala-Gln-Asn-Thr-Thr-Glu-Val-Tyr-Val-Lys-Trp-Lys-Phe-Lys-Gly-Arg-Asp-Ile-Tyr-Thr-Phe-Asp-Gly-Ala-Leu-Asn-Lys-Ser-Thr-Val-Pro-Thr-Asp-Phe-Ser-Ser-Ala-Lys-Ile-Glu-Val-Ser-Gln-Leu-Leu-Lys-Gly-Asp-Ala-Ser-Leu-Lys-Met-Asp-Lys-Ser-Asp-Ala-Val-Ser-His-Thr-Gly-Asn-Tyr-Thr-Cys-Glu-Val-Thr-Glu-Leu-Thr-Arg-Glu-Gly-Glu-Thr-Ile-Ile-Glu-Leu-Lys-Tyr-Arg-Val-Val-Ser-Trp-Phe-Ser-Pro-Asn-Glu-Asn-Ile-Leu-Ile-Val-Ile-Phe-Pro-Ile-Phe-Ala-Ile-Leu-Leu-Phe-Trp-Gly-Gln-Phe-Gly-Ile-Lys-Thr-Leu-Lys-Tyr-Arg-Ser-Gly-Gly-Met-Asp-Glu-Lys-Thr-Ile-Ala-Leu-Leu-Val-Ala-Gly-Leu-Val-Ile-Thr-Val-Ile-Val-Ile-Val-Gly-Ala-Ile-Leu-Phe-Val-Pro-Gly-Glu-Tyr-Ser-Leu-Lys-Asn-Ala-Thr-Gly-Leu-Gly-Leu-Ile-Val-Thr-Ser-Thr-Gly-Ile-Leu-Ile-Leu-Leu-His-Tyr-Tyr-Val-Phe-Ser-Thr-Ala-Ile-Gly-Leu-Thr-Ser-Phe-Val-Ile-Ala-Ile-Leu-Val-Ile-Gln-Val-Ile-Ala-Tyr-Ile-Leu-Ala-Val-Val-Gly-Leu-Ser-Leu-Cys-Ile-Ala-Ala-Cys-Ile-Pro-Met-His-Gly-Pro-Leu-Leu-Ile-Ser-Gly-Leu-Ser-Ile-Leu-Ala-Leu-Ala-Gln-Leu-Leu-Gly-Leu-Val-Tyr-Met-Lys-Phe-Val-Ala-Ser-Asn-Gln-Lys-Thr-Ile-Gln-Pro-Pro-Arg-Lys-Ala-Val-Glu-Glu-Pro-Leu-Asn-Ala-Phe-Lys-Glu-Ser-Lys-Gly-Met-Met-Asn-Asp-Glu(SEQ ID NO.:21)
融合蛋白
如本文所用，“本发明融合蛋白”、“重组融合蛋白”或“多肽”均指本发明第一方面所述的融合蛋白。
在另一优选例中，所述融合蛋白的结构如B-C-D(II)所示，式中B为GLP-1多肽；C为Fc片段；以及D为CD47信号多肽。
在另一优选例中，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO.:13、14或15所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，重组蛋白L1-self氨基酸序列如SEQ ID NO.:13所示。
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Glu-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe-Asn-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn-Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser-Val-Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Tyr-Thr-Cys-Glu-Val-Thr-Glu-Leu-Thr-Arg-Glu-Gly-Glu-Thr-Ile-Ile-Glu-Leu-Lys(SEQ IDNO.:13)
在另一优选例中，重组蛋白self-L1氨基酸序列如SEQ ID NO.:14所示。
Gly-Asn-Tyr-Thr-Cys-Glu-Val-Thr-Glu-Leu-Thr-Arg-Glu-Gly-Glu-Thr-Ile-Ile-Glu-Leu-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Glu-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe-Asn-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn-Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser-Val-Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly-(SEQID NO.:14)
重组蛋白L1-self-mu氨基酸序列如SEQ ID NO.:15所示。
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Glu-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe-Asn-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn-Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser-Val-Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Tyr-Thr-Cys-Glu-Val-Thr-Glu-Leu-Thr-Arg-Glu-Gly-Glu-Thr-Ile-Ile-Glu-Leu-Lys(SEQ IDNO.:15)
在本发明中，重组蛋白L1氨基酸序列如SEQ ID NO.:11所示。
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Glu-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe-Asn-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn-Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser-Val-Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly(SEQ ID NO.:11)
在本发明中，重组蛋白L1-mu氨基酸序列如SEQ ID NO.:12所示。
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Glu-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe-Asn-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn-Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser-Val-Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly(SEQ ID NO.:12)
如本文所用，术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的融合蛋白(如SEQ ID NO.:13、14或15序列)的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。
本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)抗原肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6×His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与SEQ ID NO.:13、14或15所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
核酸编码序列
本发明还包括编码本发明融合蛋白质的多核苷酸以及包含这些多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明也包括治疗患有非胰岛素依赖型、肥胖症及其他降低血糖和/或降低体重可获益的疾病的患者的方法，其包括应用本文所述的融合蛋白。
本发明还涉及编码根据本发明的融合蛋白的多核苷酸。
在本发明的一个优选例中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:18、19或20所示。
在本发明中，编码重组蛋白L1-self的核苷酸序列如SEQ ID NO.:18所示。
Cacggcgagggcaccttcacctccgacgtgtcctcctatctcgaggagcaggccgccaaggaattcatcgcctggctggtgaagggcggcggcggtggtggtggctccggaggcggcggctctggtggcggtggcagcgctgagtccaaatatggtcccccatgcccaccctgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtggtggcggtggcggcaactacacctgcgaggtgaccgagctgacccgcgagggcgagaccatcatcgagctgaag(SEQID NO.:18)
在本发明中，编码重组蛋白self-L1的核苷酸序列如SEQ ID NO.:19所示。
Ggcaactacacctgcgaggtgaccgagctgacccgcgagggcgagaccatcatcgagctgaagggtggcggtggccacggcgagggcaccttcacctccgacgtgtcctcctatctcgaggagcaggccgccaaggaattcatcgcctggctggtgaagggcggcggcggtggtggtggctccggaggcggcggctctggtggcggtggcagcgctgagtccaaatatggtcccccatgcccaccctgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggt(SEQID NO.:19)
在本发明中，编码重组蛋白L1-self-mu的核苷酸序列如SEQ ID NO.:20所示。
Cacggcgagggcaccttcacctccgacgtgtcctcctatctcgaggagcaggccgccaaggaattcatcgcctggctggtgcgcggcgccggcggtggtggtggctccggaggcggcggctctggtggcggtggcagcgctgagtccaaatatggtcccccatgcccaccctgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtggtggcggtggcggcaactacacctgcgaggtgaccgagctgacccgcgagggcgagaccatcatcgagctgaag(SEQID NO.:20)
在本发明中，编码重组蛋白L1的核苷酸序列如SEQ ID NO.:16所示。
Cacggcgagggcaccttcacctccgacgtgtcctcctatctcgaggagcaggccgccaaggaattcatcgcctggctggtgaagggcggcggcggtggtggtggctccggaggcggcggctctggtggcggtggcagcgctgagtccaaatatggtcccccatgcccaccctgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggt(SEQID NO.:16)
编码重组蛋白L1-mu的核苷酸序列如SEQ ID NO.:17所示。
Cacggcgagggcaccttcacctccgacgtgtcctcctatctcgaggagcaggccgccaaggaattcatcgcctggctggtgcgcggcgccggcggtggtggtggctccggaggcggcggctctggtggcggtggcagcgctgagtccaaatatggtcccccatgcccaccctgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggt(SEQID NO.:17)
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码SEQ ID NO.:13、14或15所示的多肽的序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.:13、14或15所示的多肽，但相应编码区序列有差别的核酸序列。
本发明的多肽的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术利用所述宿主细胞表达本发明融合蛋白的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列获得表达本发明融合蛋白的宿主细胞。一般来说包括步骤：将本发明第三方面所述的多核苷酸或本发明第四方面所述的载体转导入宿主细胞内。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明酶的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如毕赤酵母、酿酒酵母细胞；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的融合蛋白，以及药学上可接受的载体、稀释剂、稳定剂和/或增稠剂，并可制备成如冻干粉、片剂、胶囊、糖浆、溶液或悬浮液的药剂类型。
“药学上可接受的载体或赋形剂(excipient)”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。
组合物可以是液体或固体，例如粉末、凝胶或糊剂。优选地，组合物是液体，优选地可注射液体。合适的赋形剂将是本领域技术人员己知的。
药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温
)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。所述药物组合物用于预防和/或治疗糖尿病及相关疾病的治疗药物，所述相关疾病包括：Ⅱ型糖尿病、Ⅰ型糖尿病、肥胖、Ⅱ型糖尿病患者严重心血管事件和其他严重并发症等。
与现有技术相比，本发明主要具有以下优点：
(a)本发明对GLP-1多肽进行了突变，有效提高GLP-1生物活性。
(b)本发明对Fc片段进行了突变，显著降低ADCC效应，降低潜在的细胞毒性和免疫原性，并且有效减少GLP1-Fc单体的形成，增加重组融合蛋白的均一性和稳定性。
(c)本发明融合蛋白活性非常高，EC50值非常低，能更有效地降低血糖，降糖持续时间明显延长，具有显著的药效持续时间，明显优于现有产品。
(d)本发明融合蛋白包含GLP-1、Fc片段以及CD47信号多肽，所述融合蛋白首次发现可以以四聚体形式存在，比同类二聚体Fc融合蛋白更稳定，有效延长体内半衰期。。本发明融合蛋白更稳定，明显优于现有产品，并且本发明融合蛋白分子量大，更不容易被清除。
(e)本发明融合蛋白中的Fc片段、CD47信号多肽人源性高，在人体中引起的免疫反应低。
(f)本发明融合蛋白中的CD47信号多肽(self)模拟人源CD47功能，在人体内的半衰期更长，可达到更低的给药频率。
(g)本发明融合蛋白的编码序列为优化后序列，在哺乳动物细胞中表达量更高。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1：GLP-1-Fc重组蛋白制备
载体选择哺乳动物细胞表达载体(Bacmam)，标签蛋白(Tag)选择8个组氨酸(8His)串联两个麦芽糖结合蛋白(MBP)及sumo蛋白。人工合成编码重组蛋白的DNA，其优化后的序列如SEQ ID NO.:16-20所示，用Transfer-PCR(TPCR)(Erijman,Dantes et al.2011)的方法将基因片段克隆进入Bacmam-8His-2MBP-sumo。
将质粒转化至DH10Bac感受态细胞中，经蓝白斑筛选后，提取杆状质粒(BacmidDNA)，转染昆虫细胞得到P0代病毒，进一步在昆虫细胞中扩增病毒至需要的体积。将扩增后的病毒转染哺乳动物细胞表达4天。
病毒转染哺乳动物细胞4天后，收集上清，2000rpm，离心20min，将上清缓慢上样于Amylose预装柱中，首先用MBPA缓冲液(Tris 20mM pH8.0,NaCl 200mM，甘油10％)清洗至无杂蛋白流出，再用MBPB缓冲液(Tris 20mM pH8.0,NaCl 200mM，麦芽糖10mM，甘油10％)洗脱目的蛋白。使用ULP-1酶将目的蛋白与标签蛋白(Tag)切开，再用镍柱亲和层析法将目的蛋白与Tag分离。
实施例2：GLP-1-Fc重组融合蛋白GLP-1部分的改造及细胞活性评价
天然存在的GLP-1的主要活性形式有两种：GLP-1(7-36)NH2和GLP-1(7-37)(SEQID NO.:1)，DPPIV酶作用于第7位组氨酸(His)和8位丙氨酸(Ala)之间。延长GLP-1类药物常用的策略是将第8位丙氨酸(Ala)突变为甘氨酸(Gly)(SEQ ID NO.:2)，以抵抗DPPIV酶的降解。
研究表明GLP-1第22位甘氨酸(Gly)突变为谷氨酸(Glu)和第36位的精氨酸(Arg)突变为甘氨酸(Gly)后，GLP-1的活性增加，同时GLP-1融合蛋白引起机体免疫反应的风险降低(US 2007/0036806 A1)。上市药物杜拉鲁肽的GLP-1部分分别在第8、22、36位引入了突变(SEQ ID NO.:3)。
本实施例进一步将GLP-1第34位赖氨酸(Lys)突变为精氨酸(Arg)，第36位精氨酸(Arg)突变为丙氨酸(Ala)或缬氨酸(Val)或者亮氨酸(Leu)(SEQ ID NO.:4-7)。
合成上述具有不同位点突变的GLP-1多肽(SEQ ID NO.:1,3-7)。用含有10％血清(FBS)的高糖培养基(DMEM)培养稳定表达人源GLP-1受体(hGLP-1R)及cAMP反应原件(cAMPresponsive element，CRE)融合荧光素酶(NanoLuc)的AD293细胞，长至80-90％融合用胰酶消化，将细胞接种于96孔白板透明底培养板，100μL/孔，平衡24h后，更换为无血清的培养基DMEM，加入不同浓度的多肽(DMEM培养基配制)作用4h后，检测荧光素酶活性。根据剂量依赖曲线拟合计算多肽激活hGLP-1R的EC50值，各个多肽的活性以相对值表示(GLP1(7-37)为100％)。结果表明，GLP-1多肽Gly8-Glu22-Arg34-Ala36-GLP1(7-37)的活性最好(表1)。
表1不同位点突变的GLP-1多肽的活性比较
| 多肽 | SEQ ID NO.: | 激活hGLP-1R活性 |
| GLP1(7-37) | 1 | 100％ |
| Gly8-Glu22-Gly36-GLP1(7-37) | 3 | 121％ |
| Gly8-Glu22-Arg34-Gly36-GLP1(7-37) | 4 | 163％ |
| Gly8-Glu22-Arg34-Val36-GLP1(7-37) | 5 | 142％ |
| Gly8-Glu22-Arg34-Leu36-GLP1(7-37) | 6 | 113％ |
| Gly8-Glu22-Arg34-Ala36-GLP1(7-37) | 7 | 168％ |
实施例3：GLP-1-Fc重组融合蛋白中引入CD47信号
本发明中重组蛋白GLP-1-Fc的Fc部分来自人IgG4，包括铰链区、CH2和CH3结构域。虽然IgG4引起的ADCC效应很弱，但是仍具有潜在的细胞毒性。
本发明在天然人IgG4的Fc部分引入了两个突变F234A和L235A，可以进一步有效降低ADCC效应。此外，本发明还引入了氨基酸突变S228P，可以有效减少GLP1-Fc单体的形成，增加重组融合蛋白的均一性和稳定性。
Rodriguez等研究者通过计算机设计最小的多肽(self)模拟人源CD47减少巨噬细胞清除的功能(self序列如SEQ ID NO.:10所示)。将self多肽分别引入L1蛋白(杜拉鲁肽，SEQ ID NO.:11)的N端和C端，得到融合蛋白self-L1(SEQ ID NO.:14)和融合蛋白L1-self(SEQ ID NO.:13)。
将突变得到的GLP-1多肽Gly8-Glu22-Arg34-Ala36-GLP1(7-37)与Fc部分(SEQ IDNO.:9)通过连接肽P1(SEQ ID NO.:8)融合得到重组蛋白L1-mu(SEQ ID NO.:12)。将self多肽引入重组蛋白L1-mu的C端，得到重组蛋白L1-self-mu(SEQ ID NO.:15)。
本发明在重组融合蛋白GLP-1-Fc中引入CD47信号，结果发现，引入的CD47信号减少巨噬细胞的清除，从而延长在体内的半衰期。
实施例4：L1-self系列重组蛋白的制备及鉴定
结合实施例2和实施例3的结果，制备了一系列重组蛋白：阳性对照L1(SEQ IDNO.:11)，LI-mu(SEQ ID NO.:12)，L1-self(SEQ ID NO.:13)，L1-self-mu(SEQ ID NO.:15)。按照实施例1的方法制备得到表达量及纯度均较高的蛋白(如图1所示)。非还原胶图结果显示这四个重组蛋白均能形成二硫键。
通过HPLC或分子筛方法鉴定蛋白的聚集形态，阳性对照蛋白L1已被证明是以二聚体的形式存在。蛋白L1及已知分子量的蛋白标准品，分别经过HPLC分离检测，色谱柱为Zenix-C SEC-300。
结果如表2所示，L1的出峰时间为23.692min，与蛋白标准品比较，L1的分子量在75和158kD之间，而L1单体的理论分子量为29.8kD，结合L1在哺乳动物细胞中表达有一定的修饰，实际分子量偏大，因此L1是以二聚体的形式存在。
表2蛋白在Zenix-C SEC-300色谱柱中的出峰时间
| 蛋白 | 出峰时间(min) | 分子量(kD) |
| L1 | 23.692 | 29.8 |
| 蛋白标准品1 | 25.377 | 43 |
| 蛋白标准品2 | 25.011 | 75 |
| 蛋白标准品3 | 22.526 | 158 |
| 蛋白标准品4 | 19.651 | 440 |
蛋白L1-self-mu及已知分子量的蛋白标准品，分别经过HPLC分离检测，色谱柱为TSKgel G4000SW。结果如表3所示，L1-self-mu的出峰时间为20.357min，与蛋白标准品比较，L1-self-mu的分子量在158和440kD之间，而L1-self-mu单体的理论分子量为32.5kD，因此L1-self-mu以四聚体的形式存在。
表3蛋白在TSKgel G4000SW色谱柱中的出峰时间
| 蛋白 | 出峰时间(min) | 分子量(kD) |
| L1-self-mu | 20.357 | 32.5 |
| 蛋白标准品1 | 21.402 | 43 |
| 蛋白标准品2 | 21.174 | 75 |
| 蛋白标准品3 | 20.900 | 158 |
| 蛋白标准品4 | 19.320 | 440 |
L1-mu和L1-self的鉴定使用分子筛的方法，L1-mu和L1-self在Superdex 200柱子中的保留体积分别为13.39ml和10.21ml，其单体的理论分子量分别为29.9kD和32.4kD。蛋白标准品的保留体积为14.34ml(66kD)，10.94ml(440kD)，因此L1-mu和L1-self分别以二聚体和四聚体的形式存在。
蛋白self-L1采用上述相同的实验方法鉴定蛋白的聚集形态，表明蛋白self-L1也是以四聚体的形式存在。以上结果说明引入CD47信号(L1-self，L1-self-mu)之后，蛋白构象发生了变化。与L1类似，L1-self和L1-self-mu的Fc部分以二硫键的方式形成二聚体，与L1不同的是，L1-self、self-L1蛋白和L1-self-mu的二聚体还能继续形成四聚体，在后续实验验证中发现L1-self和L1-self-mu的稳定性更高。实验数据表明L1-self、self-L1蛋白和L1-self-mu的二聚体之间没有形成二硫键，说明四聚体是通过非共价键(如疏水作用)形成的。
实施例5：L1-self系列重组蛋白激活hGLP-1R活性评价
在稳定表达hGLP-1R及CRE融合荧光素酶(NanoLuc)的AD293细胞中评价了L1、L1-mu、L1-self、self-L1和L1-self-mu激活hGLP-1R的活性。方法与实施例2中的相同，用DMEM将蛋白稀释至不同的浓度(100nM至0.1pM梯度稀释，蛋白分子量以单体的分子量计算)。蛋白作用4h后，检测荧光素酶活性。
结果如表5所示，L1的多肽部分突变后(L1-mu)、L1-self的细胞活性与L1蛋白无显著改善，self-L1(self多肽位于L1蛋白的N端)活性降低。而L1-self-mu的细胞活性增强，高于L1蛋白。
表2 L1-self系列重组蛋白激活hGLP-1R活性
| 重组蛋白 | SEQ ID NO.: | 激活hGLP-1R活性EC<sub>50</sub>(pM) |
| L1 | 11 | 23.89 |
| L1-mu | 12 | 83.58 |
| L1-self | 13 | 45.64 |
| self-L1 | 14 | 24270 |
| L1-self-mu | 15 | 16.93 |
注：以上数据以平均值的形式显示，实验重复3次。
实施例6：L1-self系列重组蛋白在体外大鼠血清中稳定性评价
本实施例评价了在体外大鼠血清中稳定性，具体实施过程如下：首先将蛋白用大鼠血清稀释至10nM，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育0天，1天，7天，14天，21天，28天后，检测蛋白在0.03nM的浓度下激活hGLP-1R的活性，蛋白活性衰减的速度间接反映蛋白在血清中的稳定性。
结果图2所示，阴性对照GLP-1在血清中很不稳定，孵育一天后，活性下降96％。四个重组蛋白在血清中孵育一天后，活性基本不变，孵育7天后，活性变化显示出明显差异，阳性对照L1下降33.3％，L1-mu下降60.4％，L1-self和L1-self-mu分别下降27.8％和29.9％，说明L1-self和L1-self-mu在体外大鼠血清中显示出比阳性对照L1更高的稳定性。
实施例7：L1-self系列重组蛋白在动物体内的降糖活性
将6周龄雄性C57BL/KsJ小鼠根据体重及血糖随机分组：溶剂对照组(vehicle)、阳性药组及受试蛋白组，给药方式：皮下注射(s.c.)。给药一定时间后做腹腔葡萄糖耐量实验(Intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT)：小鼠禁食6h，实验开始前各组小鼠尾静脉采血，利用罗氏ACCU-CHEK血糖仪测定血糖浓度，记为-60min时间点，测各组小鼠0min血糖浓度，同时腹腔注射2g/kg体重的葡萄糖，注射葡萄糖15min，30min，60min,120min后测量记录各组小鼠血糖浓度。根据血糖浓度绘制IPGTT曲线，并根据IPGTT曲线计算曲线下面积(areas under curve,AUC0-120min(mM*min))，利用t-test检验统计分析差异。
结果如图3所示，L1-self-mu均比L1的降糖时间持续时间更长，单次给药7天后，相对于溶剂对照组，阳性药L1组血糖曲线下面积AUC下降了14.8％，L1-mu和L1-self-mu组分别下降28.2％和20％。给药10天后，L1和L1-mu组AUC无明显下降，L1-self-mu组依旧有明显的降糖活性。说明L1-self-mu在动物体内的降糖持续时间比阳性药L1更长。L1-self组由于蛋白表达量低，动物只数较少，但降糖活性及持续时间与L1-self-mu类似。
实施例8
将self多肽(SEQ ID NO.:10)更换为具有CD47功能的蛋白或多肽(如SEQ ID NO.:21所示的人源CD47蛋白)，其它方法同实施例1-7。结果发现，引入人源CD47蛋白后得到的融合蛋白的稳定性显著增加，半衰期有效延长。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 浙江柏拉阿图医药科技有限公司
<120> 长效重组GLP1-Fc-CD47蛋白及其制备和用途
<130> P2018-1023
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 2
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 3
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 4
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 5
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Val Gly
20 25 30
<210> 6
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
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1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Leu Gly
20 25 30
<210> 7
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Ala Gly
20 25 30
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 9
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
20 25 30
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
35 40 45
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
50 55 60
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
85 90 95
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
100 105 110
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
115 120 125
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
130 135 140
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
145 150 155 160
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
180 185 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
195 200 205
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Gly
225
<210> 10
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr
1 5 10 15
Ile Ile Glu Leu Lys
20
<210> 11
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu
35 40 45
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
50 55 60
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
65 70 75 80
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
85 90 95
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
100 105 110
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
115 120 125
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
130 135 140
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
145 150 155 160
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
165 170 175
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
180 185 190
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
195 200 205
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
210 215 220
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
225 230 235 240
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
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Ser Leu Gly
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<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
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Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Ala Gly Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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130 135 140
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Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
245 250 255
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
260 265 270
Ser Leu Gly
275
<210> 13
<211> 300
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu
35 40 45
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
50 55 60
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
65 70 75 80
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
85 90 95
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
100 105 110
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
115 120 125
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
130 135 140
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
145 150 155 160
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
165 170 175
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
180 185 190
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
195 200 205
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
210 215 220
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
225 230 235 240
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
245 250 255
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
260 265 270
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Val Thr Glu
275 280 285
Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys
290 295 300
<210> 14
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr
1 5 10 15
Ile Ile Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Gly His Gly Glu Gly Thr Phe
20 25 30
Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu Gln Ala Ala Lys Glu Phe
35 40 45
Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
65 70 75 80
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
85 90 95
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
100 105 110
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
115 120 125
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
130 135 140
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
145 150 155 160
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165 170 175
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
180 185 190
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
195 200 205
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210 215 220
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
225 230 235 240
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
245 250 255
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
260 265 270
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
275 280 285
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
290 295 300
<210> 15
<211> 300
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Ala Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu
35 40 45
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
50 55 60
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
65 70 75 80
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
85 90 95
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
100 105 110
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
115 120 125
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
130 135 140
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
145 150 155 160
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
165 170 175
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
180 185 190
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
195 200 205
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
210 215 220
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
225 230 235 240
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
245 250 255
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
260 265 270
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Val Thr Glu
275 280 285
Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys
290 295 300
<210> 16
<211> 825
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
cacggcgagg gcaccttcac ctccgacgtg tcctcctatc tcgaggagca ggccgccaag 60
gaattcatcg cctggctggt gaagggcggc ggcggtggtg gtggctccgg aggcggcggc 120
tctggtggcg gtggcagcgc tgagtccaaa tatggtcccc catgcccacc ctgcccagca 180
cctgaggccg ccgggggacc atcagtcttc ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc 240
atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc 300
gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 360
cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 420
gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc 480
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag agccacaggt gtacaccctg 540
cccccatccc aggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 600
ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gaaagcaatg ggcagccgga gaacaactac 660
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caggctaacc 720
gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 780
ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc tccctgtctc tgggt 825
<210> 17
<211> 825
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
cacggcgagg gcaccttcac ctccgacgtg tcctcctatc tcgaggagca ggccgccaag 60
gaattcatcg cctggctggt gcgcggcgcc ggcggtggtg gtggctccgg aggcggcggc 120
tctggtggcg gtggcagcgc tgagtccaaa tatggtcccc catgcccacc ctgcccagca 180
cctgaggccg ccgggggacc atcagtcttc ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc 240
atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc 300
gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 360
cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 420
gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc 480
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag agccacaggt gtacaccctg 540
cccccatccc aggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 600
ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gaaagcaatg ggcagccgga gaacaactac 660
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caggctaacc 720
gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 780
ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc tccctgtctc tgggt 825
<210> 18
<211> 900
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
cacggcgagg gcaccttcac ctccgacgtg tcctcctatc tcgaggagca ggccgccaag 60
gaattcatcg cctggctggt gaagggcggc ggcggtggtg gtggctccgg aggcggcggc 120
tctggtggcg gtggcagcgc tgagtccaaa tatggtcccc catgcccacc ctgcccagca 180
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gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc 480
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag agccacaggt gtacaccctg 540
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aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caggctaacc 720
gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 780
ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc tccctgtctc tgggtggtgg cggtggcggc 840
aactacacct gcgaggtgac cgagctgacc cgcgagggcg agaccatcat cgagctgaag 900
<210> 19
<211> 900
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
ggcaactaca cctgcgaggt gaccgagctg acccgcgagg gcgagaccat catcgagctg 60
aagggtggcg gtggccacgg cgagggcacc ttcacctccg acgtgtcctc ctatctcgag 120
gagcaggccg ccaaggaatt catcgcctgg ctggtgaagg gcggcggcgg tggtggtggc 180
tccggaggcg gcggctctgg tggcggtggc agcgctgagt ccaaatatgg tcccccatgc 240
ccaccctgcc cagcacctga ggccgccggg ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa 300
cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg 360
agccaggaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat 420
gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 480
accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 540
ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagagcca 600
caggtgtaca ccctgccccc atcccaggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 660
tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggaaag caatgggcag 720
ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 780
tacagcaggc taaccgtgga caagagcagg tggcaggagg ggaatgtctt ctcatgctcc 840
gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga gcctctccct gtctctgggt 900
<210> 20
<211> 900
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 20
cacggcgagg gcaccttcac ctccgacgtg tcctcctatc tcgaggagca ggccgccaag 60
gaattcatcg cctggctggt gcgcggcgcc ggcggtggtg gtggctccgg aggcggcggc 120
tctggtggcg gtggcagcgc tgagtccaaa tatggtcccc catgcccacc ctgcccagca 180
cctgaggccg ccgggggacc atcagtcttc ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc 240
atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc 300
gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 360
cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 420
gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc 480
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag agccacaggt gtacaccctg 540
cccccatccc aggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 600
ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gaaagcaatg ggcagccgga gaacaactac 660
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caggctaacc 720
gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 780
ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc tccctgtctc tgggtggtgg cggtggcggc 840
aactacacct gcgaggtgac cgagctgacc cgcgagggcg agaccatcat cgagctgaag 900
<210> 21
<211> 323
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu
130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe
145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr
165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val
180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr
195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His
210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala
225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu
245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile
260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr
275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys
290 295 300
Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met
305 310 315 320
Asn Asp Glu
Claims (14)
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的结构如下式I所示：
A-B-C-D (I)
式中，各“-”独立地为连接肽或肽键；
A为无或CD47信号多肽；
B为GLP-1多肽；
C为Fc片段；
D为无或CD47信号多肽；
并且A和D不同时为无；
其中，所述CD47信号多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:10所示；
所述GLP-1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4-7中任一所示；
所述Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.:9所示。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述A为无，D为CD47信号多肽。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述Fc片段为Fc突变体，所述Fc突变体在对应于IgG4的Fc片段存在以下突变：S228P、F234A和L235A。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述CD47信号多肽为具有CD47功能或活性的多肽。
5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO.:13、14或15所示的氨基酸序列。
6.一种寡聚体，其特征在于，所述寡聚体包含权利要求1所述的融合蛋白。
7.如权利要求6所述的寡聚体，其特征在于，所述寡聚体为权利要求1所述的融合蛋白的四聚体。
8.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白。
9.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求8所述的多核苷酸。
10.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求9所述的载体、或染色体中整合有外源的权利要求8所述的多核苷酸、或表达权利要求1所述的融合蛋白、或表达权利要求6所述的寡聚体。
11.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的融合蛋白或权利要求6所述的寡聚体，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
12.如权利要求1所述的融合蛋白、权利要求6所述的寡聚体、权利要求8所述的多核苷酸、权利要求9所述的载体、权利要求10所述的宿主细胞的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗糖尿病、肥胖症及其他降低血糖和/或降低体重可获益的疾病的药物或制剂。
13.一种GLP-1突变体，所述GLP-1突变体对应于天然GLP-1存在选自下组的氨基酸突变：
A8G、G22E、K34R和R36G，
A8G、G22E、K34R和R36V，
A8G、G22E、K34R和R36L，
A8G、G22E、K34R和R36A；
其中所述天然GLP-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。
14.如权利要求13所述的突变体，其特征在于，所述GLP-1突变体的序列如SEQ ID NO.:4-7中任一所示。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| CN103539851A (zh) * | 2003-05-28 | 2014-01-29 | 塞尔蛋白质股份有限公司 | 基于泛素蛋白的人工结合蛋白的生产 |
| CN107698684A (zh) * | 2016-08-03 | 2018-02-16 | 广东东阳光药业有限公司 | 包含突变的免疫球蛋白Fc部分的GLP‑1融合蛋白 |
| CN110172103A (zh) * | 2016-09-29 | 2019-08-27 | 上海凯茂生物医药有限公司 | GLP-1类似物-Fc融合蛋白及其制备方法和用途 |
| CN112543650A (zh) * | 2018-04-24 | 2021-03-23 | 利甘达尔股份有限公司 | 基因组编辑的方法和组合物 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| N Soltani.In vivo expression of GLP-1/IgG-Fc fusion protein enhances beta-cell mass and protects against streptozotocin-induced diabetes.《Gene Therapy》.2007,第14卷(第12期),第981-988页. * |
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