CN114539357A - 信号肽在表达glp-1融合蛋白中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了信号肽在表达GLP‑1或GLP‑1融合蛋白中的应用，该信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示，该信号肽能够提高GLP‑1或GLP‑1融合蛋白的表达量、纯度和生物活性。

Description

信号肽在表达GLP-1融合蛋白中的应用
技术领域
本发明涉及信号肽在表达GLP-1融合蛋白中的应用。
背景技术
胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一种含30或31个氨基酸的多肽激素，来源于前胰高血糖素肽的组织特异性翻译后处理。它是由肠道内分泌L细胞和脑干孤束核内的某些神经元在进食时产生和分泌的。初始产物GLP-1(1-37)易被酰胺化和蛋白水解裂解，从而产生两种截短的等电位生物活性形式GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)。活性GLP-1由两个α-螺旋组成，分别位于氨基酸的13-20和24-35位，由一个连接区隔开。GLP-1与葡萄糖依赖性胰岛素原肽(GIP)一起，是一种肠促胰岛素，因此，它能够通过促进胰岛素的分泌以葡萄糖依赖的方式降低血糖水平。除了促胰岛素作用外，GLP-1还具有多种调节和保护作用。与GIP不同的是，GLP-1的作用在2型糖尿病患者中得以保留，因此大量的药物研究已被用于开发基于GLP-1的治疗方法。
除来自人体自身的内源性GLP-1外，有类似功效的多肽还有来自吉拉毒蜥(Heloderma suspectum)的外源性GLP-1(Extendin-4)，两者的氨基酸序列有一定的相似性，个别差异的氨基酸使得Extendin-4拥有比内源性GLP-1更长的体内半衰期。将天然GLP-1的第二位氨基酸Ala突变成与Extendin-4相同的Gly后，可以增加GLP-1对DDP-4的耐受性，从而延长半衰期。
哺乳动物细胞常被用于表达重组蛋白。信号肽位于分泌蛋白的N端。一般由15～30个氨基酸组成。包括三个区：一个带正电的N末端，称为碱性氨基末端：一个中间疏水序列。以中性氨基酸为主，能够形成一段α螺旋结构，它是信号肽的主要功能区；一个较长的带负电荷的C末端，含小分子氨基酸，是信号序列切割位点，也称加工区。当信号肽序列合成后，被信号识别颗粒(SRP)所识别，蛋白质合成暂停或减缓，信号识别颗粒将核糖体携带至内质网上，蛋白质合成重新开始。在信号肽的引导下，新合成的蛋白质进入内质网腔.而信号肽序列则在信号肽酶的作用下被切除。不同的信号肽会导致不同的GLP-1融合蛋白N端截短比例，进而可能对纯度和活性产生影响，因此信号肽是影响GLP-1融合蛋白质量的重要因素，但现有技术还没有能够达到很好的纯度、活性结果。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够提高GLP-1蛋白表达纯度和生物活性的GLP-1表达蛋白及其生产方法。
信号肽在表达GLP-1或GLP-1融合蛋白中的应用，其特征在于，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在其中一个实施例中，所述信号肽含有选自以下任意一种的氨基酸替换：
第14位氨基酸替换为T；
第19位氨基酸替换为S；
第9位氨基酸替换为FW，第17位氨基酸替换为A。
在其中一个实施例中，所述GLP-1融合蛋白的融合标签为人免疫球蛋白Fc或白蛋白。
一种多核苷酸，所述多核苷酸包括：
编码信号肽的多核苷酸，和
编码GLP-1或GLP-1融合蛋白的多核苷酸；
所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在其中一个实施例中，所述信号肽含有选自以下任意一种氨基酸替换：
第14位氨基酸替换为T；
第19位氨基酸替换为S；
第9位氨基酸替换为FW，第17位氨基酸替换为A。
在其中一个实施例中，所述GLP-1融合蛋白的融合标签为人免疫球蛋白Fc或白蛋白。
一种表达载体，包含所述的多核苷酸。
一种宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的表达载体。
在其中一个实施例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
一种GLP-1或GLP-1融合蛋白的生产方法，使用所述的宿主细胞表达GLP-1或GLP-1融合蛋白。
本发明对GLP-1融合蛋白的体外宿主细胞表达进行研究，发现上述的信号肽可用于在宿主细胞中高效表达高活性的胰高血糖素样肽-1蛋白或其融合蛋白。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明实施例提供一种表达蛋白，包括信号肽以及GLP-1。该信号肽用于引导GLP-1蛋白或GLP-1融合蛋白在宿主细胞中的表达。
本发明的GLP-1蛋白是指内源性GLP-1或GLP-1类似物。
在一些实施方式中，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1MDWTWRVFCLLAVAPGVHP。
在一些实施方式中，所述信号肽的第14位氨基酸替换为T。该信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:2MDWTWRVFCLLAVTPGVHP。
在一些实施方式中，所述信号肽的第19位氨基酸替换为S。该信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
SEQ ID NO:3MDWTWRVFCLLAVTPGVHS。
在一些实施方式中，所述信号肽的第9位氨基酸替换为FW，第17位氨基酸替换为A。该信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
SEQ ID NO:4MDWTWRVFFW LLAVAPGAHP。
在一些实施方式中，所述信号肽的第9位氨基酸替换为F，第14位氨基酸替换为S,第17位氨基酸替换为A。该信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
SEQ ID NO:5MDWTWRVFFL LAVSPGAHP。
在一些实施方式中，所述GLP-1融合蛋白包括依次连接的GLP-1蛋白和融合标签。在一些实施方式中，所述融合标签为人免疫球蛋白人免疫球蛋白Fc或白蛋白。一方面用于在细胞表达后的分离纯化，另一方面GLP-1融合蛋白类药物可通过将GLP-1与大分子蛋白如抗体的可结晶片段(Fc)或白蛋白融合来延长药物在体内的半衰期。
在一些实施方式中，GLP-1融合蛋白的融合标签为人免疫球蛋白Fc，GLP-1融合蛋白的序列如SEQ ID NO:6所示。
SEQ ID NO:6为：
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSAEPK SCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK。
本发明实施例还提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码所述的表达蛋白。即，该多核苷酸包含编码上述任一实施例的信号肽的多核苷酸及编码GLP-1或GLP-1融合蛋白的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可通过常规的合成方法制备。
本发明的多核苷酸可添加于表达载体，用于GLP-1或GLP-1融合蛋白的分泌表达。
利用本发明的信号肽在宿主细胞中分泌表达GLP-1蛋白或其融合蛋白的方法为：
将编码本发明信号肽的多核苷酸与编码表达GLP-1蛋白或其融合蛋白的多核苷酸连接后克隆入宿主细胞表达载体，而后将该重组宿主细胞表达载体转染宿主细胞后表达目的GLP-1蛋白或其融合蛋白。
本发明实施例还提供一种表达载体，包含编码该多核苷酸。
术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。
在一些实施方式中，本发明所述载体中还可以包含筛选所用的基因(例如抗生素抗性基因)、用于生成荧光蛋白的核酸等片段。荧光蛋白可以选择绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白或红色荧光蛋白。
绿色荧光蛋白可以采用常见的GFP，也可以采用经过改造后的GFP基因，例如增强型GFP基因EGFP等；蓝色荧光蛋白可以选自EBFP、Azuritc、TagBFP等；黄色荧光蛋白可以选自EYFP、Ypct、PhiYFP等；橙色荧光蛋白可以选自mKO、mOrange、mBanana等；红色荧光蛋白可以选自TagRFP、mRuby、mCherry、mKate等。
在一些实施方式中，表达载体中，编码本发明信号肽的所述多核苷酸紧接在所述GLP-1或其融合蛋白多核苷酸的前端。
在一些实施方式中，表达载体可为商品化质粒pXC17.4。
本发明实施例还提供一种宿主细胞，为所述的表达载体所转染得到。即，该宿主细胞中具有该表达载体，在该宿主细胞中可表达上述表达蛋白。
优选的，宿主细胞选自哺乳动物细胞。
在一些实施方式中，所述哺乳动物细胞为啮齿类动物细胞，例如大鼠、小鼠、仓鼠。
在一些实施方式中，所述哺乳动物细胞为灵长类动物细胞，优选为人。
在一些实施方式中，所述哺乳动物细胞为原代细胞，例如肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等。
在一些实施方式中，所述哺乳动物细胞为细胞系；
常见的细胞系例如：
来源于人的细胞系：
293、IMR-90、W1-38、A549、A431、BHL-100、BeWo、Caco-2、Chang、HCT-15、HeLa、HEp-G2、HEp-2、HT-1080、HT-29、JEG-2、MCF7、KB、Saos-2、WI-38、WISH、WS1、HUVEC、EB-3、Raji、IM-9、Daudi、H9、HL-60、Jurkat、K-562、U937、KG-1；
来源于小鼠的细胞系：
McCoy、BALB/3T3、3T6、A9、AtT-20、Clone M-3、I-10、Y-1、WEHI-3b、ES-D3、F9；
来源于仓鼠的细胞系：
BHK-21、HaK、CHO-K1；
来源于大鼠的细胞系：
AR42J、BRL3A、Clone 9、H4--Ⅱ-E-C3、GH1、GH3、IEC-6、L2、XC、LLC-WRC 256、Jensen、Rat2(TK-)、PC12、L6；
来源于其他动物的细胞系：
D-17、BT、MARC-145、CV-1、COS-1、COS-3、COS-7、Vero、B95-8、CRFK。
具体的，所述的哺乳动物细胞可以是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamsterovary，CHO)、幼年仓鼠肾细胞(baby hamster kidney，BHK)、小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)、小鼠乳腺肿瘤细胞(C127)、人胚肾293细胞(human embryonic kidney293，HEK293)等。
本发明实施例还提供一种GLP-1蛋白或其融合蛋白的生产方法，为在适合条件下，培养所述的含有该表达载体的宿主细胞，而后从培养物中分离出GLP-1蛋白或其融合蛋白。
以下为具体实施例。
细胞池构建：
通过全基因合成技术合成信号肽(SP)+GLP-1-Fc融合蛋白的基因并将其构建至商品化质粒pXC17.4中，构建质粒pXC17.4-SP-GLP-1-Fc。将pXC17.4-SP-GLP-1-Fc质粒通过电穿孔转染至经悬浮无血清驯化的CHO K1细胞中。转染后用含25μM MSX的CD CHO培养基对转染后的细胞进行加压筛选，每3-4天更换一次培养基，直至细胞活率恢复至90％以上，撤去MSX。
蛋白表达：
将筛选后的细胞池以约0.5×106cell/ml接种至含60ml Dynamis培养基的250ml三角摇瓶中，培养条件：37℃，140RPM,5％CO2，85％湿度。从第3天起，每天流加补料培养基3％(v/v)Cell Boost 7a和0.3％(v/v)Cell Boost 7b，并将葡萄糖控制在5-8g/L的浓度。培养至第10天时终止培养。2000rmp离心10min收获上清，再经0.22μm滤膜过滤后保存于2-8℃。
表达量检测：
将GLP-1-Fc融合蛋白参考品用稀释液(含0.1％BSA的PBST(PBS+0.05％tween20))按梯度稀释为250，125，62.5，31.3，15.6，7.8，3.9ug/ml用于制备标准曲线，同将细胞池培养上清用稀释液稀释100倍。用Octet分子相互作用仪搭配Protein A生物传感器检测参考品和细胞培养上清的稀释样品，通过标准曲线可以计算得出培养上清中GLP-1-Fc融合蛋白的表达量，如表1所示。
表1
信号肽 细胞培养上清中GLP-1-Fc融合蛋白的表达量(g/L)
SEQ ID NO:5 2.6
SEQ ID NO:1 3.3
SEQ ID NO:2 2.9
SEQ ID NO:4 2.6
SEQ ID NO:3 3.1
本发明的这几个信号肽引导的GLP-1-Fc融合蛋白的表达量远大于现有技术中信号肽引导的GLP-1融合蛋白的表达量。
蛋白纯化
尽管GLP-1-Fc融合蛋白含有Fc标签，理论上用Protein A填料进行纯化，但因为GLP-1容易集聚的特殊性质，GLP-1-Fc融合蛋白洗脱时也会容易产生蛋白集聚。为避免纯化方法引入蛋白集聚而进入分析样品的后续分析，改用分子排阻色谱进行纯化。
层析柱：Superdex 200increase，10/300GL，CV＝24mL
流动相：10mM Na-Citrate，pH6.5
流速:0.5mL/min
样品:500uL上述细胞培养上清
收集并合并信号响应值在100mAU以上的主峰组分，并对其进行纯度和活性检测。
SEC-HPLC检测：
色谱柱：TSKgel G3000WXL(5)7.8×300
流动相:100mM磷酸钠盐,150mM氯化钠,pH7.0±0.2
流速:0.5mL/min
运行时间:30min
柱温:25±2℃
检测波长:214nm
取纯化后的蛋白溶液50uL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算纯度，如表2所示。
表2
信号肽序列 SEC-HPLC主峰(％)
SEQ ID NO:5 98.99
SEQ ID NO:1 98.09
SEQ ID NO:2 98.99
SEQ ID NO:4 98.90
SEQ ID NO:3 99.02
RP-HPLC检测
色谱柱：Ace3 C4-300(4.6×150mm,3um)
流动相A:0.05％(v/v)TFA-20％(v/v)乙醇水溶液
流动相B:0.05％(v/v)TFA-90％(v/v)乙醇水溶液
流速:1.0mL/min
柱温:60℃
检测波长:214nm
洗脱梯度如下表3所示。
表3
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 83 17
1.0 83 17
21.0 76 24
21.1 0 100
25.0 0 100
25.1 83 17
32.0 83 17
样品预处理:用0.1mol/L碳酸氢钠将样品稀释至约0.8mg/mL。取250μL样品稀释液，加入670μL 8mol/L盐酸胍溶液，再加入含50mg/mL二硫苏糖醇的8mol/L盐酸胍溶液100μL，混匀后37℃孵育30分钟，作为供试品溶液。取供试品溶液50uL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算纯度，如表4所示。
表4
信号肽序列 RP-HPLC主峰(％)
SEQ ID NO:5 65.12
SEQ ID NO:1 78.31
SEQ ID NO:2 77.78
SEQ ID NO:4 77.20
SEQ ID NO:3 77.04
体外生物学检测
GLP-1融合蛋白对HEK293/GLP-1R-CRE-荧光素酶细胞刺激后，胞内cAMP表达量增高，通过CRE启动子激活荧光素酶报告基因的表达。利用Promega公司生产的SteadyGlo荧光素酶检测系统，检测荧光素酶催化底物产生的荧光值，该指标与结合至细胞膜上GLP-1受体的蛋白产量呈正相关，从而检测GLP-1融合蛋白的体外生物学活性。
将HEK293/GLP-1R-CRE-荧光素酶细胞用胰酶消化后，用检测培养基(含0.5％BSA和0.25％FBS的DMEM培养基)重悬为约5×105个细胞/mL的细胞悬液，将此细胞悬液以100μL/孔均匀接种到白色不透明平底96孔细胞培养板中。取GLP-1融合蛋白，用检测培养基(含0.5％BSA和0.25％FBS的DMEM培养基)，梯度稀释成20，6.6667，2.2222，0.7407，0.2469，0.0823，0.0274ng/ml，每个梯度以50μL/孔加入细胞培养板中，每一稀释度设3个复孔。将细胞培养板在样板振荡器上振荡30秒，后置于37℃，5％CO2培养箱中培养4-6小时。加入荧光素酶试剂100μL/孔，于20-25℃下孵育40-70分钟，用酶标仪读取化学发光值，拟合曲线计算EC50，如表5所示。
表5
信号肽序列 EC<sub>50</sub>(ng/mL)
SEQ ID NO:1 1.4700
SEQ ID NO:2 1.2450
SEQ ID NO:4 1.3679
SEQ ID NO:3 1.3268
以上实验结果表明，本发明实施例中的这几个信号肽引导GLP-1融合蛋白分泌表达时，除了能得到较高的蛋白表达量，GLP-1融合蛋白的纯度和生物学活性也都达到较高水平。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州汉腾生物科技有限公司；佛山汉腾生物科技有限公司；佛山普津生物技术有限公司
<120> 信号肽在表达GLP-1融合蛋白中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
1 5 10 15
Val His Pro
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Val His Pro
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Trp Leu Leu Ala Val Ala Pro
1 5 10 15
Gly Ala His Pro
20
<210> 5
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Ala His Pro
<210> 6
<211> 279
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu
35 40 45
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
50 55 60
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
65 70 75 80
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
85 90 95
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
100 105 110
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
115 120 125
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
130 135 140
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
145 150 155 160
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
165 170 175
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
180 185 190
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
195 200 205
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
210 215 220
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
225 230 235 240
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
245 250 255
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
260 265 270
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275

Claims (10)

1.信号肽在表达GLP-1或GLP-1融合蛋白中的应用，其特征在于，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述信号肽含有选自以下任意一种的氨基酸替换：
第14位氨基酸替换为T；
第19位氨基酸替换为S；
第9位氨基酸替换为FW，第17位氨基酸替换为A。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述GLP-1融合蛋白的融合标签为人免疫球蛋白Fc或白蛋白。
4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括：
编码信号肽的多核苷酸，和
编码GLP-1或GLP-1融合蛋白的多核苷酸；
所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述信号肽含有选自以下任意一种氨基酸替换：
第14位氨基酸替换为T；
第19位氨基酸替换为S；
第9位氨基酸替换为FW，第17位氨基酸替换为A。
6.根据权利要求4或5所述的多核苷酸，其特征在于，所述GLP-1融合蛋白的融合标签为人免疫球蛋白Fc或白蛋白。
7.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求4-6任一项所述的多核苷酸。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求7所述的表达载体。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
10.一种GLP-1或GLP-1融合蛋白的生产方法，其特征在于，使用权利要求8或9所述的宿主细胞表达GLP-1或GLP-1融合蛋白。
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