KR101987272B1 - Fc 감마 수용체 변이체 MG2A28.1 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Fc 감마 수용체 변이체를 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 Fc 감마 수용체 변이체는 Fc 감마 수용체의 일부 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 치환하여 최적화함으로써 면역글로불린에 대한 선택적 결합력이 우수하여 약물의 체내 반감기 증가, 면역글로블린의 검출 및 정제, 장기이식반응 억제 또는 자가면역질환의 예방 또는 치료용도로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

Fc 감마 수용체 변이체 MG2A28.1{Fc gamma receptor variant MG2A28.1}
본 발명은 IgG 항체에 대해 결합력이 향상된 Fc 감마 수용체 변이체에 관한 것이다.
인체 면역세포들에서 발현되는 Fc감마 수용체들(FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa)은 IgG 항체 Fc영역(lower hinge region 및 upper CH2 region)에 결합을 하는데, 이들 Fc감마 수용체들 중 FcγRI은 혈중 IgG에 가장 높은 친화도를 가지고 있지만 열적안정성(thermostability)이 매우 좋지 않고 발현율이 낮아서 의료용으로 개발하거나 산업적 적용을 목적으로 개발하기가 어려움이 있다.
반면, FcγRIIa는 대식세포(macrophage)와 단핵구(monocyte), 호중구(neutrophil) 등의 다양한 면역세포들 표면 발현되어 있는 세포막 단백질로써 IgG와의 친화도는 낮은 편에 속는 수용체이다(KD = ~10-6). FcγRIIa는 IgG 항체 Fc 영역의 위쪽 부분 (lower hinger region과 upper CH2 region)에 결합하고 세포 내부의 신호전달 메커니즘을 통해 해당 면역세포를 활성화시킨다.
체내에 존재하는 야생형 Fc감마 수용체보다 IgG에 대해 월등히 높은 친화도를 갖는 세포 바깥영역에 존재하는 Fc감마 수용체를 soluble 하게 생산하여 주입할 수 있다면, 자가세포를 항원으로 인지한 자가항체가 면역세포 표면의 Fc감마 수용체에 결합하는 것을 효과적으로 저해하여, 자가 항체(Auto-antibody)가 장기에 축적되어 자가 세포를 외부의 항원으로 인지하고 염증을 일으키는 질환인 자가면역질환을 치료하는데, 결정적인 도움을 줄 수 있다.
또한, 일반적으로 항체를 제외한 대부분의 단백질 의약품들은 체내에서 지속시간이 짧고 혈중 반감기가 24시간을 넘지 못한다. 항체 IgG는 음세포작용(pinocytosis)에 의해 무작위로 세포 내로 들어간 뒤, 약산성 pH 조건인 엔도좀에서 FcRn과 결합하여 분해되지 않고 중성 pH인 혈중으로 반출됨으로써 약 3주 동안 체내에서 유지되는 특징이 있는데, Fc감마 수용체가 항체 IgG과 결합하는 과정을 이용하여 단백질 의약품의 혈중 반감기를 증가시키는 융합 파트너로 개발이 가능하다.
타깃 질병에 높은 특이성과 낮은 부작용을 보이는 단백질 의약에 대한 수요가 꾸준히 증가하고 있고, 이에 발맞추어 단백질의약의 효능 및 안정성을 개선하기 위한 연구들이 전 세계적으로 활발히 진행되고 있다. 특히 단백질 의약의 혈중 반감기(serum half-life)는 해당 단백질의 작용기작, 부작용 정도, 치료 효능, 생산 비용, 투여 횟수 등에 결정적인 역할을 하기 때문에 세계적 선두 제약기업들과 단백질 공학 선도 연구 그룹들을 중심으로 단백질 의약의 반감기 증가를 위한 연구들이 활발하게 수행되고 있다.
대표적으로 PEG(polyethylene glycol) 고분자를 이용하여 단백질을 수식하거나 목적 단백질을 항체 Fc나 알부민(albumin)에 융합시켜 혈중 반감기를 증가시키는 기술들이 이용되고 있다.
PEG와 같은 생체 친화적 고분자로 목적 단백질의 특정 부위에 접합(conjugation)시키거나 혹은 여러 부위에 비특이적으로 결합시킬 경우 단백질 분해 효소에 의한 분해를 줄이고, 분자량 증가를 통해 신장에서 배설이 감소되고 혈중 유지 시간이 증가될 수 있다. 1990년 Enzon사에 의해 개발된 PEG로 수식된 adenosine deaminase가 US FDA에서 허가를 얻어 시판된 이후 현재까지 10개 이상의 제품이 시판되어 임상에 이용되고 있다. Roche사는 C형 간염의 치료제로 사용되는 Interferon-α를 PEG 고분자로 수식(Pegylation)하여 PEGASYS라는 상품명으로 상업화하였고, Amgen사에서는 백혈구 감소증을 치료하기 위해 개발한 Filgrastim (Neupogen)의 N-말단에 20 kDa PEG를 수식한 지속형 제형인 Neulasta를 상업화하여 기존시장을 확대하였다. 그러나 많은 양의 단백질을 주사할 경우 체내에서 PEG moiety 제거가 늦어지게 되고 분자량이 큰 PEG를 장기적으로 주사할 경우에 부작용 문제가 야기되는 것으로 보고되고 있다. 혈중 안정성은 PEG 분자량 크기와 밀접한 관계가 있는데, 분자량 40,000 Da 이상의 PEG 제조가 쉽지 않고, 분자량이 증가할수록 단백질과의 반응성이 낮아 수율이 낮아지며, 단백질 자체 역가도 급격히 떨어지는 것으로 알려져 있다. 또한 PEG 고분자는 다양한 분자량 분포를 가진 중합체의 혼합물이기 때문에 PEG로 접합된 단백질 치료제는 비균질성 (heterogeniety)을 가지게 되고 생산과 품질관리의 어려움을 발생시킨다. 따라서 단백질 의약품의 혈중 반감기 증가를 위해서는 PEG와 같은 고분자 수식과 차별화 되는 새로운 단백질 공학기술 개발이 절실히 요구되고 있는 상황이다.
약리 효과가 있는 단백질 의약품의 혈중 반감기 향상을 위해 항체 Fc와 융합한 다양한 Fc-융합단백질 의약품이 연구 개발되고 있으며, 치료용 단백질에 인간항체 Fc 영역을 융합하여 발현함으로써 FcRn 수용체의 결합을 통해 세포 재순환 기작을 이용할 수 있다. 1998년 interferon-α와 Fc 절편을 펩타이드 링커로 연결하는 기술이 개발되었으며, 2003년에는 인간 erythropoietin을 펩타이드 링커로 Fc와 연결하는 융합단백질이 개발되었다. 대표적인 예로 etanercept(Enbrel®)는 관절염을 일으키는 주된 사이토카인(cytokine)인 TNF-α 저해제로 TNF-α 수용체 중 세포 바깥쪽 부분에 존재하는 부분을 면역글로불린 Fc 단편과 융합시킨 단백질 의약품이고, etanercept를 포함해 현재 10개의 Fc 융합 단백질들이 US FDA에 허가를 받아 임상에 이용되고 있다. 그러나 Fc 절편이 융합된 단백질 치료제들은 Fc 고유의 기능인 면역세포 활성화 기능에 의한 세포독성 문제를 극복해야 하는 과제가 대두되었으며, receptor-mediated clearance에 의해 반감기가 현저하게 증가하지 않는다는 단점이 있다. 또한 상동이중체(homodimer)로 존재하는 Fc 단편과 융합되어 발현되어야 하므로 항상 dimer 형태로 발현이 되어 목적 단백질의 약리 활성을 변화 시킨다는 문제점이 있다.
항체 Fc 절편뿐만 아니라 인간 혈청에서 높은 농도로 존재하는 알부민(albumin)을 융합 파드너로 사용하여 목적 단백질 치료제의 혈중 반감기를 증가시키는 연구들도 수행되고 있다. 알부민 융합기술을 보유하고 있는 Human genome science사는 인간성장 호르몬, 인터페론 등의 단백질 의약에 알부민을 융합하여 현재 임상진행 중에 있다. 알부민은 분자량이 큰 거대단백질(분자량: 66.5 kDa)이기 때문에 융합단백질 형성시 목적 단백질의 활성을 저해할 가능성을 내재하고 있다.
FcγR 변이체를 이용하는 기술은 현재까지 시도되지 않은 새로운 접근방법으로써 발굴되는 FcγR 변이체를 임상에 이용되고 있는 다양한 단백질 치료제와 신약 후보 단백질들에 적용함으로써 혈중 반감기를 크게 향상 시킬 수 있을 것으로 예상된다. 또한 약리학적 효능은 가지고 있지만 체내에서 낮은 반감기와 짧은 체내 유지시간 때문에 임상 적용이 어려운 수많은 펩타이드 의약품 치료제 개발에도 발굴된 FcγR 변이체 융합을 통해 혈중 반감기를 크게 증가시킬 수 있다. 따라서 약물 타깃 조직에서 오랜 시간동안 효능 발휘를 가능하게 함으로써, 투여 용량과 빈도를 획기적으로 줄일 수 있고, 신약개발 비용 감소와 신약개발 가능성을 크게 향상시킬 수 있을 것으로 보인다.
추가적으로, 자가면역질환은 체내에서 생성되는 항체가 자가의 세포를 인식하여 면역반응을 일으키는 면역세포들이 자가 세포를 공격하는 질병인데, 면역세포들은 항체와 결합할 수 있는 FcγRs이 존재하는데 항체와 결합하게 되면 ADCC나 ADCP와 같은 면역 반응이 일어나게 된다. 따라서 soluble한 FcγRIIa을 투여함으로써 자가 세포를 인식하는 항체와 결합하게 되어 자가세포를 인식하더라도 면역세포와 결합하지 못하게 차단할 수 있기 때문에 자가면역질환 치료제로도 개발이 가능한 장점을 가질 수 있다. 이러한 목적으로 IgG 친화도가 높지 않은 야생형 soluble한 FcγRIIb을 이용하여 자가면역질환을 억제하는 약물이 현재 인간을 대상으로 한 임상 2상 시험 중이다(참고문헌, Sondermann et. al., Curr Opin Immunol, 2016).
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.
본 발명자들은 체내에서 낮은 반감기와 짧은 체내 유지시간 때문에 임상 적용이 어려운 수많은 펩타이드 의약품 치료제의 혈중 반감기를 연장할 수 있는 Fc 감마 수용체 변이체를 찾고자 노력하였다. 그 결과, 일부 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 치환하여 최적화함으로써 야생형과 비교하여 IgG 결합력이 획기적으로 연장된 Fc 감마 수용체를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 Fc 감마 수용체 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드, 핵산분자 또는 벡터를 포함하는 조성물를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드 또는 핵산분자를 포함하는 조성물를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위를 검출하기 위한 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드와 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩타이드가 결합된 단백질 또는 펩타이드 융합체를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 Fc 감마 수용체 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 시료에 포함된 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위의 존재를 확인하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 시료에 포함된 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위를 정제하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위에 대한 결합력이 향상된 인간 Fc 감마 수용체 변이체를 스크리닝하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 Fc 감마 수용체 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명자들은 체내에서 낮은 반감기와 짧은 체내 유지시간 때문에 임상 적용이 어려운 수많은 펩타이드 의약품 치료제의 혈중 반감기를 연장할 수 있는 Fc 감마 수용체 변이체를 찾고자 노력하였다. 그 결과, 일부 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 치환하여 최적화함으로써 야생형과 비교하여 IgG 결합력이 획기적으로 연장된 Fc 감마 수용체를 확인하였다.
본 명세서에서 용어, “Fc 감마 수용체 변이체”는 Fc 감마 수용체의 폴리펩타이드가 야생형(wild type) Fc 감마 수용체와는 다른 것을 의미한다. 이러한 차이로서는 면역 글로불린의 결합능 차이, 치료 능력의 차이, 아미노산 조성 또는 용해성 등을 들 수 있다. 바람직하게는 면역 글로불린 또는 이의 Fc 부위(Fc region)에 결합할 수 있는 천연의 또는 합성 아미노산으로 구성되는 Fc 감마 수용체에서 1 또는 그 이상의 아미노산 서열이 변형된 것을 의미하며, 상기 변형은 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 형태를 포함한다.
면역 글로불린은 IgG, IgE, IgA, IgM 또는 IgD 중 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 IgG인 것이다. 면역 글로불린은 인간, 래트, 마우스, 소, 양, 염소 및 닭, 타조나 낙타를 포함한 어느 동물 유래일 수 있으며, 바람직하게는 인간 유래이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 Fc 감마 수용체 변이체는 야생형의 Fc 감마 수용체와 비교하여 향상된 특성을 갖는다.
본 명세서에서 용어, “향상된 특성”이라는 말은 야생형의 감마 Fc 수용체에 비해 바람직한 특성을 얻을 수 있는 것을 의미한다. 이 특성은 면역글로블린 또는 Fc에 대한 결합능을 증가 또는 촉진시키거나, 면역글로블린의 Fc에 결합하여 면역기능을 조절 또는 억제시키거나, 치료제로서 사용되는 폴리펩타이드 또는 단백질의 혈청 중의 반감기를 증가시키거나, 목적하는 폴리펩타이드 또는 단백질(예를 들어, 면역글로블린)의 검출 가능하게 하거나 이에 대한 검출 정확도를 향상시키는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, “면역 글로불린과의 결합능의 변화”라는 것은 본 발명의 Fc 감마 수용체 변이체가 야생형의 Fc 감마 수용체의 면역 글로불린 결합 활성과는 다른 활성을 가지는 것을 의미한다. 이러한 것으로서는 면역 글로불린과의 수용체의 결합능, 즉 수용체가 야생형의 Fc 감마 수용체와 비교한 경우 면역 복합체, 응집체, 이량체 또는 단량체 면역 글로불린과의 결합능이 변화하는 것을 들 수 있다.
본 명세서에서 용어, “면역 글로불린과의 결합능에 영향을 주는 1 또는 그 이상의 아미노산의 변형”은 야생형의 Fc 감마 수용체와 면역 글로불린의 결합에 관련된 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기의 영역이 Fc 감마 수용체 내에서 변화하는 것을 의미한다. 면역 글로불린의 결합에 관련된 아미노산은 직접 면역 글로불린의 결합으로 기능하는 것이라도 또는 결합이 발생하도록 수용체의 구조상의 일체성을 유지하는 것 등에 의해 간접적으로 발생하는 것일 수 있다. 이러한 변화는 치환, 결실 또는 삽입된 결과일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 Fc 감마 수용체 변이체는 야생형(wild type) Fc 감마 수용체와 비교하여 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위에 대한 결합력이 향상된다. 상기 변이된 Fc 감마 수용체 변이체는 야생형 Fc 감마 수용체와 비교하여 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상 결합력이 향상되거나, 야생형(wild type) Fc 감마 수용체와 비교하여 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 20배 이상 또는 30 배 이상 증가될 수 있다(실시예 2, 8, 10, 11, 13, 15 내지 17 및 19).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 변이체는 야생형(wild type) Fc 감마 수용체와 비교하여 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위에 대한 결합력이 3배 이상 향상된 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 Fc 수용체는 단리된 조제물의 형태를 가지며, 이것은 다른 단백질 및/또는 비단백질성 분자가 제거되어 있을 정도 정제되는 것을 의미한다.
조제물의 순도는 중량, 활성, 아미노산의 유사성, 항체의 반응성 또는 다른 기존의 수단에 의해 측정되었을 때의 비-Fc 수용체형 분자에 대해서 적어도 40％ 이상, 바람직하게는 60％ 이상, 보다 바람직하게는 75％ 이상, 보다 더 바람직하게는 85％ 이상의 Fc 수용체 특성을 나타내는 것이다.
본 발명의 Fc 수용체를 포함하는 폴리펩타이드는 세포막 또는 지지체 수단에 결합시키거나, 또는 가용성 형태를 가지는 것일 수 있다. 약제학적 조성물로서 사용하려고 할 때는 상기 폴레펩타이드는 가용성인 것이 바람직하다.
상기 폴리펩타이드는 적당한 조건 하에서 검출 가능한 시그널을 형성하는 리포터 분자로 표지될 수 있다. 이러한 리포터 분자로서는 방사성 뉴클레오타이드(radio-nucleotide), 화학 발광 분자, 생물 발광 분자, 형광 분자 또는 효소를 들 수 있다. 일반적으로 사용되는 효소로서는 다른 것 중 서양 고추냉이의 퍼옥시다제, 포도당 산화효소, β-갈락토시다아제 및 알칼리 포스파타아제 등을 들 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 Fc 수용체 변이체는 야생형의 Fc 수용체의 아미노산의 자연적 또는 인공적 돌연변이체(mutant), 변이체(variant) 또는 유도체를 포함한다. 상기 돌연변이체, 변이체 또는 유도체의 기초를 형성하는 야생형의 Fc 수용체는 사람 또는 동물종 유래일 수 있다. 이러한 동물종은 마우스, 래트, 토끼, 소, 양, 낙타 또는 염소종 등의 포유동물종인 것이 바람직하다.
본 발명의 Fc 수용체 변이체를 제조하기 위한 아미노산 변형, 즉, 결손, 삽입 또는 치환은 기존의 수단에 의해 수행된다. Fc 수용체 변이체가 재조합체 유래일 때는 이 분자를 코드화하는 핵산은 1 이상의 아미노산의 삽입 혹은 치환에 관하는 적당한 코드를 그 배열 중에 도입하거나 코딩 배열에서 적당하게 결손시킬 수도 있다. 수용체형 분자를 denovo 펩타이드 합성에 의해 제조할 때는 목적으로 하는 아미노산 서열을 도입할 수도 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 변이체는 서열목록 제43서열 또는 서열목록 제49서열의 야생형(wild type) Fc 감마 수용체의 서열에서 117번째 아미노산 및 159번째 아미노산이 변형된 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 변이체는 서열목록 제43서열 또는 서열목록 제49서열의 야생형(wild type) Fc 감마 수용체의 서열에서 117번째 아미노산, 119번째 아미노산 및 159번째 아미노산이 변형; 및 추가적으로 86번째 아미노산, 127번째 아미노산 및 171번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 아미노산 변형;된 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 변이체는 서열목록 제43서열 또는 서열목록 제49서열에서 117번째 아미노산이 아스파라긴(N)으로 치환되고 159번째 아미노산이 글루타민(Q)으로 치환된 서열을 포함하는 Fc 감마 수용체 변이체인 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 변이체는 상기 서열목록 제43서열 또는 서열목록 제49서열에서 상기 117번째 아미노산 및 159번째 아미노산 치환과 더불어, 추가적으로 55번째 아미노산, 86번째 아미노산, 119번째 아미노산, 127번째 아미노산 및 171번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 아미노산이 치환된 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 변이체는 서열목록 제43서열 또는 서열목록 제49서열에서 86번째 아미노산이 아스파르트산(D)으로, 117번째 아미노산이 아스파라긴(N)으로, 119번째 아미노산이 메티오닌(M) 또는 발린(V)으로, 127번째 아미노산이 류신(L)으로, 159번째 아미노산이 글루타민(Q)으로, 171번째 아미노산이 글루탐산(E)으로 치환된 서열을 포함하는 Fc 감마 수용체 변이체인 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 변이체는 상기 제43서열 또는 서열목록 제49서열에서 117번째 아미노산 및 159번째 아미노산 치환과 더불어, 추가적으로 55번째 아미노산이 히스티딘(H)으로, 86번째 아미노산이 아스파르트산(D)으로, 119번째 아미노산이 메티오닌(M) 또는 발린(V)으로, 127번째 아미노산이 류신(L)으로, 그리고 171번째 아미노산이 글루탐산(E)으로 치환된 군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 아미노산이 치환된 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 변이체는 서열목록 제44서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 변이체는 서열목록 제45서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 변이체는 서열목록 제46서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 변이체는 서열목록 제47서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 변이체는 서열목록 제48서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 변이체는 서열목록 제50서열을 포함하는 것이다.
본 발명이 포함하는 Fc 감마 수용체 변이체는 다양한 종류의 Fc 감마 수용체(FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 등)의 변이체를 포함하며, 바람직하게는 Fc 감마 수용체 IIa 변이체 또는 Fc 감마 수용체 IIb 변이체인 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 Fc 감마 수용체 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 제조방법을 제공한다:
a) 상기의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및
b) 상기 숙주세포에 의해 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계.
본 발명의 핵산분자는 단리된 것이거나 재조합된 것일 수 있으며, 단일쇄 및 이중쇄 형태의 DNA 및 RNA뿐만 아니라 대응하는 상보성 서열이 포함된다. “단리된 핵산”은 천연 생성 원천에서 단리된 핵산의 경우, 핵산이 단리된 개체의 게놈에 존재하는 주변 유전 서열로부터 분리된 핵산이다. 주형으로부터 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 핵산, 예컨대 PCR 산물, cDNA 분자, 또는 올리고뉴클레오타이드의 경우, 이러한 절차로부터 생성된 핵산이 단리된 핵산분자로 이해될 수 있다. 단리된 핵산분자는 별도 단편의 형태 또는 더 큰 핵산 구축물의 성분으로서의 핵산 분자를 나타낸다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 “작동가능하게 연결”된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더(leader)의 DNA는 폴리펩타이드가 분비되기 전의 형태인 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩타이드 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 “작동가능하게 연결된”은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 통상적인 방법에 따라 사용한다.
본 명세서에서 용어 “벡터”는 핵산 서열을 복제할 수 있는 세포로의 도입을 위해서 핵산 서열을 삽입할 수 있는 전달체를 의미한다. 핵산 서열은 외생(exogenous) 또는 이종(heterologous)일 수 있다. 벡터로서는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들면 박테리오파지)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 벡터를 구축할 수 있다(Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994 등).
본 명세서에서 용어 “발현 벡터”는 전사되는 유전자 산물 중 적어도 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한 벡터를 의미한다. 일부의 경우에는 그 후 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 벡터에는 다양한 조절서열을 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 또 다른 기능도 제공하는 핵산 서열도 포함될 수 있다.
본 명세서에서 용어 “숙주세포”는 진핵생물 및 원핵생물을 포함하며, 상기 벡터를 복제할 수 있거나 벡터에 의해 코딩되는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형질 전환 가능한 생물을 의미한다. 숙주세포는 상기 벡터에 의해 형질감염(transfected) 또는 형질전환(transformed) 될 수 있으며, 이는 외생의 핵산분자가 숙주세포 내에 전달되거나 도입되는 과정을 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 시료에 포함된 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위의 존재를 확인하는 방법을 제공한다:
a) IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위의 존재 여부를 판단하고자 하는 시료를 준비하는 단계;
b) 상기 시료에 제 1 항의 폴리펩타이드를 혼합하여 서로 결합시키는 단계; 및
c) 상기 폴리펩타이드가 결합된 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위의 존재를 확인하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 시료에 포함된 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위를 정제하는 방법을 제공한다:
a) IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위를 포함하는 시료에 제 1 항의 폴리펩타이드를 혼합하여 서로 결합시키는 단계; 및
b) 상기 폴리펩타이드가 결합된 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위를 정제하는 단계.
상술한 바와 같이, 본 발명의 Fc 감마 수용체 변이체는 야생형 Fc 감마 수용체와 비교하여 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위에 대한 향상된 결합력을 갖기 때문에, 상기 특성을 활용하여 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위의 존재를 확인하거나, 이를 검출하거나, 이를 정제하는 용도로 유용하게 활용할 수 있다.
폴리펩타이드의 분리 및 정제는 몇 가지 공지된 기술 중 어느 하나에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마로그래피 및 친화성 크로마토그래피, 고속액체크로마토그래피(HPLC), 역상고속액체크로마토그래피, 제조용 디스크겔전기영동법을 들 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 상기 폴리펩타이드의 분리 및 정제 기술은 통상적인 방법에 의한 폴리펩타이드의 변형을 요구할 수 있다. 예를 들어, 니켈 컬럼 정제 시 단백질에 히스티딘 태그를 부가할 수 있다. 다른 변형으로는 더 높거나 더 낮은 활성을 유발하고, 더 높은 단백질 생산을 허용하거나, 단백질의 정제를 단순화할 수 있다. 다른 태그로는 플래그 태그(flag-tag) 또한 포함할 수 있다. 이러한 태그는 바람직하게는 진핵생물 숙주에 사용된다.
폴레펩타이드를 정제하기 위한 방법으로는, 용해도의 변화를 통한 단백질 정제 방법으로 황산암모늄 침전법을 포함한다. 이러한 방법은 염석법(salting out)과 같은 일반적인 기술보다 특정한 것이다. 황산암모늄은 그 용해도가 높으므로, 높은 이온강도의 염 용액을 허용할 수 있어 일반적으로 사용된다. 폴리펩타이드의 용해도는 상기 용액의 이온강도에 따라 달라지므로, 염 농도에 따라 변화한다.
폴리펩타이드의 용해도는 높은 이온강도에서 뚜렷하게 다르기 때문에, 염석법은 특정한 폴리펩타이드의 정제에 도움이 되는 매우 유용한 방법이다. 코스모트로픽 황산암모늄(kosmotropic ammonium sulfate) 첨가에 의해, 풀림 및 이상접힘 종류 같은 폴딩 부산물뿐 아니라, 숙주세포 유래의 세포벽 성분과 같은 불순물 및 폴리펩타이드가 침전된다. 침전 농도의 증가에 따라 침전 효과는 증가하므로, Fc 수용체 변이체가 고농도의 황산암모늄에서와 같은 침전에 대해 저항하는 동안은 고순도 Fc 수용체 변이체 제조물질을 획득할 수 있다.
상기 침전된 폴리펩타이드는 원심분리에 의해 제거되고, 용액 안에 여전히 폴리펩타이드 오염물의 최대량이 남아있는 동안, 황산암모늄 농도는 대부분의 관심 폴리펩타이드가 침전하는 값으로 증가한다. 다음 정제 단계를 위해 상기 침전된 관심 폴리펩타이드는 원심분리하여 회수되고, 새로운 버퍼에 용해된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위에 대한 결합력이 향상된 Fc 감마 수용체 변이체를 스크리닝하는 방법을 제공한다:
a) 서열목록 제43서열 또는 서열목록 제49서열에서 117번째 아미노산이 아스파라긴(N)으로 치환되고 159번째 아미노산이 글루타민(Q)으로 치환된 서열을 포함하는 Fc 감마 수용체 변이체 라이브러리를 구축하는 단계; 및
b) 상기 라이브러리에서 상기 두 가지의 아미노산 서열의 치환만을 포함하는 Fc 감마 수용체 변이체와 비교하여 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위에 대한 결합력이 보다 향상된 Fc 감마 수용체 변이체를 선별하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위에 대한 결합력이 향상된 Fc 감마 수용체 변이체를 스크리닝하는 방법을 제공한다:
a) 서열목록 제43서열 또는 서열목록 제49서열에서 117번째 아미노산이 아스파라긴(N)으로 치환되고 159번째 아미노산이 글루타민(Q)으로 치환된 서열을 포함하고, 추가적으로 86번째 아미노산, 127번째 아미노산 및 171번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 포함하는 Fc 감마 수용체 변이체 라이브러리를 구축하는 단계; 및
b) 상기 라이브러리에서 상기 117번째 및 159번째의 두 가지의 아미노산 서열의 치환만을 포함하는 Fc 감마 수용체 변이체와 비교하여 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위에 대한 결합력이 보다 향상된 Fc 감마 수용체 변이체를 선별하는 단계.
본 발명의 스크리닝 방법을 이용하면, Fc 감마 수용체 변이체와 비교하여 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위에 대한 결합력이 보다 향상된 Fc 감마 수용체 변이체를 유용하게 선별할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에 의해 선별된 변이체는 하기의 아미노산 변형을 추가적으로 포함할 수 있다: 서열목록 제43서열 또는 서열목록 제49서열에서 55번째 아미노산, 86번째 아미노산, 119번째 아미노산, 127번째 아미노산 및 171번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 아미노산이 치환.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 추가적으로 55번째 아미노산이 히스티딘(H)으로, 86번째 아미노산이 아스파르트산(D)으로, 119번째 아미노산이 메티오닌(M) 또는 발린(V)으로, 127번째 아미노산이 류신(L)으로, 그리고 171번째 아미노산이 글루탐산(E)으로 치환된 군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 아미노산이 치환된 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 스크리닝 방법을 통하여, IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위에 대한 결합력이 보다 향상된 Fc 감마 수용체 변이체를 선별하였다(실시예 7 및 8).
본 발명의 스크리닝 방법은 형광표지세포분리(FACS) 스크리닝, 또는 다른 자동화된 유세포 분석 기술을 사용할 수 있다. 유세포 분석기를 실시하기 위한 기기는 당업자에게 공지이다. 그러한 기기의 예로는 FACSAria, FACS Star Plus, FACScan 및 FACSort 기기(Becton Dickinson, Foster City, CA), Epics C(Coulter Epics Division, Hialeah, FL), MOFLO(Cytomation, Colorado Springs, Colo.), MOFLO-XDP (Beckman Coulter, Indianapolis, IN)를 들 수 있다. 일반적으로 유세포 분석기 기술에는 액체 시료 중의 세포 또는 다른 입자의 분리가 포함된다. 전형적으로는 유세포 분석기의 목적은 분리된 입자를 이들의 하나 이상의 특성(예를 들면 표지된 리간드 또는 다른 분자의 존재)에 대해서 분석하는 것이다. 입자는 센서에 의해 하나씩 통과되며, 크기, 굴절, 광산란, 불투명도, 조도, 형상, 형광 등에 기초하여 분류된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩타이드, 핵산분자 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 시료에 포함된 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위를 검출하기 위한 것이다.
본 명세서에서 용어, “시료”는 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위를 포함할 가능성이 있는 물질을 의미한다. 또한, 피검자로부터 자연적 또는 인위적으로 분리된 것으로 체외로 분리된 분변, 세포, 혈액, 혈장, 혈청, 모발 또는 뇨 등을 이용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 “피검자”는 인간, 침팬지를 포함한 영장류, 개, 고양이 등의 애완동물, 소, 말, 양, 염소 등의 가축동물, 마우스, 래트 등의 설치 류 등의 포유동물을 포함하는 의미로 해석된다.
상기 조성물은 또한 키트에 포함될 수 있으며, 시료에 포함된 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위를 검출하거나, 피검자의 IgG 항체의 양을 정량하거나, 환자(예를 들어, 면역과민 반응, 자가면역 질환, 장기이식에 의한 면역의 변화)의 면역 능력 관련 상태를 측정하거나 진단하는 용도로 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩타이드와 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩타이드가 결합된 단백질 또는 펩타이드 융합체를 제공한다.
본 발명에 따른 단백질 또는 펩타이드 융합체는, 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩타이드를 상기 Fc 감마 수용체 변이체와 결합시켜, 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기를 증가시킨 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 용어, “단백질 융합체(fusion protein/fusion polypeptide)”는 하나 이상의 생리활성을 가진 단백질을 Fc 감마 수용체 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 결합시킨 새로운 분자 구성을 가진 단백질 융합체를 의미할 수 있다. 또한 “펩타이드 융합체(fusion peptide)”는 하나 이상의 생리활성을 가진 저분자량의 펩타이드를 Fc 감마 수용체 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 결합시킨 새로운 분자 구성을 가진 펩타이드 융합체를 의미한다.
상기 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩타이드는 직접 또는 아미노산으로 구성된 링커를 이용하여 Fc 감마 수용체 변이체에 결합될 수 있다.
상기 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드와 Fc 감마 수용체 변이체는 유전자 재조합 기술을 이용하여 결합시키는 것이 바람직하나, 당업계에 알려져 있는 가교제를 사용하여 Fc 감마 수용체 변이체의 N-말단, C-말단 또는 유리기에 결합시킬 수 있다.
상기 생리활성 단백질은 호르몬류 및 이의 수용체, 생물학적반응 조절물질 (biological response modifier) 및 이의 수용체, 사이토카인류 및 이의 수용체, 효소류, 항체류, 항체 단편류 등을 포함할 수 있다. 구체적으로는, 상기 생리활성 단백질은 인간성장호르몬(hGH), 인슐린, 난포자극호르몬(follicle-stimulating hormone, FSH), 인간 융모성 성선자극호르몬(human chorionic gonadotropin), 부갑상선호르몬(parathyroid hormone, PTH), 적혈구 촉진인자(EPO), 혈소판생성 촉진인자(TPO), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨, 대식세포 (marophage) 활성화 인자, 종양괴사인자(tumor necrosis factor), 조직플라스미노겐 활성체(tissue plasminogen activator), 혈액응고인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ, hBMP2 (human bone morphogenic protein 2), KGF(keratinocyte growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 알파-갈락토시다제 A(α-galactosidase A), 알파 이두로니다제(α-L-iduronidase), 이두로네이트-2-설파타제(iduronate-2-sulfatase), 락타제(lactase), 아데노신 데아미나제(adenosine deaminase), 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(chitinase), 글루타메이트 디카복실라제(glutamate decarboxylase), 이미글루세라제(imiglucerase), 리파제(lipase), 유리카제(uricase), 혈소판-활성인자 아세틸하이드롤라제(platelet-activating factor acetylhydrolase), 중성 엔도펩티다제(neutral endopeptidase), 유로키나제, 스트렙토키나제, 마이엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase), 수퍼옥사이드디스뮤타제(superoxide dismutase), 보톨리늄 독소, 콜라게나제, 히알루로니다제(hyaluronidase), L-아스파라기나제(L-asparaginase), 단일클론항체, 다클론항체, scFv, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fd 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 생리활성 펩타이드는 글루카곤-유사 펩티드-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1) 및 이의 유사체, 엑센딘 및 이의 유사체, 소마토스타틴(somatostatin) 및 이의 유사체, LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone) 작용제 및 길항제, 아드레노코티코트로픽 호르몬(adrenocorticotropic hormone), 성장호르몬-방출 호르몬(growth hormone-releasing hormone), 옥시토신(oxytocin), 티모신 알파-1(thymosin alpha-1), 코티코트로핀-방출인자(corticotropin-releasing factor), 칼시토닌(calcitonin), 비발리루딘(bivalirudin), 바소프레신 유사체(vasopressin analogues), 및 생리활성 단백질의 단편 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 펩타이드는 다른 생리활성 단백질 또는 펩타이드의 체내 반감기를 증가시킬 목적으로 유용하게 활용될 수 있으며, 상기 단백질 또는 펩타이드 융합체는 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기가 증가될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 면역 억제용 약제학적 조성물인 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 (a) 상기 폴리펩타이드, 이를 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 장기이식반응 억제용 또는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물인 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 면역 또는 장기이식반응 억제나 자가면역질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 명세서에 용어, "자가면역질환"은 용어 "자가면역장애"와 혼용되며, 그 자신의 세포, 조직, 장기 또는 이들 대상의 면역학적 반응에 의해 유발되는 세포, 조직, 장기 또는 이들의 손상에 의해 특정화된 대상의 상태를 의미한다. 용어, "염증성 질환"은 용어 "염증성 장애"와 혼용되며, 염증, 바람직하게는 만성적 염증에 의해 특정화된 상태를 의미한다. 자가면역질환은 염증과 관련될 수도 있고, 그렇지 않을 수도 있다. 또한, 염증은 자가면역질환을 유발할 수도, 그렇지 않을 수도 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 자가면역질환의 예는 알로페시아 그레아타(alopecia greata), 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 아디슨 질환, 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근병증, 복강 스프루우-피부염(celiac sprue-dermatitis), 아토피성 피부염, 천식, 비염, 만성 피로 면역이상 증후군, 만성염증성 탈수초 다발성 신경병증, Churg-Strauss 증후군, 반흔성유천포창, CREST 증후군, 한냉 응집소 질환, 크론씨병, 원판성 낭창, 복태성복합한냉글로불린혈증, 섬유근통-섬유근염, 사구체신염, 그레이브스 질환, 귈레인 바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유화증, 특발성 혈소판 감소성 자반증, IgA 신경염, 연소자성 관절염, 편평태선, 홍반성 루푸스, 메니에르병, 혼합성 연결 조직 질환, 다발성 경화증, 타입 I 또는 면역-매개 당뇨병, 중증근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결정성 다발동맥염, 다발연골염, 자가면역성 다선 증후군, 류마티스 다발성근통, 다발성 근염과 피부근염, 일차성 무감마글로불린혈증, 일차성 담증성 간경변, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 공피증, 강직인간 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 홍반성 루푸스, 다가야스 동맥염, 일시적 동맥염, 거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증 및 베게너 육아종증을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이며, 예컨대, 정맥 내 주입, 국소 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 생물학적 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 상기 면역관련 질환을 치료할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 Fc 감마 수용체 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.
(ⅱ) 또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드의 제조방법을 제공한다.
(ⅲ) 본 발명의 Fc 감마 수용체 변이체는 Fc 감마 수용체의 일부 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 치환하여 최적화함으로써 면역글로불린에 대한 선택적 결합력이 우수하여 체내 반감기 증가, 면역글로블린의 검출 및 정제, 장기이식반응 억제용도 또는 자가면역질환의 예방 또는 치료용도로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 FcγRIIa 변이체 라이브러리 구축에 대한 모식도를 나타낸다.
도 2는 human serum IgG에 대해 높은 친화도를 보이는 SH2A40 변이체의 선별 과정을 나타낸다.
도 3은 SDS-PAGE 상에서 FcγRIIa 단백질(32 kDa)이 고순도로 정제되었음을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 N-linked canonical glycosylation motif이 추가된 SH2A40의 Fc에 대한 결합력을 야생형과 비교한 그래프이다.
도 5는 정제된 SH2A40를 수득과정을 나타낸 모식도이다.
도 6은 발현 정제 후 발굴한 SH2A40의 활성을 보기 위하여 ELISA를 진행한 결과를 나타낸다.
도 7은 N-linked canonical glycosylation motif가 형성되지 않도록 FcγRIIa 변이체 라이브러리를 제작하는 과정에 대한 모식도이다.
도 8은 구축된 라이브러리와 유세포 분석기를 이용하여 선별된 변이체들(MG2A28 및 MG2A45)의 Fc에 대한 결합력을 비교한 그래프이다.
도 9는 발굴한 변이체들을 정제한 결과를 나타낸다.
도 10은 발굴한 변이체들의 Fc에 대한 결합력을 분석하기 위한 ELISA 결과를 나타낸다.
도 11은 iolayer interferometry를 통한 Fc 감마 수용체 변이체들과 rituximab의 KD value를 측정한 결과를 나타낸다.
도 12는 구축된 라이브러리와 유세포 분석기를 이용하여 선별된 변이체들(MG2A28.1 및 MG2A45.1)의 Fc에 대한 친화도를 비교한 그래프이다.
도 13은 발굴한 변이체들을 정제한 결과를 나타낸다.
도 14는 발굴한 변이체들의 Fc에 대한 결합력을 분석하기 위한 ELISA 결과를 나타낸다.
도 15는 iolayer interferometry를 통한 Fc 감마 수용체 변이체들과 rituximab의 KD value를 측정한 결과를 나타낸다.
도 16은 Fc 감마 수용체 변이체들의 mouse serum IgG와의 결합력을 ELISA로 분석한 결과를 나타낸다.
도 17은 야생형 FcγRIIb와 MG2A45.1 돌연변이가 도입된 FcγRIIb의 human serum IgG-FITC에 대한 친화도 비교결과를 나타낸다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. FcγRIIa 변이체 라이브러리 제작
pMopac12-NlpA-FcγRIIa-FLAG vector를 기반으로 FcγRIIa 내에 0.2% 정도의 무작위 돌연변이가 일어나도록 프라이머 MJ#160, MJ#161을 이용하여 무작위로 돌연변이가 도입된 FcγRIIa 유전자를 제작하였다. 또, FcγRIIa의 IgG Fc와의 결합 위치에 degenerate codon인 NNK를 도입하여 다양한 아미노산이 도입 되도록 focused insert를 프라이머 MJ#160, MJ#161, p788, p789, p790, p791, p792, p793을 이용하여 제작하였다(표 1). 제작된 두 가지 insert를 SfiI(New England Biolab)으로 제한효소 처리하여 vector와 ligation하였다. 그 후 대장균 Jude1((F' [Tn10(Tetr )proAB+ lacI qΔ(lacZ)M15] mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 araD139Δ(ara leu)7697 galU galKrpsLendA1nupG)에transformation하여 거대 FcγRIIa 변이체 라이브러리(라이브러리 크기: 2.2x109)를 구축하였다(도 1).
primer# sequence(5’→3’)
P788(서열목록 제1서열) GCGGGGTTTGCAGCACCAGMNNMNNMNNAAGCACGGTCAGATGCACCG
P789(서열목록 제2서열) CGGTGCATCTGACCGTGCTTNNKNNKNNKCTGGTGCTGCAAACCCCGC
P790(서열목록 제3서열) GCTTTTGCCATTCTGAAAAAAGGTCACTTTMNNCAGMNNMNNATCTTTCCAGCTATGGCAACGCAG
P791(서열목록 제4서열) CTGCGTTGCCATAGCTGGAAAGATNNKNNKCTGNNKAAAGTGACCTTTTTTCAGAATGGCAAAAGC
P792(서열목록 제5서열) GCGGAATGCTAAAGGTCGGATCCAGMNNAGAMNNTTTCTGMNNTTTGCCATTCTGAAAAAAGGTCACTTTCACC
P793(서열목록 제6서열) GGTGAAAGTGACCTTTTTTCAGAATGGCAAANNKCAGAAANNKTCTNNKCTGGATCCGACCTTTAGCATTCCGC
IIa_Fw_NdeI(서열목록 제7서열) GCGGAATTCCATATGCAGGCTGCCCCACCGAAAG
IIa_Rv_HindIII(서열목록 제8서열) TAAGGGAAGCTTAATCACGCCCATCGGTGAGC
MJ#1(서열목록 제9서열) CCA GGC TTT ACA CTT TAT GC
MJ#2(서열목록 제10서열) CTG CCC ATG TTG ACG ATT G
MJ#112(서열목록 제11서열) CAGCGGTTTATCTTTCCAGCTATGGC
MJ#113(서열목록 제12서열) GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKNNGGTGNNKTTTTTTCAGAATGGCAAAAGCCAGAAATTTTCTC
MJ#114(서열목록 제13서열) GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKGATGTGNNKTTTTTTCAGAATGGCAAAAGCCAGAAATTTTCTC
MJ#115(서열목록 제14서열) GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKTTTGTGNNKTTTTTTCAGAATGGCAAAAGCCAGAAATTTTCTC
MJ#116(서열목록 제15서열) GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKCATGTGNNKTTTTTTCAGAATGGCAAAAGCCAGAAATTTTCTC
MJ#117(서열목록 제16서열) GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKATTGTGNNKTTTTTTCAGAATGGCAAAAGCCAGAAATTTTCTC
MJ#118(서열목록 제17서열) GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKTATGTGNNKTTTTTTCAGAATGGCAAAAGCCAGAAATTTTCTC
MJ#119(서열목록 제18서열) GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKNNGGTGNWKTTTTTTCAGAATGGCAAAAGCCAGAAATTTTCTC
MJ#120(서열목록 제19서열) GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKNNKGTGGCGTTTTTTCAGAATGGCAAAAGCCAGAAATTTTCTC
MJ#121(서열목록 제20서열) GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKNNKGTGGGCTTTTTTCAGAATGGCAAAAGCCAGAAATTTTCTC
MJ#122(서열목록 제21서열) GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKNNKGTGCCGTTTTTTCAGAATGGCAAAAGCCAGAAATTTTCTC
MJ#123(서열목록 제22서열) GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKNNKGTGCGTTTTTTTCAGAATGGCAAAAGCCAGAAATTTTCTC
MJ#124(서열목록 제23서열) GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKNNKGTGTGGTTTTTTCAGAATGGCAAAAGCCAGAAATTTTCTC
MJ#160(서열목록 제24서열) CGCAGCGAGAGGCCCAGCCGGCCATG
MJ#161(서열목록 제25서열) CGCAATTCGGCCCCCGAGGCCCC
MJ#162(서열목록 제26서열) CGCAGCGAGCGCGCACTCCATGCAGGCTGCCCCACC
MJ#163(서열목록 제27서열) CCCTAAAATCTAGAAATCACGCCCATCGGTGAGC
MJ#197(서열목록 제28서열) CGGGAAAATTTCTTGGATTTTCCATTCTGGAAGAA
MJ#198(서열목록 제29서열) GCTGGAAGGACAAGCCTCTGGTCAATGTCGTGTTCTTCCAGAATGGAAAATCCAAGAAATTTTCCCG
MJ#199(서열목록 제30서열) CGCAATTCGGCCCCCGAGGCCCCGGGCTCTTGGACAGTGATGGTCACAGGCTTG
MJ#200(서열목록 제31서열) CAGCCCAGCTACCATTTCAAGGCCAAC
MJ#201(서열목록 제32서열) GTTGGCCTTGAAATGGTAGCTGGGCTG
MJ#202(서열목록 제33서열) CATAGGCTACACGCAGTACTCATCCAAGC
MJ#203(서열목록 제34서열) GCTTGGATGAGTACTGCGTGTAGCCTATG
실시예 2. 박테리아 배양 및 유세포 분리기(flow cytometry)를 이용한 FcγRIIa 변이체 라이브러리 탐색
구축된 FcγRIIa 변이체 라이브러리 세포 1 ml을 37℃, 250 rpm shaking 조건으로 2%(w/v) glucose에 chloramphenicol(40 μg/ml)이 포함된 Terrific Broth(TB) 배지에 넣어 주고 4시간 배양을 하였다. 배양된 라이브러리 세포를 TB 배지에 1:100으로 접종한 후 37℃, 250 rpm shaking으로 OD600가 0.6에 도달할 때까지 배양하였다. 그 후 cooling을 위해 20분 동안 25℃에서 배양한 후 1 mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside(IPTG)를 넣어 발현을 유도 하였다. 배양이 끝난 후 세포를 회수하여 OD600 normalize를 통해 균일한 양 만큼씩 14,000 rpm, 1분간 원심분리를 통해 세포를 harvest하였다. 1 ml의 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)을 첨가해 세포를 resuspension하고 1 분간 원심분리하는 wash 과정을 2회 반복하였다. 1 ml의 STE[0.5 M sucrose, 10 mM Tris-HCl, 10mM EDTA(pH 8.0)]로 resuspension하여 37℃, 30분간 rotation을 통해 세포 외막을 제거하였다. 원심분리하여 상등액을 버린 후 1 ml의 Solution A[0.5 M sucrose, 20 mM MgCl2, 10 mM MOPS pH 6.8]을 첨가해 resuspension과 원심분리를 하였다. 1 ml의 Solution A와 50 mg/ml lysozyme solution 20 μl를 혼합한 용액을 1 ml 첨가해 resuspension한 뒤 37℃, 15분간 rotation하여 peptidoglycan layer를 제거하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 1 ml의 PBS로 resuspension한 뒤 300 μl를 취해 700 μl의 PBS와 human serum IgG-FITC probe(sigma aldrich)를 함께 넣고 상온에서 rotation하여 spheroplast에 형광 probe를 labeling하였다. Labeling후 1 ml의 PBS로 1회 wash한 후 유세포 분리기(Flow cytometry: S3 cell sorter(Bio-rad))를 이용하여 높은 형광을 보이는 상위 3% 세포들을 회수 하였고 형광이 높은 세포들의 순도를 높이기 위해서 sorting 받은 세포들을 다시 resorting 하였다. resorting 받은 sample을 프라이머 MJ#160, MJ#161과 Taq polymerase(Biosesang)을 이용해 PCR로 유전자를 증폭하고 SfiI 제한효소 처리 ligation, transformation 과정을 거쳐 sorting된 세포의 유전자들이 amplify된 서브라이브러리를 제작하였다. 이 과정을 총 4라운드에 걸쳐 반복한 후, 40개의 individual 클론들을 각각 분석하여 야생형 FcγRIIa(서열목록 제35서열 및 제43서열) 보다 human serum IgG에 대해 높은 친화도를 보이는 SH2A40 변이체(서열목록 제36서열 및 제44서열)를 선별하였다(도 2).
실시예 3: 발굴한 SH2A40 변이체를 동물세포에서 발현하기 위한 클로닝 및 발현, 정제
발굴한 변이체들 중 SH2A40을 HEK293F 세포에서 발현하기 위하여 유전자를Vent polymerase와 primer MJ#162, MJ#163을 사용해 PCR로 증폭한 뒤 BssHII, XbaI(New England Biolab)으로 제한효소 처리, ligation하여 pMAZ-FcγRIIa(wild type), pMAZ-FcγRIIa variant(SH2A40)를 제작하였다. 동물세포용 발현벡터인 pMAZ에 클로닝 한 유전자들은 HEK293F 세포에 transfection하고 300 ml 규모로 임시발현하였다. 배양이 끝난 배양액은 2,000 rpm, 10분간 원심분리를 통해 세포를 제거하고 상등액을 취해 25x PBS를 이용해 equilibrium을 맞추었다. bottle top filter를 이용해 0.2 μm filter(Merck Millipore)로 여과하였다. PBS로 평형을 맞춘 Ni-NTA agarose(Qiagen) 1 ml slurry를 첨가해 4℃, 16시간 교반한 다음polypropylene column(Thermo Fisher Scientific)에 흘려주었다. pass-through solution을 취해 한 번 더 resin에 흘려서 binding 시킨 뒤, 50 ml의 1x PBS, 25 ml의 10 mM imidazole buffer, 25 ml의 20 mM imidazole buffer, 200 ul의 250 mM imidazole buffer 순으로 wash를 해주었다. Elution은 250 mM imidazole buffer 2.5 ml로 수행하였다. 받아진 단백질은 Amicon Ultra4(Merck Millipore)를 통해PBS로 buffer를 교체한 후 농축 과정을 거쳐 SDS-PAGE(BioRad)를 통해 정제된 단백질을 확인하였다(도 3). SDS-PAGE 상에서 FcγRIIa 단백질(32 kDa)이 고순도로 정제되었음이 확인되었다.
실시예 4: 동물세포 배양을 통해 생산한 FcγRIIa 단백질의 활성 및 결합력 분석을 위해 IgG1 subclass로 이루어져 있는 rituximab을 이용해 수행한 ELISA
0.05 M Na2CO3 pH 9.6에 4 μg/ml로 희석한 rituximab를 각각 50 μl씩 Flat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate(costar)에 4℃, 16 시간 동안 고정화 한 후 100 μl의 5% BSA(in 0.05% PBST)로 상온에서 2 시간 동안 blocking 하였다. 0.05% PBST 180 μl로 4 회씩 wash를 진행한 뒤 blocking solution으로serially dilution된 FcγRIIa 단백질들을 50 μl 각 well에 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. Wash 과정 후 anti-HisHRP conjugate(Sigma-Aldrich) 50 μl씩을 이용해 상온에서 1시간 동안 항체 반응을 진행하고 wash 과정을 수행하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution(Thermo Fisher Scientific) 50 μl씩 첨가해 발색 한 뒤 2 M H2SO4 50 μl씩 넣어주어 반응을 종료 시킨 다음 Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek)을 이용해 분석하였다. 각 실험은 모두 duplicate으로 진행하였으며 ELISA 결과 rituximab의 Fc부분과 야생형 FcγRIIa, SH2A40에 대한 결합력을 비교, 분석할 수 있었다. 그 결과 SH2A40이 새로운 N-linked canonical glycosylation motif이 추가가 되었기 때문에 WT FcγRIIa와 비슷한 결합력을 보였다(도 4).
실시예 5. MBP-FcγRIIa 단백질 발현을 위한 클로닝 및 E.coli 에서의 발현, 정제
선별된 SH2A40를 soluble한 단백질 형태로 생산하기 위하여 해당 gene을 IIa_Fw_NdeI, IIa_Rv_HindIII 프라이머를 이용하여 PCR을 한 후 NdeI, HindIII(New England Biolab)처리를 하였다. 그 후 NdeI, HindIII한 pET22b-MBP-TEV site-His vector와 ligation을 한 후 BL21(DE3) cell에 transformation 하였다. 해당 cell을 37℃ 250 rpm shaking 조건으로 2%(w/v) glucose에 ampicillin(100 μg/ml)이 포함된 TB 배지에 넣어 주고 전배양을 하였다. 배양된 세포를 TB 배지에 1:100으로 접종한 후 37℃ 250 rpm shaking 으로 OD600가 0.6에 도달할 때까지 배양 하였다. 그 후 cooling을 위해 20분 동안 18℃에서 배양한 후 1 mM IPTG를 넣고 14시간 동안 발현을 유도 하였다. 배양이 끝난 후 7,000 rpm, 10분간 원심분리를 통해 세포를 harvest하였다. 세포 파쇄를 위하여 sonication(5초on/10초off, 100 반복)하였고 15,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 상등액을 0.45 μm syringe filter로 여과하였다. 여과된 상등액을 Ni-NTA resin에 binding시키고 100 ml의 10 mM imidazole buffer, 100 ml의 20 mM imidazole buffer로 wash를 한 뒤, 50 mM imidazole buffer 4 ml로 elution하였다. Elution한 sample을 50 mM Tris-HCl로 buffer exchange 한 후 TEV-GST를 이용하여 MBP-SH2A40을 MBP와 SH2A40로 cleavage 한 후 GST resin과 amylose resin으로 TEV-GST와 MBP 단백질을 제거하고 순수한 SH2A40만 얻었다(도 5).
실시예 6. 대장균에서 발현한 FcγRIIa변이체의 IgG1과의 결합력을 ELISA로 분석
발현 정제 후 발굴한 SH2A40의 활성을 보기 위하여 ELISA를 진행하였다. 0.05 M Na2CO3 pH 9.6에 4 μg/ml로 희석한 Rituximab을 50 μl씩 Flat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate(costar)에 4℃, 16시간 동안 고정화 한 후 100 μl의 4% skim milk(GenomicBase)(in 0.05% PBST)로 상온에서 2시간 동안blocking 하였다. 0.05% PBST(pH 5.8/pH 7.4) 180 μl로 4회씩 wash를 진행한 뒤 1% skim milk(in 0.05% PBST)으로 serially dilution 된 WT FcγRIIa와 SH2A40을 50 μl 각 well에 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. Wash 과정 후anti-His-HRP conjugate(sigma) 50 μl씩을 이용해 상온에서 1시간 동안 항체 반응을 진행하고 wash 과정을 수행하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution(Thermo Fisher Scientific) 50 μl씩 첨가해 발색 한 뒤 2 M H2SO4 50 μl씩 넣어주어 반응을 종료 시킨 다음 Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek)를 이용해 분석하였다(도 6).
실시예 7: N-linked canonical glycosylation motif가 형성되지 않도록 FcγRIIa 변이체 라이브러리 제작
FcγRIIa 변이체(SH2A40: K117N, L159Q)에 형성된 N-linked canonical glycosylation motif(N-X-S/T)를 제거하면서 IgG Fc와의 친화도가 높은 FcγRIIa 변이체를 탐색하기 위하여 라이브러리를 제작하였다. 이 라이브러리는 SH2A40에서 N-linked canonical glycosylation motif가 형성된 V116, K117, T119 위치에 집중하여 제작하였다. 라이브러리의 template로는 SH2A40를 template로 하여 제작하였으며, unpaired Cyc를 예방하기 위해 Cys이 생기지 않도록 reduced codon을 이용하였다(도 7).
1. Sub-library-1: 117번 위치에 Asn, Cys가 생기지 않도록 제작
pMopac12-NlpA-FcγRIIa(SH2A40)-FLAG을 template로 하고 116번, 119번 위치는 20개 아미노산이 코딩 되도록 NNK degenerate codon을 사용하고, 117번 위치는 NNG reduced codon을 이용해 13개 아미노산을 코딩하고 5개의 나머지 아미노산(Gln, Phe, His, Ile, Tyr)은 각각 코딩하는 프라이머를 제작하여 동일한 양으로 혼합 후 사용하였다. 프라이머 MJ#160, MJ#112와 Vent polymerase(New England Biolab)를 사용해 FcγRIIa 유전자의 116번 앞쪽 부분인 fragment-1을 증폭하고, 뒤쪽인 fragment-2를 증폭할 때는 MJ#113-MJ#118을 동일한 아미노산 비율로 섞은mixture와 MJ#161를 사용하였다. 준비된 2개의 fragment는 Vent polymerase로 assemble하였으며, SfiI(New England Biolab) 제한효소 처리하였다.
2. Sub-library-2: 119번 위치에 Ser, Thr, Cys가 생기지 않도록 제작
pMopac12-NlpA-FcγRIIa(SH2A40)-FLAG을 template로 하고 116번, 117번 위치는 20개 아미노산이 코딩 되도록 NNK degenerate codon을 사용하고, 119번 위치는 NWK reduced codon을 이용해 12개 아미노산을 코딩하고 5개의 나머지 아미노산(Ala, Gly, Pro, Arg, Trp)은 각각 코딩하는 프라이머를 제작하여 동일한 양으로 혼합 후 사용하였다. 프라이머 MJ#160, MJ#112와 Vent polymerase(New England Biolab)를 사용해 FcγRIIa 유전자의 116번 앞쪽 부분인 fragment-1을 증폭하고, 뒤쪽인 fragment-2를 증폭할 때는 MJ#119-MJ#124을 동일한 아미노산 비율로 섞은mixture와 MJ#161를 사용하였다. 준비된 2개의 fragment는 Vent polymerase로 assemble하였으며, SfiI(New England Biolab) 제한효소 처리하였다.
제한효소 처리된 2개의 sub-library 유전자들은 동량으로 ligation 과정을 거쳐 Jude1에 transformation하여 FcγRIIa 라이브러리를 제작하였다(이론적 라이브러리 크기: 4.3 x 104, 실험적 라이브러리 크기: 6.3 x 108).
실시예 8: 구축된 라이브러리와 유세포 분석기를 스크리닝 및 MG2A28 , MG2A45 등의 변이체 선별(human serum IgG에 대한 친화도 분석)
구축된 라이브러리는 250 ml 플라스크에서 TB+2% glucose 배지 25 ml에 1 vial(1 ml)을 풀어 37℃, 4시간 배양한 후 100 ml의 TB 배지가 담긴 500 ml 플라스크에서 1:100 접종하여 OD600=0.6까지 배양하였다. 곧바로 25℃, 250 rpm에서 20분간 cooling 과정을 거친 후 1 mM IPTG를 첨가하여 25℃, 250 rpm, 5시간 동안 과발현 하였다. 과발현 후 OD600값을 측정하여 normalize된 양 만큼씩 14,000 rpm, 1분간 원심분리를 통해 세포를 회수하였다. 1 ml의 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)을 첨가해 세포를 resuspension하고 1분간 원심분리하는 wash 과정을 2회 반복하였다. 1 ml의 STE[0.5 M sucrose, 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA (pH 8.0)]로 resuspension하여 37℃, 30분간 rotation을 통해 세포 외막을 제거하였다. 원심분리하여 상등액을 제거한 후 1 ml의 Solution A[0.5 M sucrose, 20 mM MgCl2,10mM MOPS pH6.8]을 첨가해 resuspension과 원심분리를 하였다. 1 ml의 Solution A와 50 mg/ml lysozyme solution 20 μl를 혼합한 용액을 1 ml 첨가해 resuspension한 뒤 37℃, 15분간 rotation하여 peptidoglycan layer를 제거하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 1 ml의 PBS로 resuspension한 뒤 300 μl를 취해 700 μl의 PBS와 human serum IgG-FITC(Sigma aldrich) probe를 함께 넣고 상온에서 rotation하여 spheroplast에 형광 probe를 labeling하였다. Labeling후 1 ml의 PBS로 1회 wash한 후 PBS에 20배 희석하여 S3 cell sorter(Bio-rad) 장비를 이용해 상위 3%의 형광 신호를 내는 세포들만 분리하여 취하였다. 보다 효율적인 스크리닝을 위해 분리한 세포들은 한 번 더 sorting 하여 resorting 작업을 수행하였다. 걸러낸 세포들은 MJ#1, MJ#2 primer와 Taq polymerase(Biosesang)을 이용해 PCR로 유전자를 증폭하고 SfiI 제한효소 처리 ligation, transformation 과정을 거쳐 sorting된 세포의 유전자들이 amplify된 서브라이브러리를 제작하였다. 이 과정을 총 3라운드에 걸쳐 반복한 후, 50여개의 individual 클론들의 염기서열 분석을 통해 human serum IgG의 Fc부분과 높은 친화도를 보이는 변이체들을 선별하였다(도 8).
실시예 9: 발굴한 변이체를 동물세포에서 발현하기 위한 클로닝 및 발현 정제
발굴한 변이체들 중 MG2A28(서열목록 제37서열 및 제45서열), MG2A45(서열목록 제38서열 및 제46서열)를 HEK293F 세포에서 발현하기 위하여 유전자를 Vent polymerase와 primer MJ#162, MJ#163을 사용해 PCR로 증폭한 뒤 BssHII, XbaI(New England Biolab)으로 제한효소 처리, ligation하여 pMAZ-FcγRIIa variant(MG2A28), pMAZ-FcγRIIa variant(MG2A45)를 제작하였다. 동물세포용 발현벡터인 pMAZ에 클로닝 한 유전자들은 HEK293F 세포에 transfection하고 300 ml 규모로 임시발현 하였다. 배양이 끝난 배양액은 2000 rpm, 10분간 원심분리를 통해 세포를 제거하고 상등액을 취해 25x PBS를 이용해 equilibrium을 맞추었다. bottle top filter를 이용해 0.2 μm filter(Merck Millipore)로 여과하였다. PBS로 평형을 맞춘 Ni-NTA agarose(Qiagen) 1 ml slurry를 첨가해 4℃, 16시간 교반한 다음 polypropylene column(Thermo Fisher Scientific)에 흘려주었다. pass-through solution을 취해 한 번 더 resin에 흘려서 binding 시킨 뒤, 50 ml의 1x PBS, 25 ml의 10 mM imidazole buffer, 25 ml의 20 mM imidazole buffer, 200 ul의 250 mM imidazole buffer 순으로 wash를 해주었다. Elution은 250 mM imidazole buffer 2.5 ml로 수행하였다. 받아진 단백질은 Amicon Ultra4(Merck Millipore)를 통해 PBS로 buffer를 교체한 후 농축 과정을 거쳐 SDS-PAGE(BioRad)를 통해 정제된 단백질을 확인하였다(도 9). SDS-PAGE 상에서 FcγRIIa 단백질(32 kDa)이 고순도로 정제되었음이 확인되었다.
실시예 10: IgG1 subclass로 이루어져 있는 rituximab을 이용한 변이체들의 Fc에 대한 결합력을 분석하기 위한 ELISA
0.05 M Na2CO3 pH 9.6에 4 μg/ml로 희석한 rituximab를 각각 50 μl씩 Flat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate(costar)에 4℃, 16시간 동안 고정화 한 후 100 μl의 5% BSA(in 0.05% PBST)로 상온에서 2시간 동안 blocking 하였다. 0.05% PBST 180 μl로 4회씩 wash를 진행한 뒤 blocking solution으로 serially dilution된 FcγRIIa 변이체들을 50 μl 각 well에 분주하여 상온에서 1시간동안 반응시켰다. Wash 과정 후 anti-HisHRP conjugate(Sigma-Aldrich) 50 μl씩을 이용해 상온에서 1시간 동안 항체 반응을 진행하고 wash 과정을 수행하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution(Thermo Fisher Scientific) 50 μl씩 첨가해 발색 한 뒤 2 M H2SO4 50μl씩 넣어주어 반응을 종료 시킨 다음 Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek)을 이용해 분석하였다(도 10). 각 실험은 모두 duplicate으로 진행하였으며 ELISA 결과 rituximab의 Fc부분과 FcγRIIa 변이체들(야생형, SH2A40, MG2A28, MG2A45)에 대한 결합력을 비교, 분석할 수 있었다.
실시예 11: Biolayer interferometry를 통한 FcγRIIa 변이체들과 rituximab의 K D value측정
Human serum에서 약 70% 이상을 차지하고 있으며, 각종 항체 의약품에서 주로 사용되는 IgG subclass인 IgG1의 Fc와의 결합력을 측정하기 위해 rituximab을 이용하여 FcγRIIa 변이체들의 친화도 측정을 수행하였다. Blitz(Fortebio)를 사용하여 FcγRIIa 변이체들의 결합력을 측정하였다. 안정적인 분석을 위해 Amine reactive 2nd generation(AR2G) biosensor(Fortebio)에 sodium acetate pH 5.0 용액에 40 ug/ml로 희석한 rituximab 항체를 고정화하고, 1x kinetics buffer(fortebio)로 serially dilution한 FcγRIIa variants(야생형 SH2A40, MG2A28, MG2A45)를 각각 반응시켜 결합력을 분석하였다(도 11). Equilibrium binding constant(KD)를 계산하기 위하여 Blitz Pro 1.2 software(Fortebio)를 활용하였다(표 3). 그 결과 본 연구를 통해 발굴한 SH2A40과 MG2A28, MG2A45가 야생형과 비교하여 Fc에 대한 결합력이 각각 3.57배, 6.16배, 8.26배 증가된 것을 확인할 수 있었다.
실시예 12: Affinity maturation을 위한 MG2A28 , MG2A45 기반의 FcγRIIa error-prone PCR 라이브러리 구축
MG2A28과 MG2A45를 기반으로 한 FcγRIIa 변이체 라이브러리를 제작하기 위하여 pMopac12-NlpA-FcγRIIa(MG2A28, MG2A45)-FLAG을 template로 하여 error prone PCR을 진행하였다. FcγRIIa 부분에 무작위적인 점 돌연변이를 가하기 위한 방법으로 Taq polymerase(Takara)을 이용한 error prone PCR 기법을 사용하였다. 라이브러리에 MG2A28과 MG2A45 두 가지의 변이체가 50%씩 동등한 비율로 존재하게 하기 위하여 각각 PCR을 진행하였으며, primer MJ#160, MJ#161을 사용하여 전체 FcγRIIa 유전자에서 0.3%의 nucleotide에 점 돌연변이가 도입되도록 하였다. 그런 다음 SfiI 제한효소 처리 및 ligation 과정을 거쳐 Jude1에 transformation하여 FcγRIIa 라이브러리를 제작하였다(라이브러리 크기: 2.6 x 109, experimental error rate: 0.32%). 대장균의 내막에 FcγRIIa 변이체들이 디스플레이 되는 라이브러리를 구축하였다.
실시예 13: 구축된 라이브러리와 유세포 분석기를 스크리닝 및 MG2A28 .1, MG2A45 .1 등의 변이체 선별(human serum IgG에 대한 친화도 분석)
구축된 라이브러리는 250 ml 플라스크에서 TB+2% glucose 배지 25 ml에 1 vial(1 ml)을 풀어 37℃, 4시간 배양한 후 100 ml의 TB 배지가 담긴 500 ml 플라스크에서 1:100 접종하여 OD600=0.6까지 배양하였다. 곧바로 25℃, 250 rpm에서 20분간 cooling 과정을 거친 후 1 mM IPTG를 첨가하여 25℃, 250 rpm, 5시간 동안 과발현 하였다. 과발현 후 OD600값을 측정하여 normalize된 양 만큼씩 14,000 rpm, 1분간 원심분리를 통해 세포를 회수하였다. 1 ml의 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)을 첨가해 세포를 resuspension하고 1분간 원심분리하는 wash과정을 2회 반복하였다. 1 ml의 STE[0.5 M sucrose, 10 mM Tris-HCl, 10mM EDTA (pH 8.0)]로 resuspension하여 37℃, 30분간 rotation을 통해 세포 외막을 제거하였다. 원심분리하여 상등액을 제거한 후 1 ml의 Solution A[0.5 M sucrose, 20 mM MgCl2,10 mM MOPS pH 6.8]을 첨가해 resuspension과 원심분리를 하였다. 1 ml의 Solution A와 50 mg/ml lysozyme solution 20 μl를 혼합한 용액을 1 ml 첨가해 resuspension한 뒤 37℃, 15분 간 rotation하여 peptidoglycan layer를 제거하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 1 ml의 PBS로 resuspension한 뒤 300 μl를 취해 700 μl의 PBS와 human serum IgG-FITC(Sigma aldrich) probe를 함께 넣고 상온에서 rotation하여 spheroplast에 형광 probe를 labeling하였다(1-2라운드: 20 nM, 3라운드: 5 nM). Labeling 후 1 ml의 PBS로 1회 wash한 후 PBS에 20배 희석하여 S3 cell sorter (Bio-rad) 장비를 이용해 상위 3%의 형광 신호를 내는 세포들만 분리하여 취하였다. 보다 효율적인 스크리닝을 위해 분리한 세포들은 한 번 더 sorting 하여 resorting 작업을 수행하였다. 걸러낸 세포들은 MJ#1, MJ#2 primer와 Taq polymerase(Biosesang)을 이용해 PCR로 유전자를 증폭하고 SfiI 제한효소 처리 ligation, transformation 과정을 거쳐 sorting된 세포의 유전자들이 amplify된 서브라이브러리를 제작하였다. 이 과정을 총 5라운드에 걸쳐 반복한 후, 70여개의 individual 클론들의 IgG-FITC와의 결합에 의한 형광 신호 세기를 분석하였다. 이를 통해 human serum IgG의 Fc부분과 높은 친화도를 보이는 변이체들을 선별하였으며, 염기서열 분석을 통해 MG2A28 기반의 변이체와 MG2A45 기반의 변이체가 각각 1종류씩 isolation되었음이 확인되었다(도 12).
실시예 14: 발굴한 변이체를 동물세포에서 발현하기 위한 클로닝 및 발현 정제
발굴한 변이체들 중 MG2A28.1(서열목록 제39서열 및 제47서열), MG2A45.1(서열목록 제40서열 및 제48서열)를 HEK293F 세포에서 발현하기 위하여 유전자를 Vent polymerase와 primer MJ#162, MJ#163을 사용해 PCR로 증폭한 뒤 BssHII, XbaI(New England Biolab)으로 제한효소 처리, ligation하여 pMAZ-FcγRIIa variant(MG2A28.1), pMAZ-FcγRIIa variant(MG2A45.1)를 제작하였다. 동물세포용 발현벡터인 pMAZ에 클로닝 한 유전자들은 HEK293F 세포에 transfection하고 300 ml 규모로 임시발현 하였다. 배양이 끝난 배양액은 2000 rpm, 10분간 원심분리를 통해 세포를 제거하고 상등액을 취해 25x PBS를 이용해 equilibrium을 맞추었다. bottle top filter를 이용해 0.2 μm filter(Merck Millipore)로 여과하였다. PBS로 평형을 맞춘 Ni-NTA agarose(Qiagen) 1 ml slurry를 첨가해 4℃, 16시간 교반한 다음 polypropylene column(Thermo Fisher Scientific)에 흘려주었다. pass-through solution을 취해 한 번 더 resin에 흘려서 binding 시킨 뒤, 50 ml의1x PBS, 25 ml의 10 mM imidazole buffer, 25 ml의 20 mM imidazole buffer, 200 ul의 250 mM imidazole buffer 순으로 wash를 해주었다. Elution은 250 mM imidazole buffer 2.5 ml로 수행하였다. 받아진 단백질은 Amicon Ultra4(Merck Millipore)을 통해 PBS로 buffer를 교체한 후 농축 과정을 거쳐 SDS-PAGE(BioRad)를 통해 정제된 단백질을 확인하였다(도 13). SDS-PAGE 상에서 FcγRIIa 단백질(32 kDa)이 고순도로 정제되었음이 확인되었다.
실시예 15: IgG1 subclass로 이루어져 있는 rituximab을 이용한 변이체들의 Fc에 대한 결합력을 분석하기 위한 ELISA
0.05 M Na2CO3 pH 9.6에 4 μg/ml로 희석한 rituximab를 각각 50 μl씩 Flat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate(costar)에 4℃, 16시간 동안 고정화 한 후 100 μl의 5% BSA(in 0.05% PBST)로 상온에서 2 시간 동안 blocking 하였다. 0.05% PBST 180 μl로 4회씩 wash를 진행한 뒤 blocking solution으로serially dilution 된 FcγRIIa 변이체들을 50 μl 각 well에 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. Wash 과정 후 anti-HisHRP conjugate(Sigma-Aldrich) 50 μl씩을 이용해 상온에서 1 시간 동안 항체 반응을 진행하고 wash 과정을 수행하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution(Thermo Fisher Scientific) 50 μl씩 첨가해 발색 한 뒤 2 M H2SO4 50 μl씩 넣어주어 반응을 종료 시킨 다음 Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek)을 이용해 분석하였다(도 14). 각 실험은 모두 duplicate으로 진행하였으며 ELISA 결과 rituximab의 Fc부분과 FcγRIIa 변이체들(야생형, MG2A28, MG2A45, MG2A28.1, MG2A45.1)에 대한 결합력을 비교, 분석할 수 있었다.
실시예 16: Biolayer interferometry를 통한 FcγRIIa 변이체들과 rituximab의 K D value측정
Human serum에서 약 70% 이상을 차지하고 있으며, 각종 항체 의약품에서 주로 사용되는 IgG subclass인 IgG1의 Fc와의 결합력을 측정하기 위해 rituximab을 이용하여 FcγRIIa 변이체들의 친화도 측정을 수행하였다. Blitz(Fortebio)를 사용하여 FcγRIIa 변이체들의 결합력을 측정하였다. 안정적인 분석을 위해 Amine reactive 2nd generation(AR2G) biosensor(Fortebio)에 sodium acetate pH 5.0 용액에 40 ug/ml로 희석한 rituximab 항체를 고정화하고, 1x kinetics buffer(fortebio)로 serially dilution한 FcγRIIa variants(MG2A28.1, MG2A45.1)를 각각 반응시켜 결합력을 분석하였다(도 15). Equilibrium binding constant(KD)를 계산하기 위하여 Blitz Pro 1.2 software(Fortebio)를 활용하였다(표 4). 그 결과 본 연구를 통해 발굴한 MG2A28.1과 MG2A45.1이 야생형과 비교하여 Fc에 대한 결합력이 각각 5.39배, 32.09배 증가된 것을 확인할 수 있었다.
실시예 17: 쥐 모델을 이용한 동물실험을 위하여 mouse serum IgG와의 결합력을 ELISA로 분석
0.05 M Na2CO3 pH 9.6에 4 μg/ml로 희석한 mouse serum IgG를 각각 50 μl씩Flat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate(costar)에 4℃, 16시간 동안 고정화 한 후 100 μl의 5% BSA(in 0.05% PBST)로 상온에서 2시간 동안 blocking하였다. 0.05% PBST 180 μl로 4회씩 wash를 진행한 뒤 blocking solution으로 serially dilution 된 FcγRIIa 변이체들(야생형, MG2A28, MG2A45, MG2A28.1, MG2A45.1)을 50 μl 각 well에 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. Wash 과정 후 anti-HisHRP conjugate(Sigma-Aldrich) 50 μl씩을 이용해 상온에서 1시간 동안 항체 반응을 진행하고 wash 과정을 수행하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution(Thermo Fisher Scientific) 50 μl씩 첨가해 발색 한 뒤 2 M H2SO4 50μl씩 넣어주어 반응을 종료 시킨 다음 Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek)을 이용해 분석하였다(도 16). 각 실험은 모두duplicate으로 진행하였으며 ELISA 결과 mouse serum IgG와 FcγRIIa 변이체들(야생형, MG2A28, MG2A45, MG2A28.1, MG2A45.1)에 대한 결합력을 비교, 분석할 수 있었으며, MG2A28을 제외한 모든 변이체가 야생형과 비교해 유사하거나 높은 친화도로 mouse serum IgG와 결합한다는 것을 알 수 있었으며, 그 중 MG2A45와 MG2A45.1 변이체가 mouse serum IgG와 가장 높은 친화도로 결합하는 것을 확인하였다.
실시예 18: FcγRIIa와 약 96%의 homology를 가지고 있는 FcγRIIb의 Fc에 대한 친화도에 미치는 영향을 확인하기 위한 점 돌연변이 도입
발굴한 점 돌연변이들의 FcγRIIb(서열목록 제41서열 및 제49서열)에 대한 영향을 분석하기 위한 실험을 수행하였다. 이를 위해 pMopac12-NlpA-FcγRIIb-FLAG 플라스미드를 template로 사용하였으며, FcγRIIb 유전자 부분에 MG2A45.1 점 돌연변이(R55H, K117N, T119V, L159Q, V171E) 중 R55H와 L159Q를 도입하기 위하여 Quikchange site directed mutagenesis(Agilent) 기법을 이용하였다. 각 점 돌연변이 도입을 위해 MJ#200과MJ#201, MJ#202와 MJ#203 프라이머를 사용하였으며, Pfu turbo polymerase(Agilent)를 이용하여 PCR을 한 뒤, DpnI(New England Biolab) 제한효소 처리를 위해 37℃에서 3시간 incubation하였다. 준비된 유전자는 transformation한 뒤 염기서열 분석을 통해 점 돌연변이가 성공적으로 삽입되었음을 확인하였다. 또 K117N과 T119V, V171E 세 가지의 점 돌연변이를 도입하기 위해 assembly PCR 기법을 활용하였다. Quikchange site directed mutagenesis로 R55H와 L159Q가 도입되어 있는 플라스미드를 template로 하고, MJ#160과 MJ#197, MJ#198과 MJ#199 프라이머와 vent polymerase(New England Biolab)를 이용해 2개의 fragment를 증폭하고 MJ#160과 MJ#199로 assemble하였다. 그 후 SfiI 제한효소 처리 및 ligation, transformation 과정을 거쳐 염기서열을 분석하여 MG2A45.1의 5개 점 돌연변이가 모두 삽입된 pMopac12-NlpA-FcγRIIb(MG2B45.1)-FLAG 유전자 제작을 완료하였다.
실시예 19: 야생형 FcγRIIb와 MG2A45 .1 돌연변이가 도입된 FcγRIIb의 human serum IgG - FITC에 대한 친화도 비교
FcγRIIb 변이체(MG2B45.1)(서열목록 제42서열 및 제50서열)는 human serum IgG-FITC에 대한 친화도를 야생형 FcγRIIb와 비교 분석하였다. 5 ml의 TB+2% glucose 배지에서 전배양한 inoculum을 5 ml의 TB 배지에 1:100 접종하여 OD600=0.6까지 배양하였다. 곧바로 25℃, 250 rpm에서 20분간 cooling 과정을 거친 후 1 mM IPTG를 첨가하여 25℃, 250 rpm, 5시간 동안 과발현 하였다. 과발현 후 OD600값을 측정하여 normalize된 양 만큼씩 14000 rpm, 1분간 원심분리를 통해 세포를 회수하였다. 1 ml의 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)을 첨가해 세포를 resuspension하고 1분간 원심분리하는 wash과정을 2회 반복하였다. 1 ml의 STE[0.5 M sucrose, 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA(pH 8.0)]로 resuspension하여 37℃, 30분간 rotation을 통해 세포 외막을 제거하였다. 원심분리하여 상등액을 제거한 후 1 ml의 Solution A[0.5 M sucrose, 20 mM MgCl2,10 mM MOPS pH 6.8]을 첨가해 resuspension과 원심분리를 하였다. 1 ml의 Solution A와 50 mg/ml lysozyme solution 20 μl를 혼합한 용액을 1 ml 첨가해resuspension한 뒤 37℃, 15분 간 rotation하여 peptidoglycan layer를 제거하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 1 ml의 PBS로 resuspension한 뒤 300 μl를 취해 700 μl의 PBS와 human serum IgG-FITC(Sigma aldrich) probe를 함께 넣고 상온에서 1시간 동안 rotation하여 spheroplast에 형광 probe를 labeling하였다. Labeling 후 1 ml의 PBS로 1회 wash한 후 Guava(Merck Millipore) 장비를 이용해 FcγRIIb에 결합된 human IgG-FITC에 의한 형광 신호를 분석하였다(도 17).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Kookmin University Industry Academy Cooperation Foundation <120> Fc gamma receptor variant MG2A28.1 <130> HP7569 <160> 50 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P788 <400> 1 gcggggtttg cagcaccagm nnmnnmnnaa gcacggtcag atgcaccg 48 <210> 2 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P789 <400> 2 cggtgcatct gaccgtgctt nnknnknnkc tggtgctgca aaccccgc 48 <210> 3 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P790 <400> 3 gcttttgcca ttctgaaaaa aggtcacttt mnncagmnnm nnatctttcc agctatggca 60 acgcag 66 <210> 4 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P791 <400> 4 ctgcgttgcc atagctggaa agatnnknnk ctgnnkaaag tgaccttttt tcagaatggc 60 aaaagc 66 <210> 5 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P792 <400> 5 gcggaatgct aaaggtcgga tccagmnnag amnntttctg mnntttgcca ttctgaaaaa 60 aggtcacttt cacc 74 <210> 6 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P793 <400> 6 ggtgaaagtg accttttttc 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gcttggatga gtactgcgtg tagcctatg 29 <210> 35 <211> 549 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 gccccaccga aagccgtgct gaaactggaa ccgccgtgga ttaatgtgtt gcaggaagat 60 agcgtgaccc tgacctgtca gggagcgcgt agccctgaaa gcgattctat tcagtggttt 120 cacaatggaa atctgattcc gacccatacc cagccgagct atcgttttaa agcgaacaat 180 aatgatagcg gcgaatacac ctgccagacg ggccagacca gcctgagcga tccggtgcat 240 ctgaccgtgc ttagcgaatg gctggtgctg caaaccccgc atctggaatt tcaggaaggc 300 gaaaccatta tgctgcgttg ccatagctgg aaagataaac cgctggtgaa agtgaccttt 360 tttcagaatg gcaaaagcca gaaattttct cacctggatc cgacctttag cattccgcag 420 gcgaatcatt ctcactccgg cgattaccat tgtaccggca atataggcta taccctgttt 480 agcagcaaac cggtgacaat taccgtgcag gtgccgagca tgggcagcag ctcaccgatg 540 ggcgtgatt 549 <210> 36 <211> 549 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH2A40 <400> 36 gccccaccga aagccgtgct gaaactggaa ccgccgtgga ttaatgtgtt gcaggaagat 60 agcgtgaccc tgacctgtca gggagcgcgt agccctgaaa gcgattctat tcagtggttt 120 cacaatggaa atctgattcc gacccatacc cagccgagct atcgttttaa agcgaacaat 180 aatgatagcg gcgaatacac ctgccagacg ggccagacca gcctgagcga tccggtgcat 240 ctgaccgtgc ttagcgaatg gctggtgctg caaaccccgc atctggaatt tcaggaaggc 300 gaaaccatta tgctgcgttg ccatagctgg aaagataaac cgctggtgaa tgtgaccttt 360 tttcagaacg gcaaaagcca gaaattttct cacctggatc cgacctttag cattccgcag 420 gcgaatcatt ctcactccgg cgattaccat tgtaccggca atataggcta tacccagttt 480 agcagcaaac cggtgacaat taccgtgcag gtgccgagca tgggcagcag ctcaccgatg 540 ggcgtgatt 549 <210> 37 <211> 549 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MG2A28 <400> 37 gccccaccga aagccgtgct gaaactggaa ccgccgtgga ttaatgtgtt gcaggaagat 60 agcgtgaccc tgacctgtca gggagcgcgt agccctgaaa gcgattctat tcagtggttt 120 cacaatggaa atctgattcc gacccatacc cagccgagct atcgttttaa agcgaacaat 180 aatgatagcg gcgaatacac ctgccagacg ggccagacca gcctgagcga tccggtgcat 240 ctgaccgtgc ttagcgaatg gctggtgctg caaaccccgc atctggaatt tcaggaaggc 300 gaaaccatta tgctgcgttg ccatagctgg aaagataaac cgctggtgaa tgtgatgttt 360 tttcagaatg gcaaaagcca gaaattttct cacctggatc cgacctttag cattccgcag 420 gcgaatcatt ctcactccgg cgattaccat tgtaccggca atataggcta tacccagttt 480 agcagcaaac cggtgacaat taccgtgcag gtgccgagca tgggcagcag ctcaccgatg 540 ggcgtgatt 549 <210> 38 <211> 549 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MG2A45 <400> 38 gccccaccga aagccgtgct gaaactggaa ccgccgtgga ttaatgtgtt gcaggaagat 60 agcgtgaccc tgacctgtca gggagcgcgt agccctgaaa gcgattctat tcagtggttt 120 cacaatggaa atctgattcc gacccatacc cagccgagct atcgttttaa agcgaacaat 180 aatgatagcg gcgaatacac ctgccagacg ggccagacca gcctgagcga tccggtgcat 240 ctgaccgtgc ttagcgaatg gctggtgctg caaaccccgc atctggaatt tcaggaaggc 300 gaaaccatta tgctgcgttg ccatagctgg aaagataaac cgctggtgaa tgtggtgttt 360 tttcagaatg gcaaaagcca gaaattttct cacctggatc cgacctttag cattccgcag 420 gcgaatcatt ctcactccgg cgattaccat tgtaccggca atataggcta tacccagttt 480 agcagcaaac cggtgacaat taccgtgcag gtgccgagca tgggcagcag ctcaccgatg 540 ggcgtgatt 549 <210> 39 <211> 549 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MG2A28.1 <400> 39 gccccaccga aagccgtgct gaaactggaa ccgccgtgga ttaatgtgtt gcaggaagat 60 agcgtgaccc tgacctgtca gggagcgcgt agccctgaaa gcgattctat tcagtggttt 120 cacaatggaa atctgattcc gacccatacc cagccgagct atcgttttaa agcgaacaat 180 aatgatagcg gcgaatacac ctgccagacg ggccagacca gcctgagcga tccggtgcat 240 ctgaccgtgc ttagcgattg gctggtgctg caaaccccgc atctggaatt tcaggaaggc 300 gaaaccatta tgctgcgttg ccatagctgg aaagataaac cgctggtgaa tgtgatgttt 360 tttcagaatg gcaaaagcct gaaattttct cacctggatc cgacctttag cattccgcag 420 gcgaatcatt ctcactccgg cgattaccat tgtaccggca atataggcta tacccagttt 480 agcagcaaac cggtgacaat taccgtgcag gagccgagca tgggcagcag ctcaccgatg 540 ggcgtgatt 549 <210> 40 <211> 549 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MG2A45.1 <400> 40 gccccaccga aagccgtgct gaaactggaa ccgccgtgga ttaatgtgtt gcaggaagat 60 agcgtgaccc tgacctgtca gggagcgcgt agccctgaaa gcgattctat tcagtggttt 120 cacaatggaa atctgattcc gacccatacc cagccgagct atcattttaa agcgaacaat 180 aatgatagcg gcgaatacac ctgccagacg ggccagacca gcctgagcga tccggtgcat 240 ctgaccgtgc ttagcgaatg gctggtgctg caaaccccgc atctggaatt tcaggaaggc 300 gaaaccatta tgctgcgttg ccatagctgg aaagataaac cgctggtgaa tgtggtgttt 360 tttcagaatg gcaaaagcca gaaattttct cacctggatc cgacctttag cattccgcag 420 gcgaatcatt ctcactccgg cgattaccat tgtaccggca atataggcta tacccagttt 480 agcagcaaac cggtgacaat taccgtgcag gagccgagca tgggcagcag ctcaccgatg 540 ggcgtgatt 549 <210> 41 <211> 516 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 gctcccccaa aggctgtgct gaaactcgag ccccagtgga tcaacgtgct ccaggaggac 60 tctgtgactc tgacatgccg ggggactcac agccctgaga gcgactccat tcagtggttc 120 cacaatggga atctcattcc cacccacacg cagcccagct acaggttcaa ggccaacaac 180 aatgacagcg gggagtacac gtgccagact ggccagacca gcctcagcga ccctgtgcat 240 ctgactgtgc tttccgaatg gctggtgctc cagacccctc acctggagtt ccaggaggga 300 gaaaccatcg tgctgaggtg ccacagctgg aaggacaagc ctctggtcaa ggtcacattc 360 ttccagaatg gaaaatccaa gaaattttcc cgttcggatc ccaacttctc catcccacaa 420 gcaaaccaca gtcacagtgg tgattaccac tgcacaggaa acataggcta cacgctgtac 480 tcatccaagc ctgtgaccat cactgtccaa gctccc 516 <210> 42 <211> 516 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MG2B45.1 <400> 42 gctcccccaa aggctgtgct gaaactcgag ccccagtgga tcaacgtgct ccaggaggac 60 tctgtgactc tgacatgccg ggggactcac agccctgaga gcgactccat tcagtggttc 120 cacaatggga atctcattcc cacccatacc cagccgagct atcattttaa agcgaacaat 180 aatgatagcg gcgaatacac gtgccagact ggccagacca gcctcagcga ccctgtgcat 240 ctgactgtgc tttccgaatg gctggtgctc cagacccctc acctggagtt ccaggaggga 300 gaaaccatcg tgctgaggtg ccacagctgg aaggacaagc ctctggtcaa tgtcgtgttc 360 ttccagaatg gaaaatccaa gaaattttcc cgttcggatc ccaacttctc catcccacaa 420 gcaaaccaca gtcacagtgg tgattaccac tgcacaggaa acataggcta cacgcagtac 480 tcatccaagc ctgtgaccat cactgtccaa gagccc 516 <210> 43 <211> 183 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp Ile Asn Val 1 5 10 15 Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala Arg Ser Pro 20 25 30 Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr 35 40 45 His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly 50 55 60 Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu 85 90 95 Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp 100 105 110 Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Gln Lys 115 120 125 Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser 130 135 140 His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Phe 145 150 155 160 Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser Met Gly Ser 165 170 175 Ser Ser Pro Met Gly Val Ile 180 <210> 44 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SH2A40 <400> 44 Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp Ile Asn Val 1 5 10 15 Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala Arg Ser Pro 20 25 30 Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr 35 40 45 His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly 50 55 60 Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu 85 90 95 Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp 100 105 110 Lys Pro Leu Val Asn Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Gln Lys 115 120 125 Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser 130 135 140 His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Gln Phe 145 150 155 160 Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser Met Gly Ser 165 170 175 Ser Ser Pro Met Gly Val Ile 180 <210> 45 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MG2A28 <400> 45 Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp Ile Asn Val 1 5 10 15 Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala Arg Ser Pro 20 25 30 Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr 35 40 45 His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly 50 55 60 Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu 85 90 95 Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp 100 105 110 Lys Pro Leu Val Asn Val Met Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Gln Lys 115 120 125 Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser 130 135 140 His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Gln Phe 145 150 155 160 Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser Met Gly Ser 165 170 175 Ser Ser Pro Met Gly Val Ile 180 <210> 46 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MG2A45 <400> 46 Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp Ile Asn Val 1 5 10 15 Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala Arg Ser Pro 20 25 30 Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr 35 40 45 His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly 50 55 60 Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu 85 90 95 Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp 100 105 110 Lys Pro Leu Val Asn Val Val Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Gln Lys 115 120 125 Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser 130 135 140 His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Gln Phe 145 150 155 160 Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser Met Gly Ser 165 170 175 Ser Ser Pro Met Gly Val Ile 180 <210> 47 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MG2A28.1 <400> 47 Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp Ile Asn Val 1 5 10 15 Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala Arg Ser Pro 20 25 30 Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr 35 40 45 His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly 50 55 60 Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu Ser Asp Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu 85 90 95 Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp 100 105 110 Lys Pro Leu Val Asn Val Met Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Leu Lys 115 120 125 Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser 130 135 140 His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Gln Phe 145 150 155 160 Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Glu Pro Ser Met Gly Ser 165 170 175 Ser Ser Pro Met Gly Val Ile 180 <210> 48 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MG2A45.1 <400> 48 Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp Ile Asn Val 1 5 10 15 Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala Arg Ser Pro 20 25 30 Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr 35 40 45 His Thr Gln Pro Ser Tyr His Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly 50 55 60 Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu 85 90 95 Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp 100 105 110 Lys Pro Leu Val Asn Val Val Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Gln Lys 115 120 125 Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser 130 135 140 His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Gln Phe 145 150 155 160 Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Glu Pro Ser Met Gly Ser 165 170 175 Ser Ser Pro Met Gly Val Ile 180 <210> 49 <211> 172 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile Asn Val 1 5 10 15 Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser Pro 20 25 30 Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr 35 40 45 His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly 50 55 60 Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu 85 90 95 Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp 100 105 110 Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys Lys 115 120 125 Phe Ser Arg Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser 130 135 140 His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Tyr 145 150 155 160 Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala Pro 165 170 <210> 50 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MG2B45.1 <400> 50 Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile Asn Val 1 5 10 15 Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser Pro 20 25 30 Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr 35 40 45 His Thr Gln Pro Ser Tyr His Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly 50 55 60 Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu 85 90 95 Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp 100 105 110 Lys Pro Leu Val Asn Val Val Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys Lys 115 120 125 Phe Ser Arg Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser 130 135 140 His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Gln Tyr 145 150 155 160 Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Glu Pro 165 170

Claims (19)

  1. Fc 감마 수용체 변이체를 포함하는 폴리펩타이드로서,
    a) 상기 변이체는 서열목록 제43서열 또는 서열목록 제49서열의 야생형(wild type) Fc 감마 수용체의 서열에서 86번째 아미노산, 117번째 아미노산, 119번째 아미노산, 127번째 아미노산, 159번째 아미노산 및 171번째 아미노산의 변형을 포함하며,상기 아미노산의 변형은 86번째 아미노산이 아스파르트산(D)으로, 117번째 아미노산이 아스파라긴(N)으로, 119번째 아미노산이 메티오닌(M) 또는 발린(V)으로, 127번째 아미노산이 류신(L)으로, 159번째 아미노산이 글루타민(Q)으로, 171번째 아미노산이 글루탐산(E)으로 치환된 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 변이체는 서열목록 제47서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 아미노산 치환을 포함하는 변이체는 야생형 Fc 감마 수용체와 비교하여 IgG 항체의 Fc 부위에 대한 결합력이 향상된 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 아미노산 치환을 포함하는 변이체는 야생형 Fc 감마 수용체와 비교하여 IgG 항체의 Fc에 대한 결합력이 3배 이상 향상된 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  6. 제 1 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자.
  7. 제 6 항의 핵산분자를 포함하는 벡터.
  8. 제 7 항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 1 항의 폴리펩타이드, 제 6 항의 핵산분자 또는 제 7 항의 벡터를 포함하는 조성물을 포함하는 키트로서, 상기 키트는 시료에 포함된 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위를 검출하기 위한 키트.
  12. 제 1 항의 폴리펩타이드, 제 6 항의 핵산분자 또는 제 7 항의 벡터를 포함하는 면역 반응 억제용 약제학적 조성물.
  13. 제 1 항의 폴리펩타이드, 제 6 항의 핵산분자 또는 제 7 항의 벡터를 포함하는 장기이식반응 억제용 약제학적 조성물.
  14. 제 1 항의 폴리펩타이드, 제 6 항의 핵산분자 또는 제 7 항의 벡터를 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  15. 삭제
  16. 하기의 단계를 포함하는 Fc 감마 수용체 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 제조방법:
    a) 제 1 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    b) 상기 숙주세포에 의해 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계.
  17. 하기의 단계를 포함하는 시료에 포함된 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위의 존재를 확인하는 방법:
    a) IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위의 존재 여부를 판단하고자 하는 시료를 준비하는 단계;
    b) 상기 시료에 제 1 항의 폴리펩타이드를 혼합하여 서로 결합시키는 단계; 및
    c) 상기 폴리펩타이드가 결합된 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위의 존재를 확인하는 단계.
  18. 하기의 단계를 포함하는 시료에 포함된 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위를 정제하는 방법:
    a) IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위를 포함하는 시료에 제 1 항의 폴리펩타이드를 혼합하여 서로 결합시키는 단계; 및
    b) 상기 폴리펩타이드가 결합된 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위를 정제하는 단계.
  19. 하기의 단계를 포함하는 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위에 대한 결합력이 향상된 Fc 감마 수용체 변이체를 스크리닝하는 방법:
    a) 서열목록 제43서열 또는 서열목록 제49서열에서 117번째 아미노산이 아스파라긴(N)으로 치환되고 159번째 아미노산이 글루타민(Q)으로 치환된 서열을 포함하고, 추가적으로 86번째 아미노산, 127번째 아미노산 및 171번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 포함하는 Fc 감마 수용체 변이체 라이브러리를 구축하는 단계; 및
    b) 상기 라이브러리에서 상기 117번째 및 159번째의 두 가지의 아미노산 서열의 치환만을 포함하는 Fc 감마 수용체 변이체와 비교하여 IgG 항체 또는 IgG 항체의 Fc 부위에 대한 결합력이 보다 향상된 Fc 감마 수용체 변이체를 선별하는 단계.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020107359A1 (en) 1998-02-06 2002-08-08 P. Mark Hogarth Three dimensional structures and models of fc receptors and uses thereof
KR101397554B1 (ko) 2007-11-09 2014-05-21 재단법인서울대학교산학협력재단 치매(알츠하이머 병)의 진단, 예방, 치료제 및 이들의스크리닝 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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