JP7055434B2 - Fcガンマ受容体変異体 - Google Patents
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Description
b)前記宿主細胞によって発現したポリペプチドを回収する段階。
b)前記試料に記ポリペプチドを混合して互いに結合させる段階、及び
c)前記ポリペプチドが結合されたIgG抗体又はIgG抗体のFc部位の存在を確認する段階。
b)前記ポリペプチドが結合されたIgG抗体又はIgG抗体のFc部位を精製する段階。
b)前記ライブラリにおいて前記二つのアミノ酸配列の置換のみを含むFcガンマ受容体変異体と比較して、IgG抗体又はIgG抗体のFc部位に対する結合力がより向上したFcガンマ受容体変異体を選別する段階。
b)前記ライブラリにおいて前記117番目及び159番目の二つのアミノ酸配列の置換のみを含むFcガンマ受容体変異体と比較して、IgG抗体又はIgG抗体のFc部位に対する結合力がより向上したFcガンマ受容体変異体を選別する段階。
b)前記ライブラリにおいて前記55番目、117番目、119番目、159番目及び171番目の五つのアミノ酸配列の置換のみを含むFcガンマ受容体変異体と比較して、IgG抗体又はIgG抗体のFc部位に対する結合力がより向上したFcガンマ受容体変異体を選別する段階。
[実施例1:FcγRIIa変異体ライブラリ製作]
pMopac12-NlpA-FcγRIIa-FLAGベクターに基づき、FcγRIIa内に0.2%程度の無作為突然変異が生ずるようにプライマーMJ#160、MJ#161を用いて無作為に突然変異が導入されたFcγRIIa遺伝子を製作した。また、FcγRIIaのIgG Fcとの結合位置に縮退コドンであるNNKを導入して多様なアミノ酸が導入されるようにfocused insertをプライマーMJ#160、MJ#161、p788、p789、p790、p791、p792、p793を用いて製作した(表1)。製作された2種のinsertをSfiI(New England Biolabs社製)で制限酵素処理してベクターとライゲーションした。その後、大膓菌Jude1((F’[Tn10(Tetr)proAB+lacIqΔ(lacZ)M15]mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80dlacZΔM15ΔlacX74deoRrecA1araD139Δ(araleu)7697galU galKrpsLendA1nupG)に形質転換して巨大FcγRIIa変異体ライブラリ(ライブラリの大きさ:2.2×109)を構築した(図1)。
構築されたFcγRIIa変異体ライブラリ細胞1mlを37℃、250rpm振盪の条件で2%(w/v)グルコースにクロラムフェニコール(40μg/ml)が含まれたTerrific Broth(TB)培地に入れ、4時間培養した。培養されたライブラリ細胞をTB培地に1:100で接種した後、37℃、250rpm振盪の条件でOD600が0.6に到逹するまで培養した。その後、冷却のために20分間25℃で培養した後、1mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside(IPTG)を入れて発現を誘導した。培養が終わった後、細胞を回収し、OD600ノーマライゼーション(normalize)によって一定量ずつ14,000rpmで1分間遠心分離して細胞を収獲した。1mlの10mM Tris-HCl(pH8.0)を添加して細胞を再懸濁し、1分間遠心分離する洗浄する過程を2回繰り返した。1mlのSTE[0.5Mスクロース、10mM Tris-HCl、10mM EDTA(pH8.0)]で再懸濁し、37℃、30分間の回転によって細胞外膜を除去した。遠心分離して上澄み液を捨てた後、1mlの溶液A[0.5Mスクロース、20mM MgCl2、10mM MOPS pH6.8]を添加し、再懸濁及び遠心分離を行った。1mlの溶液Aと50mg/mlリゾチーム溶液20μlを混合した溶液を1ml添加して再懸濁した後、37℃で15分間回転させてペプチドグリカン層を除去した。遠心分離後、上澄み液を除去し、1mlのPBSで再懸濁した後、300μlを取り、700μlのPBSとヒト血清IgG-FITCプローブ(Sigma-aldrich社製)をともに入れ、常温で回転させてスフェロプラスト(spheroplast)に蛍光プローブをラベリングした。ラベリング後、1mlのPBSで1回洗浄した後、フローサイトメトリー分析器(Flow cytometry:S3 cell sorter(Bio-rad))を用いて高い蛍光を現す上位3%の細胞を回収し、蛍光の高い細胞の純度を高めるために選別(sorting)された細胞を再選別(resorting)した。再選別されたサンプルをプライマーMJ#160、MJ#161及びTaqポリメラーゼ(Biosesang社製)を用いてPCRで遺伝子を増幅し、SfiI制限酵素処理、ライゲーション、形質転換過程を介して選別された細胞の遺伝子が増幅されたサブライブラリを製作した。この過程を総4ラウンドにかけて繰り返した後、40個の個別クローンをそれぞれ分析して野生型FcγRIIa(配列リストの第35配列及び第43配列)よりヒト血清IgGに対して高い親和度を現すSH2A40変異体(配列リストの第36配列及び第44配列)を選別した(図2)。
発掘した変異体の中でSH2A40をHEK293F細胞で発現するために遺伝子をベントポリメラーゼ(Vent polymerase)とプライマーMJ#162、MJ#163を用いてPCRで増幅した後、BssHII、XbaI(New England Biolabs社製)で制限酵素処理、ライゲーションしてpMAZ-FcγRIIa(野生型)、pMAZ-FcγRIIa変異体(variant)(SH2A40)を製作した。動物細胞用発現ベクターであるpMAZでクローニングした遺伝子はHEK293F細胞に形質移入(transfection)し、300mlの規模で臨時発現した。培養の終わった培養液に対し、2,000rpmで10分間の遠心分離によって細胞を除去し、上澄み液を取り、25×PBSを用いて平衡を保った。ボトルトップフィルター(bottle top filter)を用いて0.2μmフィルター(Merck Millipore社製)で濾過した。PBSで平衡を保ったNi-NTAアガロース(Qiagen社製)1ml スラリーを添加し、4℃で16時間撹拌した後、ポリプロピレンカラム(Thermo Fisher Scientific社製)に流した。パススルー溶液(pass-through solution)を取り、もう一度樹脂に流して結合させた後、50mlの1×PBS、25mlの10mMイミダゾールバッファー、25mlの20mMイミダゾールバッファー、200μlの250mMイミダゾールバッファーの順に洗浄した。溶出(溶出)は250mMイミダゾールバッファー2.5mlで遂行した。得られたタンパク質はAmicon Ultra-4(Merck Millipore社製)を介してPBSにバッファーを交替した後、濃縮過程でSDS-PAGE(Bio-Rad社製)を介して精製されたタンパク質を確認した(図3)。SDS-PAGE上でFcγRIIaタンパク質(32kDa)が高純度に精製されたことが確認された。
0.05M Na2CO3 pH9.6に4μg/mlに希釈したリツキシマブをそれぞれ50μlずつFlat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate(costar)に4℃で16時間固定化した後、100μlの5%BSA(0.05%PBST)で常温で2時間ブロッキングした。0.05%PBST 180μlで4回ずつ洗浄を進めた後、ブロッキング溶液で順次希釈されたFcγRIIaタンパク質を50μlの各wellに分株し、常温で1時間反応させた。洗浄過程後、anti-His-HRP conjugate(Sigma-Aldrich社製)50μlずつを用いて常温で1時間抗体反応を進め、洗浄過程を遂行した。1-Step Ultra TMB-ELISA基質溶液(Thermo Fisher Scientific社製)50μlずつを添加して発色した後、2M H2SO4 50μlずつを入れて反応を終了させた後、Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek社製)を用いて分析した。各実験はいずれもduplicateで進め、ELISA結果、リツキシマブのFc部分と野生型FcγRIIa、SH2A40に対する結合力を比較分析することができた。その結果、SH2A40が新しいN-linked canonical glycosylation motifが追加されたから、WT FcγRIIaにほぼ同じ結合力を現した(図4)。
選別されたSH2A40を可溶性タンパク質形態に生産するために該当遺伝子をIIa_Fw_NdeI、IIa_Rv_HindIIIプライマーでPCRした後、NdeI、HindIII(New England Biolabs社製)処理を行った。その後、NdeI、HindIII一pET22b-MBP-TEV site-Hisベクターとライゲーションした後、BL21(DE3)細胞に形質転換した。該当細胞を37℃で250rpm振盪の条件で2%(w/v)グルコースにアンピシリン(100μg/ml)が含まれたTB培地に入れて前培養した。培養された細胞をTB培地に1:100で接種した後、37℃で250rpmの振盪によってOD600が0.6に到逹するまで培養した。その後、冷却のために20分間18℃で培養した後、1mM IPTGを入れ、14時間の間に発現を誘導した。培養が終わった後、7,000rpmで10分間の遠心分離によって細胞を収獲した。細胞破砕のために超音波処理(5秒オン/10秒オフ、100回繰り返し)し、15,000rpmで30分間遠心分離し、上澄み液を0.45μmシリンジフィルターで濾過した。濾過された上澄み液をNi-NTA樹脂に結合させ、100mlの10mMイミダゾールバッファー、100mlの20mMイミダゾールバッファーで洗浄した後、50mMイミダゾールバッファー4mlで溶出した。溶出されたサンプルを50mM Tris-HClで緩衝液交換した後、TEV-GSTを用いてMBP-SH2A40をMBPとSH2A40で切断(cleavage)した後、GST樹脂とアミロース樹脂でTEV-GSTとMBPタンパク質を除去して純粋なSH2A40のみ得た(図5)。
発現精製後に発掘したSH2A40の活性を調べるためにELISAを行った。0.05M Na2CO3 pH9.6に4μg/mlに希釈したリツキシマブを50μlずつFlat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate(costar)に4℃で16時間固定化した後、100μlの4%脱脂乳(GenomicBase)(0.05%PBST)で常温で2時間ブロッキングした。0.05%PBST 180μlで4回ずつ洗浄を行った後、1%脱脂乳(0.05%PBST)で順次希釈されたWT FcγRIIaとSH2A40を50μlの各wellに分株し、常温で1時間反応させた。洗浄過程後、anti-His-HRP conjugate(sigma社)50μlずつを用いて常温で1時間抗体反応を進め、洗浄過程を遂行した。1-Step Ultra TMB-ELISA基質溶液(Thermo Fisher Scientific社製)50μlずつ添加して発色した後、2M H2SO4 50μlずつ入れて反応を終了させた後、Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek社製)を用いて分析した(図6)。
FcγRIIa変異体(SH2A40:K117N、L159Q)に形成されたN-linked canonical glycosylation motif(N-X-S/T)を除去しながらIgG Fcとの親和度の高いFcγRIIa変異体を探索するためにライブラリを製作した。このライブラリはSH2A40でN-linked canonical glycosylation motifが形成されたV116、K117、T119位置に集中して製作した。ライブラリのテンプレートとしてはSH2A40をテンプレートとして製作し、unpaired Cycを予防するために、Cysが生じないようにreduced codonを用いた(図7)。
pMopac12-NlpA-FcγRIIa(SH2A40)-FLAGをテンプレートとし、116番、119番位置は20個のアミノ酸がコーディングされるようにNNK縮退コドンを使い、117番位置はNNG reduced codonを用いて13個アミノ酸をコーディングし、5個の残りのアミノ酸(Gln、Phe、His、Ile、Tyr)はそれぞれコーディングするプライマーを製作して同量で混合してから使った。プライマーMJ#160、MJ#112とベントポリメラーゼ(Vent polymerase)(New England Biolabs社製)を使ってFcγRIIa遺伝子の116番の前部分である断片-1(fragment-1)を増幅し、後側の断片-2を増幅するときはMJ#113-MJ#118を同一のアミノ酸の比率で交ぜた混合物とMJ#161を使った。準備された2個の断片はベントポリメラーゼ(Vent polymerase)でアセンブル(assemble)し、SfiI(New England Biolabs社製)制限酵素処理した。
pMopac12-NlpA-FcγRIIa(SH2A40)-FLAGをテンプレートとし、116番、117番位置は20個アミノ酸がコーディングされるようにNNK縮退コドンを使い、119番位置はNWK reduced codonを用いて12個アミノ酸をコーディングし、5個の残りのアミノ酸(Ala、Gly、Pro、Arg、Trp)はそれぞれコーディングするプライマーを製作し、同量で混合してから使った。プライマーMJ#160、MJ#112とベントポリメラーゼ(Vent polymerase)(New England Biolabs社製)を使ってFcγRIIa遺伝子の116番の前部分である断片-1を増幅し、後側の断片-2を増幅するときはMJ#119-MJ#124を同一のアミノ酸の比率で交ぜた混合物とMJ#161を使った。準備された2個の断片はベントポリメラーゼ(Vent polymerase)でアセンブル(assemble)し、SfiI(New England Biolabs社製)制限酵素処理した。
構築されたライブラリは、250mlフラスコでTB+2%グルコース培地25mlに1vial(1ml)を溶かし、37℃で4時間培養した後、100mlのTB培地が収容された500mlフラスコで1:100接種してOD600=0.6まで培養した。直ちに25℃、250rpmで20分間冷却過程を経た後、1mM IPTGを添加し、25℃、250rpmで5時間過発現した。過発現後、OD600値を測定し、ノーマライゼーションされた量ずつ14,000rpmで1分間遠心分離して細胞を回収した。1mlの10mM Tris-HCl(pH8.0)を添加して細胞を再懸濁し1分間遠心分離する洗浄過程を2回繰り返した。1mlのSTE[0.5Mスクロース、10mM Tris-HCl、10mM EDTA(pH8.0)]で再懸濁し、37℃で30分間回転させて細胞外膜を除去した。遠心分離して上澄み液を除去した後、1mlの溶液A[0.5Mスクロース、20mM MgCl2、10mM MOPS pH6.8]を添加し、再懸濁及び遠心分離を行った。1mlの溶液Aと50mg/mlリゾチーム溶液20μlを混合した溶液を1ml添加して再懸濁した後、37℃で15分間回転させてペプチドグリカン層を除去した。遠心分離後、上澄み液を除去し、1mlのPBSで再懸濁した後、300μlを取り、700μlのPBSとヒト血清IgG-FITC(Sigma-aldrich社製)プローブを一緒に入れ、常温で回転させてスフェロプラストに蛍光プローブをラベリングした。ラベリング後、1mlのPBSで1回洗浄した後、PBSに20倍希釈し、S3 cell sorter(Bio-rad)装備を用いて上位3%の蛍光信号を出す細胞のみ分離して取った。より効率的なスクリーニングのために、分離した細胞はもう一度選別して再選別作業を遂行した。選別された細胞はMJ#1、MJ#2プライマーとTaqポリメラーゼ(Biosesang社製)を用い、PCRで遺伝子を増幅し、SfiI制限酵素処理、ライゲーション、形質転換過程を経て選別された細胞の遺伝子が増幅されたサブライブラリを製作した。この過程を総3ラウンドにかけて繰り返した後、50余個の個別クローンの塩基配列分析によってヒト血清IgGのFc部分と高い親和度を現す変異体を選別した(図8)。
発掘した変異体の中でMG2A28(配列リストの第37配列及び第45配列)、MG2A45(配列リストの第38配列及び第46配列)をHEK293F細胞で発現するために遺伝子をベントポリメラーゼ(Vent polymerase)とプライマーMJ#162、MJ#163を使ってPCRで増幅した後、BssHII、XbaI(New England Biolabs社製)で制限酵素処理、ライゲーションしてpMAZ-FcγRIIa変異体(MG2A28)、pMAZ-FcγRIIa変異体(MG2A45)を製作した。動物細胞用発現ベクターであるpMAZにクローニングした遺伝子はHEK293F細胞に形質移入し、300mlの規模で臨時発現した。培養の終わった培養液は2000rpmで10分間遠心分離して細胞を除去し、上澄み液を取り、25×PBSを用いて平衡を保った。ボトルトップフィルターを用いて0.2μmフィルター(Merck Millipore社製)で濾過した。PBSで平衡を保ったNi-NTAアガロース(Qiagen社製)1mlのスラリーを添加し、4℃で16時間撹拌した後、ポリプロピレンカラム(Thermo Fisher Scientific社製)に流した。パススルー溶液(pass-through solution)を取り、もう一度樹脂に流して結合させた後、50mlの1×PBS、25mlの10mMイミダゾールバッファー、25mlの20mMイミダゾールバッファー、200μlの250mMイミダゾールバッファーの順に洗浄した。溶出は250mMイミダゾールバッファー2.5mlで遂行した。得られたタンパク質はAmicon Ultra-4(Merck Millipore社製)を介してPBSにバッファーを交替した後、濃縮過程を経てSDS-PAGE(Bio-Rad社製)を介して精製されたタンパク質を確認した(図9)。SDS-PAGE上でFcγRIIaタンパク質(32kDa)が高純度に精製されたことが確認された。
0.05M Na2CO3 pH9.6に4μg/mlに希釈したリツキシマブをそれぞれ50μlずつFlat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate(costar)に4℃で16時間固定化した後、100μlの5%BSA(0.05%PBST)で常温で2時間ブロッキングした。0.05%PBST180μlで4回ずつ洗浄した後、ブロッキング溶液で順次希釈されたFcγRIIa変異体を50μlの各wellに分株し、常温で1時間反応させた。洗浄過程後、anti-His-HRP conjugate(Sigma-Aldrich社製)50μlずつを用いて常温で1時間抗体反応を進め、洗浄過程を遂行した。1-Step Ultra TMB-ELISA基質溶液(Thermo Fisher Scientific社製)50μlずつを添加して発色した後、2M H2SO4 50μlずつ入れて反応を終了させた後、Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek社製)を用いて分析した(図10)。各実験はいずれもduplicateで進め、ELISA結果、リツキシマブのFc部分とFcγRIIa変異体(野生型、SH2A40、MG2A28、MG2A45)に対する結合力を比較分析することができた。
ヒト血清の約70%以上を占め、各種の抗体医薬品に主に使われるIgGサブクラスであるIgG1のFcとの結合力を測定するために、リツキシマブを用いてFcγRIIa変異体の親和度測定を遂行した。Blitz(Fortebio社製)を使ってFcγRIIa変異体の結合力を測定した。安定的な分析のために、Amine reactive 2nd generation(AR2G) biosensor(Fortebio社製)に酢酸ナトリウムpH5.0溶液に40μg/mlに希釈したリツキシマブ抗体を固定化し、1×キネティックバッファー(Fortebio社製)で順次希釈したFcγRIIa変異体(野生型SH2A40、MG2A28、MG2A45)をそれぞれ反応させて結合力を分析した(図11)。平衡結合定数(Equilibrium binding constant)(KD)を計算するために、Blitz Pro 1.2software(Fortebio社製)を活用した(表3)。その結果、この研究によって発掘したSH2A40とMG2A28、MG2A45は野生型と比較してFcに対する結合力がそれぞれ3.57倍、6.16倍、8.26倍増加したことを確認することができた。
MG2A28とMG2A45に基づくFcγRIIa変異体ライブラリを製作するために、pMopac12-NlpA-FcγRIIa(MG2A28、MG2A45)-FLAGをテンプレートとして変異性(error-prone)PCRを進めた。FcγRIIa部分に無作為な点突然変異を加えるための方法としてTaqポリメラーゼ(Takara社製)を用いた変異性PCR技法を用いた。ライブラリにMG2A28とMG2A45の2種の変異体が50%ずつ同じ比率で存在するようにするためにそれぞれPCRを進め、プライマーMJ#160、MJ#161を使って全てのFcγRIIa遺伝子で0.3%のヌクレオチドに点突然変異が導入されるようにした。その後、SfiI制限酵素処理及びライゲーション過程を経てJude1に形質転換してFcγRIIaライブラリを製作した(ライブラリの大きさ:2.6×109、実験誤差率(experimental error rate):0.32%)。大膓菌の内膜にFcγRIIa変異体がディスプレイされるライブラリを構築した。
構築されたライブラリは、250mlフラスコでTB+2%グルコース培地25mlに1vial(1ml)を溶かし、37℃で4時間培養した後、100mlのTB培地が収容された500mlフラスコで1:100で接種してOD600=0.6まで培養した。直ちに25℃、250rpmで20分間冷却過程を経た後、1mM IPTGを添加し、25℃、250rpmで5時間過発現した。過発現後、OD600値を測定し、ノーマライゼーションされた量ずつ14,000rpmで1分間遠心分離して細胞を回収した。1mlの10mM Tris-HCl(pH8.0)を添加して細胞を再懸濁し、1分間遠心分離する洗浄過程を2回繰り返した。1mlのSTE[0.5Mスクロース、10mM Tris-HCl、10mM EDTA(pH8.0)]で再懸濁し、37℃で30分間回転させて細胞外膜を除去した。遠心分離して上澄み液を除去した後、1mlの溶液A[0.5Mスクロース、20mM MgCl2、10mM MOPS pH6.8]を添加して再懸濁及び遠心分離を行った。1mlの溶液Aと50mg/mlリゾチーム溶液20μlを混合した溶液を1ml添加して再懸濁した後、37℃で15分間回転させてペプチドグリカン層を除去した。遠心分離後、上澄み液を除去し、1mlのPBSで再懸濁した後、300μlを取り、700μlのPBSとヒト血清IgG-FITC(Sigma-aldrich社製)プローブを一緒に入れ、常温で回転させてスフェロプラストに蛍光プローブをラベリングした(1及び2ラウンド:20nM、3ラウンド:5nM)。ラベリング後、1mlのPBSで1回洗浄した後、PBSに20倍希釈し、S3 cell sorter(Bio-rad)装備を用いて上位3%の蛍光信号を出す細胞のみ分離して取った。より効率的なスクリーニングのために、分離した細胞をもう一度選別して再選別作業を遂行した。選別された細胞はMJ#1、MJ#2プライマーとTaqポリメラーゼ(Biosesang社製)を用いてPCRで遺伝子を増幅し、SfiI制限酵素処理、ライゲーション、形質転換過程を介して選別された細胞の遺伝子が増幅されたサブライブラリを製作した。この過程を総5ラウンドにかけて繰り返した後、70余個の個別クローンのIgG-FITCとの結合による蛍光信号強度を分析した。これにより、ヒト血清IgGのFc部分と高い親和度を現す変異体を選別し、塩基配列分析によってMG2A28に基づく変異体とMG2A45に基づく変異体がそれぞれ1種類ずつ分離(isolation)されたことが確認された(図12)。
発掘した変異体の中でMG2A28.1(配列リストの第39配列及び第47配列)、MG2A45.1(配列リストの第40配列及び第48配列)をHEK293F細胞で発現するために、遺伝子をベントポリメラーゼ(Vent polymerase)とプライマーMJ#162、MJ#163を使ってPCRで増幅した後、BssHII、XbaI(New England Biolabs社製)で制限酵素処理、ライゲーションしてpMAZ-FcγRIIa変異体(MG2A28.1)、pMAZ-FcγRIIa変異体(MG2A45.1)を製作した。動物細胞用発現ベクターであるpMAZにクローニングした遺伝子はHEK293F細胞に形質移入し、300mlの規模で臨時発現した。培養の終わった培養液は、2000rpmで10分間遠心分離して細胞を除去し、上澄み液を取り、25×PBSを用いて平衡を保った。ボトルトップフィルターを用いて0.2μmフィルター(Merck Millipore社製)で濾過した。PBSで平衡を保ったNi-NTAアガロース(Qiagen社製)1mlスラリーを添加し、4℃で16時間撹拌した後、ポリプロピレンカラム(Thermo Fisher Scientific社製)に流した。パススルー溶液(pass-through solution)を取り、もう一度樹脂に流して結合させた後、50mlの1×PBS、25mlの10mMイミダゾールバッファー、25mlの20mMイミダゾールバッファー、200μlの250mMイミダゾールバッファーの順に洗浄した。溶出は250mMイミダゾールバッファー2.5mlで遂行した。得られたタンパク質はAmicon Ultra-4(Merck Millipore社製)を介してPBSにバッファーを交替した後、濃縮過程によってSDS-PAGE(Bio-Rad社製)で精製されたタンパク質を確認した(図13)。SDS-PAGE上でFcγRIIaタンパク質(32kDa)が高純度に精製されたことが確認された。
0.05M Na2CO3 pH9.6に4μg/mlに希釈したリツキシマブをそれぞれ50μlずつFlat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate(costar)で4℃で16時間固定化した後、100μlの5%BSA(0.05%PBST)で常温で2時間ブロッキングした。0.05%PBST 180μlで4回ずつ洗浄を進めた後、ブロッキング溶液で順次希釈されたFcγRIIa変異体を50μlの各wellに分株し、常温で1時間反応させた。洗浄過程後、anti-His-HRP conjugate(Sigma-Aldrich社製)50μlずつを用いて常温で1時間抗体反応を進め、洗浄過程を遂行した。1-Step Ultra TMB-ELISA基質溶液(Thermo Fisher Scientific社製)50μlずつ添加して発色した後、2M H2SO4 50μlずつ入れて反応を終了させた後、Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek社製)を用いて分析した(図14)。各実験はいずれもduplicateで進め、ELISA結果、リツキシマブのFc部分とFcγRIIa変異体(野生型、MG2A28、MG2A45、MG2A28.1、MG2A45.1)に対する結合力を比較分析することができた。
ヒト血清の約70%以上を占め、各種の抗体医薬品に主に使われるIgGサブクラスであるIgG1のFcとの結合力を測定するために、リツキシマブを用いてFcγRIIa変異体の親和度測定を遂行した。Blitz(Fortebio社製)を使ってFcγRIIa変異体の結合力を測定した。安定的な分析のために、Amine reactive 2nd generation(AR2G) biosensor(Fortebio社製)に酢酸ナトリウムpH5.0溶液に40μg/mlに希釈したリツキシマブ抗体を固定化し、1×キネティックバッファー(Fortebio社製)で順次希釈したFcγRIIa変異体(MG2A28.1、MG2A45.1)をそれぞれ反応させて結合力を分析した(図15)。平衡結合定数(KD)を計算するために、Blitz Pro 1.2 software(Fortebio社製)を活用した(表4)。その結果、この研究によって発掘したMG2A28.1とMG2A45.1は野生型と比較してFcに対する結合力がそれぞれ5.39倍、32.09倍増加したことを確認することができた。
0.05M Na2CO3 pH9.6に4μg/mlに希釈したマウス血清IgGをそれぞれ50μlずつFlat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate(costar)に4℃で16時間固定化した後、100μlの5%BSA(0.05%PBST)で常温で2時間ブロッキングした。0.05%PBST 180μlで4回ずつ洗浄を進めた後、ブロッキング溶液で順次希釈されたFcγRIIa変異体(野生型、MG2A28、MG2A45、MG2A28.1、MG2A45.1)を50μlの各wellに分株し、常温で1時間反応させた。洗浄過程後、anti-His-HRP conjugate(Sigma-Aldrich社製)50μlずつを用いて常温で1時間抗体反応を進め、洗浄過程を遂行した。1-Step Ultra TMB-ELISA基質溶液(Thermo Fisher Scientific社製)50μlずつ添加して発色した後、2M H2SO4 50μlずつ入れて反応を終了させた後、Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek社製)を用いて分析した(図16)。各実験はいずれもduplicateで進め、ELISA結果、マウス血清IgGとFcγRIIa変異体(野生型、MG2A28、MG2A45、MG2A28.1、MG2A45.1)に対する結合力を比較分析することができた。MG2A28を除いた全ての変異体は野生型と比較して同等乃至高い親和度でマウス血清IgGと結合するということが分かり、その中でMG2A45とMG2A45.1変異体がマウス血清IgGと最も高い親和度で結合することを確認した。
発掘した点突然変異のFcγRIIb(配列リストの第41配列及び第49配列)に対する影響を分析するための実験を遂行した。このために、pMopac12-NlpA-FcγRIIb-FLAGプラスミドをテンプレートとして使い、FcγRIIb遺伝子部分にMG2A45.1点突然変異(R55H、K117N、T119V、L159Q、V171E)のうちR55HとL159Qを導入するために、Quikchange site directed mutagenesis(Agilent社製)技法を用いた。各点突然変異の導入のために、MJ#200とMJ#201、MJ#202とMJ#203プライマーを使い、Pfu turbo polymerase(Agilent社製)を用いてPCRを行った後、DpnI(New England Biolabs社製)制限酵素処理のために、37℃で3時間培養(incubation)した。準備された遺伝子は、形質転換した後、塩基配列分析によって点突然変異が成功的に挿入されたことを確認した。また、K117N、T119V、V171Eの3種の点突然変異を導入するために、assembly PCR技法を活用した。Quikchange site directed mutagenesisによってR55HとL159Qが導入されているプラスミドをテンプレートとし、MJ#160とMJ#197、MJ#198とMJ#199プライマーとベントポリメラーゼ(Vent polymerase)(New England Biolabs社製)を用いて2個の断片を増幅し、MJ#160とMJ#199でアセンブルした。その後、SfiI制限酵素処理及びライゲーション、形質転換過程を経て塩基配列を分析して、MG2A45.1の5個の点突然変異が全て挿入されたpMopac12-NlpA-FcγRIIb(MG2B45.1)-FLAG遺伝子の製作を完了した。
FcγRIIb変異体(MG2B45.1)(配列リストの第42配列及び第50配列)はヒト血清IgG-FITCに対する親和度を野生型FcγRIIbと比較分析した。5mlのTB+2%グルコース培地で前培養した接種材料(inoculum)を5mlのTB培地に1:100で接種してOD600=0.6まで培養した。直ちに25℃、250rpmで20分間冷却過程を経た後、1mM IPTGを添加して25℃、250rpmで5時間過発現した。過発現後、OD600値を測定し、ノーマライゼーションされた量ずつ14,000rpmで1分間遠心分離して細胞を回収した。1mlの10mM Tris-HCl(pH8.0)を添加して細胞を再懸濁し1分間遠心分離する洗浄過程を2回繰り返した。1mlのSTE[0.5Mスクロース、10mM Tris-HCl、10mM EDTA(pH8.0)]で再懸濁し、37℃で30分間回転させて細胞外膜を除去した。遠心分離して上澄み液を除去した後、1mlの溶液A[0.5Mスクロース、20mM MgCl2、10mM MOPS pH6.8]を添加して再懸濁及び遠心分離を行った。1mlの溶液Aと50mg/mlリゾチーム溶液20μlを混合した溶液を1ml添加して再懸濁した後、37℃で15分間回転させてペプチドグリカン層を除去した。遠心分離後、上澄み液を除去し、1mlのPBSで再懸濁した後、300μlを取り、700μlのPBSとヒト血清IgG-FITC(Sigma-aldrich社製)プローブを一緒に入れ、常温で1時間回転させてスフェロプラストに蛍光プローブをラベリングした。ラベリング後、1mlのPBSで1回洗浄した後、Guava(Merck Millipore社製)装備を用いてFcγRIIbに結合されたヒト血清IgG-FITCによる蛍光信号を分析した(図17)。
Bevacizumabの重鎖をテンプレートとして、ベントポリメラーゼ(Vent polymerase)とプライマーBR#1、BR#2を用いてVH遺伝子を増幅し、軽鎖をテンプレートとして、プライマーBR#4、BR#5を用いてVL遺伝子を増幅した。それぞれ増幅された遺伝子はプライマーBR#3に導入されたGSリンカーを用いてアセンブルし、BssHII、XbaI(New England Biolabs社製)で制限酵素処理、ライゲーション過程を経て動物細胞発現用ベクターであるpMAZベクターにクローニングしてBevacizumab scFvを製作した。FcγRIIa野生型とFcγRIIa変異体はプライマーBR#6、BR#7を用いてそれぞれ増幅した。増幅されたFcγRIIa遺伝子はBR#6に導入されたGSリンカーを用いてアセンブルしてBevacizumab scFv-FcγRIIa野生型、Bevacizumab scFv-MG2A45.1遺伝子をそれぞれ増幅した。増幅された遺伝子はBssHII、XbaI(New England Biolabs社製)で制限酵素処理、ライゲーションし、動物細胞発現用ベクターであるpMAZベクターにクローニングしてpMAZ-Bevacizumab scFv、pMAZ-Bevacizumab scFv-FcγRIIa野生型、pMAZ-Bevacizumab scFv-MG2A45.1をそれぞれ製作した。本実施例で用いられたプライマーについての情報は表2の通りである。
製作された遺伝子はExpi 293F細胞に300mlの規模で臨時発現した。培養が終わった後、7500rpmで15分間遠心分離して細胞を除去し、上澄み液を取り、25×PBSを用いて平衡を保った後、ボトルトップフィルターを用いて0.2μmフィルター(Merck Millipore社製)で濾過した。PBSで平衡を保ったNi-NTAアガロース(Qiagen社製)1mlのスラリーを添加し、4℃で16時間撹拌した後、ポリプロピレンカラム(Thermo Fisher Scientific社製)に流した。その後、25mlの10mMイミダゾールバッファー、25mlの20mMイミダゾールバッファー、250μlの250mMイミダゾールバッファーの順に洗浄した。溶出は250mMイミダゾールバッファー4mlで遂行した。得られたタンパク質は、Amicon Ultra-4(Merck Millipore社製)によってPBSにバッファーを交替した後、濃縮過程を経てSDS-PAGE(Bio-Rad社製)によって精製されたタンパク質を確認した(図18)。
0.05M Na2CO3 pH9.6に500ng/mlに希釈したVEGF(Genscript社製)をそれぞれ50μlずつFlat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate(costar)に4℃で16時間固定化した後、100μlの5%BSA(0.05%PBST)で常温で1時間ブロッキングした。0.05%PBST 180μlで4回ずつ洗浄した後、ブロッキング溶液で順次希釈されたBevacizumab scFv、Bevacizumab scFv-FcγRIIa-野生型、Bevacizumab scFv-MG2A45.1タンパク質を50μlずつ各wellに分株し、常温で1時間反応させた。洗浄過程後、二次抗体(secondary antibody)であるanti-His antibody-HRP conjugate(Sigma-Aldrich社製)のFc domainとFcγRIIaの架橋結合(cross-linking)を防止するために、20μg/mlのヒト血清IgGを50μlずつ各wellに分株し、常温で1時間反応させた。洗浄過程を経た後、anti-His-HRP conjugate50μlずつを用いて常温で1時間抗体反応を進め、洗浄過程を遂行した。1-Step Ultra TMB-ELISA基質溶液(Thermo Fisher Scientific社製)50μlずつ添加して発色した後、2M H2SO4 50μlずつ入れて反応を終了させた後、Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek社製)を用いて450nmでの吸光度を分析した。各実験はいずれもduplicateで進め、ELISA結果、FcγRIIa変異体が融合したBevacizumab scFvのVEGFに対する結合活性を分析することができた。その結果、FcγRIIa野生型とFcγRIIa変異体であるMG2A45.1がBevacizumab scFvに融合してもBevacizumab scFv固有の特性であるVEGF結合が正常になされることを確認した(図19)。また、FcγRIIaが非共有結合によって二量体を成す性質があるから(Maxwell, K. F., M. S. Powell, M. D. Hulett, P. A. Barton, I. F. McKenzie, T. P. Garrett, and P. M. Hogarth. 1999. Crystal structure of the human leukocyte Fc receptor, FcγRIIa. Nat. Struct. Biol.6: 437-442)FcγRIIaが融合したタンパク質がELISA上で親和性(avidity)によって結合力が一層高く現れたことを確認することができた。
0.05M Na2CO3 pH9.6に4μg/mlに希釈したリツキシマブをそれぞれ50μlずつFlat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate(costar)に4℃で16時間固定化した後、100μlの5%BSA(0.05%PBST)で常温で1時間ブロッキングした。0.05%PBST180μlで4回ずつ洗浄した後、ブロッキング溶液で順次希釈されたBevacizumab scFv、Bevacizumab scFv-FcγRIIa野生型、Bevacizumab scFv-MG2A45.1タンパク質を50μlずつ各wellに分株し、常温で1時間反応させた。洗浄過程後、anti-His-HRP conjugate(Sigma-Aldrich社製)50μlずつを用いて常温で1時間の間に抗体反応を進め、洗浄過程を遂行した。1-Step Ultra TMB-ELISA基質溶液(Thermo Fisher Scientific社製)50μlずつ添加して発色した後、2M H2SO4 50μlずつ入れて反応を終了させた後、Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek社製)を用いて吸光度を分析した。各実験はいずれもduplicateで進めた。ELISA結果、FcγRIIaのないBevacizumab scFvを除いたBevacizumab scFv-FcγRIIa野生型とBevacizumab scFv-FcγRIIa-MG2A45.1のIgG1 Fcから構成されたリツキシマブに対する結合力がいずれも正常に維持されることを確認した。また、Fcとの結合力が向上したMG2A45.1を融合したタンパク質のリツキシマブに対する結合力がもっと増加したことが現れることから、Bevacizumab scFvを融合しても野生型FcγRIIaとその変異体であるMG2A45.1がその特性を維持していることを確認した(図20)。
Claims (18)
- Fcガンマ受容体変異体を含むポリペプチドであって、
前記変異体は配列リストの第43配列又は配列リストの第49配列において117番目アミノ酸がアスパラギン(N)に置換され、159番目アミノ酸がグルタミン(Q)に置換され、119番目アミノ酸がバリン(V)に置換された配列を含むFcガンマ受容体変異体であることを特徴とする、ポリペプチド。 - Fcガンマ受容体変異体を含むポリペプチドであって、
前記変異体は配列リストの第43配列又は配列リストの第49配列において117番目アミノ酸がアスパラギン(N)に置換され、159番目アミノ酸がグルタミン(Q)に置換された配列を含むFcガンマ受容体変異体であり、
前記Fcガンマ受容体変異体はバクテリア培養において発現し、野生型Fcガンマ受容体と比較してヒトIgG抗体のFc部位に対する結合力が向上していることを特徴とする、ポリペプチド。 - Fcガンマ受容体変異体を含むポリペプチドであって、
前記変異体は配列リストの第43配列又は配列リストの第49配列において117番目アミノ酸がアスパラギン(N)に置換され、159番目アミノ酸がグルタミン(Q)に置換され、119番目アミノ酸がメチオニン(M)に置換された配列を含むFcガンマ受容体変異体であり、
前記Fcガンマ受容体変異体は野生型Fcガンマ受容体と比較してヒトIgG抗体のFc部位に対する結合力が向上していることを特徴とする、ポリペプチド。 - 請求項3に記載のポリペプチドにおいて、さらに86番目アミノ酸のアスパラギン酸(D)への置換、127番目アミノ酸のロイシン(L)への置換、及び171番目アミノ酸のグルタミン酸(E)への置換からなる群から選択される一つ又はそれ以上のアミノ酸置換を含むFcガンマ受容体変異体を含むポリペプチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドにおいて、さらに55番目アミノ酸のヒスチジン(H)への置換、及び171番目アミノ酸のグルタミン酸(E)への置換からなる群から選択される一つ又はそれ以上のアミノ酸置換を含むFcガンマ受容体変異体を含むポリペプチド。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載のポリペプチドをコーディングする、核酸分子。
- 請求項6に記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 請求項7に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項6に記載の核酸分子又は請求項7に記載のベクターを含む、組成物。
- 前記組成物は、試料に含まれたIgG抗体又はIgG抗体のFc部位を検出するためのものであることを特徴とする、請求項9に記載の組成物。
- 請求項10に記載の組成物を含む、IgG抗体又はIgG抗体のFc部位を検出するためのキット。
- 前記組成物は免疫抑制用薬剤学的組成物であることを特徴とする、請求項9に記載の組成物。
- 前記組成物は、臓器移植反応抑制用薬剤学的組成物であることを特徴とする、請求項9に記載の組成物。
- 前記組成物は自己免疫疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物であることを特徴とする、請求項9に記載の組成物。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載のポリペプチドと生理活性タンパク質又は生理活性ペプチドが結合されたタンパク質又はペプチド融合体であって、前記タンパク質又はペプチド融合体は体内持続性を維持することによって体内半減期が増加することを特徴とする、タンパク質又はペプチド融合体。
- 下記の段階を含むFcガンマ受容体変異体を含むポリペプチドの製造方法。
a)請求項1~5のいずれか一項に記載のポリペプチドをコーディングする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養する段階、及び
b)前記宿主細胞によって発現したポリペプチドを回収する段階。 - 下記の段階を含む試料に含まれたIgG抗体又はIgG抗体のFc部位を精製する方法。
a)IgG抗体又はIgG抗体のFc部位を含む試料に請求項1~5のいずれか一項に記載のポリペプチドを混合して互いに結合させる段階、及び
b)前記ポリペプチドが結合されたIgG抗体又はIgG抗体のFc部位を精製する段階。 - 下記の段階を含むヒトIgG抗体又はヒトIgG抗体のFc部位に対する結合力が向上したFcガンマ受容体変異体をスクリーニングする方法。
a)配列リストの第43配列又は配列リストの第49配列において117番目アミノ酸がアスパラギン(N)に置換され、159番目アミノ酸がグルタミン(Q)に置換された配列を含む人間Fcガンマ受容体変異体ライブラリを構築する段階、及び
b)前記ライブラリにおいて前記二つのアミノ酸配列の置換のみを含むFcガンマ受容体変異体と比較してIgG抗体又はIgG抗体のFc部位に対する結合力がより向上したFcガンマ受容体変異体を選別する段階であり、前記二つのアミノ酸配列の置換のみを含むFcガンマ受容体変異体は、バクテリア培養において発現するFcガンマ受容体変異体であり、野生型Fcガンマ受容体と比較してヒトIgG抗体のFc部位に対する結合力が向上している、段階。
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