JP2002531086A - 組換え可溶性Ｆｃ受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明による組換え可溶性Fc受容体は、膜貫通ドメイン、シグナルペプチドおよびグリコシル化の存在しない点に特徴がある。この種のFc受容体は、原核宿主細胞においてそれぞれの核酸を発現させ、得られた封入体を再生することにより容易に取得することができ、この方法からは非常に均質で純粋な産物が得られる。かかる産物は診断および医薬用途のために、さらに結晶構造データの生成のために使用することができる。このような結晶構造データは人工分子のモデリングに使用することができる。さらなる実施形態は、本発明によるFc受容体を、抗体の分離および／または濃縮に使用しうるクロマトグラフィー材料などの固相材料に結合させることを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、組換え可溶性Fc受容体(FcR)、そのようなFc受容体をコードする組
換え核酸、対応する核酸を含む宿主細胞、ならびに患者の血液、血漿または血清
に含まれるある型の抗体の量を測定する方法、免疫系の慢性疾患を有する患者の
免疫状態を調べる方法、および抗体のそれぞれの細胞性受容体による認識およ結
合を阻害するインヒビターとして作用する能力に関して物質をスクリーニングす
る方法に関する。さらに、本発明は、組換え可溶性FcRを含有する医薬組成物、F
cRおよびFcR／Ig複合体の結晶性調製物、特にFc受容体の結晶構造データを生成
するための該結晶性調製物の使用、ならびにFcRインヒビターおよび該FcRインヒ
ビターを含有する医薬組成物に関する。

【０００２】 本発明の更なる主題は、固相（例えば、クロマトグラフィー担体材料）に結合
された組換えFc受容体である。そのようなクロマトグラフィー材料（これは本発
明のもう１つの主題である）の使用は、患者の体液からの、または免疫グロブリ
ン産生細胞の培養上清からの免疫グロブリンの吸着にある。

【０００３】 Fc受容体(FcR)は感染からヒトを防御するうえで重要な役割を果たしている。
病原体は、血液循環系に接近した後に、免疫グロブリン（Ig）によるオプソニン
化を受ける。その結果生じる免疫複合体はその多価性のため高い結合力でFcR保
有細胞に結合し、FcRのクラスター化へ至らせ、これがいくつかのエフェクター
機能を開始させる(Metzger, H., 1992A)。こうした機能としては、発現されたFc
Rの型および関連タンパク質に応じて、病原体のその後の中和および抗原提示に
よるエンドサイトーシス、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)、メディエーターの分泌
または抗体産生の調節などがある(Fridmanら, 1992; van de Winkel and Capel,
1993)。

【０００４】 全てのIgクラスに対して特異的なFcRが存在し、IgGに対するFcRは最も豊富で
、多様性も広範囲にわたる。IgEの高親和性受容体(FcεRIa)と共に、FcγRI(CD6
4)、FcγRII(CD32)およびFcγRIIIa(CD16)はＩ型膜貫通タンパク質としてまたは
可溶性形態(sFcR)で存在しているが、FcγRIIIのグリコシルホスファチジルイノ
シトールアンカー型(FcγRIIIb)も存在している。さらに、FcRはさまざまなイソ
型(FcγRIa、b1、b2、c; FcγRIIa1-2、b1-3、c)および対立遺伝子(FcγRIIa1-H
R、-LR; FcγRIIIb-NA1、-NA2)として存在している(van de Winkel and Capel,
1993)。全体的に相同性の細胞外部分とは対照的に、膜貫通ドメインおよび細胞
質ドメインは相違している。それらは完全に欠失させることができ、また、8kDa
の大きさのものでありうる。それらはFcγRIIaにおけるような26アミノ酸の免疫
受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ITAM)、またはシグナル伝達に関与する
FcγRIIbにおけるような個々の13アミノ酸抑制性モチーフ(ITIM)のいずれかを含
みうる(Amigorenaら, 1992)。

【０００５】 保存されたシステイン間隔から判断すると、FcRの細胞外部分は３つ(FcγRI、
CD64)または２つ(FcεRI、FcγRII、CD32およびFcγRIII、CD16)のIg様ドメイン
(10kDa/ドメイン)からなり、それゆえに免疫グロブリンスーパーファミリーに属
する。これらの高度にグリコシル化された受容体は相同体であり、FcγRとFcεR
Ia間のアミノ酸配列の全体的な同一性はそれらの細胞外領域では50％を上回る。
それにもかかわらず、FcRのそのリガンドへの親和性はさまざまである。FcγRI
のFcフラグメントに対する親和性は約10⁸M^-1と比較的高いが、これはその第３ド
メインのせいであり、一方、２つのドメインをもつ他のFcγRのIgGに対する親和
性は10⁵〜10⁷M^-1の範囲で変化する。２つのドメインをもつFcεRIaのIgEに対す
る親和性は10¹⁰M^-1と一定しており、これらの値をはるかに上回る(Metzger, H.,
1992B)。上記のFcRとは対照的に、IgEに対する低親和性受容体であるFcεRIIは
ある型の膜貫通タンパク質であり、より低い相同性を示す。

【０００６】 FcγRは免疫的に活動しているあらゆる細胞上に特定のパターンで発現されて
いる。FcγRIは単球とマクロファージ上に構成的に発現され、好中球および好酸
球上に誘導することができる。FcγRIの生理学的役割は、単球上での発現が必須
ではないので、まだ不明である(Ceuppensら, 1988)。FcγRIIIのGPIアンカー型(
FcγRIIIb)は顆粒球上に広く発現されている。その細胞質部分が欠失されている
ため、細胞へのシグナル伝達は、補体受容体３型(CR3)のような、少なくともFc
γRIIIbと会合できる他の膜貫通タンパク質を介してのみ起こる(Zhouら, 1993;
Pooら, 1995)。FcγRIIIaは主に単球とマクロファージ上に発現されるが、結合
タンパク質（例えば、α鎖またはγ鎖）と一緒にしか発現されない。FcγRIIは
免疫担当細胞上に最も広く分布している受容体であり、主として免疫複合体のエ
ンドサイトーシスに関与している。

【０００７】 FcγRIIaとFcγRIIbは、その細胞外領域のアミノ酸残基がたった７％しか違っ
ていない。それにもかかわらず、両形態はヒトおよびマウスIgGサブクラスへの
その結合特性(van de Winkel and Capel, 1993)およびヒトIgGへのその異なる親
和性(Sondermannら, 1998A)によって区別され得る。こうした状態は、何人かの
個体に由来するＴ細胞がマウスIgG1誘導有糸分裂に応答できることが判明した後
に命名されたFcγRIIaの高応答性／低応答性(HR/LR)多型によってさらに一層複
雑になってくる(Taxら, 1983)。その後、LR型とHR型の間のアミノ酸配列の２つ
の交換によりヒトIgG2への結合能が変化することが見いだされ、このことは、そ
れらの少なくとも１つがIgG結合に関与することを示唆している(Hogarthら, 199
2)。

【０００８】 健康な個体においてFcRが果たす有益な役割とは対照的に、それらはまた、ア
レルギー(FcεRIa)または自己免疫疾患において免疫系の刺激を伝達する。さら
に、一部のウイルス、例えばHIV(Homsyら, 1989)やデング熱ウイルス（Littaua
ら, 1990)は細胞に接近するためにFcγRを利用し、またエボラウイルス(Yangら,
1998)や麻疹ウイルス(Ravanelら, 1997)の場合にはFcγRをブロックすることに
より免疫応答を遅らせる。

【０００９】 それゆえに、本発明の基礎となる目的は、生産するのが容易で、医療または診
断用途のために有利に使用できる受容体を提供することであった。さらに、本発
明の目的は、ヒトの体内に存在する天然の受容体に類似した結合特異性および活
性を示し、その上、構造決定に適する結晶を生成することを可能にする可溶性受
容体を提供することであった。

【００１０】 この目的は、Fc受容体の細胞外部分のみからなり、グリコシル化されていない
組換え体の可溶性Fc受容体によって達成される。したがって、本発明による受容
体は膜貫通ドメイン、シグナルペプチドおよびグリコシル化が存在しないことを
特徴とする。

【００１１】 本発明にとって特に好ましいものはFcγまたはFcε受容体である。その理由は
、IgGおよびIgE分子が多数の疾患および症状に特徴的であり、そのため、それら
の定量およびそれらに影響を及ぼしうる方法が非常に関心を集めているからであ
る。図11および12は、いくつかのFcγRとFcεRIとの細胞外部分のアミノ酸配列
のアライメントを示す。本発明によるFcRは、これら全ての配列、または抗体へ
の結合能および／または適切な結晶化を依然として保持するその一部を含むもの
である。

【００１２】 本発明の特に好ましい実施形態において、組換え可溶性FcRはFcγRIIb受容体
である。さらに、該受容体はヒト由来のものが特に好適である。特に好ましい実
施形態において、それは配列番号１〜配列番号６のうちの１つに示したアミノ酸
配列を含む。

【００１３】 本発明によると、可溶性Fc受容体の調製は原核細胞において行なうことが好ま
しい。そのような発現の後には、組換えタンパク質を含む不溶性の封入体が原核
細胞中に形成され、かくして封入体を他の細胞成分から分離することで精製が促
進され、その後に封入体に含まれるタンパク質の再生（復元）が行なわれる。封
入体に含まれる本発明によるFcRの再生は基本的には公知の方法に従って行なう
ことができる。原核細胞における調製の利点である、封入体およびこうして得ら
れる組換え可溶性Fc受容体の生産は、非常に純度が高く、とりわけ非常に均質で
もある、FcR調製物を得ることを可能にする。また、グリコシル化が存在しない
ため、得られた産物はきわめて均質なものである。

【００１４】 これまでに組換え法で産生された可溶性Fc受容体は、とりわけ、相当に厄介な
精製が必要であるという欠点を抱えていた。というのは、それらが真核細胞で発
現され、真核細胞において常に均質であるとは限らないグリコシル化のため、こ
れらの産物もそれほど均質でなかったからである。

【００１５】 本発明による組換え可溶性Fc受容体は、本発明の別の実施形態の説明のところ
で後述するように、Ｘ線解析で使用するのに適した結晶を生成することを可能に
する。本発明のFcRはさらに、in vivoで天然に存在する受容体と実質的に同じ活
性および特異性を示す。

【００１６】 本発明の更なる主題は、本発明による組換え可溶性Fc受容体をコードする配列
を有する組換え核酸である。

【００１７】 本発明による核酸は、コード配列のみを含むこともできるし、また、ベクター
配列および／または特に組換えFcRをコードする配列に機能的に連結された発現
制御配列（プロモーター、オペレーターなど）をさらに含むこともできる。

【００１８】 特に好ましい実施形態において、本発明の核酸は配列番号７〜配列番号12のう
ちの１つに示した配列を含む。比較のために、配列番号13および配列番号14はそ
れぞれFcγRIIbおよびFcεRIaをコードする野性型配列を示す。配列番号15〜18
はFcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIおよびFcεRIIの野性型配列を示す。

【００１９】 本発明の核酸がベクター配列を含む場合には、これらは好ましくは１種または
数種の原核生物発現ベクターの配列であり、pETベクターの配列が好ましい。所
望により、本発明の組換え核酸には発現ベクターの他の知られている機能または
構成成分が含まれていてもよい。例えば、これらは形質転換された宿主細胞の効
率的な選択を可能とする耐性遺伝子でありうる。

【００２０】 本発明のさらに他の主題は、本発明による組換え核酸を含む宿主細胞である。
上述したように、宿主細胞は原核宿主細胞であることが好ましく、特に大腸菌細
胞が好ましい。

【００２１】 本発明による組換え可溶性Fc受容体は、特に抗体と反応するので、多くの検査
または用途に使用することができる。in vivoにおいては、可溶性Fc受容体は、
上昇したレベルで存在する場合に、免疫系の著しい抑制（多くの部分的に知られ
た作用および部分的にまだ理解されていない作用へと至らせる）をもたらす強力
な免疫調節因子となる。こうした作用に基づいて、本発明のFc受容体のいくつか
の用途は本発明の更なる主題となる。

【００２２】 そのような主題の１つは、患者の血液または血清中に含まれる、ある型の抗体
の量を測定する方法であり、この方法は、イムノアッセイにおいて本発明の組換
え可溶性FcRを使用し、FcR−抗体複合体の存在を測定することを特徴とする。か
かるアッセイにより、患者の血液、血漿または血清中のある種の抗体の存在をス
クリーニングすること、そしてまた、抗体の量を測定することが可能である。

【００２３】 FcR−抗体複合体の存在を検出できるのであれば、どのようなタイプのイムノ
アッセイでも本発明に従って使用するのに基本的に適している。ELISA（固相酵
素イムノアッセイ）、特にサンドイッチアッセイ、およびRIA（放射線イムノア
ッセイ）はどちらも適しているが、競合的試験法も好ましい。IgE抗体の存在お
よび／量を調べる場合の本発明の好適な実施形態においては、本発明による組換
え可溶性受容体としてFcεRを使用する。特に、この方法はアレルギーの素因ま
たは症状発現を判定するのに適している。

【００２４】 さらに、可溶性FcRの存在を測定し、必要ならば定量する方法が好適である。
そのような測定では、競合イムノアッセイ法を用いることが好ましく、その際、
競合試薬として本発明の組換え可溶性受容体、最も好ましくは組換えFcγRを使
用する。この試験によって、とりわけ、免疫系の慢性疾患をもつ患者の免疫状態
を競合イムノアッセイで調べることができる。これらの過程における慢性疾患と
は、例えば、AIDS、SLE（全身性エリテマトーデス）、MM（多発性骨髄腫）また
は慢性関節リウマチがあり、またFcεRIIの場合にはB-CLL (Gordonら, 1987)、
高度IgE症候群(Sarfatiら, 1988)、またはHCL(Smallら, 1990)がある。

【００２５】 本発明の組換え受容体のさらに有利な使用法は、抗体のそれぞれの細胞性受容
体による認識および結合を阻害するインヒビターとして作用する能力に関して物
質をスクリーニングすることにある。

【００２６】 マルチウェルマイクロタイタープレートおよび自動ピペッティング装置と組み
合わせたHTPS（ハイスループットスクリーニング）のような最近のスクリーニン
グ技術を用いると、現在では、特定の性質について多数の物質を同時に試験する
ことが可能である。本発明のFcRは、低コストで簡単に生産することができるの
で、そのような一連の試験法に使用することにより、阻害作用を示す物質を容易
に同定することができる。

【００２７】 特に、本発明のFc受容体を用いて、各抗体の特定の受容体による認識および結
合を阻害する能力があるインヒビターを見つけるまたはスクリーニングするよう
な使用法が好適である。

【００２８】 本発明による物質の更なる応用分野は医薬分野にある。それゆえに、本発明の
更なる主題は、本発明による組換え可溶性Fc受容体を活性薬剤として含有する医
薬組成物である。本発明によれば、この医薬組成物はもちろん慣用の担体や補助
物質を含んでいてもよい。そのような物質は当業者には公知であり、さらに投与
方式も考慮する必要がある。本発明の医薬組成物は自己免疫疾患、アレルギーま
たは腫瘍性疾患の治療や予防に有利に使用することができる。

【００２９】 FcγRIIIなどのFc受容体の可溶性形態は、Ｂ細胞の増殖および免疫グロブリン
産生のアイソタイプ特異的調節を媒介する。骨髄腫のマウスモデルにおいて、sF
cRは腫瘍細胞の増殖および免疫グロブリン産生を抑制する(Mullerら, 1985; Rom
anら, 1988; Teillaudら, 1990)。さらに、sFcRはヒトIgGを分泌する骨髄腫細胞
の培養物上の表面IgGと結合し、腫瘍細胞の増殖およびIgG分泌を抑制する。これ
らの細胞をsFcRに長期間暴露すると、腫瘍細胞の細胞溶解が生じる(Hooverら, 1
995)。

【００３０】 さらに、アレルギー反応における、または大量の抗原による、免疫系の過剰反
応は、例えば、可溶性FcRの静脈内適用によって軽減される可能性がある(Lerino
ら, 1993)。

【００３１】 したがって、AIDS、慢性関節リウマチまたは多発性骨髄腫の治療に用いる本発
明の好適な医薬組成物は、組換え可溶性Fcγ受容体、好ましくは配列番号１〜４
に示したアミノ酸配列を有する受容体を含有する。

【００３２】 また、Fc受容体および／またはFc受容体／Ig複合体の結晶構造データを得るこ
とにも非常に関心がもてる。一方において、これらは免疫複合体認識の分子機構
を理解するうえで鍵となるものであり、他方において、これらの構造データは、
各種のFc受容体の構造に共通する特徴を見つけ出し、その構造の情報を用いてイ
ンヒビターを生成するために、または新たな人工抗体受容体を同定し生産するた
めに使用することができる。

【００３３】 さらに、天然の三次元分子としての免疫グロブリンのそれぞれの受容体に対す
る実際の結合部位に関する情報を得ることも非常に興味がもてる。それらから、
抗体と受容体の相互作用に関する、さらに、その相互作用が如何にモジュレート
され得るかに関する、より一層正確な知見が得られる。これに関連して、モジュ
レーションとは、そのような相互作用の増強もしくは促進、または、例えば複合
体の１以上の部分にある結合部位を塞ぐもしくは覆うことにより、阻害に至らせ
る相互作用の低下を意味する。

【００３４】 そのような結晶構造データおよびコンフォメーション情報を得るためには、本
発明による組換え可溶性Fc受容体の結晶性調製物が用いられる。本発明による組
換え可溶性FcRは、驚いたことに、信頼できるＸ線構造解析データをもたらす結
晶を生成するに足る純度で得られる。そのような結晶化は、たいていが均質性の
欠如ゆえに、これまで生産された受容体分子では可能でなかった。

【００３５】 したがって、本発明の別の実施形態は本発明によるFc受容体の結晶性調製物に
関する。本発明のさらに別の実施形態は、関連した免疫グロブリンFc部分と一緒
の本発明の可溶性Fc受容体からなる複合体の結晶性調製物である。特に好ましい
実施形態は、適切な結晶構造データだけでなく実施例においても示される。この
結晶性調製物の結晶構造解析により、Fc受容体／Ig複合体の、まさに結合を媒介
するアミノ酸を検出することができた。これらのアミノ酸を図6aおよび6bに示し
てあり、複合体中の両分子の個々のアミノ酸間の結合のタイプも示してある。し
たがって、本発明の更なる実施形態は、Fc受容体の結晶構造データを生成するた
めの組換え可溶性Fc受容体の結晶性調製物の使用である。この結晶構造データか
ら、抗体の三次元構造および活性結合部位についての情報が得られる。特に、本
発明の組換え可溶性Fc受容体と、対応する免疫グロブリン分子との複合体の結晶
性調製物を使用して、該複合体の結晶構造データを生成することが好ましい。こ
うしたデータにより、２つの分子間で形成される実際の相互作用を調べることが
可能となり、また、分子間の相互作用に関する正確な情報を入手することによっ
て結合阻害または増強のための可能な部位についての情報を提供することが初め
て可能となる。結晶構造データから得られた情報に基づいて、Fc受容体と免疫グ
ロブリンとの相互作用をモジュレートするのに必要な知見が得られる。このモジ
ュレーションは結合の増強から完全な阻害ないし一部の阻害までの範囲でありう
る。

【００３６】 上記の応用例は結晶構造データの好ましい実施形態にすぎず、他の多くの応用
例も考えられる。

【００３７】 好ましくは、インヒビターまたは新受容体をそれぞれ生成するおよび／または
同定するための構造データはコンピュータ援用モデリングプログラムにおいて使
用される。

【００３８】 本発明にとっては、図面および実施例に示したFcRまたはFcR：Fcフラグメント
複合体の構造が特に好適である。このような構造を用いてインヒビター、アンタ
ゴニストおよび人工受容体分子を設計することができる。

【００３９】 コンピュータ援用ドラッグデザインおよびスクリーニングに適するコンピュー
タプログラムは当業者に公知であり、一般に入手可能である。そのようなプログ
ラムは、対応する構造データをコンピュータに入力したときに、多数の組成物を
、ある特定の分子と結合するその能力に関してコンピュータで調べる可能性を提
供する。この可能性の助けをかりて、多数の既知の化学組成物をその阻害作用つ
まりアンタゴニスト作用に関して調べることができる。当業者にとっては、本発
明により提供された結晶構造データと市販のスクリーニングプログラム(Program
Flexx: GMD-German Narional Research Center for Information Technology,
Schloss Birlinghoven, D-53754 Sankt Augustin, Germany)が必要になるだけで
ある。したがって、本発明の好ましい実施形態は、Fc受容体インヒビターを同定
し生産するためのコンピュータ援用モデリングプログラムにおいて、本発明の組
換え可溶性Fc受容体の得られた結晶構造データ、または本発明の組換え可溶性Fc
受容体／対応する免疫グロブリン複合体の得られた結晶構造データを使用するこ
とである。

【００４０】 同様に、本発明の更なる実施形態は、本発明の受容体または受容体／免疫グロ
ブリン複合体の得られた結晶構造データを用いて、例えばアンタゴニストや競合
物質として使用できる新Fc受容体を同定し調製することである。結晶構造データ
およびそれから得られたFc受容体結合に関与するアミノ酸に関するデータは、例
えば、インヒビターとしても使用できる変異型の免疫グロブリンを生成するのに
役立つだろう。突然変異させたまたは化学的に改変したインヒビターが強固に受
容体と結合して、受容体をブロックするということが考えられる。一方、免疫グ
ロブリンの結合部位に関して得られたデータは、免疫グロブリン分子のインヒビ
ターの同定および／または調製に使用することができる。本発明は受容体への結
合部位を教示するので、比較的単純な分子を用いて結合部位のブロックを行なう
ことは容易である。それゆえに、本発明の更なる主題は、免疫グロブリンインヒ
ビターを同定しかつ／また調製するためにFcR／Ig複合体の得られた結晶構造デ
ータを使用することである。

【００４１】 したがって、本発明のさらに他の主題は、本発明の組換え可溶性FcRと相補的
な三次元構造を有し、かつ抗体のFcRへの結合を阻害するFcRインヒビターである
。

【００４２】 本発明のさらに別の主題は、本発明の組換え可溶性Fc受容体の免疫グロブリン
結合部位と相補的な三次元構造を有し、かつ免疫グロブリンのFc受容体への結合
を阻害する免疫グロブリンインヒビターである。

【００４３】 「相補的」という用語は、インヒビター分子が、Fc受容体と免疫グロブリンと
の結合を少なくとも決定的に弱体化するほど多くの免疫グロブリン上またはFc受
容体上の結合部位を塞ぐことができる物質でなければならない、とそのように本
発明の明細書中では理解されるべきである。結合部位を塞ぐことは、いずれか一
方の構成成分の複合体形成媒介アミノ酸に結合し、しかも少なくとも複合体形成
をもはや可能にしないように結合することによって（立体的阻害）、または隣接
アミノ酸に結合し、他方では、Fc受容体と免疫グロブリンとの複雑な結合に関与
するアミノ酸を塞ぐことにより、行なうことができる。

【００４４】 本発明に関連して、抗体と抗体受容体分子との結合に関与する、まさにその結
合部位およびアミノ酸を決定することが初めて可能となった。いまや、特異的に
結合する分子を設計し、コンピュータで候補組成物をスクリーニングすることが
できる。これにより、種々の候補組成物の中から、Fc受容体と免疫グロブリンと
の複合体形成を十分に阻害しうる組成物を選択することが可能となる。

【００４５】 本発明のインヒビターにとって重要なことは、その構造および特異性のために
、それがFcRまたは免疫グロブリンと結合して、FcRと抗体の定常部との正常な結
合を妨げる能力がある、という点である。

【００４６】 そのようなFcRまたはIgGインヒビターは経口投与が簡単な小さい有機分子であ
ることが好ましい。それらは自己免疫疾患および宿主／移植片拒絶反応の治療に
用いられるコルチゾンの興味のもてる代替品となる。そのような分子はまた、い
くつかのウイルス、例えば、デング熱ウイルス（抗体被覆ウイルスはFcγRIIb依
存的インターナリゼーションを受ける; Littauaら, 1990）、HIV（CD4陽性Ｔ細
胞上では、HIV感染の抗体増強がFcγRIIIにより媒介される; Homsyら, 1989）、
またはエボラ（ウイルスにより分泌される糖タンパク質が、感染に対する宿主応
答に影響を及ぼすsFcγRIIIをブロックすることにより初期の好中球活性化を抑
制する; Yangら, 1998）による再感染率を低下させるだろう。

【００４７】 インヒビターの開発はさらに、IgEのその受容体による認識を妨害する物質を
もたらす。FcεRIのモデル化構造から、マスト細胞の脱顆粒をin vitroで抑制す
るペプチドがすでに開発されている。現在入手できる、相同受容体および受容体
−抗体複合体の構造の原子レベルでの情報を用いると、合理的なドラッグデザイ
ンの新しい可能性が開けてくる。

【００４８】 Fc受容体はいわゆる下部ヒンジ領域にあるFcフラグメントの２つのCH2ドメイ
ン間に結合する（図８）。Fc受容体の結合領域は実施例１に記載される（IgGに
対する接触境界面）。FcRと免疫グロブリンとの相互作用を促進する残基は図７
、10aおよび10bに示してある。それにより、３つの相互作用領域が明らかになる
（図５）。

【００４９】第１の領域： FcR(残基85-87および残基110)−Ig(A鎖残基326-328) Igのプロリン328は、サンドイッチのようなやり方で残基Trp87および110によ
り固定される。これらの残基はIgGおよびIgEだけでなくIgG受容体およびIgE受容
体において保存されている。この突出した領域に結合するインヒビターは結合を
強力に妨げるだろう。この領域はさらにインヒビターの設計にとっても魅力的で
ある。なぜならば、受容体の残基Trp87、Ile85、Gly86を含む、露出された疎水
性表面領域が更なる結合エネルギーを得るために利用される可能性があるからで
ある。近傍にあるThr113、Glu18およびLys19側鎖の官能基は特に特異的インヒビ
ター結合に寄与しうる。

【００５０】第２の領域： FcR(残基126-132および残基155-158)−Ig(A鎖およびB鎖残基234- 239) 両Ig鎖のアミノ末端残基234-239はFcRによって異なって認識され、それにより
２倍対称のFcフラグメントを破壊する。

【００５１】 FcフラグメントA鎖のこの残基は受容体の残基Val155-Lys158と接触しており、
FcフラグメントB鎖からの同残基は受容体の残基Gly126-His132と接触している。
この領域は免疫グロブリンだけでなく受容体の配列アライメントにおいても最大
の差異を示し、したがって特異性の発生に関与しているのであろう。Fcフラグメ
ント鎖間のこの深い割れ目はインヒビターの設計によく適合し、特異性の問題が
関係する場合のインヒビターを開発するための絶好の部位となろう。

【００５２】第３の領域： FcR(残基117、126および129-132)−Ig(B鎖残基264-265および残
基296-297) この結合領域は、側鎖中に官能基をもつアミノ酸残基が集まっている点に特徴
がある。これらは受容体およびIg接触面に対するインヒビターの設計のために様
々なやり方で利用できる可能性がある。

【００５３】 結合部位の情報を活用して明らかに設計またはスクリーニングされて、上記領
域の１以上と相互作用する分子は、本発明によるインヒビターと見なされる。

【００５４】 本発明の更なる主題は、上記のFcRインヒビターまたは免疫グロブリンインヒ
ビターを活性薬剤として含有する医薬組成物である。そのような医薬組成物は例
えば、免疫系の過剰反応または誤った反応に起因する疾患の治療または予防に、
好ましくはアレルギー、自己免疫疾患またはアナフィラキシーショックの治療ま
たは予防に使用しうる。

【００５５】 本発明の更なる主題は、固相に結合された本発明のsFcRである。このような固
定化受容体は、イムノアッセイまたは固定化形態の受容体が有利に用いられる他
の用途に使用することができる。

【００５６】 本発明の好適な実施形態において、固相は、Fc受容体をその上に固定しうるク
ロマトグラフィー担体材料、例えば、セファロース、デキストラン硫酸などであ
る。Fc受容体を結合させてあるそのようなクロマトグラフィー材料を用いて、患
者の血液、血漿または血清から、または免疫グロブリン産生細胞の培養上清から
免疫グロブリンを吸着させることができる（抗体の濃縮、富化および精製を意味
する）。

【００５７】 一方、クロマトグラフィー材料に結合された抗体を溶出して、例えば患者の免
疫状態を調べることができる。他方、後続の試験を行なう前に、患者の血液由来
の抗体を富化することもでき、これは本発明のさらに好ましい実施形態である。
多くの場合、血液サンプルは同定すべき抗体をほんの少ししか含んでおらず、診
断アッセイを血液サンプルから行なうことは難しい。本発明のFc受容体を結合さ
せた特異的クロマトグラフカラムを用いた濃縮によって、関心のある抗体を簡単
に濃縮し、試験を妨害する恐れのある他の多くの物質から分離することが可能で
ある。

【００５８】 基本的には、抗体の分離が決定的な役割を果たすような、ある種の疾患の場合
には、血液洗浄用の体外灌流システムにおいて本発明のクロマトグラフィー材料
を使用することも可能である。

【００５９】 しかしながら、本発明の可溶性Fc受容体が結合する他の材料を固相として使用
することも考えられ、例えば、壁面にFc受容体が直接または間接に結合する小型
の反応容器、マイクロタイタープレートなどがある。そのような固相および容器
は診断法には特に重要である。なんとなれば、それらは、例えば患者の血液また
は他の体液中のある種の免疫グロブリンの存在を検出するためのイムノアッセイ
を使用することにより、スクリーニングを可能にするからである。

【００６０】 要約すると、本発明により提供された組換え可溶性Fc受容体、ならびに該受容
体の結晶性調製物の、および受容体と免疫グロブリンとの結晶性複合体の、対応
する構造解析は、合理的ドラッグデザインを行なうことを初めて可能にし、それ
らから、免疫グロブリンと細胞上のFc受容体または可溶性受容体との相互作用を
モジュレートすることが可能である。かかるモジュレーションは好ましくは阻害
であり、その場合に、IgGとFc受容体からの複合体形成の阻害は、塞ぐことによ
って、好ましくはFc受容体または免疫グロブリンへのインヒビター分子の結合に
よって行なわれる。このようなモジュレーター薬物、特にインヒビターの医療用
途はいくつか存在しているが、本発明の明細書中ではほんの２、３の応用例を例
示的に記載しているにすぎない。これは他の健康障害の治療または予防のために
ここに開示した分子構造体またはFcR／Ig複合体についての知見に基づいて設計
またはスクリーニングされた分子の利用可能性を決して排除するものではない。

【００６１】 以下の実施例は、図面と関連させて本発明をさらに説明するためのものである
。

【００６２】実施例１ shFcγRIIb（可溶性ヒトFcγRIIb） 1.1 クローニングおよび発現 ヒトFcγRIIb2のcDNA (Engelhardtら、1990)を突然変異誘発(mutagenous)PCR
(Dulauら、1989)を用いて改変した。すなわち、フォワードプライマーを用いて
、新規の開始メチオニンを、NcoI部位内のシグナルペプチドの切断部位の後に導
入した(5'-AAT AGA ATT CCA TGG GGA CAC CTG CAG CTC CC-3')。一方、リバース
プライマー用いて、終止コドンを、SalI部位がその後に続く膜貫通領域と推定上
の細胞外部分との間に導入した(5' CCC AGT GTC GAC AGC CTA AAT GAT CCC C-3'
)。PCR産物をNcoIおよびSalIで消化してpET11d発現ベクター(Novagen)中にクロ
ーン化し、予想される配列を確認した。最終的な構築物をBL21 (DE3)中で増殖さ
せた(GrodbergおよびDunn, 1988)。FcγRIIbを過剰発現させるために、形質転換
した細菌の単一のコロニーを、100μg/mlのアンピシリンを含有する5mlのLB培地
(LB-Amp100)中に接種し、37℃で一晩インキュベートした。この培養物をLB-Amp1
00中で200倍に希釈し、OD600が0.7〜0.9に達するまでインキュベーションを続け
た。タンパク質の過剰発現は、最終濃度１mMになるまでIPTGを添加することによ
って誘導した。４時間の増殖時間が経過した後、細胞を遠心(30分間, 4000 x g)
により回収し、超音波処理バッファー(リン酸ナトリウム30 mM、塩化ナトリウム
300 mM、アジ化ナトリウム 0.02%、pH 7.8)中に再懸濁した。懸濁液1mlあたり0.
1mgのリゾチームを添加し、室温で30分間インキュベートした後、氷上で超音波
処理を行った(Branson Sonifier、Danbury、CT；Macrotip、出力90%、インター
バル80%、15分間)。この懸濁液を遠心(30分間、30,000 x g)にかけ、Dounceホモ
ジナイザーを用いて、0.5%のLDAOを含有する超音波処理バッファー中に再懸濁し
た。この遠心工程およびLDAO含有バッファー中への再懸濁をもう一度繰り返し、
その後、この工程をLDAOなしで２回繰り返した。精製した封入体を４℃で保存し
た。

【００６３】1.2 可溶性ヒトFcγRIIb (shFcγRIIb)の再生および精製 精製した封入体は、塩化グアニジン6 M、2-メルカプトエタノール100 mM中に
、タンパク質濃度10mg/mlで溶解し、遠心により不溶性物質から分離した。再生
は、急速な希釈によって達成された。そうして、1mlの該封入体溶液を、撹拌し
ながら、15時間以内に400mlの再生バッファー(0.1 M TRIS/HCl、アルギニン1.4
M、塩化ナトリウム150 mM、GSH 5 mM、GSSG 0.5 mM、PMSF 0.1 mM、アジ化ナト
リウム 0.02%、pH 8.5、4℃)に滴下した。その後、この混合物を、空気酸化によ
り、遊離のチオール基の濃度がEllman (Ellman, 1959)の方法で測定して1 mMに
減じるまで、2〜3日間にわたって撹拌した。この溶液をPBSに対して透析して滅
菌濾過し、その後、3kD MWCO限外濾過膜を備えた撹拌セル中で10倍に濃縮した。
このタンパク質溶液を、hIgGセファロースカラム(セファロース4B 1mlあたりhIg
G 50 mg)にアプライした。未結合のタンパク質は、50 mM TRIS pH 8.0で洗浄し
て取り除き、その後pHジャンプ(塩化ナトリウム150mM、グリシン100mM、アジ化
ナトリウム 0.02%、pH 3.0)によって、FcγRIIｂを溶出させた。溶出物は、1 M
TRIS pH 8.0ですぐに中和させた。FcγRIIb含有溶液を濃縮し、結晶化バッファ
ー(MOPS 2 mM、塩化ナトリウム150 mM、アジ化ナトリウム 0.02%、pH 7.0)で平
衡化したSuperdex-75カラムを用いたゲル濾過に付した。FcγRIIbを含む画分を
プールし、7 mg/mlまで濃縮して-20℃で保存した。

【００６４】1.3 平衡ゲル濾過実験 Superdex75カラムをFPLCに連結し、10μg/mlのshFcRIIbを含むPBSで平衡化さ
せた。ヒトFcフラグメントを、1μg/10μlの濃度で、平衡化バッファー中に溶解
して注入した。得られたクロマトグラムは、shFcγRIIbとFcフラグメントの複合
体を含む正のピークを示した。一方、負のピークは複合体形成のためにランニン
グバッファーから消費された受容体の欠如を表す。

【００６５】1.4 結晶化およびデータ収集 96条件スパースマトリックススクリーニング（96 condition sparse matrix s
creen）(JancarikおよびKim, 1991)を使用した最初の結晶化試験は、蒸気拡散法
を用い、20℃でのシッティングドロップ法で実施した。生成する結晶は、塩、沈
殿剤および添加剤の濃度だけでなくpHを変化させることによっても向上した。適
当な結晶の回折データを、RU200b回転アノード発生装置（50kV、100mAで操作；R
igaku）からのグラファイト単色CuKα放射線を用いて、イメージプレートシステ
ム(MAR research)上に収集した。反射をプログラムMOSFLM (Leslie, 1997)で積
分し、続いてそのデータは、CCP4プログラムセット(Collaborative Computation
al Project, 1994)の手順を用いて、基準化、減少および切り捨てを行い、構造
因子の独立変数を得た。

【００６６】1.5 shFcγRIIbの発現、精製および再生の概要 FcγRIIbの細胞外部分は、T7 RNAポリメラーゼ陽性大腸菌株BL21/DE3 (Grodbe
rg & Dunn, 1988)中、T7プロモーターの制御下で、高レベルで発現させた。該タ
ンパク質は封入体中に集積していたが、これを最初の精製工程において使用した
。封入体の単離は、リゾチームと超音波処理を組み合わせた強力な手法を用いて
開始し、そうしなければ産物を汚染することになる細胞を実質的にすべて破裂さ
せた。それに続く界面活性剤LDAO（この界面活性剤は、不純物を溶解させるが封
入体自体は溶解しない点で優れた特性を有する）を用いた洗浄工程により、早く
も90％より高い純度で産物が得られた(図1)。

【００６７】 この産物は、さらに精製を行うことなく、再生試験に使用した。該封入体は高
濃度の2-メルカプトエタノールおよびグアニジンに溶解し、共有結合凝集体およ
び非共有結合凝集体を確実に単量体へシフトさせた。この溶液は、すぐに再生バ
ッファーで希釈し、そうしなければ凝集体を形成してしまう折りたたまれていな
いタンパク質分子同士の接触を最小限に抑えた。再生バッファー中でアルギニン
を用いることにより、尿素を用いた場合にしばしば認められるような側鎖の不可
逆的改変を防ぐことができる。タンパク質を再生バッファーに添加した後、該溶
液を、遊離のチオール基の濃度が1mMに減じるまで４℃で撹拌した。この工程は
、初期の透析で不活性産物が生じたときに絶対的に必要であった。第２の精製工
程において、透析して再生されたFcγRIIbを固定化したhIgGに結合させ、大腸菌
タンパク質および不活性受容体のマイナー画分を取り除いた。該タンパクをpHジ
ャンプによって溶出させ、すぐに中和した。このアフィニティークロマトグラフ
ィー工程の後、shFcγRIIbは、繰り返し使用した後でさえもマトリックスから浸
出してくる共溶出IgGによるわずかな汚染を除き、本質的に純粋である（図1）。
還元SDS-PAGEで認識されないIgGならびに受容体多量体は、ゲル濾過によって容
易に除去できた。この工程における汚染物質の除去と平行して、バッファーを定
量的に交換した。この手法は、わずかな改変さえもが結晶化の再現不能を引き起
こしたり、結晶形成を阻害するときでさえ、一定の組成のタンパク質溶液を確実
にもたらす。大腸菌培養物1Lあたり全部で6 mgの純粋なタンパク質を得ることが
できた。これは、封入体のFcγRIIb含有量の約10％である。

【００６８】 N末端タンパク質の配列決定により、検出可能な不純物を含まず、予想された
配列H₂N-GTPAAPを持つものであることが示された。ESI-MS分析により、結晶化試
験で用いられた最終物質は、サイズに関して均一であることを示された。１次配
列から、分子量は20434 Daであることが計算され、これは、質量分析で測定され
た20429 Daと一致している。誤差は、装置のエラー範囲にあり、リーディングメ
チオニンを含有する種についての追加のピークは、見られなかった。

【００６９】 shFcγRIIbの結晶化は、蒸気拡散法を用い、シッティングドロップ法で実施し
た。スパースマトリックススクリーニング(Jancarik & Kim, 1991)を用いた最初
の試験で、早くも、小さな針状結晶が得られた。これに続く、沈殿剤、塩、それ
らの濃度およびpHを変化させることによる予備的結晶化条件の最適化により、３
つの異なる結晶形態が単離された。斜方晶結晶は、1.5 μlのリザーバー溶液(PE
G2000 33%、酢酸ナトリウム 0.2 M、pH 5.4)と3 μlのタンパク質溶液の混合物
から成長した。それらは３日以内に発生し、約80μm x 80μm x 500μmの最終サ
イズに１週間後に到達した。これらの結晶は1.7Åで回折した。結晶は、PEG8000
26%、酢酸ナトリウム0.2 M、pH 5.6、Zn(OAc)₂ 5 mM、塩化ナトリウム100 mMを
含むリザーバー溶液から（六方晶形態）、およびPEG8000 26%、NaOAc 0.2 M、pH
5.6、1,4-ジオキサン 10% (v/v)、塩化ナトリウム100mMを含むリザーバー溶液
から(正方晶形態)、２つの異なる空間群でも成長できた。これらの結晶はX線解
析に適したサイズであるが、それぞれ正方晶形態で2.7Å、六方晶形態で3.8Åで
しか回折しなかった(表1)。

【００７０】 FcγRIIは大腸菌で発現させた。大腸菌は、比較的安価な製造コストおよび入
手可能性に加え、IgG結合が炭水化物結合と独立に生じるFcγRIIの場合のように
、哺乳動物細胞により起こるグリコシル化がタンパク質の機能に必要でないとき
に、特に、いくつかの利点を有する(Sondermannら、1998A)。大腸菌においては
、均一な産物が再現可能に生成でき、バッチに依存した変動がしばしば観察され
る哺乳動物細胞における発現と対照的である。このような系においては、産物が
数日間、30℃をこえる温度でプロテアーゼに暴露される。反対に、37℃で、強力
なT7プロモーターの制御下、大腸菌内でタンパク質を発現させると、しばしばプ
ロテアーゼが接近できない封入体が形成される。細菌内における発現のさらなる
利点は、該物質が使用した仔牛血清または細胞系自体に由来しうる病原菌を含ま
ないと考えられることである。哺乳動物細胞発現においては、標的タンパク質の
精製の間、特別に注意を払わなければならない。なぜなら、存在しうる効果的な
ホルモンまたは成長因子が同時に精製される可能性があるからである。sFcγRの
効果がTGFβ１汚染に起因する場合の１事例が、既に報告されている(Galonら、1
995)。

【００７１】1.6 精製 精製手順は、簡便である。該手順は１日で容易に実施できる３つのステップか
らなる。該タンパク質は、純粋な形態でかつ高収率で得られ、その上、高価なIg
Gアフィニティーカラムを用いずに、かなりの品質で得ることができた。このプ
ロトコルの成功は、封入体の注意深い調製に依るのだろう。なぜなら、ほとんど
の不純物は、最初の精製ステップにおいて前もって除去できるからである。

【００７２】1.7 特性評価 精製FcγRIIbは、SDS-PAGEおよび等電点電気泳動ならびにN末端配列決定およ
び質量分析によって特性評価した。従って、該物質は、その化学的組成に関して
純粋かつ均一であると考えられる。しかし、受容体が正確に折りたたまれている
かという興味深い疑問を考察する余地がある。Ellmanの試験では遊離のチオール
基は検出されないことから、すべてのシステインは対になっている。該物質は単
量体であり、サイズ排除クロマトグラフィーカラムから、対称形のピークとして
、予想された保持時間に溶出する。さらに。FcγRIIbはIgGセファロースに結合
し、大腸菌からの組換えFcγRIIbはIgGを特異的に結合することから活性である
。

【００７３】1.8 結晶化 FcγRIIbの斜方晶結晶形態は、X線を、1.7Åの分解能で回折した。これは、以
前に報告された昆虫細胞発現に由来する同一分子の結晶と比較して、劇的な改良
である(Sondermannら、1998A)。これらの結晶は、2.9Åで回折し、空間群P3₁21
である。従って、昆虫細胞由来の受容体のグリコシル化は、結晶化状態に影響を
与えることになる。三方晶空間群のかわりに、３つの異なる結晶形態が見出され
る。その構造の解析が可能となった後は、これらの結晶形態は、結晶接触に起因
するタンパク質の人工的コンフォメーションの同定を助けるであろう。

【００７４】 FcγRは、その他のタンパク質と配列類似性を示さないが、保存されたシステ
イン配置から、それらは免疫グロブリンスーパーファミリーに属するとみなされ
る。従って、本発明者らはその構造を分子置換によって解析しようと試みたが、
多様な分子からのIgGドメインを用いた広範囲にわたる試験は、失敗に終わった
。従って、FcγRIIbの構造は、多重重原子同形置換法によって解析しなければな
らない。

【００７５】 本発明者らは、初めて、FcγRIIbが大腸菌から活性な形態で得られることを示
した。これは、結晶学的研究にとっての基礎であり、既に得られた異例の品質を
有する結晶のため、すぐに、この重要な分子の構造解析をもたらすだろう。この
構造は、IgG結合部位に関する情報を提供し、かつリガンドのその受容体による
認識を阻害する薬物を知見に基づいて設計するための開始点を提供するだろう。
さらに、FcγRIIbとFcεRIaを含むその他のFcRとの高度な相同性から、これらの
分子は同様に作製することができると考えられ、進行中の研究に対して価値ある
材料を提供するだろう。

【００７６】1.9 方法 タンパク質化学 組換え可溶性ヒトFcγRIIbは、大腸菌で発現させ、他で記載されたように、再
生し、精製し、結晶化した(Sondermannら、1998B)。簡単に言うと、hFcγRIIb2
の推定上の細胞外領域(Engelhardtら、1990)を、大腸菌内で過剰発現させた。
封入体は、細胞のリゾチーム処理およびこれに続く超音波処理によって精製した
。得られた懸濁液を遠心(30分間、30,000 x g)にかけ、0.5% LDAOを含むバッフ
ァーで洗浄した。遠心工程およびLDAO含有バッファー中への再懸濁をもう一度繰
り返し、その後、この手順をLDAOなしで2回繰り返した。封入体を6 M塩酸グアニ
ジンに溶解し、タンパク質を上記のように再生した。透析し、濾過したタンパク
質溶液をhIgGセファロースカラムにアプライし、pHジャンプによって溶出した。
濃縮し、中和した画分を、Superdex-75カラム(26/60, Pharmacia)を用いるサイ
ズ排除クロマトグラフィーにかけた。

【００７７】結晶化 結晶化は、蒸気拡散法を用い、シッティングドロップ法で20℃にて実施した。
結晶化スクリーニングは、pH、塩、沈殿剤および添加剤を変化させることにより
実施した。データ収集のために使用する最終的な結晶は、PEG2000 33%、酢酸ナ
トリウム0.2 M、pH 5.4中 (斜方晶形態)、PEG8000 26%、酢酸ナトリウム0.2 M、
pH 5.6、1,4-ジオキサン 10% (v/v)、塩化ナトリウム100 mM中(正方晶形態)、お
よびPEG8000 26%、酢酸ナトリウム0.2 M、pH 5.6、ZN(OAc)₂ 5mM、塩化ナトリウ
ム100mM中(六方晶形態)で成長させた。昆虫細胞由来のタンパク質は、PEG6000 3
2%、酢酸ナトリウム0.2 M、pH 5.3中で結晶化した。

【００７８】重原子誘導体の調製 重原子誘導体は、2 mMプラチナ(II)-(2,2'-6,2''テルピリジニウム)クロリド
を含む結晶化バッファー中に24時間または塩化ウラニル10 mMを含む結晶化バッ
ファー中に8日間、結晶を浸透することによって調製した。

【００７９】Ｘ線データ収集 回折データはRU200b回転アノード発生装置（50kV、100mAで操作；Rigaku）か
らのグラファイト単色CuKα放射を用い、イメージプレートシステム(MAR resear
ch)上に収集した。反射を、プログラムMOSFLM 5.50 (Leslie, 1997)で積分し、
続いてそのデータは、CCP4プログラムセット(Collaborative Computational Pro
ject, 1994)の手順を用いて、基準化および切り捨てを行い、構造因子の独立変
数を得た。

【００８０】構造決定 構造は、MIR法の標準的手法で解析した。様々な重原子成分を用いて実施した
多数の浸透物から、２つの化合物のみが、解釈可能なパターソンマップをもたら
した。各誘導体についての重原子位置は差パターソンマップから決定し、初期位
相を算出した。２次元（Cross-phased）差フーリエ合成図を使用して、重原子位
置を確認し、誘導体の共通の原点を確立した。異常分散データ(anomalous data)
を含ませてエナンチオマー同士を区別した。重原子パラメーターは、CCP4パッケ
ージのプログラムMLPHAREを用いてさらに精密化すると、表２の統計をもたらす
。電子密度マップは、分解能2.1Åまで計算し、位相は、CCP4セットのプログラ
ムDMを用いた溶媒平滑化(solvent flattening)およびヒストグラムマッチング(h
istogram matching)によりさらに改良した。得られた電子密度マップは、ほとん
どのアミノ酸残基を構築するのに十分な品質であった。モデル構築は、Indigo2
ワークステーション(Silicon Graphics Incorporation)上のO (Jonesら、1991)
を用いて実施した。構造精密化はXPLOR (Brungerら、 1987)を利用し、Enghおよ
びHuber (Engh & Huber, 1991)のパラメーターセットを使用して分解能を1.7Å
まで段階的に増加させることにより実施した。構造が、数ラウンドのモデル構築
および個々の精密化B因子(R_fac = 29% / R_Free = 36%)の後に完成したときは、3
.5σで等高線を付けたFo-Fcマップが、1σで等高線を付けた十分に明確な電子密
度の２Fo-Fcマップと一致するとき、150個の水分子を電子密度に組み込んだ。得
られた精密化統計を表３に示す。

【００８１】1.10 構造決定 組換え可溶性ヒトFcγRIIbの結晶構造は、多重重原子同形置換法(MIR)によっ
て1.7Åの分解能で解析した。なぜなら、ヒトIgG1から単離したFcフラグメント
のドメインを用いた分子置換による構造解析(Huberら、 1976, PDB entry 1fc1;
Deisenhofer, 1981)が失敗したからである。該受容体の推定上の細胞外部分(ア
ミノ酸残基1-187、配列番号2に示す)を使用して、結晶化試験を行った(Sonderma
nnら、1998B)。一方、モデルは、末端がフレキシブルで電子密度を調査できない
ときは、残基5-176を含むものである。さらに該モデルは150個の水分子を含み、
精密化統計は表２にまとめている。該構造は位置11にcisプロリンを含有する。
ラマチャンドラン（Ramachandran）プロットの非許容領域に位置する主鎖ねじれ
角はなかった。完全に精密化したモデルを使用して、同一タンパク質の空間群P4 ₂ 2₁2の結晶および昆虫細胞に由来するグリコシル化形態の空間群P3₁21の結晶の
構造を解析した（表２）。

【００８２】 FcγRIIbのポリペプチド鎖は、免疫グロブリンスーパーファミリーとの関係か
ら予測されるように、２つのIg様ドメインに折りたたまれる。各ドメインは、向
かい合っているシート上のB鎖とF鎖を連結する保存されたジスルフィド架橋によ
ってサンドイッチ状に配置された２つのβシートから構成される(図3)。３つの
逆平行のβ鎖(A1, B, E)は、５つのβ鎖(C', C, F, G, A2)のシートと向かいあ
っており、これにより、鎖A1は３本鎖のβシートを残し、５番目の短く平行な鎖
A2を追加した４本鎖の逆平行シートに交差する。２次構造要素の配置ならびにそ
の連結性はFcγRIIbの双方のドメインにおいて同一であり、一方のドメインのも
う一方のドメイン上への強固な立体フィットは、67個のマッチしたCα原子の平
方二乗平均で1.29Åの距離であった。

【００８３】 このドメインは互いにほぼ垂直に配置され、その長軸間は70℃の角度を有し、
ハート形の全体構造を形成している。この配置は、該ドメイン間に十分な接触領
域をもたらす(図4)。鎖A2由来の残基およびN末端ドメインのA2とA1を連結するセ
グメント由来の残基は、C末端ドメインの鎖A1およびBの残基とかみ合っている。
この領域は密にパッキングされ、相互作用はいくつかの水素結合によって強化さ
れ、強固な配置をもたらす。これは、３つの異なる空間群における構造の保存に
よって確認される。斜方晶、正方晶および六方晶（昆虫細胞由来）の結晶形態で
は、ドメイン間角度において2°未満の偏差が認められる。

【００８４】1.11 全体構造 大腸菌からの組換えヒトFcγRIIbの構造は、斜方晶結晶から、MIRによって1.7
Åの分解能で解析した。実質的に同一の構造が、正方晶結晶および昆虫細胞由来
タンパク質の六方晶結晶において見られる。これら３つの構造すべてにおいて、
ポリペプチド鎖の最後の９残基は、無秩序であることが見出された。分子の構造
中心と膜貫通部位間のC末端リンカー領域のフレキシビリティーは機能的に関連
し、受容体のいくつかの再配向を可能にして、免疫複合体におけるFc部位の認識
を強化しうる。

【００８５】1.12 相同受容体 タンパク質のIgスーパーファミリーに見られるIgドメインは、向かい合ったシ
ートの２つの鎖を連結する保存されたジスルフィド架橋を有するβサンドイッチ
構造によって特徴づけられる。FcγRIIb に見られるようなサンドイッチを形成
する３および４個の逆平行β鎖の典型的な配置は、T細胞受容体、Fcフラグメン
ト、CD4またはFabフラグメントにおいても生じる。これらの分子の個々のIgドメ
インとFcγRIIbの２つのドメインとの構造アライメントは、共通の、密接に関連
した構造を示す。しかし、該ドメインの相対的配置は、これらの分子においては
関連しておらず、広範なセクターに及ぶ。様々な分子に由来するIgドメイン間の
構造類似性およびFcγRIIの２つのドメインが重なりあっている場合に生じるCα
原子の著しく低い平均二乗平均偏差にもかからわず、有意な配列類似性は見られ
ない(図5aおよび5b)。構造に基づく配列アライメントは、ドメインの配列にそっ
て保存された疎水性パターンを示し、それとともにシステインの他には、同一の
アミノ酸残基は少ししかなかった。本発明者らは、最初に、IgG1重鎖の２つのC
末端ドメインとFcγRIIbとの構造に基づくアライメントを作成し、その他の関連
するFcγRおよびFcεRIaドメインの配列を加えた。これにより、３つのドメイン
のFcγRIおよび２つのドメインの受容体の配列はIgドメインの疎水性パターンと
一致し、いくつかの保存されたアミノ酸残基を表すことが示された。第１に、Fc
Rの異なるドメインは、Igスーパーファミリーのその他の分子からのIgドメイン
に対するよりも、互いにより関連する。第２に、受容体のN末端ドメインは、第
２ドメインと同様に互いに関連する。第３に、FcγRIの第３ドメインの配列は、
ドメイングループの双方に由来する特徴を示す。まとめると、本発明者らは、Fc
RがIgスーパーファミリーに属することを確認し、すべてのFcRドメインは共通の
先祖、遺伝子複製により第２ドメインを獲得した古代の１ドメインの受容体に源
を有するものと考えられ、さらに、このような２ドメインの受容体のさらなる分
枝発生は、第３ドメインを獲得したFcγRIを含む現在の多様性をもたらした。

【００８６】 アライメントにおける、FcγRIIb内のドメイン間接触に寄与するこれらのアミ
ノ酸残基の保存は、異なる受容体における類似のドメイン配置に対するヒントに
る。表４では、その側鎖でドメイン間接触に寄与している残基（図４）を、図５
bの構造に基づく配列アライメントに従って、FcγRIIbについて、その他の受容
体内の対応するアミノ酸残基とともに編集している。FcR間で保存されていないA
sn15を除き、含まれる残基は同一であるかまたは保存的に置換され、すべてのFc
Rにおける類似の構造およびドメイン配置を強力に支持している。

【００８７】1.13 IgGに対する接触境界面 FcRとそのリガンドとの相互作用に関する限定的な情報は、突然変異誘発研究(
Hogarthら、1992; Hulettら、1994; Hulettら、1995)から入手可能である。Fcγ
RIIa β鎖間のループをFcεRIaアミノ酸残基と系統的に交換することにより、C
末端ドメインのB/C、C'/EおよびF/Gループは、リガンドの結合にとって重要であ
ることが評価された(図3、図5b)。構造モデルにおいて、これらのループは隣接
し、潜在的なリガンドに自由に接近可能である。さらに、これらのループ内のほ
とんどのアミノ酸残基を、単点突然変異によってアラニンに置換すると、FcγRI
Iaの２量体ヒトIgG1への親和性の劇的な変化が生じた。また、高応答性/低応答
性多形におけるC末端ドメイン（C'/Eループ）内のArg131のHisへの単一アミノ酸
置換は、FcγRIIaのマウスIgG1への親和性を変化させ、その領域を指す。従って
、このエリア内のアミノ酸残基は、リガンド結合またはその領域の構造保全性の
いずれにも重要である。ここで、該構造は、Tyr 157近傍の疎水性アミノ酸残基P
ro 114、Leu 115およびVal 116のクラスター形成を示す。このパッチは中心構造
からはみ出している正に荷電したアミノ酸残基Arg 131およびLys 117により、Le
u 159、Phe 121およびPhe 129の領域から分離されている(図5b)。

【００８８】1.14 グリコシル化 FcγRIIbの配列中に、３つの潜在的Nグリコシル化部位が見出された。３つの
部位はすべて、分子の表面にあり、接近可能である。それらは、両ドメインのE/
Fループ内(N61およびN142)およびC末端ドメインの鎖E(N135)上に位置する(図3、
図6)。構造解析に使用した材料は、大腸菌から得たものであるため、炭水化物を
含まず、一方、哺乳動物細胞から単離したFcRは高度にグリコシル化されている
。これらの３つの潜在的グリコシル化部位は、推定のIgG結合領域からかなり離
れて位置し、グリコシル化されていないFcγRIIbはヒトIgGを結合することから
、結合においてグリコシル化の役割が少ないことを示唆している。この事実は、
昆虫細胞において産生されグリコシル化されているFcγRIIbの構造により確認さ
れた(Sondermannら、1998A)。おそらく異なる結晶接触によるものであるドメイ
ン間角度の２°の変異を除き、グリコシル化タンパク質と非グリコシル化タンパ
ク質の構造の間に違いは見られなかった。３つのグリコシル化部位は、物質が４
つのバンドとして現れるSDS-PAGEで示されるように、場合により使用されるのみ
である。これらの糖についての追加の電子密度によっても、化学的および構造的
な異質性の結果は見られなかった。

【００８９】実施例２ shFcγRIIa（可溶性ヒトFcγRIIa） 手順は、以下に示す変化を除き、実施例１に従って実施した。

【００９０】2.1 クローニングおよび発現 shFcγRIIaは、表５に挙げた突然変異(mutagenous)プライマーを用いた実施例
１に従い、各野生型cDNAを突然変異させることによって産生し（Stengelinら、1
988）、発現させた。タンパク質の発現のためには、pET22b+ベクターを選択した
。

【００９１】2.2 再生および精製 shFcγRIIaは、実施例１に従って、表６に挙げた各再生バッファーを用いて、
再生した。

【００９２】2.3 結晶化 shFcγRIIaは、表７に示した条件下で記載した通りに結晶化した。

【００９３】2.4 構造決定 構造は、調査モデルとしてshFcγRIIaを用い、同形置換法で解析した。

【００９４】実施例3 shFcγRIII（可溶性ヒトFcγRIII） 手順は、以下に示す変化を除き、実施例１に従って実施した。

【００９５】3.1 クローニングおよび発現 shFcγRIIIは、表５に挙げた突然変異(mutagenous)プライマーを用いた実施例
１に従い、各野生型cDNAを突然変異させることによって産生し（Simmons＆Seed
、1988）、発現させた。タンパク質の発現のためには、pET22b+ベクターを選択
した。

【００９６】3.2 再生および精製 shFcγRIIIは、実施例１に従って、表６に挙げた各再生バッファーを用いて再
生した。

【００９７】3.3 結晶化 shFcγRIIIは、表７に示した条件下で記載した通りに結晶化した。

【００９８】3.4 構造決定 構造は、調査モデルとしてshFcγRIIbを用い、同形置換法で解析した。

【００９９】3.5 shFcγRIII：hFc1複合体の結晶化 骨髄腫患者の血清に由来するhIgG1を使用して、プラスミンを用いた消化によ
ってFcフラグメント(hFc1)を調製した（Deisenhoferら、1976）。得られたFcフ
ラグメントは、プロテインAクロマトグラフィーによって、Fabフラグメントから
分離した。部分的に消化されたhIgGは、サイズ排除クロマトグラフィーにより、
ランニングバッファーとしてMBS(MOPS 2mM、NaCl 150mM、アジ化ナトリウム 0.0
2%、pH 7.0)を用いて除去した。等モル量のhFc1およびshFcgRIIIを混合してMBS
で希釈し、10mg/mlの濃度とした。複合体は、表５に示した条件下で記載の通り
に結晶化した。

【０１００】実施例4 shFcεRII（可溶性ヒトFcεRII） 手順は、以下に示す変化を除き、実施例１に従って実施した。

【０１０１】4.1 クローニングおよび発現 shFcεRIIは、表５に挙げた突然変異(mutagenous)プライマーを用いた実施例
２に従い、各野生型cDNAを突然変異させることによって産生し（Kikutaniら、19
86）、発現させた。タンパク質の発現のためには、pET23a+ベクターを選択した
。

【０１０２】4.2 再生および精製 shFcεRIIの再生は、急速な希釈の前に溶解した封入体を塩化グアニジン 6M、
酢酸ナトリウム 20mM、pH 4.0に対して透析することを除き、実施例１に記載の
通りに実施した。shFcεRIIは、実施例１に従って、表６に挙げた各再生バッフ
ァーを用いて再生した。再生の後、タンパク質溶液をPBSに対して透析し、100倍
に濃縮し、Superdex 75を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した
。これにより、純粋なshFcεRIIが得られ、これをTRIS/HCL 2mM、NaCl 150mM、
アジ化ナトリウム 0.02%、pH 8.0に対して透析し、10mg/mlまで濃縮し、4℃で保
存した。

【０１０３】実施例５ shFcγRI（可溶性ヒトFcγRI） 手順は、以下に示す変化を除き、実施例１に従って実施した。

【０１０４】5.1 クローニングおよび発現 shFcγRIは、表５に挙げた突然変異(mutagenous)プライマーを用いた実施例１
に従い、各野生型cDNAを突然変異させることによって産生し（Allen＆Seed、198
8）、発現させた。タンパク質の発現のためには、pET32a+ベクターを選択した。
該ベクターは、N末端チオレドキシンの後にC末端トロンビン切断部位を有するヘ
キサヒスチジンタグを含み、その後に記載のタンパク質およびアミノ酸残基とイ
ンフレームのshFcγRIが続く。融合タンパク質の過剰発現のために、プラスミド
pUBSおよびpLysS (Novagen)を含む大腸菌株BL21(DE3)を使用した。

【０１０５】 精製した封入体は、グアニジン-HCl 6M、β-メルカプトエタノール 10mM、Tri
s 50mM、pH 8.0に溶解し、Ni-NTAカラム(Qiagen)に結合させた。溶出は、0〜1 M
のイミダゾール勾配で行った。溶出したタンパク質は、NaCl 150ｍM、Tris 50mM
、pH 8.0、GSH 2mM、GSSG 0.5 mMの1000倍量に対して、24時間4℃で透析した。
タンパク質溶液を最初の容量の25％に濃縮した後、トロンビンを添加した。37℃
で6時間のインキュベートした後、N末端チオレドキシンおよびHisタグをN末端配
列決定により確認して完全に除去した。この消化の間、shFcgRIは溶液から定量
的に沈殿析出した。

【０１０６】5.2 再生および精製 shFcγRIは、実施例１に従って、表６に挙げた各再生バッファーを用いて再生
した。酸化還元電位が1mMに減じた後、溶液をPBS pH 8.0に対して透析し、濃縮
した。再生したタンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーによって分析すると
、予想された単量体受容体のピークが得られ、非還元SDS-PAGEは30 kDaに主要な
バンドを示した。

【０１０７】実施例6 shFcεRIa（可溶性ヒトFcεRIa） 手順は、以下に示す変化を除き、実施例１に従って実施した。

【０１０８】6.1 クローニングおよび発現 shFcεRIは、表５に挙げた突然変異(mutagenous)プライマーを用いた実施例１
に従い、各野生型cDNAを突然変異させることによって産生し（Kochanら、1988）
、発現させた。タンパク質の発現のためには、pET23a+ベクターを選択した。

【０１０９】

【表１】

【０１１０】

【表２】

【０１１１】

【表３】

【０１１２】

【表４】

【０１１３】

【表５】

【０１１４】

【表６】

【０１１５】

【表７】

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plexes of IgG and soluble human Fcγ-Receptor II produced in insect cell
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IIとの複合体の解析およびその結晶化）」, (提出済み）. 59. Stengelin S., Stamenkovic I., Seed B.;「Isolation of cDNAs for two
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ローニングによる異なった2つのヒトFc 受容体のcDNAの単離）」: EMBO J. 7: 1
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【０１２２】 60. Tax, W.J.M., Willems, H.W., Reekers, P.P.M., Capel, P.J.A., Koene,
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の共キャップ形成。レクチン様相互作用の潜在的役割」, J. Immunol. 150, 303
0-3041.

【０１２３】配列情報

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、sFcγRIIbの精製を示す15%還元SDS PAGEである。レーン１：分子量マ
ーカー。レーン２：導入前の大腸菌溶解物。レーン３：導入1時間後の大腸菌溶
解物。レーン４：導入４時間後の大腸菌溶解物。レーン５：精製したsFcγRIIb
の封入体。レーン６：hIgGアフィニティーカラムの溶出液。レーン７：ゲル濾過
カラムのプールした画分。

【図２】 図２は、平衡化ゲル濾過である。1 μgのhFcを10 μlの平衡化バッファー(PBS
1mlあたり10 μgのsFcγRIIbを含む)に溶解したものをサイズ排除クロマトグラ
フィーカラムにアプライし、溶出液の吸光度(280nm)を時間の関数として測定し
た。注入したFcフラグメントは、平衡化バッファー中でsFcγRIIbと複合体を形
成する（t = 22分）。消費されたsFcγRIIbの負のピークは、t = 26分に観察さ
れる。

【図３】 図３は、ヒトsFcγRIIbの全体構造である。sFcγRIIb構造の立体的リボン表示
である。IgG結合に重要であると思われるループは、結合部位内のいくつかの残
基とともに赤で示し、保存されたジスルフィド架橋は球および棒で示す。潜在的
Nグリコシル化部位は緑の球で示す。末端に記を付け、β鎖においてはN末端ドメ
インには黒で、C末端ドメインには青で、連続的に番号を付した。この図は、プ
ログラムMOLSCRIPT (Kraulis, 1991)およびRENDER (MerrittおよびMurphy, 1994
)で作成した。

【図４】 図4は、ドメイン間接触を表す。この図は、sFcγRIIbのドメイン間接触に関与
する残基の拡大図を示す。N末端ドメインのアミノ酸残基を青色で示し、C末端ド
メインの残基を黄色で示す。このモデルは、最終座標から得られた1σで等高線
を付した2Fo-Fc電子密度によってカバーされる。ドメイン間の水素結合は白線で
示す。この図は、プログラムMAIN(Turk、1992)を用いて作成した。

【図５】 図５aは、２つのFcγRIIbドメインとヒトIgG1のCH2ドメインとの重ね合わせを
表す。FcγRIIbの双方のドメインとhIgG1のCH2ドメインを重ね合わせた。N末端
ドメインは青色で示し、C末端ドメインは赤色で示し、hIgG1のCH2ドメインは緑
色で示す。各末端には記を付け、保存されたジスルフィド架橋は細い線で示す。 図５bは、sFcγRIIbドメインとFcRファミリーのその他のメンバーのドメイン
との構造に基づく配列アライメントである。図の上部は、プログラムGBF-3D-FIT
(Lessel & Schomburg, 1994)を用いて実施したFcγRIIbとhIgG1 Fcフラグメン
トドメインとの構造に基づく配列アライメントである。重ね合わせたドメインの
うち、2.0Å未満のCα距離を有するアミノ酸残基は、Fcフラグメントドメイン間
でマッチした残基についてはライラック色で記を付け、FcγRIIbドメイン内の残
基には黄色で記を付け、４つのドメインすべてにおいて重ね合わせることができ
たときは緑色で記をつけている。β鎖はこのアライメントの部分の下に示し、図
３と一致するように記をつけている。 図の下部は、GCGパッケージ(Genetics Computer Group, 1994)からのルーチン
を用い、図の上部に示されたプロファイルに従った、その他のFcγRのアミノ酸
配列と相同体FcεRIaとのアミノ酸配列のアライメントを示す。上および下の列
の数字は、FcγRIIbのN末端およびC末端ドメインに関する。保存されたシステイ
ンは、マゼンタ色でタイプし、潜在的グリコシル化部位は青色でタイプしている
。第１ドメインで同一の残基には橙色で記を付け、第２ドメインで同一の残基に
はピンク色で記をつけ、双方のドメインで残基が保存されている場合は緑色で記
をつけている。あまり保存されていないFcγRIの第３ドメインは、第１および第
２ドメイン間でアライメントを行った。赤色の矢印は第１ドメインと第２ドメイ
ン間の側鎖の接触に関与する残基を指し、青色の矢印はIgG結合に関連する残基
を示している。この図は、プログラムALSCRIPT(Barton, 1993)で作成した。

【図６】 図６は、FcγRIIbの推定の結合部位を表す。GRASP (Nichollsら、1991)で作成
したときのFcγRIIbの固体表面表示は、カラーコードは負（赤色）から正（青色
）への相対的表面電位に従う。図６ａは、図３で示した分子を垂直線を軸として
反時計回りに約90°回転させたものを示す。図６ｂでは、該分子を同じ軸まわり
で、時計回りに90°回転させている。両図は、C末端ドメイン（図６ａ）およびN
末端ドメイン（図６ｂ）上の推定結合領域を示す。本明細書中で考察したアミノ
酸残基に記を付けている。

【図７】 図７は、Fcγ受容体の重ね合わせ構造のCαトレースである。FcγRIIIは赤色
、FcγRIIaは緑色、FcγRIIbは青色で表している。IgG結合に重要な残基は球と
棒で表している。N末端およびC末端には記を付けている。

【図８】 図８は、FcγRIII/Fcフラグメント結晶構造のリボン表示の概観である。Fcフ
ラグメントに結合する糖残基を、球と棒で示している。FcγRIII（青色）は、Fc
フラグメントの鎖B（赤色）および鎖A（緑色）間の下部のヒンジ領域に結合して
いる。

【図９】 図９は、FcγRIIIとFcフラグメントとの結合領域の拡大図である。着色は、図
８と一致させ、複合体形成に重要な残基は、球と棒で表している。

【図１０】 図１０ａの上部には、Fc受容体エクトドメインの構造に基づく配列アライメン
トを示す。保存された残基は黄色で陰を付け、同一の残基は橙色で陰を付けてい
る。この図の下部は、ヒト抗体配列のアライメントの一部を示す。複合体結晶構
造中においてFcフラグメントと接触しているヒトFcγRIIIの残基は、線でつない
でいる（疎水性相互作用は黒色、塩橋(salt brigde)は赤色、水素橋は青色）。F
cフラグメントのA鎖と接触しているFc受容体由来の残基は点線でつなぎ、Fcフラ
グメントのB鎖と接触している残基は実線でつないでいる。赤色、青色および黒
色の線はそれぞれ、荷電性の接触、極性の接触およびその他の接触を示す。 図１０ｂの上部は、Fc受容体エクトドメインの構造に基づく配列アライメント
を示す。保存された残基には黄色で影を付け、同一の残基には橙色で影を付けて
いる。あまり関連していないKirとFc受容体配列間の保存された残基は、青で影
を付けている。図の下部は、ヒト抗体とマウスIgE(mIgE)配列とのアライメント
の一部を示す。複合体結晶構造内でFcフラグメントと接触しているヒトFcγRIII
の残基は、線でつないでいる（疎水性相互作用は黒色、塩橋は赤色、水素結合は
青色）。FcフラグメントのA鎖と接触しているFc受容体由来の残基は点線でつな
ぎ、FcフラグメントのB鎖と接触している残基は実線でつないでいる。赤色、青
色および黒色の線はそれぞれ、荷電性の接触、極性の接触およびその他の接触を
示す。

【図１１】 図１１は生成したsFcγR、sFcεRIaおよびsFcεRIIの短い形態のもののアライ
メントを示す。

【図１２】 図１２は生成したsFcγRとsFcεRIaのアライメントを示し、sFcεRIIは含ませ
ていない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/18 Ａ６１Ｐ 37/02 35/00 37/08 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/735 37/08 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ０７Ｋ 14/735 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｎ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｑ Ｇ０１Ｎ 33/53 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ヤコブ，ウエ ドイツ連邦共和国 ディー−80339 ミュ ンヘン グルデインシュトラーセ 42 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 CA20 DA06 EA04 GA11 GA19 GA25 HA03 4B065 AA26X AA93Y AB01 AC14 BA02 BA16 BB01 BC03 BD01 BD14 BD15 BD17 BD46 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA17 BA44 CA18 CA53 DA39 DC50 NA14 ZA962 ZB072 ZB132 ZB152 ZB262 ZC552 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 EA20 EA50 FA74 GA01 GA10 GA15 GA22 GA26 GA40

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 膜貫通ドメイン、シグナルペプチドおよびグリコシル化が存
   在しないことを特徴とする、組換え可溶性Fc受容体。
2. 【請求項２】 前記受容体がFcγRまたはFcεRである、請求項１に記載の組
   換えFc受容体。
3. 【請求項３】 前記受容体がFcγRIIbである、請求項１または２に記載の組
   換えFc受容体。
4. 【請求項４】 前記受容体がヒト由来のものである、請求項１〜３のいずれ
   か１項に記載の組換えFc受容体。
5. 【請求項５】 配列番号１〜６のうちの１つに示したアミノ酸配列を含む、
   請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えFc受容体。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えFc受容体をコー
   ドする配列を含む組換え核酸。
7. 【請求項７】 配列番号７〜１２のうちの１つに示した配列を含む、請求項
   ６に記載の組換え核酸。
8. 【請求項８】 組換えFc受容体をコードする配列に機能的に連結された発現
   制御配列をさらに含む、請求項６または７に記載の組換え核酸。
9. 【請求項９】 原核生物発現ベクター、好ましくはpETベクター上に保持さ
   れている、請求項６〜８のいずれか１項に記載の組換え核酸。
10. 【請求項１０】 請求項６〜８のいずれか１項に記載の組換え核酸が存在す
    ることを特徴とする宿主細胞。
11. 【請求項１１】 原核宿主細胞、好ましくは大腸菌細胞である、請求項１０
    に記載の宿主細胞。
12. 【請求項１２】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換え可溶性Fc受容
    体をイムノアッセイにおいて使用して、FcR−抗体複合体の存在を測定すること
    を特徴とする、患者の血液、血漿または血清中に含まれるある型の抗体の量を測
    定する方法。
13. 【請求項１３】 イムノアッセイがELISAであり、好ましくはサンドイッチ
    アッセイである、請求項１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 測定すべき抗体がIgE抗体であり、組換え可溶性受容体がF
    cεRである、請求項１２または１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 アレルギーの素因または症状発現を判定するための請求項
    １４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 測定すべき抗体がIgG抗体であり、組換え可溶性受容体がF
    cγRである、請求項１２または１３に記載の方法。
17. 【請求項１７】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のFc受容体を競合イム
    ノアッセイにおいて使用し、患者の血液、血漿または血清中に含まれる対応する
    可溶性Fc受容体の量を測定することを特徴とする、免疫系の慢性疾患を有する患
    者の免疫状態を調べる方法。
18. 【請求項１８】 慢性疾患がAIDS、SLE、MMまたは慢性関節リウマチである
    、請求項１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 抗体のそれぞれの細胞性受容体による認識および結合を阻
    害するインヒビターとして作用する能力に関して物質をスクリーニングするため
    の、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換え可溶性Fc受容体の使用。
20. 【請求項２０】 組換え可溶性FcγRを使用し、IgG抗体の認識および結合に
    関心がある、請求項１９に記載の使用。
21. 【請求項２１】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換え可溶性Fc受容
    体を活性薬剤として含有する医薬組成物。
22. 【請求項２２】 自己免疫疾患、アレルギーもしくは腫瘍性疾患の治療また
    は予防に使用するための、請求項２１に記載の医薬組成物。
23. 【請求項２３】 組換え可溶性FcγR、好ましくは配列番号１に示したアミ
    ノ酸配列を有するもの、を含有する、AIDS、慢性関節リウマチまたは多発性骨髄
    腫の治療に使用するための請求項２１または２２に記載の医薬組成物。
24. 【請求項２４】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の可溶性組換えFc受容
    体の結晶性調製物。
25. 【請求項２５】 可溶性組換えFc受容体／免疫グロブリン複合体の結晶性調
    製物。
26. 【請求項２６】 Fc受容体の結晶構造データを得るための請求項１〜５のい
    ずれか１項に記載の組換え可溶性Fc受容体の結晶性調製物の使用。
27. 【請求項２７】 受容体／免疫グロブリン複合体およびそれらのそれぞれの
    結合部位の結晶構造データを生成するための、可溶性組換えFc受容体／免疫グロ
    ブリン複合体の結晶性調製物の使用。
28. 【請求項２８】 Fc受容体インヒビターまたは免疫グロブリンインヒビター
    を同定および／または調製するための、請求項２６または２７に記載の使用によ
    り得られた結晶構造データの使用。
29. 【請求項２９】 新しい抗体受容体を同定して調製するための、請求項２６
    または２７に記載の使用により得られた結晶構造データの使用。
30. 【請求項３０】 コンピュータ援用モデリングプログラムにおける請求項２
    ６〜２９のいずれか１項に記載の使用。
31. 【請求項３１】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換え可溶性FcRに
    相補的な三次元構造を有することを特徴とするFcRインヒビター。
32. 【請求項３２】 免疫グロブリンのFc受容体結合部位に相補的な三次元構造
    を有することを特徴とする免疫グロブリンインヒビター。
33. 【請求項３３】 請求項３１に記載のFcRインヒビターを活性薬剤として含
    有する医薬組成物。
34. 【請求項３４】 請求項３２に記載の免疫グロブリンインヒビターを活性薬
    剤として含有する医薬組成物。
35. 【請求項３５】 免疫系の過剰反応または誤った反応による疾患の治療また
    は予防に使用するための、請求項３３または３４に記載の医薬組成物。
36. 【請求項３６】 アレルギー、自己免疫疾患またはアナフィラキシーショッ
    クを治療または予防するための、請求項３３、３４または３５に記載の医薬組成
    物。
37. 【請求項３７】 Fc受容体と免疫グロブリンとの相互作用をモジュレートす
    るための分子の使用であって、該分子が請求項２４または２５に記載の結晶性調
    製物から得られた結晶構造データを用いて設計または同定されることを特徴とす
    る、上記使用。
38. 【請求項３８】 前記モジュレーションがFc受容体と免疫グロブリンとの結
    合の部分的または完全な阻害である、請求項３７に記載の使用。
39. 【請求項３９】 固相に結合された、請求項１〜５のいずれか１項に記載の
    Fc受容体。
40. 【請求項４０】 固相がクロマトグラフィー担体材料である、請求項３９に
    記載のFc受容体。
41. 【請求項４１】 患者の血液、結晶もしくは血清から、または免疫グロブリ
    ン産生細胞の培養上清から免疫グロブリンを吸着させるための、請求項４０に記
    載のクロマトグラフィー担体材料の使用。
42. 【請求項４２】 さらなる試験を行なうために患者の血液、結晶もしくは血
    清から、または免疫グロブリン産生細胞の培養上清から抗体を富化するための、
    請求項４１に記載の使用。