JPH02443A

JPH02443A - 可溶性組換えＦｃεレセプター、その調製法及びその使用法

Info

Publication number: JPH02443A
Application number: JP63323197A
Authority: JP
Inventors: Chuzo Kishimoto; 忠三岸本; Masaki Suemura; 末村　正樹; Hitoshi Kikutani; 菊谷　仁; Eru Baasumian Edowaado; エドワード　エル　バースミアン; Yozefu Shiyunaidaa Furantsu; フランツ　ヨゼフ　シュナイダー; Shiyubuendenbuain Renaate; レナーテ　シュヴェンデンヴァイン; Zonmeruguruuberu Buorufuganku; ヴォルフガンク　ゾンメルグルーベル; Subuetoriyuu Peetaa; ペーター　スヴェトリュー
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-12-22
Filing date: 1988-12-21
Publication date: 1990-01-05
Also published as: NO885687D0; IL88743A0; NO885687L; FI885873A; DK712488A; HUT50498A; EP0321842A1; AU2738088A; PT89299A; DK712488D0; FI885873A0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】最近、イムノグロブリンに対するヒトのリンパ細胞レセ
プター（ＦｃｇＲ）の分子構造は、そのクローニング及
び発現とともに、タダミツ・キシモト（Ｔａｄａ＋＋＋
１ｔｓｕ　Ｘｉｓｈｉｍｏｔｏ）等（セル（Ｃｅｌｌ）
４７巻、６５７〜６６５頁（１９８６年））及びガイ・
デレスペス（Ｇｕｙ　Ｄｅｌｅｓｐｅｓｓｅ）等（ＥＭ
ＢＯジャーナル、６巻、１０９〜１１４頁（１９８７年
））の文献に報告されている。ＦｃεＲの分子構造（図
１参照）は、細胞膜を中心に、そのＮ末端を細胞の内側
に、そのカルボキシ末端を細胞の外側につき出した様に
配向していることを示している。

さらに、Ｆｃ、−Ｒの１５０番の残基は、トリプシン様
プロテアーゼの潜在的切断部位であり、このことは、Ｂ
細胞及び、一部のＢ−リンパ芽球種性皮疹細胞系列の培
養上清に、ＦｃεＲの可溶性成分の存在を説明している
。このことは、正常人及びアトピー患者の血清中、後者
に有意に高いレベルで、ＩｇＥと会合もしくは複合体を
作った、水溶性ＦｃεＲ又はその一部が存在することの
理由であろう。

さらに、未公開のヨーロッパ特許出願第８７１１１３９
２．４には、１番から１４８番のアミノ酸をコードする
ｃＤＮＡの少なくとも一部が、真核性シグナル配列をコ
ードする適当なｃＤＮＡ断片で置き換ったｃＤＮＡ配列
が報告されている。

従って、報告されているプラスミドｐｓＦｃｇＲ−１（
第４図参照）において、１番から１３３番のアミノ酸の
コード配列は次のように、ＢＳＦ−２シグナル配列と置
き換っている。１９８６年８月１日、ブダペスト条約に
基き、ＦＥＲＭ　　ＢＰ１１１６として保管されたプラ
スミドＬＥ３９２（セル（Ｃｅｌｌ）　　４７巻、６５
７〜６６５頁（１９８６年））をＨｉｎｄ　ＩＩＩで消
化し、全ＦｃεＲｃＤＮＡのうちの１３４番から３２１
番のアミノ酸に対応するコード配列を含む、１．０ｋｂ
ｐのＨ４ｎｄｌ［Ｉ断片を得た。この断片のくぼんだ３
′末端をＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメントで
充填し、つづいてこのＤＮＡを、Ｐｓｔｌで消化する。

このようにして得た断片を、好ましくは、ＢａｍＨＩ−
Ｐｓｔｌ消化したｐＢＳＦ２−Ｌ８のような適当なベク
ター中にクローン化するが、その調製は次のようにして
筒便に行なわれる。

ＥｃｏＲＴ　　Ｂａｎ＋ＨＩ消化した１、　２　ｋｂｐ
のＢＳＦ−２ｃＤＮＡ挿入物は、ｐＢＳＦ−２，３８（
ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、３２４巻、７３〜７６
頁（１９８６年））をＨｉｎｄ　ｍとＢａｎ＋ＨＩで消
化して得る。全ＢＳＦ−２ｃＤＮＡを含む、この断片を
ＨｉｎｆＩで消化し、そのくぼんだ３′末端をＤＮＡポ
リメラーゼのクレノーフラグメントで充填した。Ｋｐｎ
　Ｉ消化の後、ＢＳＦ−２リ一ダー配列を含む、このＫ
ｐｎ　Ｉ　−Ｈｌｎｆ　Ｉ　１１０　ｂｐ断片を、予め
Ｋｐｎ　Ｉ及びＳｍａＴで消化したｃＧＥＭ４の多重ク
ローン化部位にクローン化した。選択したクローンの１
つを増殖しｐＢ　Ｓ　Ｆ　２−Ｌ８と命名した（図３参
照）。

ｐＢＳＦ２−Ｌ８をＢａｍＨＩで消化し、そのくぼんだ
３′末端をＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント
で充填する。ＢａｍＨ１部位充填後、上述のＨｉｎｄ　
ｍ−Ｐｓｔｌ　ＦｃεＲｃＤＮＡを、これまで述べてき
たようにＢａｍＨＩ　−Ｐｓｔ　Ｉで消化したｐＢＳＦ
２−Ｌ８にクローン化した。選択したクローンの１つを
増殖し、ｐｓＦｃεＲ１と命名した（第４図参照）。

驚くべきことに、多細胞生物由来の細胞における、１番
から１４８番のアミノ酸をコードするｃＤＮＡ配列の少
なくとも一部が、真核性シグナル配列をコードする適当
なｃＤＮＡ配列に置き換ったようなコード配列の発現が
起ったとき、非常に生活性の高い水溶性Ｆｃ１ｌＲが得
られた。そして、原則として、を椎、非を椎細胞にかか
わらず、どの細胞培養物も使用可能である。しかし、を
椎細胞は最も興味深くかつ、培養（組織培養）における
を椎参照の増殖は、最近ルーチンワークになってきてい
る（組織培養；アカデミツクプレス、クルーズ（Ｋｒｕ
ｓｅ）とパターソン（Ｐａ　ｔ　ｔｅｒｓｏｎ）　’ｔ
ｓ、（１９７３年））。そのような有効な宿主細胞系列
の例には、ＶＥＲＯ及びＨｅ１ａ細胞、チャイニーズハ
ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系列、及びＷ１３８、ＢＨ
Ｋ、ＣＯ３−７及びＭＤＣＫ細胞系列がある。そのよう
な細胞に対する発現ベクターには、通常（必要なら）複
製オリジン、発現すべき遺伝子の前に位置するプロモー
ター、つづいて必要とされるリボゾーム結合部位εＲＮ
Ａスプライシング部位、ポリアゾニレ−ジョン部位、及
び転写停止配列がある。

ホ乳類細胞で使用するためには、しばしば、発現ベクタ
ー上の制御機能は、ウィルスゲノムから提供される。た
ええば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオマ、
アデノウィルス２、そして最も頻繁には、シミアン・ウ
ィルス４０　（ＳＶ４０）に由来するものである。ＳＶ
４０のアーリー及びレート・プロモーターは、両方とも
、ＳＶ４０ウィルスの複製オリジンをも含む断片として
、容易に得られるところから、特に有用である（フィア
ーズ（Ｆｉｅｒｓ）等、ネイチ＋　　（Ｎａｔｕｒｅ）
　、２７３巻、１１３頁（１９７８年））。もしＨｉｎ
ｄｎＩ部位から、ウィルスの複製オリジン中のＢｇ１１
部位まで伸びるおよそ２５０　ｂｐの配列があるならよ
り大きいか又はより小さいＳＶ４０断片を使うこともで
きる。さらに、その制御配列が宿主細胞のシステムで使
えるなら、望まれる遺伝子配列に正しく結合するプロモ
ーター又は制御配列を使うことも可能であり、また、し
ばしばその方が望ましい場合もある。

複製オリジンは、ＳＶ４０又は他のウィルス（例えば、
ボリオマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ他）源由来のもので
あるような外来のものを含めるようなベクターの構築で
も与えられうるし、また、宿主細胞の染色体複製メカニ
ズムでも提供されうる。もし、ベクターが宿主細胞染色
体中に組込まれるなら、後者がしばしば満足のいくもの
となる。

しかし、原核生物同様真核生物中で複製可能なりローニ
ングベヒクル（シャトル・プラスミド）を使うことが最
も望ましい。プラスミドの真核生物中で複製する能力は
、ＤＮＡ配列を取扱いの、かつホ乳類細胞へのトランス
フェクションに必要な大量のプラスミドを得るための容
易な手段を提供する。

そのようなシャトルプラスミドは真核生物由来のＤＮＡ
配列同様、原核生物ＤＮＡモチーフを含んでいる。

このクローニングの原核性部分には、通常プラスミドｐ
ＢＲ３２２（ムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）　＋　Ｒ。

Ｃ１等、プロシーディング、イン・ナショナル・アカデ
ミ−・オフ・サイエンス　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　　ＵＳＡ、　７８巻、２０７
２〜２０７６頁（１９８１年）由来の複製オリジン及び
抗生物質含有培地における選択を可能にするマーカー遺
伝子を含んでいる。最も広く使われる選択遺伝子には、
アンピシリン、テトラサイクリン又はクロラムフェニコ
ールに対する耐性を仲介するものがある（ムリガン（Ｍ
ｕｌｌｉｇａｎ）、　Ｒ，Ｃ，等、プロシーディング、
イン・ナショナル・アカデミ−・オフ゛・サイエンス（
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＩＪ
ｓＡ。

７８巻、２０７２〜２０７６頁（１９８１年））。

このシャトル・プラスミドの真核性部分は、通常、シミ
アンウィルス４０　（ムリガン（Ｍｕ　Ｉ　Ｉ　ｉｇａ
ｎ）　＋Ｒ，Ｃ，等、プロシーディング、イン・ナショ
ナル・アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ＋　　７８巻、２０７
２〜２０７６頁（１９８１年））又は子牛パピローマウ
ィルス（ジマイオ（ＤｉＭａｉｏ）　Ｄ、等、モレキュ
ラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．
　Ｂｉｏｌ、）　　４巻、３４０〜３５０頁（１９８４
年））のようなウィルスゲノム由来の複製オリジンを含
まねばならない。第２に、選択可能なマーカー遺伝子は
、そのシャトル・プラスミドを宿す細胞が、その細胞中
にそのプラスミドを維持するように、選択条件において
生育できることが要求される。このマーカー遺伝子は、
原核生物由来でも真核生物由来でもよい（例えば、原核
性遺伝子：キサンチン−グアニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼをコードするｇｐｔ遺伝子（ムリガン（Ｍ
ｕｌ［ｉｇａｎ）　、　Ｒ、Ｃ。

等、プロシーディング、イン・ナショナル・アカデミ−
・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ。

Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、　　７８巻、２０７２〜２０７６
頁（１９８１年））、ムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）ε
Ｒ，Ｃ。

等、サイエンス　（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０９巻、１４
２２頁（１９８０年））、ネオマイシン誘導体Ｇ４１８
に対する耐性を仲介するバクチリアル・ホスファターゼ
をコードするｎｅｏ遺伝子（サウザーン（Ｓｏｕｔｈｅ
ｒｎ）　Ｐ　、等、ジャーナル・オフ・モレキュラー・
アンド・アプライド・ジェネティクス（Ｊ。

Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、）　、１巻、３２
７頁（１９８２年））、スコラー（Ｓｃｈｏｌｅｒ）　
Ｕ　、等、セル（Ｃｅｌｌ）。

３６巻、１４２２頁（１９８４年）、クロラムフェニコ
ール、アセチルトランスフェラーゼをコードするＣＡＴ
遺伝子（ゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）　Ｃ，モレキュラー
・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、）　２巻、１０４４頁（１９８２年））、真
核性遺伝子；チミジンキナーゼをコードする遺伝子（ウ
ィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）　Ｍ、等、セル（Ｃｅｌｌ）
、１１巻、２２３頁（１９７７年））。目的とするクロ
ーン化遺伝子の発現を可能とする、第３の真核性ＤＮＡ
モチーフは、構成的もしくは誘導可能なプロモーター配
列がある（例えば、構成的プロモーター；シミアン４０
ウイルス又はロウス・ザルコーマウィルス（ムリガン（
Ｍｕｌｌｉｇａｎ）εＲ，ｃ。

等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２０９巻、１４２
２頁（１９８０年））、レイモンズ（Ｌａｉｍｏｎｓ）
　Ｌ　、等、プロシーディング・イン・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、７９巻、６４５３頁
（１９８２年））；ｇｌプロモーター：マウス乳腫瘍ウ
ィルスプロモーター（チー１”７プマン（Ｃｈａｐｍａ
ｎ）　Ａ　、　Ｂ　、等、モレキュラー・セルラー・バ
イオロジー（Ｍｏｌ、　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、）　３巻、１４２１〜１４２９頁、ヒートシ
ョックプロティンプロモーター（ペルハム（Ｐｅｌｈａ
ｍ）Ｈｌ等、ＥＭＢＯジャーナル、１巻、１４７３頁（
１９８２年））、メタロチオネイン・プロモーター（マ
ヨ（Ｍａｙｏ）　　Ｋｏ等、セル（Ｃｅｌｌ）　、２９
巻、９９頁（１９８２年）、カリシ（Ｋａｒｉｎ）　Ｍ
　。

等、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）　２９９巻、７９７頁
（１８７２年））。

高等な真核生物で、比較的多量の、Ｆｃ、−レセプター
の可溶性部分を得る１つの方法は、Ｆｃ。

−レセプター遺伝子の可溶性部分をＳＶ４０プロモータ
ー（構成的）にアニールし、このハイブリッド遺伝子を
、ジヒドロホレート・リダクターゼ（ｄｈｆｒ）をコー
ドする遺伝子を含むプラスミドにクローン化することで
ある。選択圧の下、そのｄｈｆｒ遺伝子及びそれに隣接
するＤＮＡ配列を１（１１）０倍まで増申し、ｄｈｆｒ
遺伝子だけでなく、可溶性のＦｃ、−レセプタ一部分ま
でも収量を増加させる（ＥＰ−Ａ−（１１）９３６１９
）。

しかし、本発明の好ましい態様は、図４に示すｐｓＦｃ
εＲ１の上述コード配列を含む多細胞生物の細胞におけ
る発現に適したベクター、そのようなベクターでトラン
スフェクトした細胞、適当なレプリコン及び制御配列と
機能的に結合した対応する遺伝子及びそれらの調製法で
ある。

例えば、本発明に従うそのようなベクターは、次のよう
にして、基本的ベクターとしてＰＤＥ−２、ｐＳＶ２又
はπ８３Ｍベクターを用いて調製することができる。

ａ）　　２つのＳＶ４０アーリープロモーターをもつ発
現ベクターＰＤＥ−２（日本特許出願１９８６／８８８
７９参照）を、標準操作を用いてＥ　ｃｏＲ１で消化し
、Ｂ５Ｆ２リーダー配列を含むｐｓＦｃεＲ−１のＥｃ
ｏＲｒ断片とライゲーションする（第２図参照）、でき
た発現ベクター構築物ＰＤＥ−２ｓＦｃｇＲをサルのＣ
ｏｓ−７細胞での発現に用いる。

ｂ）　発現ベクターπＨ３Ｍ（プロシーディング・イン
・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ、　ＮａＬ［、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ン　８４巻、３
３６５−３３６９頁（１９８７年））をＸｈｏｌで消化
後、その線状プラスミドをｄＮＴＰの存在下、クレノー
フラグメントで平滑末端とした。つづいて、そのベクタ
ーを、バクチリアル・アルカリホスファターゼで処理し
、フェノール抽出後、沈殿化した。

平行して、プラスミドｐｓＦｃεＲ−１（Ｆｃ。

−レセプターの可溶性部分及びその遺伝子の上流にＢＳ
Ｆ−２リ一ダー配列を含む）をＥｃｏＲＩで消化した。

クレノーフラグメントによる充填後、そのＤＮＡ断片を
電気溶出した。

線状の脱リン酸化したπ８３Ｍベクターを、ＢＳＦ−２
ｓＦｃ、−ＤＮＡ断片にライゲーションした。生じたプ
ラスミドを大腸菌にトランスホームし、増殖させて、π
３　ＦｃｇＲと命名した。

Ｃ）　発現ベクターｐＳＶ２ｇｐｔ　　（サイエンス（
Ｓｃｉｅｎｃｅ　）　２０９巻、１４２２頁（１９８０
年））をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化後、生じたＤ
ＮＡをエタノールで沈殿化し、つづいて、クレノーフラ
グメントで処理した。その酵素を失活させた後、ＤＮＡ
を子牛の腸アルカリホスファターゼで処理し、フェノー
ル抽出後、アガロースゲルで精製し、電気溶出した。

平行して、ジヒドロホレートリダクターゼの遺伝子（ｄ
ｈｆｒ）とハムスター細胞由来の対応する制御頭載（モ
レキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１
．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、）　　６巻、４２５〜４４
０頁（１９８６年））を含む、ｐＢＲ３２２−ｄｈｆｒ
プラスミドをＦｓｐｌとＨｉｎｄＩ［［で消化する。エ
タノール沈殿後、単離した２６５８ｂｐのＤＮＡ断片を
平滑末端とし、アガロースゲルで精製後、電気溶出した
。

このようにして得られたＤＮＡ断片及び修正したｐｓＶ
ｇｐｔベクターをライゲーションし、大腸菌ＪＭ７（１
３）にトランスフェクトした。ＥｃｏＲＩ及びＭｓｔＩ
［を用いた、制限酵素分析後、ＳＶ４（１１）ＲＩに対
して、ｄｈｆｒ遺伝子の向きが違う２つの陽性クローン
を選択し、各々、ｐ　Ｓ　Ｖ　”ｇｐｔ−ｄｈｆｒｌ７
、ｐＳ　Ｖｇｐｔ−ｄｈｆｒ２０と命名した。

得られたｐ　Ｓ　Ｖ　”ｇｐｔ−ｄｈｆｒベクターの１
つをＡｐａｌで消化し、クレノー酵素処理した。フェノ
ール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿後、得たＤＮ
ＡをＨ４ｎｄ［Ｉとインキュベートし、その酵素を失活
させた後に、子牛腸アルカリホスファターゼとインキュ
ベートした。ｇｐｔ遺伝子を含まない、望ましいｐＳＶ
　　ｄｈｆｒベクターが、フェノール／７（１１）ホル
ム抽出、アガロースゲルクロマトグラフィー及び電気溶
出によって得られた。

このようにして単離したｐ　Ｓ　Ｖ　２−ｄｈｆｒベク
ターを、その上流にＢＳＦ−２リ一ダー配列をもつ、Ｆ
ｃεＲの可溶性部分をコードする配列を含むＤＮＡ断片
とライゲーションした。この断片は、上流にＢＳＦ−２
リ一ダー配列をもつ、Ｆｃ、レセプター遺伝子の可溶性
部分を含むπＨ３ＭプラスミドのＰｓｔｌによる消化、
ｄＮＴＰ存在下でのクレノー酵素と生成した反応混合物
とのインキュベーションによる末端の平滑化、及びエタ
ノール沈殿により調製するのが望ましい。得られたＤＮ
ＡをＨｉｎｄＩ［Ｉとインキュベートし、フェノール／
クロロホルム抽出後、アガロースゲルで精製した。単離
した１５（１１）ｂρ断片の電気溶出後、その断片を、
線状化したｐＳ　Ｖ　２−ｄｈｆｒベクターとライゲー
ションし、さらに、大腸菌ＨＢＩＩＯにトランスフェク
トした。

制限酵素分析後、２つの陽性クローンを選択し、ｐＳ　
Ｖ−ｄｈｆｒｌ　？　−ｓＦｃ、及びｐＳ　Ｖ　２　　
ｄｈｆｒ２０　　ｓＦｃ、と命名した。この発現ベクタ
ーを、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞における発現
に用いた。

微生物に加え、多細胞生物由来の細胞培養物も宿主とし
て用いることができる。原則として、そのような細胞培
養物は、を椎、無を生物いずれのものも利用できる。

培養における細胞の増殖（組織培養）は、ルーチンワー
クになってきている（組織培養、アカデミツクプレス、
クルース（Ｋｒｕｓｅ　）とパターリン（Ｐａｔｔｅｒ
ｓｏｎ　）　ｋＪＭ　（１９７３年））。を椎宿主細胞
系列の例には、ＶＥＲＯ及びＨｅ１ａ細胞、チャイニー
ズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びＷＩ３８、ＢＮＫ
％　ＣＯ５−７及びＭＤＣＫ細胞系列；また最近無を椎
細胞系列も有用となってきている（例えば、ＡＴＣＣか
ら利用可能な、スボドプテラ・フラジペルダ（Ｓｐｏｄ
ｏｐ　ｔｅｒａフラジペルダ細胞由来の８９９クロ一ン
化細胞系列）。

通常、そのような細胞に対する発現ベクターは（もし必
要なら）複製オリジン、発現する遺伝子の前に位置する
プロモーター、つづいて必要とされるリボゾーム結合部
位εＲＮＡスプライシング部位、ポリアゾニレ−ジョン
部位及び転写停止配列を含んでいる。

ホ乳類細胞で使用するため、発現ベクター上の制御機能
は、しばしば、ウィルスゲノムから提供される。例えば
、−Ｃに使用されるプロモーターは、ボリオマ、アデノ
ウィルス２、そして最も頻繁には、シミアン・ウィルス
４０　（ＳＶ４０）由来のものであり、無を椎生物に対
しては、例えば、オートグラファ・カリホルニア・ヌー
クリア・ポリへドロシス・ウィルス（ＡｃＮＰＶ）のポ
リヘトリン遺伝子のプロモーターが使われる（サマーズ
（Ｓｕｎ＋ｎ＋ｅｒｓ　）　Ｍ、　Ｄ、　とスミス（Ｓ
ｍｏｔｈ　）　Ｇ、　Ｅ、；バクロウィルスベクターと
昆虫細胞培養操作法マニュアル（１９８７年）、農業試
験所及びテキサスＡ＆Ｍ大学、テキサス昆虫学科）。

ＳＶ４０のアーリー及びレート・プロモーターは、両方
が、ＳＶ４０複製オリジンをも含む断片として、ウィル
スから容易に得られるので特に有用である（フィアス（
Ｆｉｅｒｓ　）等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２７
３巻、１１３頁（１９７８年））。

もし、ＨｉｎｄＩ［Ｉ部位からウィルスの複製オリジン
中のＢｇｌ　　１１部位まで伸長するおよそ２ｏｂｐの
配列を含むなら、より小さいか又はより大きいＳＶ４０
断片を用いることもできる。さらに、もし、その制御配
列が宿主細胞システム中で働くことができるなら（例え
ば、ＣＨＯ細胞に対するＤＨＦＲ遺伝子）、望まれる遺
伝子配列と正しく結合するプロモーター又は制御配列を
利用することも可能であり、また、しばしばその方が望
ましいこともある。

複製オリジンは、ＳＶ４０又は他のウィルス（例えば、
ポリオマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ、ＡｃＮＰＶ他）源
由来の外来オリジンを含めるようなベクターの構築でも
与えられるし、また、宿主細胞染色体複製メカニズムに
よっても提供される。もし、そのベクターが宿主細胞染
色体に組込まれるなら、後者もしばしば満足のいくもの
となる。

しかし、原核生物同様真核生物で複製可能なりローニン
グベヒクルを用いるのが最も望ましい。

プラスミドの原核生物中で複製できるという能力は、Ｄ
ＮＡ配列の取扱い及び、ホ乳頻細胞へトランスフェクシ
ョンするのに必要な多量のプラスミドＤＮＡの収穫の容
易な手段を提供する。

そのようなシャトル・プラスミドは、真核生物由来のＤ
ＮＡ配列と同様に、原核性ＤＮＡモチーフをも含んでい
る。

そのプラスミドの原核性部分は、通常プラスミドｐＢＲ
３２２（ムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）　Ｒ，Ｃ，等プ
ロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、７８巻、２０７２〜２０７６頁（１
９８１年））由来の複製オリジン及び抗生物質含存培地
での選択を可能にするマーカー遺伝子を含んでいる。選
択に最もよく使われる遺伝子は、アンピシリン、テトラ
サイクリン又はクロラムフェニコールに対する耐性を仲
介するものである（ムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）　Ｒ
，Ｃ，等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　ＵＳＡ、　７８巻、２０７
２〜２０７６頁（１９８１年））。

このシャトル・プラスミドの真核性部分は、通常、シミ
アン４０ウイルス（ムリガン（Ｍｕ　Ｉ　ｌ　ｉ　ｇａ
ｎ）Ｒ，Ｃ，等、プロシーディング・イン・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　Ｕ　Ｓ　Ａ　７８巻、２０
７２〜２０７６頁（１９８１年））又は子牛のパピロマ
・ウィルス（ジマイオ（ＤｉＭａｉｏ　）Ｄ、等、モレ
キュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．
　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、）　４巻、３４０〜３５０頁（１９８４年）
）等のウィルスゲノム由来の、複製オリジンを含まなけ
ればならない。第２に、選択マーカー遺伝子はシャトル
・プラスミドを宿している宿主が、その細胞中にそのプ
ラスミドを維持するがために、選択的条件下で生育する
のに必要である。このマーカー遺伝子は、原核生物又は
真核生物のいずれに由来してもよい（例えば、原核性遺
伝子：キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼをコードするｇｐｔ遺伝子（ムリガン（Ｍｕｌ
ｌｉｇａｎ）Ｒ，Ｃ，等、プロシーディング・イン・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　Ｕ　Ｓ　Ａ、７８巻、２０
２７〜２０７６頁（１９８１年）、ムリガン（Ｍｕｌｌ
ｉｇａｎ　）Ｒ，Ｃ５等、サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ
　）　、２０９巻、１４２２頁（１９８０年））、ネオ
マイシン誘導体６４１８に対する耐性を仲介するバクチ
リアルホスファターゼをコードするｎｅｏ遺伝子（サウ
ザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）　Ｐ、等ジャーナル拳オブ
帝モレキュラー・アンド・アプライド・ジエネティクス
（Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、）１巻、３２７頁（１９８２
年）、スコラー（Ｓｃｈｏｌｅｒ）　Ｕ　、等、セル（
［：ｅｌｌ）　、３６巻、１４２２頁（１９８４年）、
クロムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼをコ
ードするＣＡＴ遺伝子（ゴーマル（Ｇｏｒｍａｌ　）Ｃ
，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（！
ｏｆ、　Ｃｅ１ｌＢｉｏｌ、　）　２巻、１０４４頁（
１９８２年））真核性遺伝子；チミジンキナーゼをコー
ドする遺伝子（ウィグラー（Ｗ＋ｇｌｅｒ　）Ｍ、等、
セル（Ｃｅｌｌ）１１巻、２３３頁（１９７７年））。

目的とするクローン化した遺伝子の発現を可能にする第
３の真核性ＤＮＡモチーフは、構造的もしくは誘導性の
プロモーターである（例えば、構成的プロモーター；シ
ミアン４０ウイルス又はロウス・ザルコーマウィルス（
ムリガン（！Ｊｕｌｌｉｇａｎ　）Ｒ，Ｃ，等、すイエ
ンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）　、２０９巻、１４２２頁（
１９８０年）、レイモンズ（Ｌａｉｍｏｎｓ）　Ｌ等、
プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オ
フ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｉｃ、　）ＵＡＳ７９巻、６４５３頁（１９８２年
））；誘導性プロモーター；マウス乳腫瘍ウィルスプロ
モーター（チ＋７１マン（Ｃｈａｐｍａｎ　）　Ａ、　
　Ｂ、等、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロ
ジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　）　３巻、
１４２１〜１４２９ｇ）、ヒートショックプロティンプ
ロモーター（ペルハム（Ｐｅｌｈａｍ　）　Ｈ、等、Ｅ
ＭＢＯジャーナル１巻、１４７３頁（１９８２年））、
メタロチオネイン・プロモーター（マヨ（Ｍａｙｏ、　
Ｋ　等、セル（Ｃｅ１ｌ　）、２９巻、９９頁（１９８
２年）、カリシ（Ｋａｒｉｎ　）　、Ｍ等、ネイチ＋　
　（Ｎａｔｕｒｅ　）２９９巻７９７頁（１９８２年）
）。

外来遺伝子の適当な宿主細胞への転移は、ＤＮＡの、宿
主細胞細胞核への直接的マイクロインジェクション（カ
ベフチ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ　）Ｍ、セル（Ｃｅ１ｌ）２
２巻、４７９頁（１９８０年））；外来ＤＮＡをもつバ
クテリアのプロトプラストと真核性宿主細胞とのプロト
プラスト融合（シャファ（Ｓｃｈａｆｆｅｒ）Ｗ、プロ
シーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オフ゛
・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ。

Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、　７７巻、２１６３頁（１９８０年
））；トランスフェクトされるＤＮＡ存在下での、宿主
細胞膜のエレクトロポレーションにューマン（Ｎｅｕｍ
ａｎ　）　Ｅ、等、ＥＭＢＯジャーナル１巻、８４１頁
（１９８２年））；組換えＤＮＡを含むリポソームと宿
主細胞との融合（フレーシー（Ｆｒａｌｅｙ　）Ｒ，等
ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ
、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）　２５５巻、１０４３
１頁（１９８０年））によって行うことができる。もっ
ともよく使われる方法は、ＤＮＡ及びリン酸カルシウム
の共沈殿法（グラハム（Ｇｒａｈａｍ　）　Ｆ、　Ｌ、
及びヴアン・デル・アープ（ｖａｎｄｅｒ　Ｅｒｂ、　
）Ａ、　　Ｊ、ヴイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　）５
２巻、４５６頁（１９７３年））及びＤＥＡＥテキスト
ラン媒介のトランスフェクション法（バヘリ（Ｖａｈｅ
ｒｉ　）Ａ、等、ヴイロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）２
７巻、４３５頁（１９６５年））である。

トランスフェクトしたｃｏｓ−７又はＣＨＯ細胞のイン
キュベーション後、その培養上清を収穫し、次に示すよ
うに可溶性ＦｃｇＲのテストを行った。

Ｃｏｓ細胞上清は、当出願者による、ヨーロッパ特許出
願第８７１１（１６）のいずれか５８．９号に述べられ
ているように、ＦｃεＲ（８−３０）に特異的なモノク
ローナル抗体でそのレセプターの存在をテストする方法
で、ＦｃεＲの発現について、好酸球細胞系列を用いて
テストした。第５図に示したように、ＦｃεＲに対して
、８〜３０の抗体をもつこれら細胞株をコントロールと
比較した。

さらに、細胞上のＦｃεＲは、ヒトのＩｇＥでコートし
た固定化ｏｘＲＢＣ（ＯＲＢＣ）を用いた検定法で検出
した（ゴンザレスーモリナ（ＧｏｎｚａｌｅｓＭｏｌ　
１ｎａ）　、　Ａ　、及びスビーゲルバーグ（Ｓｐｉｅ
ｇｅｌｂｅｒｇ）Ｈ，Ｌ、ジャナル・オフ・クリニカル
・インベスチゲーション（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅ
ｓｔ、　）　５９巻、６１６頁（１９７７年））。Ｉｇ
Ｂロゼンタ形成細胞の数は、子牛血清アルブミンでコー
トした固定化０ＲＢＣとの非特異的結合数を差引いて見
積った。

Ｃｏｓ細胞上清でトランスフェクトしたＰＤＥ−２ｓ　
ＦｃεＲに見られるＩｇＥ結合活性は、ＥｏＬ−３細胞
に対するＩｇＥ−ＯＲＢＣの結合（ロゼツタ形成）の阻
害活性で分析した。表１に示した結果は、可溶性Ｆｃε
ＲがそのレセプターへのＩＥＨの競合的結合を阻害する
ことができることを示している。

可溶性レセプター活性の存在は、以下に述べるイライザ
（ＥＬＩＳＡ）法によって確認した。

ＦｃεＲ活性はモノクローナル抗体３−５及び８−３０
に対する結合能で測定し、二重抗体酵素結合免疫吸着法
（ＥＬＩＳＡ）を用いてモニターした。コントロールの
Ｃｏｓ−７細胞の上清にはＦｃｇＲ活性は検出されなか
ったが、ＰＤＥ−２ｓＦｃｅＲをトランスフェクトした
Ｃｏｓ−７細胞には、有意なレセプター活性の分泌があ
った。事実、ＦｃεＲ活性のレベルは、１％及び１０％
のウシ胎児血清（Ｆｅ２）を含む、トランスフェクシン
トの培養物上清で各々５及び２５ユニット／ｎ＋１！で
あった。ＦｃεＲ活性の結果を第６図に示す。

トランスフェクトしたＣＨＯ細胞から単離した水溶性Ｆ
ｃεＲを用いたときも同様の結果が得られた。

さらに、即時型過敏症は、季節性鼻炎からアナフィラキ
シ−までの範囲の巾広に徴候と見なせることが分ってい
る。即時型過敏症のメカニズムにはＩｇＥ抗体及びそれ
ら抗体に対する、表面の特異的レセプターをもつ、ｍ織
肥満細胞や好塩基性細胞のような反応性細胞が関与して
いる。特異的刺激原によるこれら細胞の活性化で、一連
の生化学的事象が細胞顆粒から予め形成されている仲介
物や、新しく合成された膜アラキト酸の脂質代謝物質が
放出され、これらの物質は、血管の透過性の増加、スム
ーズな筋肉の収縮及びこれらの反応に付随する全ての徴
候を特徴とする炎症プロセスを引き起こす。この過程は
、自分自身の前炎症性成分を放出することによりその反
応を逆に促進するニュートロフィルや好酸球のような細
胞の走化性により増巾される。好酸球に特異的な一群の
因子は、アナフィラキシ−の好酸球走化性因子であり、
それらは、酸性のテトラペプチドで、アレルギー反応の
部位に好酸球を引きつける。最近の知見は、アレルギー
や寄生虫の蔓延における好酸球の重要性を示している。

好酸球はその表面に、ＩｇＥ存在下、脱顆粒反応及び炎
症プロセスの促進で特徴づけられるＩｇＥ仲介の事象に
活発に参与しているＩｇＥ　（ＦｃεＲ）に対するレセ
プターをもつことが示されている。さらに、好酸球上に
みられるＦｃεＲは、肥満細胞及び好酸基性細胞でみら
れるものと比較して、低い親和性を持っている。即時型
過敏及び特に喘息における好酸球の重要性から考えて、
これら細胞のＩｇＥ仲介による脱顆粒反応を制御する手
段を見つけることは重要である。さらに、中心的問題は
、肥満細胞、好塩基性細胞及び好酸球に対するＩｇＥの
結合を妨ぐか、又はこれと競合することである。ｒｇＥ
結合因子は、ＩｇＥの生合成を制御するか、又は、血清
ＴｇＥを中和又は捕獲することにより、それを成し遂げ
ることができるのだという仮説が唱えられた。

先に述べた証拠は、本発明に従がい調製した水溶性Ｆｃ
εＲは、ＩｇＥと結合し、かつ、その可溶型により、そ
れは、即時型過敏症（アレルギー）、特に喘息のある特
性に関係することが知られている好酸球へのＩｇＥの結
合を妨ぐことができることを示している。

それゆえ、本発明に従って調製した可溶性Ｆｃ　、　Ｒ
は、アレルギーの炎症効果を制御するのに有効であり、
かつ、本発明のもう１つの目的である、ＩｇＥにより誘
導される局所的かつアレルギー性反応の処置又は予防に
適している。

可溶性ＦｃεＲは、溶液又はスプレーのような、適当な
医薬組成物中に医薬的用途で組入れられる。

完全ではないが、次に示す例は、より詳細に本発明を説
明するであろう。

モノクローナル抗ＦｃεＲ抗体３−５（Ｙ、）及び８−
３０　　（μ）は、Ｐ３Ｌ１１ミエロマをεＲＰ旧−８
８６６細胞で免疫化したＢａ１ｂ／ｃマウス由来の肺臓
細胞とハイブリダイズすることにより作った（１９８６
年、７月２９日登録の、本出願者のヨーロッパ特許出願
第８６１１０４２０．６号参照）。８３０抗体は、Ｆｃ
εＲのＴｇＥ結合部位に近接するエピトープを認識し、
かつＩｇＥの８８６６　Ｕンパ芽球腫性皮疹細胞への結
合を阻害することができる。３−５抗体は、ＦｃεＲ上
の別のエピトープを認識するが、そのレセプターへのＩ
ｇＥの結合を効果的に阻害することができない。これら
の抗体は、還元、非還元条件下で、４６ｋｄ及び２５ｋ
ｄのポリペプチドを沈殿化する。モノクローナル抗体は
、５０％飽和硫酸アンモニウム沈殿と、それにつづ（１
ｇＭ類に対しては、セファロース６Ｂを用いたゲル濾過
（スウェーデン、アブサラ（Ｕｐｐｓａｌａ　）　、　
　ファルマシア・ファイン・ケミカル社）又は、ＩｇＣ
；１に対しては、ＱＡＥ−セファデックスを用いたイオ
ン交換クロマトグラフィー（ファルマシア・ファイン・
ケミカル社）ヲ用いて、腹水から精製した。

マウスのポリクローナルＩｇＧも同様にして単離した。

抗マウスＩｇＭ−アルカリホスファターゼ結合体はタボ
（Ｔａｇｏ　）　（ＣＡ州バーミンガム）から購入した
。

炭−旦プラスミド　ｐｓＦｃεＲ−１の構築（ａｌ　　ｐ　Ｇ　Ｅ　Ｍ　４のＳｍａｒ部位中にＢ　
Ｓ　Ｆ　−２ｃＤＮＡを含むｐＢＳＦ２−３８．３５０
μｇ（ネイチ＋　　（Ｎａｔｕｒｅ　）、　　３２４巻
、７３〜７６頁（１９８６年））を、５（１１）μｌ高
塩バツフア（１（１１）ｍＭ　ＮａＣ１，５０ｍＭトリ
ス・塩酸、ｐＨ７，５，１０ｎ＋Ｍ　ＭｇＣ７！ｚ　、
１ｍＭ　ＤＴＴ）　、中、７（１１）ユニツトのＥｃｏ
ＲＩ及びＢａｍＨＩを用い、３７℃、２ｈｒの消化を行
った。消化したＤＮＡを、１％アガロースゲルの分取電
気泳動にかけ、１、２　Ｋｂｐの全ＢＳＦ−２ｃＤＮＡ
を含むＥｃｏＲＩＢａｍＨＩ断片を、そのゲルから電気
溶出し、７０％エタノールで沈殿したのち、ＴＥバッフ
ァに１μｇ／μｌの濃度となるよう溶解した。

この断片２０μｇを５０μｌの高塩バッファ中、４０ユ
ニツトのＨｉｎｆＩを用い１時間消化し、その後フェノ
ール抽出及びエタノール沈殿を行った。この消化したＤ
ＮＡを２５μβの１×二ンクトランスレーシヨンバツフ
ア中に溶解しく５０ｍＭ）リス−塩酸、ｐＨ１７，２，
１０ｍＭ　Ｍｇ５ｏ４．０．１ｍＭＤＴＴ、５０　μｇ
／ｍβＢＳＡ）　、そして、８．０ユニツト／μ！のク
レノーフラグメント及び１ｍＭ　　ｄＮＴＰ溶液１溶液
１占ｌに、２０℃、３０分間、インキュベートした。そ
の充填反応は、７０℃、５分間のインキュベーションに
より停止した。この結果生じた１２７ｂｐの平滑末端断
片をフェノール抽出し、５０μｌの低塩バッファ（１０
ｍＭ）リス・塩酸、ｐＨ７，５，１０ｍＭ　！ＪｇＣＡ
’　２、Ｉ　ｎ＋八へＤ　Ｔ　Ｔ　）中、３７ｔ′、１
時間、４０ユニツトのＫｐｎｌで消化し、ついで、２．
５ユニツトのバクチリアル・アルカリ・ホスファターゼ
−とともに６５℃、３０分間インキユヘートシ、さらに
、分取用１％アガロースゲルにかけ電気泳動した。ＢＳ
Ｆ−２１Ｊ−グー配列を含むｔｔｏｂｐ断片を電気溶出
し、ついで、エタノール沈殿した。その１１０ｂｐの断
片を１０μｌのライゲーションバッファ　（５（１３）
ＩＭトリス・塩酸、ＰＨ７，４，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ！
ｚ　、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭスペルミジン、１　ｍＭ
　　Ａ　Ｔ　Ｐ　。

０、１　ｍｇ／ｍＩＢ　Ｓ　Ａ）に溶かし、２（１１）
ユニツトのＴ４リガーゼとともに４℃で１６時間インキ
ュベーションすることで、ｌμｇのＫｐｎｌ及びＳｍｌ
消化のｐＧＥＭ４とライゲーションし、大腸菌（ＭＣ１
（１６）のいずれか５）にトランスフェクトした。得ら
れたコロニーから４個のコロニーをピックアップし、１
つのクローンを選択して、増殖後、唯一のリーダー配列
をこの選択したクローンのプラスミドが含むことを確認
の上、それをｐＢＳＦ−Ｌ８と命名した（第３図参照）
。

ｆｂ１８０μｇのプラスミドＬＥ−３９２又はｐＧＥＭ
４　（ｐＦｃεＲ−１）を、２（１１）１ＩＪの低塩バ
ッファ　（１０＋ｎＭトリス・塩酸、ｐＨ７，５，１０
ｍＭＭｇＣｊ２ｚ　、１ｍＭＤＴＴ）中、１５０ユニツ
トのＨｉｎｄＩ［［を用い、３７°ｃ、１時間消化し、
分取用の１％アガロースゲル電気泳動にかけた。可溶性
ＦｃεＲ領域を含むＨｉｎｄ　Ｉ［Ｉ断片を、そのゲル
から電気溶出し、エタノール抽出後、ＴＥバ７ファに１
μｇ／μｌの濃度となるよう溶解した。ｌｔｔｇのＨｒ
ｎｄ　ＩＩＩ断片を、１０ｐ１の１×二ツクトランスレ
ーシヨンバツフア中、８．２ユニツトのクレノーフラグ
メント及び１　ｍＭ　ｄＮＴＰとともに、２０℃、３０
分間インキュベートして、くぼんだ３′末端を充填後、
フェノール抽出してから、エタノール沈殿した。その３
′末端を充填したＨ　ｉｎｄ　ｍ断片を、１０μｌの中
温バッファ中（５０ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭトリス・
塩酸、ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣ７！ｚ　、１ｍＭ
ＤＴＴ）中、３７℃、１時間、２ユニツトのＰｓｔｌを
用いて消化し、ついで、６５℃、３０分間、０．２５ユ
ニツトのバクチリアル・アルカリ・ホスファターゼとと
もにインキュベート後、エタノール沈殿した。別に、１
μｇのｐＢＳＦ２−Ｌ８を、２０μｌの高塩バッファ中
、３７°Ｃ１１時間、２ユニツトのＢａ１ＨＩで消化し
た後、フェノール抽出してからエタノール沈殿した。Ｂ
ａｍＨＩ消化したｐＢＳＦ２−Ｌ８を、１０μｌの１×
二ツクトランスレーシヨンバツフアに溶かし、２０°Ｃ
１３０分間、８．０ユニツトのクレノーフラグメント及
び１ｍＦＩ　　ｄＮＴＰとともにインキュベートして、
そのくぼんだ３′末端を充填し、フェノール抽出後、エ
タノール沈殿した。その沈殿を、２０μｌの高温バッフ
ァに溶かし、２ユニツトのＰｓｔｌを用い、３７℃、１
時間の消化を行ない、ついで、フェノール抽出及びエタ
ノール沈殿を行った。Ｐｓ口消化した可溶性ＦｃεＲコ
ード領域を含む断片及びＰｓｔＩ消化したｐＢｓＦ２−
Ｌ８を、１０μβのライゲーションバッファ中、４℃、
１６時間、２（１１）ユニツトのＴ４リガーゼとともに
インキュベーションすることによりライゲーションを行
ない、ついで大腸菌（ＭＣＩＱ６５）中にトランスフェ
クションした。得られたコロニーから８個のコロニーを
ピックアップした。１つのクローンを選択し、増殖後、
そのプラスミド構築を確認してからｐｓＦｃεＲ１と命
名した。増殖したｐｓＦｃεＲ−１は、ＢＳＦ−２リー
ダー及びＦｃεＲ配列の間に、ｐＧＥＭ４への多重クロ
ニング部からの７個の塩基を読み枠を同じくして含んで
いる（第１図参照；ヌクレオチド１３７〜１４３）。

例Ｃｐ　Ｓ　Ｖ　２−ｇｐｔ−ｄｈｆｒ−プラスミドの構築
ｆａ）　　１（１１）ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｎ＋Ｍトリ
ス・塩酸（ｐＨ７，５）　、６ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　、　
Ｉ　ＯＯμｇ／ｍｌのゼラチン及び６ｍＭβ−メルカプ
トエタノールを含む溶液中、５μｇの発現ベクターｐｓ
Ｖ２ｇｐｔ（サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）　、　　
２０９巻、１４２２頁（１９８０年））を、ＥｃｏＲＴ
及びＢａｍＨＩを用い、３７°Ｃ１−晩消化した。その
ＤＮＡを７０℃でエタノール沈殿した後、７ＩＩＩＭＭ
ｇＣ１□、７ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ７，５）　、５０
ｍＭ　ＮａＣｌ２．１ｍＭＤＴＴ及び５０μＭ　　ｄＮ
ＴＰを含む溶液中、５ユニツトのクレノーフラグメント
とともに、３７°Ｃ１１５分間インキュベートした。

６８℃、１０分間の酵素失活後、１０分の１容のトリス
・塩酸ＣｐＨ８，０）及び２０ユニツトの子牛腸アルカ
リホスファターゼを加えた。インキュベーションは３７
°Ｃで２時間行った。つづいて、望ましいＤＮＡを含む
溶液を、フェノールで２度抽出し、１％アガロースゲル
にかけた。

その修正をうけた線状プラスミドを電気溶出した。

ｆｂｌ　　１０ｍＭ）リス・塩酸（ｐＨ７，５）　、５
０ｍＭ　ＮａＣ１，６ｍＭ　ＭｇＣｌ！ｚ　、６ｉ＋Ｍ
β−メルカプトエタノール及び１（１１）μｇ　／　ｍ
　！！ゼラチンを含む１（１１）μｌの溶液中、ｄｈｆ
ｒ　（ジヒドロホレート・リダクターゼ）遺伝子及びハ
ムスター細胞由来のそれに対する制御領域を含むｐＢＲ
３２２〜ｄｈｆｒプラスミド（モレキュラー・アンド・
セルラーバイオロジー（Ｃｅ１１．　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ
ｌ、　）６巻、４２５〜４４０頁（１９８６））５μｇ
を、３７°Ｃ３晩、２５ユニツトのＦｓｐｌ及び６０ユ
ニツトのＨｉｎｄｌｌｒで消化した。エタノール沈殿後
、生成したＤＮＡ断片（２６５８塩基対）を平滑末端と
し、先に述べたように精製した。

ｆｃ１１０μｌの１．Ｊ　ガーゼ・バッファ（４ｏユニ
ツトのりガーゼ、５０ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ７，５）
、１０ｍＭ　ＭｇＣｊｌ！ｚ　、２０ｍＭＤＴＴ、　１
ｍＭ　ＡＴＰ、５０　ｕ　ｇ／ｍｌ！　Ｂ　ＳＡ）中、
ｄｈｆｒ　（断片及び修正したｐｓＶ２ｇｐｔベクター
を、３７℃、−晩でライゲーションし、ついで、大腸菌
ＪＭＩＯ１へのトランスホーメーションに用いた。Ｅｃ
ｏＲＩ及びＭｓｔＵを用いた制限酵素分析後、ｄｈｆｒ
遺伝子の方向を異にする（ＳＶ４０のＯＲＩに対して）
、２個の陽性クローンを選択した。これらのベクターを
、各々、ｐｓＶ　−ｇｐｔ−ｄｈｆｒｌ　７、ｐｓＶ　
２−ｇｐｔ−ｄｈｆｒ２０と命名した。

（ｄｌ　　１（１１）ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭトリス
・塩酸（ｐＨ７，５）　　６ｍＭ　ＭｇＣ７！２６ｍＭ
β−メルカプトエタノール及び１（１１）μｇ／ｍｌの
ゼラチンを含む溶液中、ｐＳＶ　２−ｇｐｔ−ｄｈｆｒ
プラスミドの１つ、５μｇを３７℃で２時間、２ｏユニ
ツトのＡｐａｒを用いて消化した。同反応混合物中、５
ユニツトのクレノー酵素及び５μＭのｄＮＴＰ存在下、
２０°Ｃ１２５分間のクレノー充填反応の後、そのＤＮ
Ａを、フェノール／クロロホルムで抽出し、最後に、エ
タノール沈殿で回収した。得たＤＮＡを、１０ｐＨの１
（１１）ｍＭ　ＮａＣ７！、１０ｍＭトリス・塩酸（ｐ
Ｈ７，５）　、６ｍＭ　ＭｇＣ７！ｚ　、６ｍＭβ−メ
ルカプトエタノール及び１１（１１）ｔｔ／ｍｐのゼラ
チンを含む溶液に溶解し、３７℃、２時間、２０ユニツ
トのＨｉｎｄ　ｍとインキュベートした。７０’Ｃ，１
０分間でその酵素を失活させた後、２０ユニツトの子牛
腸アルカリホスファターゼを加え、さらにその反応混合
物を、３７°Ｃ１３０分間インキュベートした。目的と
するＤＮＡを含む、その混合物を、フェノール／クロロ
ホルムで２度抽出し、最後に、１％アガロースゲルにか
けた。ｇｐｔ遺伝子を含まないｐｓＶ２ｄｈｆｒベクタ
ーを、電気溶出で精製した（第７図参照）。

去施拠土ＰＤＥ−２ｓ　ＦｃεＲの構築５０ｍＭ　ＮａＣｊ！、１（１１）ｍＭトリス・塩酸（
ｐＨ７，５）５ｍＭＭｇＣＩ！２及び１（１１）μｇ／
ｍｊ２ＢｓＡを含む１（１１）μｌの溶液中、２０μｇ
の発現ベクターＰＤＥ−２（日本特許公開１９８６／８
８８７９）を、３７°Ｃ１２時間、４０ユニツトのＥｃ
ｏＲＩで消化した。フェノール／クロロホルム抽出後、
ＤＮＡをエタノール沈殿で回収した。消化したＤＮＡを
２５μｌのバッファに溶かし、２０ユニツトのバクチリ
アル・アルカリ・ホスファターゼを用い、６５℃、３０
分間処理した後、フェノール／クロロホルムで２度抽出
し、エタノール沈殿した。平行して、ｐｓＦｃεＲ−１
プラスミドのＥｃｏＲＩ断片（第４図参照）を次に示す
ようにして作った。

５０ｍＭ　ＮａＣ１１，１（１１）ｍＭ）リス・塩ｆｉ
ｐｌ＋７．５．５ＩｒＩＦＩＭｇＣ１２及び１（１１）
．１７ｇ／ｎ＋ｊ？ＢｓＡを含む１（１１）ｔｔｌの溶
液中、２０ｔｔｇのｐｓＦｃεＲ−１を、３７℃、２時
間、２０ユニツトのＥｃｏＲＩで消化した。そのベクタ
ー及び挿入ＤＮＡの両方を分取用の１％アガロースゲル
にかけ、電気泳動した。ｐｓＦｃεＲ−１の１．５　ｋ
ｂＥｃｏＲＩ断片（ＢＳＦ２リーダー及びｓ　Ｆｃ、配
列を含む）及び線状ＰＤＥ−２ヘクターを電気溶出し、
エタノール沈殿した。脱リン酸化した線状ベクターを、
２０μｐのライゲーション・バッファ中（５０ｍＭ）リ
ス・塩酸、ｐｌ＋７．４．１０ｍＭ　ＭｇＣｊ！　ｚ　
、２０ｍＭ　ＤＴＴ。

１ｍＭスペルミジン、１ｍＭＡＴＰ及び１（１１）μｇ
／ｍＡＢｓＡ）　、４°Ｃ１１６時間、２（１１）ユニ
・ノドのＴ４リガーゼを用い、１．５　ｋｂＥｃｏＲＩ
断片とライゲーションし、それを、大腸菌にトランスフ
ェクトした。制限酵素分析によって正しく挿入が起てい
るかどうか確めた。１個の陽性クローンを選択し、ＰＤ
Ｅ−２ｓ　ＦｃεＲと命名した。その発現ベクターＰＤ
Ｅ−２ｓＦｃεＲを、従来法に従がい、サルのＣｏｓ−
７細胞における発現に使用した。

実施例２ πｓ　ＦｃεＲの構築５０ｍＭ　ＮａＣ１，Ｉ　ＯｍＭ）リス・塩酸（ｐＨ７
，５）、６ｍＭ　ＭｇＣ７！ｚ　、６ｍＭβ−メルカプ
トエタノールび１（１１）μｇ／＋ｌ！ゼラチンを含む
溶液中、３７°Ｃ１２時間、２０ユニツトのＸｈｏＩで
５μｇの発現ベクターπＨ３Ｍ　（プロシーディング・
イン・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（　
Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　）　
Ｕ　Ｓ　Ａ．　　８　４巻、３３６５〜３３６９頁（１
　９　８　７年））を消化後、線状プラスミドを５μＭ
　　ｄＮＴＰの存在下、２０℃、２５分間クレノーフラ
グメントで平滑末端化した。つづいてそのベクターを、
バクチリアル・アルカリ・ホスアターゼで処理し、フェ
ノールで抽出した後、沈殿化した。平行して、先に述べ
たバッファ中、５μｇのプラスミドρｓａｃ　、　Ｒ１
　　（Ｆｃｇレセプター遺伝子の可溶性部分、及びその
遺伝子の上流にＢＳＦ−２リ一ダー配列を含む）を、３
７°Ｃ、２時間、２０ニー’−　／トのＥｃｏＲｒで消
化した。クレノーによる充填反応後ＤＮＡ断片をアガロ
ースゲルから電気溶出した。線状化し、脱　リン酸化し
たπＨ３Ｍベクターを、２０μｌの５０ｍＭトリス・塩
ＩＷ　（ｐ）１７．５）　、Ｉ　ＯｍＭ　ＭｇＣ７！ｚ
、２　０ｍＭＤＴＴ，　１ｍＭＡＴＰ，　５　０　１１
　ｇ／ｍ７！ＢＳＡ及び４０ユニツトのＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを含む溶液中、１４℃、−晩でＢＳＦ−２／ｓＦｃ
。

ＤＮＡ断片とライゲーションした。このプラスミドを大
腸菌にトランスホームし、増巾した。

実施■ユＰＤＥ−２ｓ　ＦｃεＲの発現Ｃｏｓ−７細胞（直径６０龍のプレート当り５×１０’
個の細胞）をトランスフェクションの１日前、６（１３
）璽ブレートにＩ直径した。２５ＩＩＩＭトリス・塩Ｍ
　（ｐＨ７，５）　、１３７ｍＭ　ＮａＣｅ、５＋ｎＭ
ＫＣ１！。

０、６ｍＭ　Ｎａｚｌ（ＰＯ４，０，５ｍＭ　ＭｇＣｅ
　２．０．７ｍｌ’ｌＣａＣ１，及び５（１１）ｔｔｇ
のＤＥＡＥ−デキストラン（ファルマシア・ファイン・
ケミカル）？８ｆｉ１ｍｌ中、プラスミドＤＮＡ２μｇ
を用いてトランスフェクションした。３７℃、１時間の
インキュヘーション後、この？容ン皮を、１０％ＦＣ５
及び１５０μＭクロロクインを含む０μ巳Ｍで置き換え
、３７℃、３時間インキュベーションした後、１０％Ｆ
Ｃ３を含む新鮮なりＭＥＭで置き換えた。

インフエクションの翌日、その培地を、ＤＭＥＭ中１％
又はｌＯ％ＦＣ３が含まれるように変えた。

その培養上清を、培地交換の２日後収集し、可溶性Ｆｃ
εＲ活性に対するテストを行った。

同様な結果が、Ｃｏｓ−７細胞でトランスフェクトした
πｓ　ＦｃεＲでも得られている。

夫施Ｈ土ＩｇＥロゼツタ形成及びその阻害ＩｇＥロゼツタ阻害のため、２５μｌのＦｃｌ：Ｒ保持
細胞を、決った容積（例えば１（１１）μＮ）のテスト
試料又はコントロール培地と混合し、４°Ｃ１時間イン
キユヘートした。３以上の０ＲＢＣをもつロゼツタの数
を計数した。その結果を表−１に示す。実験■及び■に
おいて、ＦｃεＲ保持細胞はＥ□Ｌ　　３ｍ胞であった
。コントロール培地は、コントロールＣｏｓ〜７細胞、
すなわち非トランスホーム細胞の上清である。

表−１組換え可溶性ＦｃεＲによるＥｏＬ−３細胞のＩｇＥ・
ロゼツタ形成の阻害未希釈１／３１／９１／２７酵素結合免疫吸着検定法（イライザ法）最初に９６穴マ
イクロプレートを、コーティングバッフｙ　（Ｎａｔ（
ＣＯ３０，ｌ　Ｍ、　ｐＨ９，６）中、ウェル当り１０
μβのモノクローナル抗体（１０μｇ／１ｆｆ）を用い
コーティングし、４°Ｃで一晩インキユベートした。そ
れから、このプレートを、洗浄バッファ、すなわち、０
，０５％トウィーン２０（Ｔｗｅｅｎ　２０　）　’ｃ
含むダルベコ・リン酸バフファで４回洗浄し、ついで希
釈バッファ（トリス・塩Ｈ０，０５Ｍ、　ｐ）１８．　
ｌ　、ＦＩｇＣｌ　ｚ　１　ｍＭ、ＮａＣｊ！、０、１
５　Ｍ、トウィーン２（１１）．０５％（Ｖ／Ｖ）、Ｎ
ａＮ５Ｏ，０２％、Ｂ５Ａｌ％）で希釈した１（１１）
μＡのテスト試料を添加した。そのマイクロプレートを
室温で２時間インキュベートし、洗浄バッファで４回洗
浄した後、タイター値測定され、かつ希釈されたヤギの
抗マウスＩｇＭ−アルカリホスファターゼ結合物１（１
１）μｌを添加した。

そのプレートを、室温で２時間インキュベートし、つい
で、洗浄バッファで４回洗浄した。最後に、基質バッフ
　ア（ＮａｔｌＣＯｚｏ、　０５　Ｍ、　ｐＨ９，８、
！、Ｉｇｉ　２　Ｘ　６１１２（１３）０ｍ！わ中の基
質、ｐ−フェニル酸二ナトリウム（Ｉｍｇ／ｍｆ）　、
１（１１）μＲを加え、その発色反応物は２時間の間、
３０分毎、４０５μｍ及び６２０μｍでの測定を行った
。ＦｃｇＲ活性の結果を第６図に示した。

実施例６ｐ　Ｓ　Ｖ　２−ｄｈｆｒ　−ｓ　ＦｃεＲの構築５０
ｍＭ　ＮａＣｆ１．　１０ｍＭ）リス・塩酸（ｐ１４７
．５）、６　ｍＭ　’、ＡｇＣ１２，６ｍＭβ−メルカ
プトエタノール及び１（１１）μｇ　／　ｍβゼラチン
の溶液中、３７℃、２時間、１０μｇのπＨ３Ｍプラス
ミド（その上流にＢＳＦ−２リ一ダ配列が連結されてい
る、Ｆｃ　ｅＲレセプター遺伝子の可溶性部分を含む）
を、Ｐｓｔ　Ｔで消化した。平滑末端とするため、５０
ｍＭのｄＮＴＰの存在下、２０°Ｃ１２５分間５ユニツ
トのクレノー酵素と、反応混合物をインキュベーション
した後、このＤＮＡを、フェノールで抽出し、ついでエ
タノール沈殿を行った。得られたＤＮＡを、１（１１）
ｍＭのＮａＣｊ２．１０ｍＭ）リス・塩ｆｊ１（ｐＨ７
，５）　、６ｍＭ　　ＭｇＣＡｚ　、６ｍＭβ−メルカ
プトエタノール及び１（１１）μｇ　／　ｍ　１ゼラチ
ンを含む溶液２０μｌに熔かし、ついで、３７℃、２時
間、２０ユニツトのＨｉｎｄ　ｍとインキュベートした
。フェノール／クロロホルム抽出後、目的とするＤＮＡ
を含む反応混合物を１％アガロースゲルにかけ、１５（
１１）塩基対の断片を電気溶出した。

５０ＩＩＩＭトリス・塩酸（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭ
　ＭｇＣｊ！ｚ、２０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰ及び５
０μｇ／ｍＩＢＳＡ及び４０ユニツトの７４ＤＮＡリガ
ーゼを含む溶液１０μ！中、１４℃、−晩でその１５（
１１）塩基付断片を、線状化したｐ　Ｓ　Ｖ　２−ｄｈ
ｆｒベクター　（ｇｐｔ遺伝子を欠く）とライゲーショ
ンした後、このライゲーション混合物を、大腸菌ＨＢＩ
ＯＩのトランスホーメーションに用いた。制限酵素分析
後、１つの陽性クローンを選択し、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ−
ｓＦｃ、と命名した（第７図参照）。

実施例７ｐＳ　Ｖ　２−ｄｈｆｒ　−ｓ　Ｆｃ、の発現ジヒドロ
ホレート・リダクターゼを欠いたチャイニーズ・ハムス
ター卵巣細胞（ｄｈｆｒ−、チャジン（Ｃｈａｓｉｎ　
）Ｌ、　）を、１０％ウシ胎児血清、ヒボキサンチン及
びチミジン（ＨＴ）を含むα−ＭＥＭ培地中で増殖した
。ＣＨＯ細胞への、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒｌ　
７−ｓＦｃε又はｐＳＶ２−ｄｈｆｒ２０−　ｓ　Ｆｃ
、のトランスフェクションは、リン酸カルシウム沈殿法
によって行った（ヴイロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、
５２巻、４５６頁（１９７３年））。

トランスフェクションの前日、７Ｘ１０’個の細胞を培
養プレートに植種した。その細胞を、３７℃で４時間、
ＩＯμｇのプラスミドを含むリン酸カルシウム沈殿にさ
らす。つづいて、その培地を吸引し、１０％のウシ胎児
血清を含む選択培地α−ＭＥＭで置き換える。トランス
ホームした細胞のコロニーが１２から１６日後に出現し
、クローニング・シリンダー又はピペットの先端で単離
した。その上清は、イライザ法を用いＦｃεＲ活性をテ
ストした。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＦｃεＲ−１の塩基及びアミノ酸配列を示
す。第２図は、ｐＤＥ−２の構築を示したものである。第３図は、ｐＢＳＦ２−Ｌ８の塩基及びアミノ酸配列を
示す。第４図は、ｐｓＦｃεＲ−１の塩基及びアミノ酸配列を
示す。第５図は、好酸球白血病細胞系列によるＦｃ　、　Ｒの
発現を示す図である。第６図は、ＰＤＥ−２ｓ　ＦｃεＲをトランスフヱクト
したＣｏｓ−７細胞によるＦｃεＲの発現を示した図で
ある。第７図は、ｐ　Ｓ　Ｖ　２ｇｐｔ　　−ｄｈｆｒ及びｐ
ＳＶ２ｄｈｆｒ−ｓＦｃ、の構築を示した図である。第８図は、πｓＦｃｇＲ（４，７に塩基対）の構築を示
した図である。 ω　　ｒ＋　　ψ　　い ○ ○ ０＜　　コ（ｊ　　　：Ｉｌｊ　　　コく１．ｌＵ　　
Ｆ−１＜　　　ｓ＜　　　ｐ−＋＜１１＋（Ｊ　　　（
ｊＬ）　　　Ｑｌｊ　　　じＱΦυ Ｊ：Ｅ−ＩＩＥ４ α○　　　　ｅ（Ｊ ψ＜　　　　ψく＜Ｑ　　くくｒ−＞リ　Ｎ＞ｏ　　ｒ＋−〇　ＩＮＱＩ（ＪＩＮ、−
１（ｊ　　望−ｕ　哨Φ０　さ−〇”ＩＬＩ＋ｊ　　Ａ
Ｃ：）Ｕ　　−１ｔｏべ　−くＯａ＋１−４０．Ｅ−Ｉ
ＬＪＣＪ　　　　シ、Ｆ４ｄＥ−Ｉ　　ψ＜　　≦（Ｊ
　　　ｓａＨ＜　　　＜ａ　　ｌ−Ｉ＜　　ａａテ（５？￥　　Ｏ（Ｊ　　　ＷＣＪｈｅ　　　　＞ａ　　　　ｏ４ｕ　　　　ψ−−υ　　
Ｑｌ（５コＱ＞０晋？　　μビ　Ｊご　Ｊ８＞Ｕ　　　　　ａＩＵ　　　　　＞＋り　　　　σリフ
−Ｕ　　　ＡＥｓ　　＋（ｊ　　　１ａ（ｊａａ　　　
Ｈ＜　　ａａ　　　べ０ＬＮ１．１ＣＪ＋＋−ａＩ−へ０ぺ　Ｉ％　ＪＪ　□Ｎ
Ｊ：υ　ｆｆ１ｊ：Ｆ−４ｔｎｕＱ　　１５Φθ、−４
Ｅ４＜　　、−ＩＱＩｌ−Ｉ　　Ｐ４Ｑｌ（Ｊ　　−Σ
べ、ツ足　　：詫　二む　　２旨工υ　　（１１）　　く０　　ΣべｌａＱ　　　方＜　　　Ｏ，ａ　　　−＋Ｃ＋Φじ　　
−（５ＬＪＬＩ　　　ｍＥｓ史＜　　　ａａ　　　ｈｅ　　　＞ａづ０　　ψ（５ｅ（Ｊ　　　ψ０コ８　片ゴ　芝ゴ　δ旨、＝ギ　　：８　；８　片足＝０　−Ｑ　　ψクク０ｒ＋ｌｌ１（ｊ　　ｌＮ０ＪＱ　　ｒ＋＋ｕＱ　　ヘコ
じ−＞＜　ｎψ＜　！為く　ψＨく一４ｈＪ＜　　、−＋＜ｕ　　ＦＩｌ−ＩＥ−Ｉ　　Ｐ
−Ｉ（ｊ（ｊ芸８　　ぷ￥　　片足　シ８ｈ＜　　　、ＪＥ−１＜ａ　　　ａａ託　ロ　ｄ属　翻 Φｕ　　　ｃｎａ　　　ＩＩＩＥ−Ｉ　　　Ｌｌ（ＪＪ
：８　　　　−リ　　　　・−く　　　　Φじ山Ｅ−１
＜（Ｊ　　　エリ　　ψくＱＩＣＪ：ｌｌ−Ｉｌ、ＩＯ■Ｑｖ＋＜　　　ａｒｈ　　　ｌ１ｌ（５Ｌｌ：１く０　−
Ｑ　　ψ＜　　くυ ＯｎＫＸ　　　　　ｎ

Claims

【特許請求の範囲】

（１）第１図に示されているように、全Ｆｃ＿εＲ遺伝
子のうち１番から１４８番までのアミノ酸に対応するコ
ード配列の少なくとも１部が、真核生物のシグナル配列
により置き換っている、多細胞生物の細胞での発現に適
しているレプリコン及び制御配列の両方と機能的に結合
したクローン化遺伝子又はこれと等価なコード配列。
（２）上記シグナル配列がインターロイキンｃＤＮＡシ
グナル配列である請求項（１）記載のクローン化遺伝子
又はこれと等価なコード配列。
（３）上記シグナル配列がＢＳＦ−２シグナル配列であ
る請求項（２）記載のクローン化遺伝子又はこれと等価
なコード配列。
（４）上記ＢＳＦ−２シグナル配列がプラスミドｐＢＳ
Ｆ−２．３８の１１０ｂｐＫｐｎ I −Ｈｉｎｆ I 断片
に含まれている、請求項（３）記載のクローン化遺伝子
又はこれと等価なコード配列。
（５）第４図に示したような式で示される請求項（１）
記載のクローン化遺伝子又はこれと等価なコード配列。
（６）請求項（１）乃至（５）のいずれかに記載のクロ
ーン化遺伝子を含む多細胞生物の細胞における発現に適
した発現ベクター又はこれと等価なコード配列。
（７）ベクターとして第２図に示されるＰＤＥ−２ｓＦ
ｃ＿εＲ、第７図に示されるｐＳＶ２−ｄｈｆｒ−ｓＦ
ｃ＿ε又は第８図に示されるπｓＦｃ＿εＲを用いる、
請求項（６）記載のベクター。
（８）請求項（６）又は（７）記載の発現ベクターでト
ランスフェクションした多細胞生物の細胞。
（９）上記細胞がを脊椎動物細胞系列の１つである請求
項（８）記載の多細胞生物の細胞。
（１０）上記脊椎動物細胞がＣｏｓ−７細胞又はＣＨＯ
細胞の１つである、請求項（９）記載の多細胞生物の細
胞。
（１１）請求項（１）乃至（５）記載のＤＮＡ分子によ
ってコードされた、ヒトの低親和性Ｆｃ＿ε−レセプタ
ーの水溶性部分。
（１２）上記Ｆｃ＿ε−レセプターが、請求項（８）乃
至（１０）のいずれかに記載の細胞系列によって発現さ
れる、請求項（１１）記載のヒトの低親和性Ｆｃ＿ε−
レセプターの水溶性部分。
（１３）第１図に示した、少なくとも１５０番から３２
１番のアミノ酸を含む、請求項（１１）又は（１２）記
載の、ヒトの低親和性Ｆｃ＿ε−レセプターの水溶性部
分。
（１４）第１図に示される１３４番から３２１番のアミ
ノ酸及びＢＳＦ−２．３８リーダーペプチドを含む請求
項（１１）乃至（１３）のいずれかに記載の、ヒトの低
親和性Ｆｃ＿ε−レセプターの水溶性部分。
（１５）発現したペプチドが、第４図に示される式で表
わされる、請求項（１４）記載のヒトの低親和性Ｆｃ＿
ε−レセプターの水溶性部分。
（１６）請求項（１１）乃至（１５）のいずれか１項に
記載のヒトの低親和性Ｆｃ＿ε−レセプターの水溶性部
分のｏ−グリコシル化誘導体。
（１７）請求項（１１）乃至（１６）のいずれか１項に
記載の水溶性Ｆｃ＿ε−レセプターを含む医薬組成物。
（１８）局所的もしくは全身的ＩｇＥアレルギー反応の
治療に適した、請求項（１７）記載の医薬組成物。
（１９）医薬組成物を調製するための、請求項（１１）
乃至（１６）記載の水溶性Ｆｃ＿ε−レセプターの使用
。
（２０）第１図に示した、１５０番のアミノ酸から始ま
るヒトの低親和性Ｆｃ＿ε−レセプターの、少なくとも
水溶性部分をコードするＤＮＡ配列と真核性シグナル配
列のライゲーションを含む、請求項（１）乃至（５）の
いずれか１項に記載のクローン化遺伝子を調製する方法
。
（２１）適当に線状化したベクタ−と、請求項（１）乃
至（５）のいずれか１項に記載のクローン化遺伝子との
ライゲーションを含む、請求項（６）又は（７）記載の
発現ベクターを調製する方法。
（２２）請求項（６）又は（７）記載の発現ベクターに
よる細胞のトランスフェクションを含む、請求項（８）
乃至（１０）のいずれか１項に記載の細胞系列を調製す
る方法。
（２３）請求項（８）乃至（１０）のいずれか１項に記
載のトランスフェクションした細胞を培養し、かつ、生
じた水溶性Ｆｃ＿ε−レセプターを単離することを含む
、請求項（１１）乃至（１６）のいずれか１項に記載の
、ヒトの水溶性低親和性Ｆｃ＿ε−レセプターの調製方
法。
（２４）１つ以上の賦形剤中、請求項（１１）乃至（１
６）のいずれか１項に記載の水溶性Ｆｃ＿ε−レセプタ
ーを有効量で含有させることを含む、請求項（１７）又
は（１８）記載の医薬組成物の調製方法。